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用新的复性方法制备重组人神经生长因子

基本信息

  • 申请号 CN00111220.1 
  • 公开号 CN1334271A 
  • 申请日 2000/07/19 
  • 公开日 2002/02/06 
  • 申请人 王革  
  • 优先权日期  
  • 发明人 王革  
  • 主分类号  
  • 申请人地址 250013山东省济南市历下区青龙后街45号王如秀转 
  • 分类号  
  • 专利代理机构  
  • 当前专利状态 发明专利申请公布 
  • 代理人  
  • 有效性 授权 
  • 法律状态 审查中-公开
  •  

摘要

本发明公开了一种用二硫键异构酶PDI促进变性的重组人神经生长因子(rhNGF)正确折叠并提高其复性率的新型方法。
在rhNGF的复性体系中加入一定比例的PDI,可以使rhNGF中错误配对的二硫键打开并形成正确的二硫键,从而提高复性率,降低异构体比例,简化后续纯化工艺,提高rhNGF产率。
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权利要求书

1、用一种新的复性方法制备重组人神经生长因子(简称rhNGF)。
其特 征在于在变性rhNGF的复性体系中加入二硫键异构酶,以提高rhNGF的复 性率。
2、重组人神经生长因子(rhNGF)的制备工艺,其特征在于经过工程 菌表达→菌体破碎→包含体分离→变性→PDI催化复性→脱盐→阳离子 交换层析等步骤完成。
3、如权利要求2所述的重组人神经生长因子(rhNGF)的变性,其特 征在于用尿素作为变性剂,变性体系含1~10M尿素,5~50mM Tris,
0.5~5mM EDTA,pH7~10。
4、如权利要求2所述的PDI催化的重组人神经生长因子(rhNGF)的 复性,其特征在于PDI为重组人PDI或其它来源的PDI,rhNGF与PDI的 摩尔比为100∶1~10∶1。
5、如权利要求2所述的阳离子交换层析,其特征在于采用CM- Sepharose阳离子交换柱,洗脱条件是0~1M NaCl,pH4~8,最佳洗脱 浓度是0.3~0.4M NaCl。
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说明书

本发明属医药领域中的重组蛋白质药物。
重组人神经生长因子(human nerve growth factor,简称rhNGF)是一 种对正常神经细胞有营养作用,对损伤神经修复机能有调节作用的生物活性因 子,它可维持交感神经和感觉神经的生存,促进神经细胞的分化,决定轴突的 伸展方向。
对促进大脑的发育,神经系统的生长,损伤神经的再生和功能恢复 具有重要作用。
rhNGF可应用于糖尿病性周围神经病变、老年痴呆病、帕金森氏病、面 神经炎,以及神经损伤(包括脊髓损伤、高位截瘫、断指再植、脑损伤,周围 神经损伤等中枢及外围神经系统的损伤)等神经系统疾病,是目前可应用于临 床的神经系统蛋白质因子。
人神经生长因子在人体中含量甚微,天然来源几乎 不可能,以前人们试图从小鼠中提取鼠源NGF,但存在种属差异及致病微生物 污染的问题。
因此,用基因工程的方法生产重组人神经生长因子是唯一的选择。
因为rhNGF不含糖基化位点,可以用大肠杆菌来表达。
我们构建了高 效表达rhNGF的工程菌以表达rhNGF。
由于rhNGF含有三对二硫键,用细 菌表达的rhNGF形成包含体形式,溶解变性后用常规方法复性很难正确折 叠和复性成活性形式,产率很低。
这是由于组成三对二硫键的六个半胱 氨酸在复性时错误配对造成的。
为了提高变性rhNGF的复性率,我们发明 了用二硫键异构酶(PDI)促进复性的生产工艺,我们在rhNGF的复性体 系中加入重组人二硫键异构酶(rhPDI),使错配的二硫键打开重新形成 正确的二硫键,从而提高复性率,最终提高rhNGF的产率,降低成本,并 可应用于工业化生产。
本发明的原理:二硫键异构酶PDI可以特异性地作用于蛋白分子中 错配的二硫键,打开该错配二硫键,并促进其形成正确配对的二硫键, 完成分子结构重排,形成正确活性形式,达到复性目的。
本发明的目的:使用二硫键异构酶催化变性的rhNGF形成正确配对的 二硫键,从而复性成正确的有活性的分子构型。
这样可提高rhNGF的复性 率,降低异构体比例,简化后续纯化步骤,由此提高rhNGF的产率,降低 生产成本。
技术方案:用工程菌表达rhNGF→菌体破碎→包含体分离→尿素变性 溶解→在复性体系中按一定比例加入重组人PDI以催化rhNGF的复性→脱 盐→阳离子交换层析。
经上述步骤,即可制备得到纯度大于95%,具天然 生物学活性的rhNGF。
最佳实施例: rhNGF的复性体系如下:25mM Tris,pH7~10,1mM EDTA,rhNGF蛋 白浓度0.1~1mg/ml。
在此复性体系中加入重组人二硫键异构酶PDI,使 rhNGF与PDI的摩尔比为100∶1~10∶1。
在加入PDI的复性体系中进行复 性,rhNGF的复性率比不加PDI时有显著提高,二硫键错配造成的异构体 比例大大降低,rhNGF的终产率也相应提高。
rhNGF制备方法如下:将表达后的rhNGF工程菌菌体离心收集,悬浮 于25mM Tris,pH8.0,超声破碎并10000×g,30分钟离心后制得rhNGF 包含体。
包含体用8M尿素,25mM Tris,1mM EDTA充分溶解后,10000 ×g,30分钟离心,取上清,即为变性的rhNGF。
将变性的rhNGF逐滴滴入己加PDI的复性体系中,使得rhNGF终浓度 达到0.5mg/ml,室温下放置过夜。
将上述复性液用脱盐柱脱盐后,再经 过CM-Sepharose柱层析纯化(平衡缓冲:20mM PB,pH6.0,0~1MNaCl线性梯度洗脱),得到纯度>95%,具天然生物学活性的rhNGF。
本发明的优点:本发明提供了一种用PDI促进变性的rhNGF折叠复性 以制备rhNGF的新型工艺方法。
它与传统的rhNGF生产工艺相比具有以下 特点:①变性rhNGF的复性率提高。
②复性体系中rhNGF蛋白浓度可以提 高,复性体积减少,操作方便,节省试剂。
③异构体比例低,简化了后 续纯化步骤。
④提高rhNGF产率,降低生产成本。
上述优势使本发明具有 明显的技术创新性与工艺先进性,成本降低,更适合于工业化生产rhNGF。
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