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含有死的益生菌共生发酵培养物的营养组合物

基本信息

  • 申请号 CN00111082.9 
  • 公开号 CN1273838A 
  • 申请日 2000/04/26 
  • 公开日 2000/11/22 
  • 申请人 济南三株药业有限公司  
  • 优先权日期  
  • 发明人 吴炳新 董立山 孙筱林 王红  
  • 主分类号  
  • 申请人地址 250100山东省济南市山大北路77号 
  • 分类号  
  • 专利代理机构  
  • 当前专利状态 发明专利申请公布 
  • 代理人  
  • 有效性 发明公开 
  • 法律状态
  •  

摘要

本发明总地涉及用于恢复和维持胃肠道健康及相关生理功能的,含有灭活的或死亡的益生菌及其代谢产物的营养组合物、其生产方法及其在改善肠道菌群平衡和刺激特异性或非特异性免疫功能中的应用。
本发明特别涉及在同一培养基中和同样发酵条件下,以分级接种、共生发酵方法培养和增殖多种益生菌的方法,以及所说的益生菌混合培养物在制备用于恢复和维持胃肠道正常菌群平衡、改善机体特异性或非特异性免疫功能及抗肿瘤活性的营养组合物中应用。
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权利要求书

1、一种含有灭活的或热杀死的一种以上肠道益生菌,并含有可溶性膳食纤维及大豆 异黄酮的悬液态营养组合物。
2、根据权利要求1的营养组合物,其中所说的益生菌选自乳杆菌属、双歧杆菌属、 链球菌属、肠球菌属、丙酸菌属、明串珠菌属、芽孢杆菌属的一种或多种人肠道非致病菌。
3、根据权利要求1的营养组合物,其中所说的益生菌选自两歧双歧杆菌、短双歧杆 菌、婴儿双歧杆菌、长双歧杆菌、嗜酸性乳杆菌、保加利亚乳杆菌、奶酪乳杆菌、德氏乳 杆菌、植物乳杆菌、嗜热链球菌、粪肠球菌、屎肠球球菌、嗜柠檬酸明串珠菌、枯草孢杆 菌和地衣形芽孢杆菌。
4、根据权利要求1的营养组合物,其中所说的可溶性纤维含量约为每毫升含20-40μ g,并且其中所说的大豆异黄酮含量为每毫升30-100μg。
5、生产权利要求1-4中任一项所限定的悬液态营养组合物的方法,该方法包括: (1)提供基本上由大豆或大豆芽蒸煮液、蛋白酶解牛肉肉汤、酵母浸膏、糖和矿物 质组成的液体培养基; (2)按照湿菌体生物量约占培养基总重量0.5-1.0%的比例,依次向培养基内接种待 培养的二种或二种以上肠道益生菌,并在每接入一种细菌后,于38-41℃的温度和pH6.6 条件下,厌氧培养4-10小时; (3)当发酵培养物中菌体总浓度约达到7×108/ml以上时,使温度降至约32℃并维 持2-4小时,以完成微生物体的代谢转化; (4)当发酵培养物的pH降至大约3.5--3.9,使温度升高至48-50℃并保持4-6小时, 以完成菌体热灭活和发酵体系稳定化。
6、根据权利要求5的方法,其中所说的液体培养基是由约25%大豆芽煎煮液、约2.5% 胰蛋白酶水解牛肉肉汤、约1.3%酵母浸膏、约1.3%葡萄糖、约1.3%蔗糖和适当量包括Mg++、 Ca++、K+、Na+的矿物质组成的。
7、根据权利要求5的方法,其中所说的肠道益生菌选自两歧双歧杆菌、短双歧杆菌、 婴儿双歧杆蓖、长双歧杆菌、嗜酸性乳杆菌、保加利亚乳杆菌、奶酪乳杆菌、德氏乳杆菌、 植物乳杆菌、嗜热链球菌、粪肠球菌、屎肠球球菌、嗜柠檬酸明串珠菌、枯草孢杆菌和地 衣形芽孢杆菌。
8、权利要求1-4中任一项所限定的营养组合物在纠正和维持肠道正常微生态平衡中 的应用。
9、权利要求1-4中任一项所限定的营养组合物在调整机体非特异性免疫反应中的应 用。
10、权利要求1-4中任一项所限定的营养组合物在生物转化或修饰一种或多种天然药 物的有效成分并使之发挥或改善其生物学活性中的应用。
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说明书

本发明总地涉及用于恢复和维持胃肠道健康及相关生理功能的,含有灭活的或死亡的 益生菌及其代谢产物的营养组合物、其生产方法及其在改善肠道菌群平衡和刺激特异性或 非特异性免疫功能中的应用。
本发明特别涉及在同一培养基中和同样发酵条件下,以分级 接种、共生发酵方法培养和增殖多种益生菌的方法,以及所说的益生菌混合培养物在制备 用于恢复和维持胃肠道正常菌群平衡、改善机体特异性或非特异性免疫功能及抗肿瘤活性 的营养组合物中应用。
一切干扰宿主的因素,不论是物理的、化学的,还是生物的都会引起微生态的平衡失 调。
对于健康的人体,常常可能因为手术(特别是腹部手术)、外伤、精神压力、肿瘤、 胆盐刺激及滥用抗生素等机体内环境或外环境的变化导致肠道内微生物菌群紊乱,即有益 和有害肠道微生态间的平衡失调。
其中,导致肠道正常微生物菌群失调的最重要的因素是 长期滥用抗生素。
一旦正常菌群的发酵过程受到破坏,即可导致许多有益细菌的减少,进 而使结肠粘膜衰竭。
同时,因潜在的恶性细菌的迅速生长而严重损害结肠粘膜功能。
有害 细菌穿透功能失常的结肠壁并感染器官,引起器官的脓肿或使多数器官功能减弱甚至丧 失。
以前,人们常常使用各种抗生素预防或治疗肠道菌群失调,特别是腹部手术后肠道正 常群菌群失调所致的继发感染。
然而,长时间大量使用抗生素不仅花费很高,而且难于纠 正正常肠道菌群失调,特别是往往因致病菌的过度生长而导致病情进一步恶化。
为了调整正常肠道微生态平衡,一种普遍接受的方法是筛选并利用人们已知的、在正 常胃肠道内占优势并可在小肠粘膜上定植的非致病无毒性细菌,添加或不添加膳食纤维、 寡聚糖或免疫球菌蛋白、含硫氨基酸等辅助成份,制成药物组合物或营养补充剂,投用于 需要进行正常肠道微生态失调治疗的病人。
大量的实验室研究和临床观察证明,微生态平 衡疗法可对于改善和维持胃肠道菌群平衡、改善机体特异性或非特异性免疫及降低血胆固 醇发挥不可替代的作用。
已有许多现有技术文献描述了益生菌的治疗作用及其应用。
例如,Fernandes详细评述 了以食品或发酵乳制品方式引入体内的乳杆菌,特别是嗜酸性乳杆菌的益生作用(Fernandes et al.,“Therapeutic role of dietary lactobacilli and lactobacillic fermented diary products”,FEMS Microbiology Reviews 46:343-356,1987)。
Nobuo Saegara的研究证明,口服粪链球菌可显著 地改善人和动物的脂质代谢(Microecology and therapy,vol.15,271-280,1985)。
欧洲专利EP 0199535描述了从粪便中分离的,体外试验证明能够在肠粘膜上粘附的酸性乳杆菌的纯培 养物。
国际专利WO89/05849描述了从猪胃肠道中分离的,可在猪胃肠道上皮细胞上粘附, 并对强酸和胆汁有耐受性的乳酸菌。
可使用所说的细菌制造发酵乳品,并用以预防或治疗 小猪的大肠杆菌性腹泻。
另一方面,美国专利4,805,368公开了一种以膳食纤维为基础 的含有嗜酸性乳杆菌和/或两歧双歧杆菌、乳脂明串珠菌(Leuconostoc citrovorum)及谢氏 丙酸杆菌(Propionibacterium shermanii)的益生菌组合物及其制备方法。
美国专利4,913, 913描述了混合或分别培养奶酪乳杆菌(L.casei)和长双歧杆菌(B.longum),以制备含双 歧杆菌的乳酸菌发酵乳品的方法。
美国专利5,716,615公开了包括嗜热链球菌、乳杆菌和双 歧杆菌的,用于治疗胃肠道疾病和高胆固醇血症的药物组合物。
美国专利5,744,134还描述 了含有免疫球蛋白和可溶性膳食纤维、多价铁螯合分子和葡糖酸,以及一种或多种肠道益 生菌的,用于促进胃肠道健康的组合物。
最后,本发明人于1993年提交并已授权的中国专 利93101172.0公开了一种含有热杀死的嗜酸性乳酸菌(Lactobacillus acidoilus)、短双歧杆 菌(Bifidobacterium breve)和屎肠球菌(Enterococcus faecium)的营养补充剂(即所谓“三 株口服液”)。
与其他现有技术不同,虽然该悬液态营养补充剂不含活的益生菌,但据信 所说的悬液中含有多种有益的细菌酶及其他细菌代谢产物,并且由于其生产过程中使用了 富含可溶性纤维和大豆异黄酮的培养基成分,所以不仅有利用细菌的存活和生长,而且也 为所说的营养混合物提供了这些及其他有益成分。
然而,无论是生产含活的还是死的多种益生菌的组合物,并且无论只含一种或多种细 菌还是另外含有其他辅助成分的组合物,上述现有技术均没有描述在同一培养基中和同一 发酵条件下,以分级培养和共生发酵技术培养并增殖两种以上肠道益生菌的方法。
因此,本发明的一个目的是提供一种含有灭活的或热杀死的一种或多种益生菌,并含 有可溶性膳食纤维及大豆异黄酮的悬液态营养组合物。
根据本发明这一目的的一个优选实施方案,其中所说的益生菌选自双歧杆菌属、乳杆 菌属、链球菌属、肠球菌属、丙酸菌属、明串珠菌属及芽孢杆菌属的一种或多种人肠道非 致病菌。
根据本发明这一目的的一个优选实施方案,其中所说的益生菌选自两歧双歧杆菌、短 双歧杆菌、婴儿双歧杆菌、长双歧杆菌、嗜酸性乳杆菌、保加利亚乳杆菌、奶酪乳杆菌、 德氏乳杆菌、植物乳杆菌、嗜热链球菌、粪肠球菌、屎肠球球菌、嗜柠檬酸明串珠菌、枯 草孢杆菌和地衣形孢杆菌。
根据本发明这一目的的一个优选实施方案,其中所说的可溶性纤维含量约为每毫升含 20-40μg,并且其中所说的大豆异黄酮含量为每毫升30-100μg。
本发明的另一个目的是提供生产上文限定的悬液态营养组合物的方法,该方法包括: (1)提供基本上由大豆或大豆芽蒸煮液、蛋白酶解牛肉肉汤、酵母浸膏、糖和矿物 质组成的液体培养基; (2)按照湿菌体生物量约占培养基总重量0.5-1.0%的比例,依次向培养基内接种一种 或多种细菌,并在每接入一种细菌后,于38-41℃的温度和pH6.6条件下,厌氧培养4-10小 时; (3)当发酵培养物中菌体总浓度约达到7×108/ml以上时,使温度降至约32℃并维持2- 4小时,以完成生物代谢转化; (4)当发酵培养物的pH降至大约3.5--3.9时,使温度升高至48-50℃并保持4-6小时, 以完成菌体热灭活和发酵体系稳定化。
根据本发明这一目的的一个优选实施方案,其中所说的液体培养基是由约25%大豆芽 煎煮液、约2.5%胰蛋白酶水解牛肉肉汤、约1.3%酵母浸膏、约1.3%葡萄糖、约1.3%蔗糖和 适当量包括Mg++、Ca++、K+、Na+的矿物质组成的。
根据本发明这一目的的一个优选实施方案,其中所说的大豆或大豆芽蒸煮液是发芽大 豆在水中按30%(W/V)比例混合并于105-121℃下蒸煮30分钟,然后经常规过滤得到的滤 液。
本发明的再一个目的是提供上述营养组合物在纠正和维持肠道正常微生态平衡中的应 用。
本发明的再一个目的是提供上述营养组合物在调整机体非特异性免疫反应中的应用。
本发明的再一个目的是提供上述营养组合物在生物转化或修饰一种或多种天然药物的 有效成分并使之发挥或改善其生物学活性中的应用。
附图1显示单独发酵培养短双歧杆菌、屎肠球菌和嗜酸性乳杆菌时,三种细菌各自的 生物量随时间变化的增殖曲线。
附图2显示在同一培养基中和同样培养条件下,短双歧杆菌、屎肠球菌和嗜酸性乳杆 菌混合共生培养时,总生物量随时间变化的增殖曲线。
本发明涉及一种含有热杀死的肠道益生菌,并含有由微生物培养基提供的可溶性纤维 及大豆异黄酮的营养组合物。
本发明进一步涉及以分级接种和共生发酵技术,在同一培养 基及同样条件下培养二种或二种以上益生菌的方法。
所说的营养组合物经口服投用后,可 有效地恢复和维持胃肠道正常菌群平衡、改善特异性或非特异性免疫功能并降低血胆固 醇水平。
目前商品化的益生菌制剂,大多宣称使用的是一株或多株可耐受胃内强酸性(1.0) 和小肠上部1-1.5%胆盐环境的,并可在小肠粘膜表面定居的益生菌。
然而,这些制剂的研 制人员却相对轻视了益生菌的大量代谢产物的益生作用。
事实上,目前微生态学领域普遍 接受这样一个观点:为维持机体的微生态平衡,除肠道正常细菌群体外,还存在一类所谓 的“益生物质”,包括微生物表面活性物质及其一系列代谢产物,例如维生素、抗体、肽、 肽聚糖及氨基酸等。
这些物质可有效地抑制胃肠道内及可发酵食物中某些有毒细菌的生 长。
已有许多实验证明了某些死亡的细菌和其碎片如细胞壁、肠内物质及细菌代谢产物对 人和动物的有益作用。
例如有人证明,被杀死的乳酸菌能够粘附到肠粘膜上皮细胞上,通 过竞争性排斥在空间上抑制致病菌与肠道细胞毛刷状缘结合部位的接触,从而阻止致病菌 在肠道内定植,切断细菌感染的第一个关键性步骤。
Coconnier等人的研究显示,热杀死的 嗜酸性乳杆菌和保加利亚乳杆菌对Caco-2细胞(一种用于研究人肠道细胞的组织和功能的, 具有典型的肠道细胞分化特征的细胞系)和粘膜分泌性HT29-MTX细胞具有高度粘附性, 从而可通过阻断人肠道细胞的病原受体来阻止肠道致病菌对CaCO-2及HT29-MTX细胞的粘 附和侵袭(Coconnier MH,J.DiarrhoealDes.Res.11(4):235-242,1993; Coconnier,FEMS Microbiol.lett.110(3):299-305,1993)。
另外,Quwehand和Conway (J.Appl.Bacteriol.80(3):311-318,1996)发现,乳杆菌104r细胞株死亡后释放一种能够抑制肠毒 素型大肠杆菌K88在小肠粘膜上粘附的物质,而且证明这种可在溶菌酶作用下失活并含有 葡萄糖和半乳糖的物质,只有在培养过程中不断由死菌释放到细菌培养物中时才表现有这 样的抑制活性。
也已就死的益生菌的肿瘤抑制活性进行了许多研究。
已知肠道细菌如大肠杆菌和粪肠 球菌能产生多种使前致癌物转化为致癌物的酶,如β-葡糖醛酸酶和硝基还原酶等。
另外, 益生菌代谢产生的乳酸和短链脂肪酸(SCFA)可导致肠道内pH值降低,使这些代谢酶的 活性受到抑制,从而阻止肠道内致癌物质的形成。
再者,乳酸菌等益生菌对致突变物质的 特殊结合能力,也发挥一定的抗突变和肿瘤生成抑制作用。
张学斌(J.Dairy Sci.73(3):1477-1481,1991)的研究发现,某些乳酸菌如乳脂链球菌和嗜酸性乳杆菌,以及 两歧双歧杆菌的菌体成分(包括胞浆和菌体细胞壁骨架成分)对诱变剂TRP-P-1和N-亚硝 基二甲胺具有很强的结合能力。
Sekine等人(Caneer Res.,45:1300-1310,1985)证明,婴儿 双歧杆菌细胞壁中分离的肽聚糖(WPG)作为一种生物反应调节剂,对肿瘤生长具有明显 地抑制作用。
并且进一步的研究显示,益生菌菌壁制剂(WPG)的抗肿瘤活性是由于WPG 诱导细胞因子表达并激活巨噬细胞产生大量一氧化氮所导致的。
最后,就死益生菌的免疫调节作用而言,已有人发现热杀死的乳酸菌KVS20能够激活 静止和活动期的巨噬细胞(Kitazawa,H.et al.,J.Dairy Sci.,74:2082-2088,1991)。
另外,还有人 发现,热杀死的嗜热链球菌可刺激巨噬细胞和T辅助细胞产生细胞因子,使TNF-α水平增 加约135-176倍,IL-6水平增加约31-192倍(Marin ML,J.Food Prot.61C7):859-864,1998)。
从上述以前的研究结果可以看出,益生菌死菌制剂无论是在理论上还是在实践上都已 证明是有效的。
另外,这里还应提到的一个不容忽视的问题是,现已发现包括屎肠球菌在 内的许多传统的益生菌均可能携带抗生素抗性质粒,而这些质粒可能在适当条件下在外来 的或肠道内固有的益生菌或致病菌之间转移。
一旦这样的抗生素抗性质粒转入肠道致病菌 内,便有可能造成严重的不良后果,从而给使用活益生菌制剂的病人留下潜在隐患,这也 是本发明人确定使用灭活的益生菌制剂作为本发明营养组合物的理由之一。
为了制备作为营养组合物或补充剂的含有死的益生菌共生发酵培养物的益生菌制剂, 可以选用本领域已知的任何两种或两种以上的人正常肠道益生菌。
所说的益生菌包括但不 只限于选自双歧杆菌属、乳杆菌属、链球菌属、肠球菌属、丙酸菌属、明串珠菌属及芽孢 杆菌属的一种或多种人肠道非致病菌,特别是包括但不只限于两歧双歧杆菌、短双歧杆菌、 婴儿双歧杆菌、长双歧杆菌、嗜酸性乳杆菌、保加利亚乳杆菌、奶酪乳杆菌、德氏乳杆菌、 植物乳杆菌、嗜热链球菌、粪肠球菌、屎肠球球菌、嗜柠檬酸明串珠菌、枯草孢杆菌和地 衣形芽孢杆菌。
用于发酵培养本发明中使用的益生菌的培养基基本上是由大豆或大豆芽蒸煮液、蛋白 酶解牛肉肉汤、酵母浸膏、糖及矿物质组成的。
本发明中使用的培养基不同于常规细菌发 酵培养基,其主要特征在于其中除含有基本碳源(葡萄糖和蔗糖)、氮源(酶解肉汤和酵 母浸膏)及矿物质外,还特别加入了占液体培养基较大重量比(约25%)的大豆或大豆芽 蒸煮液。
用于本发明的典型的培养基组成如下: 2.5%酶解牛肉肉汤、1.3%酵母浸膏、25%大豆芽煎煮液、1.3%葡萄糖、1.3%蔗糖、 0.05%MgSO4、0.05%CaCO3、0.03%K2HPO4、0.03%KH2PO4、0.03%NaCI。
以上比例均 为重量百分比(W/W)。
这里应特别指出的是,培养基中的大豆或大豆芽蒸煮液主要并不是作为氮源和/或碳源 加入的。
培养基中加入大豆或大豆芽蒸煮液的目的主要在于为益生菌培养液提供或补充大 豆异黄酮、可溶性纤维及大豆寡糖(如水苏糖和棉籽糖)。
已知大豆异黄酮类化合物(包 括大豆甙元、染料木黄酮及大豆黄素)作为植物雌激素,具有抗自由基、降低血脂、减小 心血管疾病的危险性、防止绝经期女子内分泌失调引起的骨质疏松等作用。
大豆芽浸出液 中所含有的可溶性食物纤维可阻止肠道内中性脂肪及胆固醇的吸收、促进胃肠蠕动、防止 便秘并延缓或抑制碳水化合物的吸收。
另外,大豆芽浸出液中所含有的大豆寡糖可被肠道 乳酸菌分解利用,但几乎不被肠道有害菌利用,从而有利于纠正肠道菌群失调。
总之,以 大豆或大豆芽蒸煮液作为益生菌培养基成分和本发明营养组合物的主要成分之一,代表了 本发明技术特征的一个重要方面。
经检测,按本发明方法制得的益生菌液体培养物中所含 大豆异黄酮和可溶性纤维的浓度分别为20-40μg/ml和30-100μg/ml。
为了制备作为培养基主要组分的大豆或大豆芽蒸煮液,首先将新鲜的成熟大豆在约2 倍体积的温水中浸泡5-6小时,以使大豆组织吸水膨胀。
然后转置于25-27℃环境下保温60-72 小时,以使大豆生长出长约3-8厘米的胚芽。
收集发芽或不发芽并吸水膨胀的大豆,按照每 升斤发芽大豆加约3升水的比例向大豆或发芽大豆中加入自来水,并在控制温度约105-121 ℃的高压蒸煮容器内加热30分钟。
加热后,通过双层滤布过滤并收集如此得到的发芽大豆 蒸煮液。
用于本发明的培养基中的另一个主要组分是蛋白酶处理的新鲜牛肉和牛肝组织水解 物。
与现有技术中所使用的常规肉汤不同的是:本发明的肉汤在由材选择上不仅使用牛肉 组织,还加用了富含各种酶类的牛肝脏组织,另外肉汤制备中还使用了从猪或牛胰腺中提 取的粗制胰蛋白酶制剂。
因此,为了制备作为本发明所用培养成分的酶解牛肉汤,首先将 仔细选择的牛肉和牛肝组织按5∶2的重量比混合并绞碎成肉糜。
向其中加入1-1.5倍体积的 水搅拌均匀,并于大约100℃下加热约60分钟。
然后使温度下降至38-41℃,向其中加入约1% (V/V)按下述方法制备的粗胰蛋白酶制剂。
在pH7-9条件下消化处理约1小时。
酶水解后, 以2000rmp离心收集上清液,得到蛋白酶水解的牛肉汤。
如此制得的肉汤大大增加了细菌 生长所需的营养成分,减少了原料的浪费,而且明显地改善了培养基及发酵后所得细菌培 养物的味道和口感。
为了制备用于水解牛肉和牛肝组织的粗胰酶提取物,可首先制备动物如牛、马、羊或 猪的胰组织匀浆,并按1∶1∶3的比例将所得匀浆与无水乙醇和蒸馏水混合,然后持续搅 拌72小时。
搅拌后离心(500rpm,10分钟)收集上清并用浓盐酸将所得上清液的pH调至5.5, 即得到所需的粗制胰蛋白酶制剂。
作为具体实例,本发明特别选择分布于正常人肠道的不同区段,并且彼此在生理学功 能上具有一定互补性的包括嗜酸性乳杆菌、短双歧杆菌和屎链球菌的正常肠道益生菌,以 制备本发明的含有益生菌共生发酵培养物的营养组合物或营养补充剂。
因此,在不背离本 发明的基本思想和原则的前提下,选用两种或两种以上其他任何属或种的益生菌,制备具 有某种保健功能的营养组合物或营养补充剂,均将落入本发明待批权利要求的范围之内。
一般说来,现有技术中制备包括一种或二种以上益生菌制剂的方法大都是将各个种或 株的细菌分别发酵,当细菌增殖至所期望的浓度后,收集活的和/或死的生物量,混合细菌 悬液或经冻干处理后得到的冻干菌粉,并加入一种或多种营养素或基质成分,制成具有一 定治疗或预防作用的药物或营养组合物或补充剂。
然而,从工业化大规模生产角度上看, 这些方法的一个共同缺点是生产过程繁杂,所花费的成本较高,而且混合各菌种或菌株时 难以找到最适细菌浓度比例。
本发明人在以前使用传统的分别发酵培养屎肠球菌、双歧杆菌和嗜酸性乳杆菌,以生 产含有这三种益生菌的口服营养液的实践中发现,在使用完全相同的培养基及相似的培养 条件的情况下,用于制备所说营养液的屎肠球菌(○)在发酵开始阶段的增殖速度较快,即 第3小时细菌开始迅速增殖,但到第6.5小时细菌数只达到峰值的大约1/2。
第13小时后,细 菌增殖速度又开始缓慢增加,到第23-25小时相对稳定在2.7×108/ml的水平(参见附图1)。
从图1中可以看出,分别单独发酵的嗜酸性乳杆菌(□)和短双歧杆菌(▲)表现有与屎 肠球菌不同的增殖曲线。
嗜酸性乳球菌增殖速度较慢,而且在很快达到较高峰值后即进入 一个平台,然后是相对平缓的上升阶段。
短双歧杆菌的增殖速度亦较为平缓,在大约第15 小时达到峰值,但第16-17小时后很快下降并趋于与屎链球菌相似的稳定增殖水平(约3.0 ×108/ml)。
如图1所示,三种菌在各自单独发酵时,虽然在不同时间达到峰值水平,但进 入稳定状态后,它们各自的细胞增殖数均不超过3.0×108细胞/ml。
因此,三种细菌分别发 酵的方法不仅工艺操作上很麻烦,而且在利用本发明的培养基发酵生产时,细菌增殖数目 也是有限的。
针对现有技术的缺陷,本发明人试图在不改变培养基的情况下,适当调整和控制发酵 过程中培养物的pH值和培养温度,摸索并建立了三种细胞在同一培养基中分级接种、共生 发酵的方法。
现就该方法操作步骤详细描述如下: 首先提供经过灭菌处理的,基本上由重量比25%大豆或大豆芽蒸煮液、2.5%蛋白酶水 解牛肉肉汤,1.3%酵母浸膏、1.3%葡萄糖,1.3蔗糖、0.03%NaCI、0.05%MgSO4、0.05% CaCO3、0.03%K2HPO4和0.03%KH2PO4组成的液体培养基。
在大约pH7.0和温度约40℃条件下,首先按照湿菌体生物量约占培养基总重量0.5-1.0% 的比例向培养基中接种短双歧杆菌,并于约38-40℃的温度下发酵6-8小时。
发酵约6-8小时 后,培养物中短双歧杆菌浓度约达到3.5×108/ml。
然后向培养基中接种约占培养基总重量 0.5-1.0%的嗜酸性乳杆菌湿生物量,搅拌均匀后继续发酵培养4-8小时。
当发酵培养物中嗜 酸性乳杆菌浓度约达到3.0×108/ml,或屎肠球菌与嗜酸性乳球菌的总细菌数约达到6.5× 108/ml,并且发酵培养物的pH降至5.0-5.5时,用0.5N NaOH溶液将pH调至约5.8-6.3,然后 再次按照0.5-1.0%的比例向上述培养物中接入屎肠球菌,并在同样温度下继续培养4-8小 时。
当发酵过程进行约24小时,并且总细菌浓度约达到6×108/ml以上时,通过控制循环水 的温度使发酵系统的温度降低至大约30-34℃,并在该温度下保持2-4小时,以完成反应体 系中活微生物对培养基固有成分的代谢转化。
当培养物的pH降低至大约3.8-4.2时,将体系 的温度升高至49℃左右,杀死所有活的细菌细胞,以得到含有热杀死的嗜酸性乳杆菌、双 歧杆菌和屎肠球菌及它们的代谢产物,并含有由发酵培养基提供的可溶性食物纤维、大豆 异黄酮和大豆寡糖的总发酵培养物。
特别令人惊喜的是,使用本发明的分级接种混合共生发酵方法不仅大大减化了操作步 骤,而且显著地提高了三种益生菌的增殖速率。
如前所述,在使用同样培养基分别发酵培 养三种菌时,尽管它们各自表现有不同的增殖曲线,但培养到大约24-25小时时,每种细菌 的细菌浓度均不超过3.0×108/ml(参见附图1)。
然而,按照本发明的分级接种共生发酵方 法同时培养三种细菌,这些细菌不仅彼此间没有发生相互干扰和共生抑制现象,而且似乎 还可能存在有某种相互协同和生长促进作用。
从图2所示的曲线可以看出,在同一培养基 中依次分级接种三种益生菌,并在同样发酵条件下使三种细菌共生发酵,发酵培养至大约 第24-25小时培养基中的细菌总浓度高达11×108/ml,此浓度显然大大超过了三种细菌分别 发酵时的细菌总浓度的简单相加值。
虽然不拘泥于理论,但我们推测出现这种体外共生增 殖现象的原因可能是由于三种益生菌存在有代谢互补性,即其中一种细菌(如双歧杆菌) 的代谢产物(如乙酸和乳酸)将更有利于后来接种的另一种细菌(如嗜酸性乳杆菌)生长。
另外,发酵过程中适当调整pH也是促成对酸具有不同耐受性的三种细菌在同一环境中共生 的重要因素之一。
有理由相信,本发明的多种益生菌分级接种共生发酵方法也适用于在模 拟的肠道内生存条件下共生培养更多种(例如五种、七种或七种以上)益生菌,以制备含 有多种活的或死的益生菌及其他营养成分的药物或营养组合物。
可以直接将按本发明方法制备含有热杀死的嗜酸性乳杆菌、短双歧杆菌和屎肠球菌的 发酵培养物作为营养补充剂,用于恢复和维持胃肠道正常菌群平衡和/或改善机体特异性或 非特异性免疫功能(包括抗肿瘤免疫功能)。
或者,可在发酵完成之后(约24小时)和升高发酵体系的温度以热杀死细菌之前,向 总细菌培养物内加入适于被所说的细菌或其代谢产物加工或转化的、已知结构或未知结构 的任何天然来源的一种或多种药物或其混合物。
在接近生理状态的发酵条件(37℃,pH6.0) 下,这些天然药物提取物中的一种或多种成分将会在厌氧益生菌或其代谢产物的作用下发 生结构改变或代谢转化,使原来无活性的天然药物化合物转化成有活性的化合物,或者将 某些原来活性较弱的分子修饰成具有较强生物学活性的分子或其集合体,或者使某些原来 具有较强生理毒性的化合物(特别是动物来源的天然化合物)变成有较小毒性或无毒性的 化合物或其集合体。
再者,如本领域技术人员已知的,也可在按本发明的分级接种共生发酵方法完成发酵 步骤之后,离心分离活的细菌,并按常规方法进行冷冻干燥处理,以制备活的益生菌干燥 粉术。
可将这样的粉末与适当的载体或赋形剂混合,制成片剂、乳剂、悬浮剂、胶囊剂、 栓剂、糖浆等不同剂型的活菌制剂。
例如,在制备片剂制剂的情况下,可使用高岭土、滑 石粉等天然矿物粉未或硅酸盐等合成的矿物粉末及蔗糖、乳糖、葡萄糖等糖作为固体载体, 并可根据剂型的不同加入烷基磺酸盐或芳基磺酸盐等乳化剂,木质素、羧甲基纤维素、淀 粉及聚乙烯吡咯烷酮等分散剂,以及硬脂酸镁、滑石粉、硬脂酸、十二烷基磺酸钠等润滑 剂。
益生菌活菌制剂的优选剂型是片剂或粉末剂或栓剂等固态制剂,特别是片剂。
在制剂 固态制剂的情况下,优选的赋形剂是麦芽糖糊精、微晶纤维素、玉米淀粉、果糖、乳糖及 右旋糖。
除了常用的赋形剂外,还可加入柠檬酸钠、碳酸钙、磷酸二氢钙等添加剂。
在制 备片剂药物组合物的情况下,其中还可含有抗胆碱能药、抗组织胺药、止痛药、肾上腺素 能药、抗炎剂、保肝剂、抗脂剂及抗肿瘤剂。
为了提高嗜酸性乳杆菌及其他益生菌的存活率,可在片剂中加入L-胱氨酸、维生素(如 维生素A、C、D和E)、矿物质(如碳酸钙、氧化镁和碳酸镁)、乳糖、乳清蛋白浓缩物、 自溶酵母提取物、脱乙酰甲壳素、卵磷脂及可溶性或非可溶性食物纤维(如苹果纤维或谷 物纤维)。
其中加入L-胱氨酸主要是为了降低固体片剂中的氧,以延长细菌细胞的存活时 间。
加入维生素主要是利用它们的抗氧化剂性质。
已知在矿物质存在下,食物纤维对嗜酸 性乳杆菌的生长具有极好的保护和刺激作用。
自溶的酵母提取物不仅用于刺激细菌在胃肠 道内的生长,而且也是维生素B的主要来源。
有报导认为,维生素D和乳糖对于人胃肠道中 钙的吸收具有重要作用。
另外,乳糖也有利用肠道中嗜酸性乳杆菌的生长。
已有证据表明, 脱乙酰甲壳素作为动物来源的食物纤维,其具有促进肠道内钙吸收的作用。
卵磷脂则主要 作为乳化剂和润滑剂,便于口服片剂的制备。
一般说来,含有冻干的活乳酸菌、双歧杆菌和屎肠球菌的口服片剂每片重约500- 1500mg,较好为750mg,并且每片中细菌重量约占组合物总重量的30-80%。
下列实施例旨在进一步举例说明按本发明方法制备的益生菌制剂的优点及应用,这些 实施例并不以任何方式限制本发明待批权利要求的范围。
实施例1:益生菌共生发酵培养物的制备 本实施例旨在举例说明以分级接种、共生发酵方法,在同一培养基中生产混合的嗜酸 性乳杆菌、短双歧杆菌和屎肠球菌的共生发酵培养物的方法。
1、益生菌菌种的选择 双歧杆菌是人或乳哺动物体内最重要的生理性细菌,主要分布于小肠下部和结肠中。
已知双歧杆菌对于人体的营养、生长、发育及免疫功能均具有重要作用。
嗜酸性乳杆菌是 人体内分布最为广泛的益生菌。
在胃肠道中,该细菌主要分布于迥肠部。
嗜酸性乳杆菌参 予维生素,特别是B族维生素的生物合成,具有辅助食物消化、促进营养素代谢及提高宿 主对乳糖的耐受性等功能。
屎肠球菌主要分布在小肠的盲肠部分,具有帮助胆固醇分解代 谢,降低血胆固醇的作用。
因此,本发明选用短双歧杆菌、嗜酸性乳杆菌和屎肠球菌等三 个常见益生菌菌株,主要是基于它们在人肠道内分布的总体广泛性及其生理学活性的互补 性。
可以从中国典型培养物保藏中心(CCTCC)(中国,武汉)等菌种保藏机构购得,或 者从正常人的粪便或肠粘膜组织中分离得到这些细菌菌株。
2、培养基组成及制备 培养基组成:每升培养基含有25ml蛋白酶水解牛肉肉汤、15g酵母浸膏、250ml大豆或 大豆芽蒸煮液、12g葡萄糖、13g蒸糖、5g MgSO4、3g CaCO3、3g NaCI、3g K2HPO4和3g KH2PO4
基本上按照本说明详细描述部分所述的方法制备用于配制本发明特定培养基的蛋白酶 水解牛肉肉汤和大豆芽(或大豆或发芽大豆)蒸煮液。
将培养基各成分混合均匀后,于121 ℃高压灭菌30分钟备用。
3、分级接种共生发酵方法 将经过灭菌处理的上述培养基100升加热至大约40℃,按生物量湿重约占培养基总重 量约0.8%的比例(W/W)在培养基中接种活化的双歧杆菌1000g(湿重),并于39℃下厌 氧发酵7.5小时。
当发酵过程中pH降至5.0时,持续搅拌下向培养基中滴加适当量的0.5N NaOH以将pH调到大约6.2,并再次向培养基中接种活化的屎肠球菌生物量约950g(湿重), 并搅拌20分钟。
于同样温度下继续发酵培养6小时。
当发酵罐内pH降至大约5.5时,再次向 培养基中加入0.5NNaOH溶液以将调至6.2,然后接种嗜酸性乳杆菌生物量约850g(湿重), 并继续在同样温度下发酵。
当发酵罐内总细菌浓度达到6.5×108/ml以上,并且pH降低到大 约3.5-3.8时,通过控制循环水温度使发酵培养物的温度降低至大约32℃,并保持约2小时, 以完成发酵产物的生物转化。
发酵完成后,根据如此得到的益生菌共生发酵培养物的使用 目的的不同,可以(1)离心收集共生发酵的活的益生菌并冻干之,以制备含有冻干菌粉 的固体药物或营养补充组合物;(2)向包括培养基和活菌及其代谢产物的培养物中加入 待转化的天然药物提取物,以制备具有特定生物学活性和功能的药物组合物;(3)使发 酵培养物的温度升高至大约39℃,热杀死增殖的活菌,离心分离培养物上清后或直接制备 含有益生菌共生发酵产物及细菌碎片的营养补充组合物。
对共生发酵培养物上清的生物化学分析结果显示,培养物上清中水解氨基酸含量达 23.322mg/ml,其中可以满足双歧杆菌和乳杆菌生长所需,并且含有二硫键的胱氨酸含量 为1.8mg/ml(水解的)和0.33mg/ml(游离的)。
共生发酵培养物上清中总糖含量约为0.04 mg/ml,其中除还原糖外,还存在有双歧杆菌等益生菌生长繁殖所需的低聚糖和膳食纤维。
后者在肠道内具有抑制血糖升高,阻止中性脂肪和胆固醇吸收及缓解便秘的作用。
另外, 用乙酸乙酯提取并用HPLC法分析(255nm),测得培养物上清中大豆异黄酮的细菌转化产 物即大豆甙元高达80μg/ml。
再者,培养物上清中还含有多种维生素和一定量的矿物质, 其中主要是B族维生素(约40mg/l)及P、Fe、Zn、Mg、K和Na等矿物质(分别为5.04、5.36、 8.29、88.83、783、283mg/l)。
这些检测结果进一步表明共生发酵培养物上清足可作为培 养基,提供细菌生长所需的全部营养素。
在细菌增殖到一定程度之后,由于菌体代谢产生 大量酸性产物(有机酸),故导致培养体系的pH值下降(pH4.0以下),进而使细菌停止 生长。
实施例2:益生菌培养物对肠道致病菌的体外抑菌和杀菌活性 本实施例旨在举例说明按本发明方法制备的双歧杆菌、嗜酸乳杆菌和屎肠球菌的共生 发酵培养物对某些已知肠道致病菌的体外抑菌和杀菌作用。
1、以弗氏痢疾杆菌、携带耐药质粒的D15痢疾杆菌,多耐药性大肠杆菌及鼠伤寒沙门 氏菌作为靶细菌,以小井法检测本发明的益生菌共生发酵培养物(IV号样品)和按相似方 法制备的单一益生菌发酵培养物(I、II、和III号样品)对这些病原菌的体外抑菌活性。
首先用打孔器在营养琼脂板上打孔(直径6mm),并在各实验孔内加入用生理盐水105倍 稀释的上述病原菌的18小时肉汤培养液。
将平板37℃保温2小时后,向各实验孔内分别加 入0.1ml单独发酵或混合共生发酵的益生菌培养物上清液。
37℃下厌氧保温24小时,然后取 出琼脂板观察并记录加样孔周围的抑菌环直径(mm)。
结果如下列表1所示。
表1共生发酵培养物与单一菌株发酵培养物对肠道致病菌的体外抑菌活性                     试   验       样   品 致病菌                    #I    #II    #III    #IV 弗氏痢疾杆菌           8.0*  -      -       13.0 D15痢疾杆菌            -     -      -       11.5 多耐药大肠杆菌         -     -      -       8.5 伤寒杆菌               -     -      -       10.5 *表中数字为培养物上清的抑菌环直径毫米(mm)数。
从表1中所给出的数据可以看出,在模拟肠道环境的实验条件(病原菌稀释液内含有 0.1%胆盐)下,按本发明方法制备的多株益生菌共生发酵培养液上清对四种常见的肠道致 病菌的抑菌环直径达8.5-13.0mm。
然而,在同样条件下,三种细菌各自的单独培养物上清 则几乎未出现这样的抑菌环。
实验结果表明,按本发明方法制备的益生菌共生发酵培养物 具有十分显著的体外抑菌活性。
2、以常见的肠道致病菌弗氏痢疾杆菌、多耐药大肠杆菌、鼠伤寒沙门氏菌和金黄色 葡萄球菌作为靶细菌,以倾注平板法检测本发明的益生菌共生发酵培养物对这些病原微生 物的体外杀菌活性。
首先,在含有4ml按本发明方法制得的益生菌共生发酵培养物上清的试管内加入约4μl 致病菌悬液105细菌/ml,并于37℃保温约18小时。
预培养后,于试验的0、2、6小时分别取 1ml试验样品加于10ml溶融的营养琼脂中,混合后倾注于玻璃平板上。
将平板置于37℃孵 箱中保温24小时后观察并记录所形成的细菌菌落数。
使用生理盐水(NS)作为对照。
表2益生菌共生发酵培养物对肠道致病菌的体外杀菌活件       伤寒杆菌          痢疾杆菌       大肠杆菌     金黄色葡萄球菌接触时间       +培养物  +NS     +培养物  +NS    +培养物  +S     +培养物   +盐水 0         288*    890     1080     1200   1248     1800   1302      1460 2         0        1120    0        1140   62       1950   1050      1540 6         0        1320    0        1260   0        1920    620      1488 *数值为相应致病菌加益生菌共生发酵培养物(实验组)或生理盐水(对照组)保温不同时间(0.2,6小 时)后,在营养琼脂平板上形成的致病菌菌落数。
从表2所示的结果可以看出,胃肠道致病菌与按本发明方法制备的益生菌共生发酵培 养物接触约2小时后,分散于营养琼脂培养基中的所有沙门氏鼠伤寒杜菌、弗氏痢疾杜菌、 耐药大肠杜菌几乎全部被杀死。
接触约6小时后,对绝大部分对所说的共发酵培养物敏感 性较低的金黄色葡萄球菌也被杀死。
实验结果表明,按本发明方法制备的益生菌共生发酵 培养物表现有十分显著的体外杀菌活性。
实施例3:益生菌共发酵培养物上清对肠道益生菌的体外生长促进作用 本实施例旨在举例说明按本发明方法制备的益生菌共发酵培养物对长双歧杆菌 (B.longum)、两歧双歧杆菌(B.bifidum)和嗜酸性乳杆菌(L.acidcilus)的体外生长促 进作用。
使用长双歧杆菌、两双歧杆菌和嗜酸性乳杆菌作为实验菌,实验菌经活化后按每管0.1ml (接种后培养基细菌浓度为106个/ml)分别接种于(1)常规PTYG培养基(每升培养基含 有胰蛋白胨5g、大豆蛋白胨5g、酵母提取物10g、葡萄糖10g、盐溶液40ml、半胱氨酸盐酸 盐0.5g吐温80 0.1ml、0.1%刃天青1ml);(2)缺少酵母提取物或(3)缺少胰蛋白胨和大 豆蛋白胨,或(4)缺少蛋白胨和酵母提取物,但均以本发明的益生菌共生发酵培养物上 清代替这些成分的PTYG培养基以及单纯的共生发酵培养物上清(作为培养基)中。
接种 后将试管置于37℃下恒温培养24小时。
培养后收集培养液,取1/100稀释液0.1ml制作Hungate 厌氧滚管,并于37℃下继续培养48小时,然后进行菌落计数。
结果如下列表3所示。
表3益生菌共生发酵培养物上清对双歧杆菌及嗜酸性乳杆菌生长的影响 培养基              双歧杆菌     长双歧杆菌    嗜酸性乳杆菌 益生菌共生培养物    1.53×108   1.03×1010   1.04×108全成分PTYG培养基    1.39×108   1.22×1010   8×108缺少酵母提取物的 PTYG共生培养物      2.0×108    1.24×1010   1.2×109缺少蛋白胨的PTYG+ 共生培养物          1.37×108   6.4×109     4.5×108缺少蛋白胨和酵母提取 物的PTYD+其生培养物 1.67×108   9.7×109     3.0×108从表3中所示的数据可以看出,将双歧杆菌和嗜酸性乳杆菌等已知的益生菌接种于不 含任何常规培养基成分的本发明益生菌共生培养物上清中培养48小时后,被接种的细菌数 均增殖到108cfu/ml以上。
另一方面,用本发明的益生菌共生发酵培养物上清代替常规PTYD 培养基中的碳源、氮源及矿物质来源材料,培养后三种被试细菌的细胞数亦在108cfu/ml以 上。
因此可以认为,按本发明方法制备的多种(株)益生菌共生发酵培养物上清对正常人 肠道中的主要益生菌具有明显的生长促进作用。
虽然有关机理尚不明确,但推测这种益生 菌生长促进活性与所说的培养物中含有作为碳源的低聚糖(包括果寡糖、半乳寡糖和大豆 寡糖)(即所谓“双歧因子”)、水解氨基酸(包括胱氨酸等含二硫键的氨基酸)、矿物 质(钙、镁、磷、钾等)、B族维生素(B1、B2、B6)及其他氮源物质有关。
实施例4益生菌共生发酵培养物对小鼠非特异性免疫功能的影响 本实施例旨在借助小鼠腹腔巨噬细胞吞噬试验(体内法)和小鼠迟发型足垫反应试验 观察并评价本发明的益生菌共生发酵培养物对哺乳动物非特异性免疫功能的影响。
1、小鼠腹腔巨噬细胞吞噬试验(体内法) 以体重约20-25g的健康Balb/c小鼠作为动物模型,以鸡红细胞作为被吞噬细胞,基本上按照 文献中已描述的常规方法进行细胞吞噬试验。
简单地说,将动物随机分成实验组和对照组 (每组10只),常规圈养3天后,对实验组动物每天每只灌胃投用按本发明方法制备的益 生菌共生发酵培养物原液(上清)0.5ml,连续投用15天。
对照组动物则饲以同体积的生理 盐水。
15天后,断颈处理动物并收集腹腔吞噬细胞,以生理盐水洗过的鸡红细胞作为靶细 胞,高倍显微镜下计数并记录实验组和对照组动物腹腔巨噬细胞的红细胞吞噬数,并由之 计算巨噬细胞的百分吞噬率(%)和吞噬指数。
结果如下列表4所示。
表4益生菌共生发酵培养物对小鼠腹腔巨噬细胞吞噬能力的影响     组别(n=10)    百分吞噬率(%)      吞噬指数(X±SD)     实验组         88.2±5.51          5.27±0.56     对照组         67.7±8.08          24.2±0.62 2、小鼠迟发型足垫反应 以体重约20-25g的健康昆明种小鼠作为动物模型,按常规方法进行迟发型足垫反应试 验。
简单地说,对分笼圈养的动物连续喂饲按本发明方法制备的益生菌共生发酵培养物共 12天(0.5ml原液/只/天),第13天在小鼠左后足垫内注入0.1ml鸡红血细胞(103细胞/ml)。
96小时后以同样量的鸡红细胞攻击动物右后足垫。
攻击前和攻击后24小时分别在体视显微 镜下测量小鼠右后足垫的厚度,并由之计算出足垫增厚程度(mm)。
试验中使用同样体 积的生理盐水作为对照。
结果如下列表5所示。
表5益生菌共生发酵培养物对小鼠迟发型足垫反应的影响        组别(n=10)             足垫厚度(mm)        实验组                  1.89±0.43*       对照组                  0.98±0.40 *所给出的数值为10只动物的平均数±标准差。
P<0.01。
巨噬细胞吞噬异物的能力代表哺乳动物非特异性免疫功能之一,而迟性型足垫变态反 应则反映哺乳动物的细胞免疫状态。
从表3和4所示的数据可以看出,本发明的益生菌共生 发酵培养物,表现有良好的非特异性免疫功能增强活性,故在临床上有能用作免疫增强剂 使用。
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