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单一聚合度的甘露糖醛酸的制备方法及应用

基本信息

  • 申请号 CN00111368.2 
  • 公开号 CN1341665A 
  • 申请日 2000/09/07 
  • 公开日 2002/03/27 
  • 申请人 青岛海洋大学  
  • 优先权日期  
  • 发明人 管华诗 刘岩 江晓路  
  • 主分类号  
  • 申请人地址 266003山东省青岛市鱼山路5号 
  • 分类号  
  • 专利代理机构 青岛海昊专利事务所 
  • 当前专利状态 发明专利申请公布 
  • 代理人 崔清晨 
  • 有效性 发明公开 
  • 法律状态
  •  

摘要

一种单一聚合度的甘露糖醛酸的制备方法,包括使褐藻酸钠溶于水,加入褐藻胶裂合酶进行反应,用沸水浴加热使酶失活,离心后除去沉淀杂质,将溶液调pH,离心除去产生的沉淀物,用碱液溶解并调pH,加入乙醇产生沉淀,干燥后用离子交换色谱柱进行分离,用洗脱液洗脱,其特征是所述的将溶液的调pH范围为2.5~3.2,所述的洗脱液为醋酸钠的梯度洗脱液,所述的酶是由弧菌产生的专一性褐藻胶裂合酶。
本产品是具有抗肿瘤活性,用于开发抗肿瘤药物。
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权利要求书


1.一种单一聚合度的甘露糖醛酸的制备方法,包括使褐藻酸钠溶于水, 加入褐藻胶裂合酶进行反应,用沸水浴加热使酶失活,离心后除去沉淀杂质, 将溶液调pH,离心除去产生的沉淀物,用碱液溶解并调pH,加入乙醇产生沉 淀,干燥后用离子交换色谱柱分离各单一聚合度的甘露糖醛酸混合物,将甘露 糖醛酸混合物用洗脱液洗脱,分步收集洗脱液组分,分别加入乙醇进行沉淀, 脱盐后冻干,其特征是所述的将溶液调pH的范围为2.5~3.2,所述的洗脱液为 醋酸钠的梯度洗脱液,所述的酶是由弧菌产生的专一性褐藻胶裂合酶。
2一种单一聚合度的甘露糖醛酸,其特征是具有抗肿瘤活性,用于开发 抗肿瘤药物。
3如权利要求1所述的方法,其特征是所述的甘露糖醛酸的单一聚合度 分别为2~12。
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说明书

本发明涉及一种有机聚合物,特别是涉及一种具有抗肿瘤活性的单一聚合 度的甘露糖醛酸。
在一日本专利:(06172375)中公开了一种用鲍鱼丙酮粉提取物制备甘露糖醛 酸的方法,该鲍鱼丙酮粉提取物中含有甘露糖醛酸裂合酶。
这是一种应用酸水 解和酶解制备聚合度2~7的寡聚甘露糖醛酸的方法,其分离效果不佳。
本发明的目的是提供一种制备过程简单,分离效果好的单一聚合度的甘露 糖醛酸的制备方法,并且该产品具有抗肿瘤活性,可用于开发抗肿瘤药物。
一种单一聚合度的甘露糖醛酸的制备方法,包括使褐藻酸钠溶于水,加 入褐藻胶裂合酶进行反应,用沸水浴加热使酶失活,离心后除去沉淀杂质,将 溶液调pH,离心除去产生的沉淀物,用碱液溶解并调pH,加入乙醇产生沉淀, 干燥后用离子交换色谱柱分离各单一聚合度的甘露糖醛酸混合物,将甘露糖醛 酸混合物用洗脱液洗脱,分步收集洗脱液组分,分别加入乙醇进行沉淀,脱盐 后冻干,其特征是所述的将溶液调pH范围为2.5~3.2,所述的洗脱液为醋酸钠 的梯度洗脱液,所用褐藻胶裂合酶是由弧菌产生的。
一种单一聚合度的甘露糖醛酸,其特征是具有抗肿瘤活性,用于开发抗 肿瘤药物。
本发明的制备方法分离效率高,制出的各种单一聚合度的甘露糖醛酸具有 不同程度的抗肿瘤活性,可用于开发成抗肿瘤药物。
下面通过实施例说明本发明。
取5g褐藻酸钠溶于100ml水,加入5单位(褐藻胶裂合酶的酶活力单 位为每min使0.2%的褐藻胶溶液吸光度增加1所需的酶量为一个酶活单位。
) 由弧菌产生的褐藻胶裂合酶液,该酶的生产方法己在00111178.7号在先申请中 叙述过了。
在28℃下反应,直到230nm吸光值不再变化,然后沸水浴加热使 酶失活,冷却后离心去杂质,将上清液调pH2.85,离心去掉沉淀,用4mol/L的 NaOH调pH到7,加入乙醇使产品沉淀,干燥后得到不同聚合度的甘露糖醛 酸混合物。
用Q-sepharose fast flow阴离子交换色谱柱分离各单一聚合度的甘 露糖醛酸。
色谱柱先用0.1mol/LpH7.5的醋酸钠缓冲液起始洗脱液平衡好,再 将1g上述制备的甘露糖醛酸溶于起始缓冲液上色谱柱,用0.1~1的醋酸钠梯 度洗脱液洗脱,用230nm的紫外检测器检测洗脱下来的甘露糖醛酸含量,分 步收集各洗脱组分,脱盐后分别加入乙醇沉淀出甘露糖醛酸,干燥后得到2~12 不同聚合度的甘露糖醛酸。
采用本方法可以制备出聚合度为2~12的甘露糖醛酸。
这些寡糖用高效阴 离子交换色谱(high performance anion exchange chromatography HPAEC)检测 为单峰,说明为单一聚合度。
用噻唑蓝(TTM)实验方法测定了用本发明的方法制备的各单一聚合度 的甘露糖醛酸的抗肿瘤活性。
实验时将癌细胞以10%小牛血清(FCS)的 RPMI1640培养基配成104个/ml悬液,于37℃,5%CO2,100μl/孔(96孔板) 抚育24h,各组对应加三聚甘露糖醛酸,使其浓度分别为1,10,100ug/ml,空 白组对应加培养基,每组5个平行孔,培养24h后加入5mg/ml的TTM 20ul, 培养4h,去上清液加150ul二甲基亚砜(DMSO),用酶标仪测定570nm,(630nm 为设定波长)吸光值。
所用的癌细胞株为Ovcar-3人卵巢癌细胞。
用此方法测 得三聚甘露糖醛酸100ug/ml的剂量时的抑瘤率为18.6%。
其他各种聚合度的甘 露糖醛酸也以此方法测定了抑瘤率,其结果类似。
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