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葡激酶微乳制剂及其制备方法

基本信息

  • 申请号 CN00111418.2 
  • 公开号 CN1108816C 
  • 申请日 2000/01/05 
  • 公开日 2003/05/21 
  • 申请人 复旦大学  
  • 优先权日期  
  • 发明人 宋后燕 黄阳滨  
  • 主分类号  
  • 申请人地址 200032上海市医学院路138路 
  • 分类号  
  • 专利代理机构 上海正旦专利代理有限公司 
  • 当前专利状态 发明专利权部分无效宣告的公告 
  • 代理人 吴桂琴 
  • 有效性 有效专利 
  • 法律状态
  •  

权利要求书

1、一种葡激酶的微乳制剂,其特征在于采用葡激酶作为原料, 采用水相、油相、表面活性剂和助表面活性剂混合物作为药物载 体,制备微乳制剂。
2、按权利要求1所述的葡激酶微乳制剂,其特征在于所述的葡 激酶包括:天然葡激酶、重组葡激酶、通过基因突变产生的各种 葡激酶突变体。
3、按权利要求1所述的葡激酶微乳制剂,其特征在于所述的油 相包含长链、中链脂肪酸,长链、中链脂肪酸酯,长链脂肪醇及 上述几种的混合物,包括它们的饱和、不饱和、直链、含支链 形式。
4、按权利要求3所述的葡激酶微乳制剂,其特征在于所述的油 相包含如大豆油、蓖麻油、亚油酸、油酸、单硬脂酸甘油酯、单 油酸甘油酯、中链(C8-C10)脂肪酸的甘油酯、十六醇等。
5、按权利要求1所述的葡激酶微乳制剂,其特征在于所述的表 面活性剂为非离子型表面活性剂、天然表面活性剂、部分阴离子 表面活性剂。
6、按权利要求5所述的葡激酶微乳制剂,其特征在于所述的非 离子型表面活性剂是脂肪酸甘油酯、PEG类衍生物、聚氧乙烯脂 肪醇醚类、聚氧乙烯失水山梨醇脂肪酸酯、山梨醇及失水山梨醇 脂肪酸酯、聚氧乙烯脂肪酸酯类、Vitamin E衍生物类、聚氧烯 烃整体共聚表面活性剂。
7、按权利要求5所述的葡激酶微乳制剂,其特征在于所述的天 然表面活性剂是卵磷脂、豆磷脂、胆甾醇和胆酸类、海藻酸钠等。
8、按权利要求5所述的葡激酶微乳制剂,其特征在于所述的部 分阴离子表面活性剂是二辛基琥珀酰磺酸钠。
9、按权利要求1所述的葡激酶微乳制剂,其特征在于所述的助 表面活性剂是采用聚乙二醇类。
10、按权利要求1所述的葡激酶微乳制剂,其特征在于采取水中 加入高分子物质、高HLB值的表面活性剂和低HLB值的表面活性剂混 合使用、加入O/W型表面活性剂等措施提高水相粘度和微乳对水稀释 的稳定性。
11、按权利要求1所述的葡激酶微乳制剂,其特征在于采用亲脂 性添加剂和固化载体。
12、按权利要求10所述的葡激酶微乳制剂,其特征在于所述的 亲脂性添加剂为硬脂酸钠、十六醇、十八醇、Myverol 18-99、Vitamin E-TPGS等。
13、按权利要求10所述的葡激酶微乳制剂,其特征在于所述的 固化载体为CaSO4、海藻酸、硬脂酸酯、HPC等。
14、一种葡激酶微乳剂的制备方法,其特征在于采用下述步骤: (1)选择油相,若油相是固体的半固体状,熔融或加溶剂溶解,再 往油相内加入抗氧剂。
(2)制备水相,水相中含葡激酶。
(3)选择表面活性剂作乳化剂。
(4)在37℃或室温下,搅拌中把水相滴入含表面活性剂的油相中。
(5)增加微乳粘度或固化微乳,提高微乳稳定性。
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说明书

微乳是由水相、油相、表面活性剂和助表面活性剂按适当比例 混合后自发形成的各相同性、透明、热力学稳定的分散体系,80年 代后作为药物载体受到医药界的重视,在药物制剂研究及临床方面 的应用日益广泛。
微乳的实质是乳剂的一种,乳滴小于50nm,乳滴均匀地分散在 连续相中。
连续相为油相,分散相为水相的微乳称W/O型微乳;而 连续相为水相,分散相为油相的微乳称O/W型微乳。
根据药物的溶 解特性,药物常分散或溶解于分散相中。
对于水溶性良好的蛋白质, 一般把蛋白质溶解于水相中,形成W/O型微乳。
W/O型微乳的吸收机理有两种方式,一种是拟脂滴吸收方式, 因为微乳乳滴很小,只有20-40nm,若选择适当的表面活性剂和助表 面活性剂,使其稳定性增加,则微乳与微小脂滴很相似,可以以拟 脂滴形式被吸收,即以被动转运方式进入淋巴管,再入血循环;另 一种吸收方式是胞饮,因为外相油膜呈脂性,可以与肠上皮细胞接 触,再加上微乳内含有的表面活性剂可改变细胞膜张力,引起膜内 陷,细胞膜与微乳外相油膜融合,把蛋白质导入胞内。
基于这样的 吸收机制,微乳的吸收量有可能比其它任何一种制剂都大。
微乳作为蛋白质的口服载体,通过对蛋白质的包裹,可以避开 胃酸和胃肠道内各种酶的降解,例如把水溶性良好的胰岛素制成W/O 型微乳,胰岛素溶解于内水相中,外油相可有效把蛋白水解酶拒之 于外。
微乳还具有缓释作用,W/O型微乳犹如水溶性药物的储库, 可使药物持续释放,增加药物的生物利用度、延长药物半衰期。
除了用于降低移植后排斥反应的环孢菌素(cyclosporine A, MW=1202)微乳外,至今还不见水溶性蛋白质的口服微乳面市。
cyclosporine A是一种含11个氨基酸的环状多肽化合物,不溶于水, 易溶于乙醇,几乎不溶于油,但通过乙醇的介导很好地溶于油中后, 加入O/W型表面活性剂及相应的助表面活性剂,口服,进入胃肠道, 自发形成O/W型微乳,这就是1994年5月Sandoz公司在德国上市 的第二代Sandimmun Neoral软胶囊。
cyclosporine A微乳的成功给 药剂工作者不少启示。
cyclosporine A与一般蛋白质的本质区别在于溶解性,一般蛋 白质呈水溶性,其微乳只能制备W/O型。
因为内水相体积有限,如 占10%左右,和毫微粒一样,蛋白质包裹率约0.5mg/g微乳;同时微 乳制备工艺中需要多种亲脂性物质,如外油相、表面活性剂和助表 面活性剂,这些物质的总量相对水相大得多,以致亲水性的蛋白质 在这样非极性环境中容易变性析出。
W/O型微乳的另一个问题是稳 定性,包括储存稳定性和体内亲水环境中的稳定性。
虽然存在以上 问题,但是微乳仍不啻是口服蛋白质的一种相当有前途的载体。
组织型纤溶酶原激活物(t-PA)、链激酶(SK)、尿激酶(UK)等溶 栓药物广泛应用于临床以后,葡激酶(staphylokinase,Sak)以其 纤维蛋白特异性强、良好的溶栓能力、分子量小等优点日益受到人 们重视。
上述几种药物均以静脉滴注方式给药,用于急性心肌梗塞 等血管栓塞性疾病的急救,溶栓治疗最佳时间是发病6hr内。
但是, 静脉注射必须在医院进行,由此,许多病人失去了溶栓治疗的机会。
本发明的目的是提供一种以葡激酶为原料的,适合于较长期使 用的非静脉滴注预防性药物制剂,提高人血浆中纤溶或抗凝活性, 预防急性心肌梗塞和脑梗塞等血栓性疾病。
能服用方便。
本发明采用葡激酶包括从葡萄球菌中提取的天然葡激酶(有公 开文献报道)、重组葡激酶(recombinant staphylokinase,r-Sak, 专利号为94112105)、通过基因突变产生的葡激酶各种突变体及上述 品种的体外修饰物为原料。
本发明集中于以下几个方面: a.对油相的选择,如长链、中链脂肪酸,长链、中链脂肪酸酯, 长链脂肪醇及上述几种的混合物,包括它们的饱和、不饱和、直链、 含支链形式。
如大豆油、蓖麻油、亚油酸、油酸、单硬脂酸甘油酯 (如Myvaple 600,Eastman Fine Chemical Company)、单油酸甘油 酯(如Myverol 18-92,Eastman Fine Chemical Company)、中链 (C8-C10)脂肪酸的甘油酯(如Captex 366、Captex200、Capmul MCM, Abitec Corporation)、十六醇等。
b.选择适当的表面活性剂,增加药物的包裹量。
选择毒性小、 口服安全的非离子型表面活性剂,如脂肪酸甘油酯、PEG类衍生物 (如PEG 400单油酸酯、PEG 400单月桂酸酯)、聚氧乙烯脂肪醇醚 类(如Brij类)、聚氧乙烯失水山梨醇脂肪酸酯(Tween类)、山梨 醇及失水山梨醇脂肪酸酯(Span类)、聚氧乙烯脂肪酸酯类(Myrj 类)、Vitamin E衍生物类(如Vitamin E TPGS,Eastamn Fine Chemical Company)、聚氧烯烃整体共聚表面活性剂(Pluronic类);天然表 面活性剂,如卵磷脂、豆磷脂、胆甾醇和胆酸类、海藻酸钠等;部 分阴离子表面活性剂,如二辛基琥珀酰磺酸钠(Aerosol OT)。
c.选择刺激性小的助表面活性剂,减少或不用助表面活性剂。
例如选择聚合度小的聚乙二醇类,如PEG 400。
d.增加微乳的稳定性,包括对水稀释的稳定性及储存稳定性。
水相中加入一定量高分子物质(如明胶、PVP)以提高水相粘度、高HLB 值的表面活性剂和低HLB值的表面活性剂混合使用(如将单甘酯、 卵磷脂、胆固醇等表面活性剂混合使用)、加入一定量O/W型表面活 性剂以使微乳进入胃肠道内立即形成W/O/W型复乳等措施有助于提 高微乳的对水稀释稳定性。
e.增加微乳的粘度,使微乳固化。
选择适当的亲脂性添加剂,使 微乳在常温下成流动性很小的凝胶状或固状,进入体内后又融化成 液态。
硬脂酸钠、十六醇、十八醇、Myverol 18-99、Vitamin E-TPGS 等都有此作用。
选择适当的固化载体,如CaSO4、海藻酸、硬脂酸酯、 HPC等,将液状的微乳吸收,转化成固状,可提高微乳的储存稳定 性。
f.微乳中加入适量抑菌剂、抗氧剂。
g.将微乳(液状、凝胶状或固状)装入胶囊(软胶囊或硬胶囊, 小肠溶、结肠溶或胃溶)。
本发明采用下列技术方案 1.微乳制备: 油相的选择见上述a。
若油相本身在室温下部分或全部呈固状 或半固状,需熔融或以适量溶剂如乙醇、PEG 400溶解。
油相中加入 0.005-0.02%叔丁基对羟基茴香醚(BHA)或二丁甲苯酚(BHT)作抗 氧剂。
水相为含Sak的缓冲液(pH4-9),可加1-10%高聚合度PEG(聚 合度≥20)、0.1-1%明胶或0.1-5%PVP等高分子物质,增加内水相粘 度,使微乳稳定。
水相中含0.01-0.25%尼泊金类抑菌剂。
乳化剂一般是表面活性剂,包括非离子表面活性剂、阴离子表 面活性剂、天然表面活性剂(见上述b),含量大于油相量的20%, 亲水亲油平衡值(HLB)范围比较广。
可以使用一种表面活性剂,也 可高HLB值的表面活性剂和低HLB值的表面活性剂混合使用,一般 地,HLB=5-20。
若乳化剂水溶性好,则可部分先溶解于含Sak的 缓冲液里,再滴入油相、助乳化剂(见上述c)及其它乳化剂的混 合液中;若乳化剂水溶性较差,可先以助乳化剂、油相溶解,或与 油相熔融混匀后加入水相。
操作顺序一般是在搅拌下,把水相滴入含表面活性剂(和助表 面活性剂)的油相中。
所有操作在37℃或室温下完成,得到透明W/O微乳。
增加微乳的稳定性的措施,包括对水稀释的稳定性及储存稳定 性见上述d、e。
为了使微乳服用方便、易于运输及增加微乳的储存稳定性,可 把微乳固体化,如把微乳装入胶囊(见e)。
肠溶型材料包括邻苯二 甲酸醋酸纤维素(CAP)、邻苯二甲酸羟丙基甲基纤维素(HPMCP)、 邻苯二甲酸聚乙烯醇酯(PVAP)、苯乙烯马来酸共聚物(StyMA)、丙 烯酸树脂(如Eudragit L100、Eudragit S100)等,软胶囊可采用 压制法制得。
2.生物活性法检测微乳体外稳定性及大鼠口服Sak W/O微乳生 物利用度 2.1微乳体外稳定性: 微乳1g,加入PBS 100ml,37℃搅拌2-4hr后,10000rpm× 20min离心,酪蛋白板溶圈法测水层纤溶活性。
2.2大鼠口服Sak W/O微乳生物利用度: SD大鼠24只,分成对照组和给药组,每组12只,其中给药组 服含1.5mg Sak的微乳,对照组服等体积空白微乳,给药前及给药后 每隔2hr尾部取血0.4ml,肝素抗凝,3000rpm×5min离心,取血浆。
不影响Sak活性的Sak单抗纯化后包被于96孔板,加入待测血 浆及含有Sak活性标准系列,37℃温育1hr,倾去,洗涤后加入发色 底物S2390与人纤溶酶原混合液,37℃温育,测A405,作活性-时间 曲线,计算AUCpo。
大鼠12只,戊巴比妥钠麻醉,静脉注射与上述口服剂量相同的 Sak,不同时间取血,酪蛋白板溶圈法测血浆中纤溶活性变化,计算 AUCiv。
计算大鼠口服口服Sak微乳的生物利用度。
微乳载药量定义为每g微乳含有的Sak毫克数。
微乳按1∶100用PBS稀释,37℃搅拌2hr,酪蛋白板溶圈法显示, 水相Sak量占总Sak量2-10%,表明微乳比较稳定。
大鼠口服Sak微乳后血浆纤溶活性明显上升,证实了部分Sak 进入血液循环。
人或大鼠静脉注射Sak,快速消除相t1/2=3.0min,而口服Sak 微乳t1/2为2-3hr(见附表4),说明口服Sak制剂具缓释作用。
本发明的Sak微乳除了可用于口服吸收(小肠吸收、结肠吸收) 之外,还可用于透皮吸收。
表1例举了Sak 5种W/O型微乳的制备方案(以A、B、C、D和 E表示)。
其中水相为含有Sak、抑菌剂、0.5%明胶的PBS(pH7.4)溶 液,油酸中含抗氧剂。
实施例1:把油酸、Tween 80、Span 80混合,三者互溶,加入 助表面活性剂正丁醇、PEG 400,室温搅拌下滴入水相,混匀即可。
实施例2:50℃融化Vitamin E TPGS,加入油酸、Span 80, 三者互溶,使温度降至37℃,37℃下逐滴加入37℃保温的水相,混 匀即可。
实施例3:60℃融化Pluronic F68,加入油酸、Span 80,三 者互溶,使温度降至37℃,37℃下逐滴加入37℃保温的水相,混匀 即可。
实施例4:卵磷脂以乙醇溶解,加入PEG 400、油酸,混合均匀, 室温搅拌下滴入水相,混匀即可。
实施例5:10%AOT以乙醇溶解,加入PEG 400、油酸,混合均 匀,室温搅拌下滴入水相,混匀即可。
实施例6:大豆油4g、Pluronic F68 2g、Span 85 1.2g、Sak 溶液0.9ml。
60℃融化Pluronic F68,加入大豆油、Span 85,三 者互溶,使温度降至37℃,37℃下逐滴加入37℃保温的水相,混匀 即可。
实施例7:亚油酸3.5g、Vitamin E TPGS1.8g、Span 83 0.8g、Sak溶液1.1ml。
50℃融化Vitamin E TPGS,加入亚油酸、Span 83,三者互溶,使温度降至37℃,37℃下逐滴滴加37℃保温的水相, 混匀即可。
1g该微乳可以3g海藻酸或单硬脂酸酯吸收,成固体制剂。
实施例8:Captex 366 10g、Tween 20 5g、Myvaple 600 1.5g、 PEG400 3ml、Sak溶液2.7ml。
Myvaple 600与Captex 366、PEG400 混合,加热熔融,加入Tween 20,混匀,使温度降至37℃,37℃下 逐滴加入37℃保温的水相,混匀即可。
例2、3、6、7、8在37℃呈流动性良好的液体状,当温度降至 20℃左右,粘度逐渐增高,流动性差;温度进一步降低,可呈固状, 易于贮存,此时若再将温度升至37℃,制剂又呈流动性良好的液体。
表2例举了表1中Sak 5种W/O型微乳的载药量(mg/g微乳)。
表3例举了表1中Sak 5种W/O型微乳在PBS中37℃搅拌2hr 后,水层的纤溶活性占微乳中Sak总活性的百分数。
表4例举了表1中Sak 5种W/O型微乳大鼠口服的生物利用度(活 性代谢方式)。
附图1为大鼠口服微乳后血浆纤溶活性的变化。
由例1-5可见,表面活性剂的选择直接影响微乳的载药量、稳 定性及口服给药的生物利用度。
表1是微乳成分表 表1     A
    B
    C
  D
    E
 Sak溶液
    4ml
    3.9ml
   4.4ml
  3.8ml
    4ml
 油酸
    10g
    10g
   10g
  10g
    10g
 TPGS
    6g
 Pluronic
 F68
    6g

 卵磷脂
    4g
 Tween 80
    2g
 Span  80
    3.2g
    3g
    3g
 10%AOT
    6g
 EtOH
    8g
    6g
 PEG 400
    10g
    1g
    1g
    2g
    2g
 正丁醇
    30g
表2是W/O微乳载药量 表2单位:mg/g  A            B           C          D           E 0.18         0.75        0.63       0.38        0.82 表3是微乳在PBS中37℃搅拌2hr后,水层的纤溶活性占微乳中Sak 总活性的百分数 表3  A             B           C          D           E 8.9%         4.1%       2.0%      7.0%       2.5% 表4为大鼠口服r-Sak W/O微乳生物利用度(活性代谢方式) 表4               A           B          C           D          E AUCpo          1035         1542       1491        990        1959 (HU.min.ml-1) AUCiv                                  26502 (HU.min.ml-1) 生物利用度      3.9%        5.7%      5.7%       3.6%      7.2% t1/200(hr)      2.54         2.54       2.45        2.43       2.94 t1/2iv(min)                             3.0 展开

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