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基本信息
- 申请号 CN00111418.2
- 公开号 CN1108816C
- 申请日 2000/01/05
- 公开日 2003/05/21
- 申请人 复旦大学
- 优先权日期
- 发明人 宋后燕 黄阳滨
- 主分类号
- 申请人地址 200032上海市医学院路138路
- 分类号
- 专利代理机构 上海正旦专利代理有限公司
- 当前专利状态 发明专利权部分无效宣告的公告
- 代理人 吴桂琴
- 有效性 有效专利
- 法律状态 无
权利要求书
1、一种葡激酶的微乳制剂，其特征在于采用葡激酶作为原料， 采用水相、油相、表面活性剂和助表面活性剂混合物作为药物载 体，制备微乳制剂。
2、按权利要求1所述的葡激酶微乳制剂，其特征在于所述的葡 激酶包括：天然葡激酶、重组葡激酶、通过基因突变产生的各种 葡激酶突变体。
3、按权利要求1所述的葡激酶微乳制剂，其特征在于所述的油 相包含长链、中链脂肪酸，长链、中链脂肪酸酯，长链脂肪醇及 上述几种的混合物，包括它们的饱和、不饱和、直链、含支链 形式。
4、按权利要求3所述的葡激酶微乳制剂，其特征在于所述的油 相包含如大豆油、蓖麻油、亚油酸、油酸、单硬脂酸甘油酯、单 油酸甘油酯、中链(C8-C10)脂肪酸的甘油酯、十六醇等。
5、按权利要求1所述的葡激酶微乳制剂，其特征在于所述的表 面活性剂为非离子型表面活性剂、天然表面活性剂、部分阴离子 表面活性剂。
6、按权利要求5所述的葡激酶微乳制剂，其特征在于所述的非 离子型表面活性剂是脂肪酸甘油酯、PEG类衍生物、聚氧乙烯脂 肪醇醚类、聚氧乙烯失水山梨醇脂肪酸酯、山梨醇及失水山梨醇 脂肪酸酯、聚氧乙烯脂肪酸酯类、Vitamin E衍生物类、聚氧烯 烃整体共聚表面活性剂。
7、按权利要求5所述的葡激酶微乳制剂，其特征在于所述的天 然表面活性剂是卵磷脂、豆磷脂、胆甾醇和胆酸类、海藻酸钠等。
8、按权利要求5所述的葡激酶微乳制剂，其特征在于所述的部 分阴离子表面活性剂是二辛基琥珀酰磺酸钠。
9、按权利要求1所述的葡激酶微乳制剂，其特征在于所述的助 表面活性剂是采用聚乙二醇类。
10、按权利要求1所述的葡激酶微乳制剂，其特征在于采取水中 加入高分子物质、高HLB值的表面活性剂和低HLB值的表面活性剂混 合使用、加入O/W型表面活性剂等措施提高水相粘度和微乳对水稀释 的稳定性。
11、按权利要求1所述的葡激酶微乳制剂，其特征在于采用亲脂 性添加剂和固化载体。
12、按权利要求10所述的葡激酶微乳制剂，其特征在于所述的 亲脂性添加剂为硬脂酸钠、十六醇、十八醇、Myverol 18-99、Vitamin E-TPGS等。
13、按权利要求10所述的葡激酶微乳制剂，其特征在于所述的 固化载体为CaSO4、海藻酸、硬脂酸酯、HPC等。
14、一种葡激酶微乳剂的制备方法，其特征在于采用下述步骤： (1)选择油相，若油相是固体的半固体状，熔融或加溶剂溶解，再 往油相内加入抗氧剂。
(2)制备水相，水相中含葡激酶。
(3)选择表面活性剂作乳化剂。
(4)在37℃或室温下，搅拌中把水相滴入含表面活性剂的油相中。
(5)增加微乳粘度或固化微乳，提高微乳稳定性。
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2、按权利要求1所述的葡激酶微乳制剂，其特征在于所述的葡 激酶包括：天然葡激酶、重组葡激酶、通过基因突变产生的各种 葡激酶突变体。
3、按权利要求1所述的葡激酶微乳制剂，其特征在于所述的油 相包含长链、中链脂肪酸，长链、中链脂肪酸酯，长链脂肪醇及 上述几种的混合物，包括它们的饱和、不饱和、直链、含支链 形式。
4、按权利要求3所述的葡激酶微乳制剂，其特征在于所述的油 相包含如大豆油、蓖麻油、亚油酸、油酸、单硬脂酸甘油酯、单 油酸甘油酯、中链(C8-C10)脂肪酸的甘油酯、十六醇等。
5、按权利要求1所述的葡激酶微乳制剂，其特征在于所述的表 面活性剂为非离子型表面活性剂、天然表面活性剂、部分阴离子 表面活性剂。
6、按权利要求5所述的葡激酶微乳制剂，其特征在于所述的非 离子型表面活性剂是脂肪酸甘油酯、PEG类衍生物、聚氧乙烯脂 肪醇醚类、聚氧乙烯失水山梨醇脂肪酸酯、山梨醇及失水山梨醇 脂肪酸酯、聚氧乙烯脂肪酸酯类、Vitamin E衍生物类、聚氧烯 烃整体共聚表面活性剂。
7、按权利要求5所述的葡激酶微乳制剂，其特征在于所述的天 然表面活性剂是卵磷脂、豆磷脂、胆甾醇和胆酸类、海藻酸钠等。
8、按权利要求5所述的葡激酶微乳制剂，其特征在于所述的部 分阴离子表面活性剂是二辛基琥珀酰磺酸钠。
9、按权利要求1所述的葡激酶微乳制剂，其特征在于所述的助 表面活性剂是采用聚乙二醇类。
10、按权利要求1所述的葡激酶微乳制剂，其特征在于采取水中 加入高分子物质、高HLB值的表面活性剂和低HLB值的表面活性剂混 合使用、加入O/W型表面活性剂等措施提高水相粘度和微乳对水稀释 的稳定性。
11、按权利要求1所述的葡激酶微乳制剂，其特征在于采用亲脂 性添加剂和固化载体。
12、按权利要求10所述的葡激酶微乳制剂，其特征在于所述的 亲脂性添加剂为硬脂酸钠、十六醇、十八醇、Myverol 18-99、Vitamin E-TPGS等。
13、按权利要求10所述的葡激酶微乳制剂，其特征在于所述的 固化载体为CaSO4、海藻酸、硬脂酸酯、HPC等。
14、一种葡激酶微乳剂的制备方法，其特征在于采用下述步骤： (1)选择油相，若油相是固体的半固体状，熔融或加溶剂溶解，再 往油相内加入抗氧剂。
(2)制备水相，水相中含葡激酶。
(3)选择表面活性剂作乳化剂。
(4)在37℃或室温下，搅拌中把水相滴入含表面活性剂的油相中。
(5)增加微乳粘度或固化微乳，提高微乳稳定性。
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说明书
微乳是由水相、油相、表面活性剂和助表面活性剂按适当比例 混合后自发形成的各相同性、透明、热力学稳定的分散体系，80年 代后作为药物载体受到医药界的重视，在药物制剂研究及临床方面 的应用日益广泛。
微乳的实质是乳剂的一种，乳滴小于50nm，乳滴均匀地分散在 连续相中。
连续相为油相，分散相为水相的微乳称W/O型微乳；而 连续相为水相，分散相为油相的微乳称O/W型微乳。
根据药物的溶 解特性，药物常分散或溶解于分散相中。
对于水溶性良好的蛋白质， 一般把蛋白质溶解于水相中，形成W/O型微乳。
W/O型微乳的吸收机理有两种方式，一种是拟脂滴吸收方式， 因为微乳乳滴很小，只有20-40nm，若选择适当的表面活性剂和助表 面活性剂，使其稳定性增加，则微乳与微小脂滴很相似，可以以拟 脂滴形式被吸收，即以被动转运方式进入淋巴管，再入血循环；另 一种吸收方式是胞饮，因为外相油膜呈脂性，可以与肠上皮细胞接 触，再加上微乳内含有的表面活性剂可改变细胞膜张力，引起膜内 陷，细胞膜与微乳外相油膜融合，把蛋白质导入胞内。
基于这样的 吸收机制，微乳的吸收量有可能比其它任何一种制剂都大。
微乳作为蛋白质的口服载体，通过对蛋白质的包裹，可以避开 胃酸和胃肠道内各种酶的降解，例如把水溶性良好的胰岛素制成W/O 型微乳，胰岛素溶解于内水相中，外油相可有效把蛋白水解酶拒之 于外。
微乳还具有缓释作用，W/O型微乳犹如水溶性药物的储库， 可使药物持续释放，增加药物的生物利用度、延长药物半衰期。
除了用于降低移植后排斥反应的环孢菌素(cyclosporine A， MW＝1202)微乳外，至今还不见水溶性蛋白质的口服微乳面市。
cyclosporine A是一种含11个氨基酸的环状多肽化合物，不溶于水， 易溶于乙醇，几乎不溶于油，但通过乙醇的介导很好地溶于油中后， 加入O/W型表面活性剂及相应的助表面活性剂，口服，进入胃肠道， 自发形成O/W型微乳，这就是1994年5月Sandoz公司在德国上市 的第二代Sandimmun Neoral软胶囊。
cyclosporine A微乳的成功给 药剂工作者不少启示。
cyclosporine A与一般蛋白质的本质区别在于溶解性，一般蛋 白质呈水溶性，其微乳只能制备W/O型。
因为内水相体积有限，如 占10％左右，和毫微粒一样，蛋白质包裹率约0.5mg/g微乳；同时微 乳制备工艺中需要多种亲脂性物质，如外油相、表面活性剂和助表 面活性剂，这些物质的总量相对水相大得多，以致亲水性的蛋白质 在这样非极性环境中容易变性析出。
W/O型微乳的另一个问题是稳 定性，包括储存稳定性和体内亲水环境中的稳定性。
虽然存在以上 问题，但是微乳仍不啻是口服蛋白质的一种相当有前途的载体。
组织型纤溶酶原激活物(t-PA)、链激酶(SK)、尿激酶(UK)等溶 栓药物广泛应用于临床以后，葡激酶(staphylokinase，Sak)以其 纤维蛋白特异性强、良好的溶栓能力、分子量小等优点日益受到人 们重视。
上述几种药物均以静脉滴注方式给药，用于急性心肌梗塞 等血管栓塞性疾病的急救，溶栓治疗最佳时间是发病6hr内。
但是， 静脉注射必须在医院进行，由此，许多病人失去了溶栓治疗的机会。
本发明的目的是提供一种以葡激酶为原料的，适合于较长期使 用的非静脉滴注预防性药物制剂，提高人血浆中纤溶或抗凝活性， 预防急性心肌梗塞和脑梗塞等血栓性疾病。
能服用方便。
本发明采用葡激酶包括从葡萄球菌中提取的天然葡激酶(有公 开文献报道)、重组葡激酶(recombinant staphylokinase，r-Sak， 专利号为94112105)、通过基因突变产生的葡激酶各种突变体及上述 品种的体外修饰物为原料。
本发明集中于以下几个方面： a.对油相的选择，如长链、中链脂肪酸，长链、中链脂肪酸酯， 长链脂肪醇及上述几种的混合物，包括它们的饱和、不饱和、直链、 含支链形式。
如大豆油、蓖麻油、亚油酸、油酸、单硬脂酸甘油酯 (如Myvaple 600，Eastman Fine Chemical Company)、单油酸甘油 酯(如Myverol 18-92，Eastman Fine Chemical Company)、中链 (C8-C10)脂肪酸的甘油酯(如Captex 366、Captex200、Capmul MCM， Abitec Corporation)、十六醇等。
b.选择适当的表面活性剂，增加药物的包裹量。
选择毒性小、 口服安全的非离子型表面活性剂，如脂肪酸甘油酯、PEG类衍生物 (如PEG 400单油酸酯、PEG 400单月桂酸酯)、聚氧乙烯脂肪醇醚 类(如Brij类)、聚氧乙烯失水山梨醇脂肪酸酯(Tween类)、山梨 醇及失水山梨醇脂肪酸酯(Span类)、聚氧乙烯脂肪酸酯类(Myrj 类)、Vitamin E衍生物类(如Vitamin E TPGS，Eastamn Fine Chemical Company)、聚氧烯烃整体共聚表面活性剂(Pluronic类)；天然表 面活性剂，如卵磷脂、豆磷脂、胆甾醇和胆酸类、海藻酸钠等；部 分阴离子表面活性剂，如二辛基琥珀酰磺酸钠(Aerosol OT)。
c.选择刺激性小的助表面活性剂，减少或不用助表面活性剂。
例如选择聚合度小的聚乙二醇类，如PEG 400。
d.增加微乳的稳定性，包括对水稀释的稳定性及储存稳定性。
水相中加入一定量高分子物质(如明胶、PVP)以提高水相粘度、高HLB 值的表面活性剂和低HLB值的表面活性剂混合使用(如将单甘酯、 卵磷脂、胆固醇等表面活性剂混合使用)、加入一定量O/W型表面活 性剂以使微乳进入胃肠道内立即形成W/O/W型复乳等措施有助于提 高微乳的对水稀释稳定性。
e.增加微乳的粘度，使微乳固化。
选择适当的亲脂性添加剂，使 微乳在常温下成流动性很小的凝胶状或固状，进入体内后又融化成 液态。
硬脂酸钠、十六醇、十八醇、Myverol 18-99、Vitamin E-TPGS 等都有此作用。
选择适当的固化载体，如CaSO4、海藻酸、硬脂酸酯、 HPC等，将液状的微乳吸收，转化成固状，可提高微乳的储存稳定 性。
f.微乳中加入适量抑菌剂、抗氧剂。
g.将微乳(液状、凝胶状或固状)装入胶囊(软胶囊或硬胶囊， 小肠溶、结肠溶或胃溶)。
本发明采用下列技术方案 1.微乳制备： 油相的选择见上述a。
若油相本身在室温下部分或全部呈固状 或半固状，需熔融或以适量溶剂如乙醇、PEG 400溶解。
油相中加入 0.005-0.02％叔丁基对羟基茴香醚(BHA)或二丁甲苯酚(BHT)作抗 氧剂。
水相为含Sak的缓冲液(pH4-9)，可加1-10％高聚合度PEG(聚 合度≥20)、0.1-1％明胶或0.1-5％PVP等高分子物质，增加内水相粘 度，使微乳稳定。
水相中含0.01-0.25％尼泊金类抑菌剂。
乳化剂一般是表面活性剂，包括非离子表面活性剂、阴离子表 面活性剂、天然表面活性剂(见上述b)，含量大于油相量的20％， 亲水亲油平衡值(HLB)范围比较广。
可以使用一种表面活性剂，也 可高HLB值的表面活性剂和低HLB值的表面活性剂混合使用，一般 地，HLB总＝5-20。
若乳化剂水溶性好，则可部分先溶解于含Sak的 缓冲液里，再滴入油相、助乳化剂(见上述c)及其它乳化剂的混 合液中；若乳化剂水溶性较差，可先以助乳化剂、油相溶解，或与 油相熔融混匀后加入水相。
操作顺序一般是在搅拌下，把水相滴入含表面活性剂(和助表 面活性剂)的油相中。
所有操作在37℃或室温下完成，得到透明W/O微乳。
增加微乳的稳定性的措施，包括对水稀释的稳定性及储存稳定 性见上述d、e。
为了使微乳服用方便、易于运输及增加微乳的储存稳定性，可 把微乳固体化，如把微乳装入胶囊(见e)。
肠溶型材料包括邻苯二 甲酸醋酸纤维素(CAP)、邻苯二甲酸羟丙基甲基纤维素(HPMCP)、 邻苯二甲酸聚乙烯醇酯(PVAP)、苯乙烯马来酸共聚物(StyMA)、丙 烯酸树脂(如Eudragit L100、Eudragit S100)等，软胶囊可采用 压制法制得。
2.生物活性法检测微乳体外稳定性及大鼠口服Sak W/O微乳生 物利用度 2.1微乳体外稳定性： 微乳1g，加入PBS 100ml，37℃搅拌2-4hr后，10000rpm× 20min离心，酪蛋白板溶圈法测水层纤溶活性。
2.2大鼠口服Sak W/O微乳生物利用度： SD大鼠24只，分成对照组和给药组，每组12只，其中给药组 服含1.5mg Sak的微乳，对照组服等体积空白微乳，给药前及给药后 每隔2hr尾部取血0.4ml，肝素抗凝，3000rpm×5min离心，取血浆。
不影响Sak活性的Sak单抗纯化后包被于96孔板，加入待测血 浆及含有Sak活性标准系列，37℃温育1hr，倾去，洗涤后加入发色 底物S2390与人纤溶酶原混合液，37℃温育，测A405，作活性-时间 曲线，计算AUCpo。
大鼠12只，戊巴比妥钠麻醉，静脉注射与上述口服剂量相同的 Sak，不同时间取血，酪蛋白板溶圈法测血浆中纤溶活性变化，计算 AUCiv。
计算大鼠口服口服Sak微乳的生物利用度。
微乳载药量定义为每g微乳含有的Sak毫克数。
微乳按1∶100用PBS稀释，37℃搅拌2hr，酪蛋白板溶圈法显示， 水相Sak量占总Sak量2-10％，表明微乳比较稳定。
大鼠口服Sak微乳后血浆纤溶活性明显上升，证实了部分Sak 进入血液循环。
人或大鼠静脉注射Sak，快速消除相t1/2＝3.0min，而口服Sak 微乳t1/2为2-3hr(见附表4)，说明口服Sak制剂具缓释作用。
本发明的Sak微乳除了可用于口服吸收(小肠吸收、结肠吸收) 之外，还可用于透皮吸收。
表1例举了Sak 5种W/O型微乳的制备方案(以A、B、C、D和 E表示)。
其中水相为含有Sak、抑菌剂、0.5％明胶的PBS(pH7.4)溶 液，油酸中含抗氧剂。
实施例1：把油酸、Tween 80、Span 80混合，三者互溶，加入 助表面活性剂正丁醇、PEG 400，室温搅拌下滴入水相，混匀即可。
实施例2：50℃融化Vitamin E TPGS，加入油酸、Span 80， 三者互溶，使温度降至37℃，37℃下逐滴加入37℃保温的水相，混 匀即可。
实施例3：60℃融化Pluronic F68，加入油酸、Span 80，三 者互溶，使温度降至37℃，37℃下逐滴加入37℃保温的水相，混匀 即可。
实施例4：卵磷脂以乙醇溶解，加入PEG 400、油酸，混合均匀， 室温搅拌下滴入水相，混匀即可。
实施例5：10％AOT以乙醇溶解，加入PEG 400、油酸，混合均 匀，室温搅拌下滴入水相，混匀即可。
实施例6：大豆油4g、Pluronic F68 2g、Span 85 1.2g、Sak 溶液0.9ml。
60℃融化Pluronic F68，加入大豆油、Span 85，三 者互溶，使温度降至37℃，37℃下逐滴加入37℃保温的水相，混匀 即可。
实施例7：亚油酸3.5g、Vitamin E TPGS1.8g、Span 83 0.8g、Sak溶液1.1ml。
50℃融化Vitamin E TPGS，加入亚油酸、Span 83，三者互溶，使温度降至37℃，37℃下逐滴滴加37℃保温的水相， 混匀即可。
1g该微乳可以3g海藻酸或单硬脂酸酯吸收，成固体制剂。
实施例8：Captex 366 10g、Tween 20 5g、Myvaple 600 1.5g、 PEG400 3ml、Sak溶液2.7ml。
Myvaple 600与Captex 366、PEG400 混合，加热熔融，加入Tween 20，混匀，使温度降至37℃，37℃下 逐滴加入37℃保温的水相，混匀即可。
例2、3、6、7、8在37℃呈流动性良好的液体状，当温度降至 20℃左右，粘度逐渐增高，流动性差；温度进一步降低，可呈固状， 易于贮存，此时若再将温度升至37℃，制剂又呈流动性良好的液体。
表2例举了表1中Sak 5种W/O型微乳的载药量(mg/g微乳)。
表3例举了表1中Sak 5种W/O型微乳在PBS中37℃搅拌2hr 后，水层的纤溶活性占微乳中Sak总活性的百分数。
表4例举了表1中Sak 5种W/O型微乳大鼠口服的生物利用度(活 性代谢方式)。
附图1为大鼠口服微乳后血浆纤溶活性的变化。
由例1-5可见，表面活性剂的选择直接影响微乳的载药量、稳 定性及口服给药的生物利用度。
表1是微乳成分表 表1
微乳的实质是乳剂的一种，乳滴小于50nm，乳滴均匀地分散在 连续相中。
连续相为油相，分散相为水相的微乳称W/O型微乳；而 连续相为水相，分散相为油相的微乳称O/W型微乳。
根据药物的溶 解特性，药物常分散或溶解于分散相中。
对于水溶性良好的蛋白质， 一般把蛋白质溶解于水相中，形成W/O型微乳。
W/O型微乳的吸收机理有两种方式，一种是拟脂滴吸收方式， 因为微乳乳滴很小，只有20-40nm，若选择适当的表面活性剂和助表 面活性剂，使其稳定性增加，则微乳与微小脂滴很相似，可以以拟 脂滴形式被吸收，即以被动转运方式进入淋巴管，再入血循环；另 一种吸收方式是胞饮，因为外相油膜呈脂性，可以与肠上皮细胞接 触，再加上微乳内含有的表面活性剂可改变细胞膜张力，引起膜内 陷，细胞膜与微乳外相油膜融合，把蛋白质导入胞内。
基于这样的 吸收机制，微乳的吸收量有可能比其它任何一种制剂都大。
微乳作为蛋白质的口服载体，通过对蛋白质的包裹，可以避开 胃酸和胃肠道内各种酶的降解，例如把水溶性良好的胰岛素制成W/O 型微乳，胰岛素溶解于内水相中，外油相可有效把蛋白水解酶拒之 于外。
微乳还具有缓释作用，W/O型微乳犹如水溶性药物的储库， 可使药物持续释放，增加药物的生物利用度、延长药物半衰期。
除了用于降低移植后排斥反应的环孢菌素(cyclosporine A， MW＝1202)微乳外，至今还不见水溶性蛋白质的口服微乳面市。
cyclosporine A是一种含11个氨基酸的环状多肽化合物，不溶于水， 易溶于乙醇，几乎不溶于油，但通过乙醇的介导很好地溶于油中后， 加入O/W型表面活性剂及相应的助表面活性剂，口服，进入胃肠道， 自发形成O/W型微乳，这就是1994年5月Sandoz公司在德国上市 的第二代Sandimmun Neoral软胶囊。
cyclosporine A微乳的成功给 药剂工作者不少启示。
cyclosporine A与一般蛋白质的本质区别在于溶解性，一般蛋 白质呈水溶性，其微乳只能制备W/O型。
因为内水相体积有限，如 占10％左右，和毫微粒一样，蛋白质包裹率约0.5mg/g微乳；同时微 乳制备工艺中需要多种亲脂性物质，如外油相、表面活性剂和助表 面活性剂，这些物质的总量相对水相大得多，以致亲水性的蛋白质 在这样非极性环境中容易变性析出。
W/O型微乳的另一个问题是稳 定性，包括储存稳定性和体内亲水环境中的稳定性。
虽然存在以上 问题，但是微乳仍不啻是口服蛋白质的一种相当有前途的载体。
组织型纤溶酶原激活物(t-PA)、链激酶(SK)、尿激酶(UK)等溶 栓药物广泛应用于临床以后，葡激酶(staphylokinase，Sak)以其 纤维蛋白特异性强、良好的溶栓能力、分子量小等优点日益受到人 们重视。
上述几种药物均以静脉滴注方式给药，用于急性心肌梗塞 等血管栓塞性疾病的急救，溶栓治疗最佳时间是发病6hr内。
但是， 静脉注射必须在医院进行，由此，许多病人失去了溶栓治疗的机会。
本发明的目的是提供一种以葡激酶为原料的，适合于较长期使 用的非静脉滴注预防性药物制剂，提高人血浆中纤溶或抗凝活性， 预防急性心肌梗塞和脑梗塞等血栓性疾病。
能服用方便。
本发明采用葡激酶包括从葡萄球菌中提取的天然葡激酶(有公 开文献报道)、重组葡激酶(recombinant staphylokinase，r-Sak， 专利号为94112105)、通过基因突变产生的葡激酶各种突变体及上述 品种的体外修饰物为原料。
本发明集中于以下几个方面： a.对油相的选择，如长链、中链脂肪酸，长链、中链脂肪酸酯， 长链脂肪醇及上述几种的混合物，包括它们的饱和、不饱和、直链、 含支链形式。
如大豆油、蓖麻油、亚油酸、油酸、单硬脂酸甘油酯 (如Myvaple 600，Eastman Fine Chemical Company)、单油酸甘油 酯(如Myverol 18-92，Eastman Fine Chemical Company)、中链 (C8-C10)脂肪酸的甘油酯(如Captex 366、Captex200、Capmul MCM， Abitec Corporation)、十六醇等。
b.选择适当的表面活性剂，增加药物的包裹量。
选择毒性小、 口服安全的非离子型表面活性剂，如脂肪酸甘油酯、PEG类衍生物 (如PEG 400单油酸酯、PEG 400单月桂酸酯)、聚氧乙烯脂肪醇醚 类(如Brij类)、聚氧乙烯失水山梨醇脂肪酸酯(Tween类)、山梨 醇及失水山梨醇脂肪酸酯(Span类)、聚氧乙烯脂肪酸酯类(Myrj 类)、Vitamin E衍生物类(如Vitamin E TPGS，Eastamn Fine Chemical Company)、聚氧烯烃整体共聚表面活性剂(Pluronic类)；天然表 面活性剂，如卵磷脂、豆磷脂、胆甾醇和胆酸类、海藻酸钠等；部 分阴离子表面活性剂，如二辛基琥珀酰磺酸钠(Aerosol OT)。
c.选择刺激性小的助表面活性剂，减少或不用助表面活性剂。
例如选择聚合度小的聚乙二醇类，如PEG 400。
d.增加微乳的稳定性，包括对水稀释的稳定性及储存稳定性。
水相中加入一定量高分子物质(如明胶、PVP)以提高水相粘度、高HLB 值的表面活性剂和低HLB值的表面活性剂混合使用(如将单甘酯、 卵磷脂、胆固醇等表面活性剂混合使用)、加入一定量O/W型表面活 性剂以使微乳进入胃肠道内立即形成W/O/W型复乳等措施有助于提 高微乳的对水稀释稳定性。
e.增加微乳的粘度，使微乳固化。
选择适当的亲脂性添加剂，使 微乳在常温下成流动性很小的凝胶状或固状，进入体内后又融化成 液态。
硬脂酸钠、十六醇、十八醇、Myverol 18-99、Vitamin E-TPGS 等都有此作用。
选择适当的固化载体，如CaSO4、海藻酸、硬脂酸酯、 HPC等，将液状的微乳吸收，转化成固状，可提高微乳的储存稳定 性。
f.微乳中加入适量抑菌剂、抗氧剂。
g.将微乳(液状、凝胶状或固状)装入胶囊(软胶囊或硬胶囊， 小肠溶、结肠溶或胃溶)。
本发明采用下列技术方案 1.微乳制备： 油相的选择见上述a。
若油相本身在室温下部分或全部呈固状 或半固状，需熔融或以适量溶剂如乙醇、PEG 400溶解。
油相中加入 0.005-0.02％叔丁基对羟基茴香醚(BHA)或二丁甲苯酚(BHT)作抗 氧剂。
水相为含Sak的缓冲液(pH4-9)，可加1-10％高聚合度PEG(聚 合度≥20)、0.1-1％明胶或0.1-5％PVP等高分子物质，增加内水相粘 度，使微乳稳定。
水相中含0.01-0.25％尼泊金类抑菌剂。
乳化剂一般是表面活性剂，包括非离子表面活性剂、阴离子表 面活性剂、天然表面活性剂(见上述b)，含量大于油相量的20％， 亲水亲油平衡值(HLB)范围比较广。
可以使用一种表面活性剂，也 可高HLB值的表面活性剂和低HLB值的表面活性剂混合使用，一般 地，HLB总＝5-20。
若乳化剂水溶性好，则可部分先溶解于含Sak的 缓冲液里，再滴入油相、助乳化剂(见上述c)及其它乳化剂的混 合液中；若乳化剂水溶性较差，可先以助乳化剂、油相溶解，或与 油相熔融混匀后加入水相。
操作顺序一般是在搅拌下，把水相滴入含表面活性剂(和助表 面活性剂)的油相中。
所有操作在37℃或室温下完成，得到透明W/O微乳。
增加微乳的稳定性的措施，包括对水稀释的稳定性及储存稳定 性见上述d、e。
为了使微乳服用方便、易于运输及增加微乳的储存稳定性，可 把微乳固体化，如把微乳装入胶囊(见e)。
肠溶型材料包括邻苯二 甲酸醋酸纤维素(CAP)、邻苯二甲酸羟丙基甲基纤维素(HPMCP)、 邻苯二甲酸聚乙烯醇酯(PVAP)、苯乙烯马来酸共聚物(StyMA)、丙 烯酸树脂(如Eudragit L100、Eudragit S100)等，软胶囊可采用 压制法制得。
2.生物活性法检测微乳体外稳定性及大鼠口服Sak W/O微乳生 物利用度 2.1微乳体外稳定性： 微乳1g，加入PBS 100ml，37℃搅拌2-4hr后，10000rpm× 20min离心，酪蛋白板溶圈法测水层纤溶活性。
2.2大鼠口服Sak W/O微乳生物利用度： SD大鼠24只，分成对照组和给药组，每组12只，其中给药组 服含1.5mg Sak的微乳，对照组服等体积空白微乳，给药前及给药后 每隔2hr尾部取血0.4ml，肝素抗凝，3000rpm×5min离心，取血浆。
不影响Sak活性的Sak单抗纯化后包被于96孔板，加入待测血 浆及含有Sak活性标准系列，37℃温育1hr，倾去，洗涤后加入发色 底物S2390与人纤溶酶原混合液，37℃温育，测A405，作活性-时间 曲线，计算AUCpo。
大鼠12只，戊巴比妥钠麻醉，静脉注射与上述口服剂量相同的 Sak，不同时间取血，酪蛋白板溶圈法测血浆中纤溶活性变化，计算 AUCiv。
计算大鼠口服口服Sak微乳的生物利用度。
微乳载药量定义为每g微乳含有的Sak毫克数。
微乳按1∶100用PBS稀释，37℃搅拌2hr，酪蛋白板溶圈法显示， 水相Sak量占总Sak量2-10％，表明微乳比较稳定。
大鼠口服Sak微乳后血浆纤溶活性明显上升，证实了部分Sak 进入血液循环。
人或大鼠静脉注射Sak，快速消除相t1/2＝3.0min，而口服Sak 微乳t1/2为2-3hr(见附表4)，说明口服Sak制剂具缓释作用。
本发明的Sak微乳除了可用于口服吸收(小肠吸收、结肠吸收) 之外，还可用于透皮吸收。
表1例举了Sak 5种W/O型微乳的制备方案(以A、B、C、D和 E表示)。
其中水相为含有Sak、抑菌剂、0.5％明胶的PBS(pH7.4)溶 液，油酸中含抗氧剂。
实施例1：把油酸、Tween 80、Span 80混合，三者互溶，加入 助表面活性剂正丁醇、PEG 400，室温搅拌下滴入水相，混匀即可。
实施例2：50℃融化Vitamin E TPGS，加入油酸、Span 80， 三者互溶，使温度降至37℃，37℃下逐滴加入37℃保温的水相，混 匀即可。
实施例3：60℃融化Pluronic F68，加入油酸、Span 80，三 者互溶，使温度降至37℃，37℃下逐滴加入37℃保温的水相，混匀 即可。
实施例4：卵磷脂以乙醇溶解，加入PEG 400、油酸，混合均匀， 室温搅拌下滴入水相，混匀即可。
实施例5：10％AOT以乙醇溶解，加入PEG 400、油酸，混合均 匀，室温搅拌下滴入水相，混匀即可。
实施例6：大豆油4g、Pluronic F68 2g、Span 85 1.2g、Sak 溶液0.9ml。
60℃融化Pluronic F68，加入大豆油、Span 85，三 者互溶，使温度降至37℃，37℃下逐滴加入37℃保温的水相，混匀 即可。
实施例7：亚油酸3.5g、Vitamin E TPGS1.8g、Span 83 0.8g、Sak溶液1.1ml。
50℃融化Vitamin E TPGS，加入亚油酸、Span 83，三者互溶，使温度降至37℃，37℃下逐滴滴加37℃保温的水相， 混匀即可。
1g该微乳可以3g海藻酸或单硬脂酸酯吸收，成固体制剂。
实施例8：Captex 366 10g、Tween 20 5g、Myvaple 600 1.5g、 PEG400 3ml、Sak溶液2.7ml。
Myvaple 600与Captex 366、PEG400 混合，加热熔融，加入Tween 20，混匀，使温度降至37℃，37℃下 逐滴加入37℃保温的水相，混匀即可。
例2、3、6、7、8在37℃呈流动性良好的液体状，当温度降至 20℃左右，粘度逐渐增高，流动性差；温度进一步降低，可呈固状， 易于贮存，此时若再将温度升至37℃，制剂又呈流动性良好的液体。
表2例举了表1中Sak 5种W/O型微乳的载药量(mg/g微乳)。
表3例举了表1中Sak 5种W/O型微乳在PBS中37℃搅拌2hr 后，水层的纤溶活性占微乳中Sak总活性的百分数。
表4例举了表1中Sak 5种W/O型微乳大鼠口服的生物利用度(活 性代谢方式)。
附图1为大鼠口服微乳后血浆纤溶活性的变化。
由例1-5可见，表面活性剂的选择直接影响微乳的载药量、稳 定性及口服给药的生物利用度。
表1是微乳成分表 表1
