用哌啶类氮氧化物防治皮肤的氧化性损伤

一种哌啶类氮氧化物,其特征是用哌啶类氮氧化物防治皮肤的氧化性损伤,并制成相应的化妆品或药物。
所述的哌啶类氮氧化物为N－氧—2,2,6,6－四甲基哌啶、N－氧－4－羟基－2,2,6,6－四甲基哌啶和N－氧－4－氨基－2,2,6,6－四甲基哌啶。
这些哌啶半衰期长,分子量小,膜通透性好,不易与H展开

1.一种哌啶类氮氧化物，其特征是用哌啶类氮氧化物防治皮肤的氧化性 损伤，并制成相应的化妆品或药物。

2.如权利要求1所述的哌啶类氮氧化物，其特征是该哌啶氮氧化物为N -氧-2，2，6，6-四甲基哌啶、N-氧-4-羟基-2，2，6，6-四甲基哌啶和N- 氧-4-氨基-2，2，6，6-四甲基哌啶。
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本发明涉及一种哌啶类氮氧化物，特别是涉及一种能防治皮肤的氧化性 损伤的哌啶类氮氧化物。
有机氮氧化物是一种含有 基的杂环化合物，主要包括三类：哌啶 类，恶唑脘类及吡咯类。
哌啶类氮氧化物能自由出入细胞，主要作为一种生 物物理标记物，用于检测细胞代谢，细胞内pH值，O₂水平，蛋白、脂类的流 动性及细胞结构等。
另外，哌啶类氮氧化物还用做核磁共振的对比显影剂。
近年来，哌啶类氮氧化物的抗氧化性损伤功能引起国际学者的注意，国外学 者将哌啶类氮氧化物应用于细菌、培养的心肌细胞及中国仓鼠细胞、离体心 脏灌注、活体动物等研究体系中，观察其抗氧化损伤作用。
已有的研究结果 提示哌啶类氮氧化物可在多个环节阻断自由基链式反应发生，防止过氧化损 伤。
目前国内外尚未有将哌啶类氮氧化物应用于皮肤的氧化性损伤的研究工 作报道。
更未应用到化妆品或临床治疗中。
只有超氧化物歧化酶(superoxide dismutase SOD)已开始应用于临床治疗某些皮肤疾病。
然而SOD半衰期短、 分子量大、膜通透性差、不易向病灶部位穿透，故抗自由基作用有局限性。
目前SOD在皮肤科的应用处于停滞阶段。
本发明的目的是提出用哌啶类氮氧化物防治皮肤的氧化性损伤，以弥补 现有技术的上述不足。
一种哌啶类氮氧化物，其特征是用哌啶类氮氧化物防治皮肤的氧化性损 伤，并制成相应的化妆品或药物。
本发明所涉及的哌啶半衰期长，分子量小，膜通透性好，不易与H₂O₂及 O₂反应，在生理环境和细胞代谢中相对稳定，毒性低，将哌啶类氮氧化物制 成溶液或霜剂擦涂在皮肤上就能快速地防治人表皮细胞的氧化性损伤，而且 价格低廉。
下面通过实施例说明本发明。
实施例一哌啶类氮氧化物对培养的人的表皮细胞氧化性损伤的保护作 用。
1.哌啶类氮氧化物溶液的配制 在室温下称取三种哌啶类氮氧化物晶体：N-氧-2，2，6，6-四甲基哌啶 (TEMPO)、N-氧-4-羟基-2，2，6，6-四甲基哌啶(TEMPOL)、N-氧-4- 氨基-2，2，6，6-四甲基哌啶(TEMPAMINE)，分别放入溶剂瓶中，后两种加入 适量的双蒸水配成重量百分数为0.3-0.6的多种浓度的溶液，置4℃冰箱中 保存备用。
TEMPO是脂溶性的，用10％的乙醇溶液配制。
2.人表皮细胞的培养 取正常健康男性的包皮在无菌条件下经胰蛋白酶消化，将表皮细胞与其 下方的真皮组织分离，得到的表皮细胞用无血清培养液在24孔培养板中培养。
待培养的人表皮细胞生长至单层融合时，吸除培养液，每孔加入0.9ml新鲜 基础培养液。
实验分四组：正常对照组、单纯加H₂O₂组、TEMPO+H₂O₂组和 TEMPOL+H₂O₂组。
每组至少6孔。
加样顺序为：TEMPO+H₂O₂组和TEMPOL+H₂O₂组 每孔加入事先配好的TEMPO或TEMPOL溶液50μl，使其在培养液中浓度为4mM， 然后加入H₂O₂50μl，使其在培养液中浓度为1.5mM；H₂O₂组加入H₂O₂50μl， 终浓度为1.5mM。
正常对照组和单纯加H₂O₂组每孔相应加入磷酸缓冲液(PBS) 以平衡；使每孔总反应体积为1ml。
3.观察指标 (1)观察细胞存活率：通过台盘蓝染色计数细胞存活数量。
(2)测定细胞内谷胱甘肽(GSH)含量，谷胱甘肽过氧化物酶(GSH-Px)、 超氧化物歧化酶(SOD)和过氧化氢酶(CAT)的活性： 将上述反应完毕的细胞超声裂解，离心，取上清液，用DTNB比色法测定 细胞内GSH含量及GSH-Px的活性。
用羟胺法及单纯比色法测定SOD和CAT活 性。
4.观察结果： (1)哌啶类氮氧化物对H₂O₂引起的人表皮细胞的损伤有保护作用 H₂O₂可破坏培养的人表皮细胞，引起细胞存活率下降。
浓度为1.5mM的H₂O₂作用于培养的人表皮细胞后，表皮细胞的存活率(％)下降为45.00±6.16，正 常对照组为93.33±4.97，二者比较有极显著性差别(P＜0.001)。
如果预先在 培养液中加入TEMPO或TEMPOL(4mM)，可抑制H₂O₂引起的细胞损伤，分别提高 细胞的存活率(％)为88.00±7.62及88.00±6.05，这种差异有极显著性(P＜ 0.001)。
(2)哌啶类氮氧化物对H₂O₂损伤的人表皮细胞内GSH含量的影响 正常对照组表皮细胞内GSH含量(％)为100±15.14。
浓度为1.5mM 的H₂O₂，作用于培养的表皮细胞后，表皮细胞内GSH含量(％)降为67.17± 9.33，与正常对照组比较有极显著性差别(P＜0.001)。
预先加入TEMPO或 TEMPOL(4mM)，可分别提高表皮细胞内GSH含量(％)为87.17±9.62及90.17 ±7.70，与H₂O₂组比较，有极显著性差别(P＜0.01)。
(3)氮氧化物对H₂O₂损伤的人表皮细胞内GSH-Px，SOD和CAT活 性的影响 (A)人表皮细胞内GSH-Px活性的变化 浓度为1.5mM的H₂O₂，作用于培养的人表皮细胞后，表皮细胞内 GSH-Px活性(％)为65.17±8.06，正常对照组为100±11.83，二者比较有极显 著性差别(P＜0.001)。
TEMPO+H₂O₂组细胞内GSH-Px活性(％)为89.00±7.82， TEMPOL+H₂O₂组细胞内GSH-Px活性(％)为88.67±7.20，二者与单纯加H₂O₂组比较，有极显著性差别(P＜0.001)， (B)人表皮细胞内SOD活性的变化 H₂O₂(1.5mM)可使培养的表皮细胞内SOD活性(％)降为72.33±9.48，正 常对照组为100±11.17，二者比较有极显著性差别(P＜0.001)。
TEMPO+H₂O₂组SOD活性(％)为89.00±9.17，TEMPOL+H₂O₂组SOD活性(％)为89.00±8.49， 二者与单纯加H₂O₂组比较，有极显著性差别((P＜0.01)。
(C)人表皮细胞内CAT活性的变化 H₂O₂(1.5mM)可使培养的表皮细胞内CAT活性(％)降为77.33±5.24，正 常对照组为100±9.32，二者比较有极显著性差别(P＜0.001)。
TEMPO+H₂O₂组CAT活性(％)为90.83±8.11，TEMPOL+H₂O₂组CAT活性(％)为91.33±6.22， 二者与单纯加H₂O₂组比较，有极显著性差别(P＜0.01)。
     所得的结论 本实验采用无血清技术培养人皮肤表皮细胞，用加入H₂O₂的方法造成表 皮细胞的氧化性损伤，研究了哌啶类氮氧化物对培养的人皮肤表皮细胞氧化 性损伤的保护作用，可得出如下结论： 1.加入H₂O₂可造成培养的人表皮细胞氧化性损伤，细胞存活率降低和 抗氧化物质GSH含量降低，抗氧化酶GSH-Px、SOD、CAT活性减弱。
2.加入哌啶类氮氧化物(TEMPO和TEMPOL)对H₂O₂损伤造成的人表 皮细胞存活率降低有抑制作用，说明哌啶类氮氧化物对人表皮细胞的氧化性 损伤有保护作用。
3.哌啶类氮氧化物(TEMPO和TEMPOL)对H₂O₂损伤引起的人表皮细 胞内GSH含量降低，GSH-Px，SOD和CAT活性减弱有抑制作用。
4.哌啶类氮氧化物对培养的人表皮细胞氧化性损伤的保护作用与保护 抗氧化酶活性、提高细胞抗氧化防御系统水平，平衡细胞内氧化还原状态有 关。
5.哌啶类氮氧化物在对抗氧化性损伤方面独特的性能，使它有可能成为 一种具有良好开发应用前景的抗氧化剂。
实施例二哌啶类氮氧化物对紫外线照射引起的皮肤损伤的保护作用 紫外线照射能引起皮肤的衰老、皮炎、皮肤癌及色素斑等。
现已公认紫 外线对皮肤的损伤与紫外线照射皮肤后诱发皮肤内氧自由基的产生有关。
本 实验探讨了哌啶类氮氧化物对紫外线引起的豚鼠的皮肤损伤的保护作用。
1.N-氧-4-氨基-2，2，6，6-四甲基哌啶(TEMPAMINE)溶液的配制 在室温下称取适量的TEMPAMINE放入溶剂瓶中，然后加入适量的双蒸 水配成重量百分浓度为3.5％及0.35％的溶液置4℃冰箱中保存备用。
2.紫外线照射模型 36只白色豚鼠，雌雄各半，分成4组：(1)紫外线照射组；(2)高浓 度TEMPAMINE组；(3)低浓度TEMPAMINE组；(4)对照组。
照射前豚 鼠的皮肤脱毛5×6cm²。
每次照射前于氮氧化物组的豚鼠背部脱毛区外涂上 述氮氧化物的溶液，然后照射紫外线。
每次照射50分钟，共照射14周。
3.观察指标 (1)皮肤的皱纹数 (2)组织学改变 (3)丙二醛及羟脯氨酸的含量：丙二醛为皮肤发生氧化性损伤后的最终 分解产物，通过测定丙二醛的含量，可以间接推断皮肤氧化性损伤的程度。
羟脯氨酸是皮肤的主要胶原蛋白成分，皮肤发生老化时，羟脯氨酸的含量降 低。
4.观察结果     (1)皮肤皱纹数 与对照组比较，其余三组在紫外线照射后第四周开始，皮肤皱纹数逐渐 高于对照组且有显著性差异，但两组外涂氮氧化物的豚鼠背部皮肤的皱纹数 要少于单纯紫外线照射组。
这种差异从照射后第四周开始出现一直持续到第 十四周实验结束。
差异有显著性意义(P＜0.001)。
两种不同浓度的哌啶类氮 氧化物比较，从第八周开始，高浓度组的皱纹数显著低于低浓度组(P＜0.001)。
(2)丙二醛含量 紫外线照射14周后，对照组豚鼠皮肤中丙二醛含量为502.7±104.3， 紫外线照射组为969.3±97，低、高浓度哌啶类氮氧化物组丙二醛含量分别为 509.9±6.7及496.8±88.8与单纯紫外线照射组比较有极显著性差异 (P＜0.001)。
(3)羟脯氨酸含量 紫外线照射14周后，对照组豚鼠皮肤中羟脯氨酸含量为5.70±0.14， 紫外线照射组为5.10±0.40，低、高浓度哌啶类氮氧化物组羟脯氨酸的含量 分别为5.52±0.22及5.68±0.35，与单纯紫外线照射组比较有极显著性差异 (P＜0.001)。
(4)组织学改变 与对照组比较，单纯紫外线照射组豚鼠的表皮变薄，真皮内弹力纤维变 形，胶原纤维断裂，周围淋巴细胞浸润。
而在哌啶类氮氧化物组，真皮内弹 力纤维及胶原纤维的改变较单纯紫外线组轻。
5.所得结论 (1)紫外线照射能引起豚鼠皮肤皱纹数明显增多，皮肤内丙二醛含量 升高，羟脯氨酸含量降低。
组织学上表现为退行性变。
(2)外涂哌啶类氮氧化物能够减少皮肤内丙二醛的含量，升高羟脯氨 酸的含量，改善组织学变化。
(3)哌啶类氮氧化物水溶液能预防紫外线照射引起的皮肤损伤。
实施例三哌啶类氮氧化物霜剂对紫外线照射引起的皮肤损伤的保护作 用 霜剂是最适合于化妆品和外用药物的剂型，本实验探讨了哌啶类氮氧化 物霜剂对紫外线引起的豚鼠的皮肤损伤的保护作用。
1.N-氧-4-氨基-2，2，6，6-四甲基哌啶(TEMPAMINE)霜剂的配制 在室温下称取适量的TEMPAMINE放入溶器中，然后加入适量的霜剂基 质，重量百分浓度为2％。
2.紫外线照射模型 30只豚鼠，雌雄各半，分成3组：(1)紫外线照射组；(2)TEMPAMINE 组；(3)对照组(不照射)。
照射前豚鼠背部脱毛，范围5×6cm²。
每次照 射前于TEMPAMINE组的豚鼠背部脱毛区外涂上述霜剂适量，然后照射紫外 线。
每次照射50分钟，共照射14周。
3.观察指标     (1)皮肤的皱纹数 (2)丙二醛及羟脯氨酸的含量 (3)组织学改变 4.观察结果 (1)皮肤皱纹数 对照组豚鼠脱毛区皮肤皱纹数无变化，其它两组豚鼠脱毛区皮肤皱纹数 从第四周开始逐渐增多，但外涂TEMPAMINE组豚鼠脱毛区皮肤皱纹数增加 数目明显低于不涂该霜剂组，至第14周实验结束时，两组的差别更明显，统 计学处理有极显著差异(P＜0.001)。
(2)丙二醛含量 紫外线照射14周后，对照组豚鼠皮肤中丙二醛含量为501.6±102.1， 紫外线照射组为964.1±93，TEMPAMINE保护组为476.6±83.7，与单纯紫 外线照射组比较有极显著性差异(P＜0.001)。
(3)羟脯氨酸含量 紫外线照射14周后，对照组豚鼠皮肤中羟脯氨酸含量为5.72±0.12， 紫外线照射组为5.09±0.3，TEMPAMINE组为5.67±0.34，与单纯紫外线照 射组比较有极显著性差异(P＜0.001)。
(4)组织学改变 与对照组比较，单纯紫外线照射组豚鼠的表皮变薄，真皮内弹力纤维变 形，胶原纤维断裂，周围淋巴细胞浸润。
而TEMPAMINE保护组豚鼠真皮内 弹力纤维及胶原纤维的改变较单纯照射紫外线组明显轻微。
   5.所得结论     外涂氮氧化物霜剂能保护皮肤，明显减轻紫外线照射引起的皮肤损伤。
本发明所涉及的哌啶类氮氧化物又称为“坦波尔”。
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