单一聚合度的甘露糖醛酸的制备方法及应用

一种单一聚合度的甘露糖醛酸的制备方法,包括使褐藻酸钠溶于水,加入褐藻胶裂合酶进行反应,用沸水浴加热使酶失活,离心后除去沉淀杂质,将溶液调pH,离心除去产生的沉淀物,用碱液溶解并调pH,加入乙醇产生沉淀,干燥后用离子交换色谱柱进行分离,用洗脱液洗脱,其特征是所述的将溶液的调pH范围为2.5～3.2,所述的洗脱液为醋酸钠的梯度洗脱液,所述的酶是由弧菌产生的专一性褐藻胶裂合酶。
本产品是具有抗肿瘤活性,用于开发抗肿瘤药物。
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1.一种单一聚合度的甘露糖醛酸的制备方法，包括使褐藻酸钠溶于水， 加入褐藻胶裂合酶进行反应，用沸水浴加热使酶失活，离心后除去沉淀杂质， 将溶液调pH，离心除去产生的沉淀物，用碱液溶解并调pH，加入乙醇产生沉 淀，干燥后用离子交换色谱柱分离各单一聚合度的甘露糖醛酸混合物，将甘露 糖醛酸混合物用洗脱液洗脱，分步收集洗脱液组分，分别加入乙醇进行沉淀， 脱盐后冻干，其特征是所述的将溶液调pH的范围为2.5～3.2，所述的洗脱液为 醋酸钠的梯度洗脱液，所述的酶是由弧菌产生的专一性褐藻胶裂合酶。
2一种单一聚合度的甘露糖醛酸，其特征是具有抗肿瘤活性，用于开发 抗肿瘤药物。
3如权利要求1所述的方法，其特征是所述的甘露糖醛酸的单一聚合度 分别为2～12。
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本发明涉及一种有机聚合物，特别是涉及一种具有抗肿瘤活性的单一聚合 度的甘露糖醛酸。
在一日本专利：(06172375)中公开了一种用鲍鱼丙酮粉提取物制备甘露糖醛 酸的方法，该鲍鱼丙酮粉提取物中含有甘露糖醛酸裂合酶。
这是一种应用酸水 解和酶解制备聚合度2～7的寡聚甘露糖醛酸的方法，其分离效果不佳。
本发明的目的是提供一种制备过程简单，分离效果好的单一聚合度的甘露 糖醛酸的制备方法，并且该产品具有抗肿瘤活性，可用于开发抗肿瘤药物。
一种单一聚合度的甘露糖醛酸的制备方法，包括使褐藻酸钠溶于水，加 入褐藻胶裂合酶进行反应，用沸水浴加热使酶失活，离心后除去沉淀杂质，将 溶液调pH，离心除去产生的沉淀物，用碱液溶解并调pH，加入乙醇产生沉淀， 干燥后用离子交换色谱柱分离各单一聚合度的甘露糖醛酸混合物，将甘露糖醛 酸混合物用洗脱液洗脱，分步收集洗脱液组分，分别加入乙醇进行沉淀，脱盐 后冻干，其特征是所述的将溶液调pH范围为2.5～3.2，所述的洗脱液为醋酸钠 的梯度洗脱液，所用褐藻胶裂合酶是由弧菌产生的。
一种单一聚合度的甘露糖醛酸，其特征是具有抗肿瘤活性，用于开发抗 肿瘤药物。
本发明的制备方法分离效率高，制出的各种单一聚合度的甘露糖醛酸具有 不同程度的抗肿瘤活性，可用于开发成抗肿瘤药物。
下面通过实施例说明本发明。
取5g褐藻酸钠溶于100ml水，加入5单位(褐藻胶裂合酶的酶活力单 位为每min使0.2％的褐藻胶溶液吸光度增加1所需的酶量为一个酶活单位。
) 由弧菌产生的褐藻胶裂合酶液，该酶的生产方法己在00111178.7号在先申请中 叙述过了。
在28℃下反应，直到230nm吸光值不再变化，然后沸水浴加热使 酶失活，冷却后离心去杂质，将上清液调pH2.85，离心去掉沉淀，用4mol/L的 NaOH调pH到7，加入乙醇使产品沉淀，干燥后得到不同聚合度的甘露糖醛 酸混合物。
用Q-sepharose fast flow阴离子交换色谱柱分离各单一聚合度的甘 露糖醛酸。
色谱柱先用0.1mol/LpH7.5的醋酸钠缓冲液起始洗脱液平衡好，再 将1g上述制备的甘露糖醛酸溶于起始缓冲液上色谱柱，用0.1～1的醋酸钠梯 度洗脱液洗脱，用230nm的紫外检测器检测洗脱下来的甘露糖醛酸含量，分 步收集各洗脱组分，脱盐后分别加入乙醇沉淀出甘露糖醛酸，干燥后得到2～12 不同聚合度的甘露糖醛酸。
采用本方法可以制备出聚合度为2～12的甘露糖醛酸。
这些寡糖用高效阴 离子交换色谱(high performance anion exchange chromatography HPAEC)检测 为单峰，说明为单一聚合度。
用噻唑蓝(TTM)实验方法测定了用本发明的方法制备的各单一聚合度 的甘露糖醛酸的抗肿瘤活性。
实验时将癌细胞以10％小牛血清(FCS)的 RPMI1640培养基配成10⁴个/ml悬液，于37℃，5％CO₂，100μl/孔(96孔板) 抚育24h，各组对应加三聚甘露糖醛酸，使其浓度分别为1，10，100ug/ml，空 白组对应加培养基，每组5个平行孔，培养24h后加入5mg/ml的TTM 20ul， 培养4h，去上清液加150ul二甲基亚砜(DMSO)，用酶标仪测定570nm，(630nm 为设定波长)吸光值。
所用的癌细胞株为Ovcar-3人卵巢癌细胞。
用此方法测 得三聚甘露糖醛酸100ug/ml的剂量时的抑瘤率为18.6％。
其他各种聚合度的甘 露糖醛酸也以此方法测定了抑瘤率，其结果类似。
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