八月瓜首页 > 专利查询 > >正文

一种检测甲胎蛋白半定量快速诊断试剂及制备方法

基本信息

  • 申请号 CN00111436.0 
  • 公开号 CN1262440A 
  • 申请日 2000/01/12 
  • 公开日 2000/08/09 
  • 申请人 上海本草生物医学工程研究所 宗英  
  • 优先权日期  
  • 发明人 俞海燕 陶义训  
  • 主分类号  
  • 申请人地址 200040上海市胶州路58号1901室 
  • 分类号  
  • 专利代理机构 上海医药专利事务所 
  • 当前专利状态 发明专利申请公布 
  • 代理人 王巍 
  • 有效性 发明公开 
  • 法律状态
  •  

摘要

本发明公开了一种用以检测甲胎蛋白的新型半定量快速诊断试剂及制备方法。
本发明的试剂是以微孔膜为固相载体,以有色颗粒为标记物,在膜上包被有特定浓度的两种抗体,构成检测区和质控区的试剂条。
检测结果显示的两区颜色变化及颜色对比与被测物的含量范围呈明确对应关系。
本发明检测方法操作简便、快速、不需测试仪器,可适应于多种物质的检测。
展开

权利要求书

1、一种检测甲胎蛋白半定量快速诊断试剂,其特征在于该试剂 是由样品垫(1),固定有有色颗粒标记的抗AFP抗体I的吸水材 料(2),微孔膜(3),吸水垫(4),底板(5),抗AFP抗 体IIA,抗抗体B组成的试剂。
2、一种如权利要求1所述的检测甲胎蛋白半定量快速诊断试剂 的制备方法,其特征在于该方法包括下列步骤: ①单抗的纯化:含单抗的腹水1份,经12000r/min离心10min 后取上清液加入2份0.06mol/L pH 4.0醋酸缓冲液,按33.3μl/ml腹 水比例加入正辛酸,4℃搅拌30min,离心12000r/min,30min,取 上清液过滤,用0.002mol/L pH7.4的NaCl透析48h;在紫外分光光 度计上测定A280和A260;根据公式:【1.45×A280
-0.74×A260】 ×稀释倍数,计算蛋白浓度;加入0.2%NaN3,分装,-20℃冻存; ②多抗的纯化:抗AFP的抗血清1份加上4份0.06M pH4.0 醋酸缓冲液,再加入0.125份的正辛酸,4℃搅拌30min,10000r/min 离心30min,取上清过滤,加入1/10体积的PBS,调pH至7.0; 冷却至4℃,按每ml体积加0.277g比例加入硫酸铵,4℃搅拌1h, 4000r/min离心15min,沉淀用1份生理盐水溶解,混匀,再加1份 生理盐水,透析,计算蛋白浓度,保存方法同单抗纯化; ③胶体金的制备:用柠檬酸还原法制备,配制1%的柠檬酸钠 溶液,按1.5%的比例加入到双蒸水中,煮沸后再按1%的比例加入 1%氯金酸溶液,继续煮沸15min,冷却备用; ④金标抗体的制备:如上制备的胶体金溶液用0.1mol/L K2CO3调节pH至中性,加入1/10(V/V)的适当浓度的抗AFP抗体I溶 液,室温反应15min后,加入1%聚乙二醇;12000r/min离心30min, 吸去上清;用含1%BSA的磷酸盐缓冲液洗涤2-4次;最后沉淀 复悬于相当于原体积1/5的1%BSA溶液中;4℃保存; ⑤金标抗体的固定:取金标抗体液与1%BSA溶液1∶1混匀, 按比例加至吸水材料上,干燥; 在微孔膜上平行包被两种抗体,一种为抗AFP抗体II,包被浓 度为2mg/ml;另一种为兔抗鼠IgG,包被浓度为1.5mg/ml;干燥; ⑥组合成试剂条:将上述固定着有色颗粒标记抗AFP抗体I的 吸水材料(2)、包被着抗AFP抗体II和兔抗鼠IgG的微孔膜(3)、 样品垫(1)和吸水垫(4)粘贴在底板(5)上组合成试剂条; 首先,将微孔膜(3)粘贴在底板(5)上,距底板(5)的 近B末端30mm,然后将吸水垫(4)粘贴在底板(5)的近B端, 吸水垫(4)与微孔膜(3)重叠处为1mm,再将吸水材料(2) 粘贴在底板(5)的近A端,吸水材料(2)与微孔膜(3)重叠 处为1mm;最后将样品垫(1)也粘贴在底板(5)的近A端,样 品垫(1)与吸水材料(2)重叠处为1mm。
3、根据权利要求1所述的一种检测甲胎蛋白半定量快速诊断 试剂,其特征在于其中所述的微孔膜为尼龙膜、PVDF膜、聚酯膜、 硝酸纤维素膜、醋酸纤维素膜或硝酸纤维素与醋酸纤维素的混合 膜;所述的有色颗粒为胶体金、胶体硒或彩色胶乳;所述的抗体为 单克隆抗体或多克隆抗体。
展开

说明书

本发明属生物技术诊断试剂,具体涉及一种检测甲胎蛋白的诊 断试剂及制备方法。
甲胎蛋白(α-fetoprotein,AFP)测定是肝细胞性肝癌的主要实 验室诊断方法。
正常人血清也含有低浓度的AFP。
临床检测AFP时, 常以20-50μg/L作为正常参考值上限。
在临床检测中测定AFP的常用方法有酶免疫法,放射免疫法, 化学发光免疫法等。
但这些定量测定法需用特殊的仪器和试剂,不 适合广泛推广使用,而且结果报告时间较长。
现有的AFP快速诊断试剂条为定性试剂,当标本中AFP含量超 过正常参考值上限时,只报告阳性结果。
由于在临床上除肝癌外,其它肝病如肝炎等血清AFP亦会显著 升高,但升高程度不及肝癌,因我国为肝炎高发区,如仅以超过正 常为阳性来报告AFP的含量范围,临床上缺乏鉴别诊断的参考。
本发明的目的在于克服上述缺点,研制一种不需要测试仪器, 简便、快速的半定量诊断方法。
本发明提供了一种检测甲胎蛋白半定量快速诊断试剂,其特征 在于该试剂是由样品垫1,固定有有色颗粒标记的抗AFP抗体I的 吸水材料2,微孔膜3,吸水垫4,底板5,抗AFP抗体II A, 抗抗体B组成的试剂。
如图1、图2所示。
图1为检测甲胎蛋白半定量快速诊断试剂侧视图 图2为检测甲胎蛋白半定量快速诊断试剂俯视图 本发明的检测甲胎蛋白半定量快速诊断试剂在使用时采用免疫 层析法(immunochromatographic assay,ICA),这是一种以微孔薄膜 为载体的快速免疫结合方法。
ICA中滴加在膜一端的样品溶液受膜 的毛细管作用向另一端移动。
移动过程中被分析物与固定于膜上某 一区域的受体(抗原或抗体)结合而被固定,无关物则越过该区域 而被分离,然后通过标记物的显色来判断实验结果。
本发明的检测甲胎蛋白半定量快速诊断试剂的半定量是应用下 列原理来达到的。
在制备普通免疫层析法试剂时,人们通常在微孔膜上设检测区 和质控区,但这里的质控区只用来指示该试剂是否失效,与被测物 的含量没有明确关系。
在实验中我们发现,随着被测物含量的增加, 检测区的颜色逐渐加深,而质控区的颜色却逐渐减淡。
我们以有色 颗粒为标记物,通过调节检测区和质控区的抗体包被浓度,使检测 区和质控区的颜色变化及两区的颜色对比与被测物的含量范围呈明 确对应关系,从而达到半定量的目的。
检测时,将试剂样品垫一端浸入待测标本或将待测标本滴加在 样品垫上,等液体前移至前沿达到微孔膜时,取出试剂平放,15分 钟观察结果。
若仅有质控区显色,表明待测物中AFP含量小于正常参考值(例 如30ug/L); 若测试区与质控区均显色,但质控区颜色深于测试区。
表明待 测物中AFP含量在正常参考值与阳性诊断值(例如200μg/L)之间; 若测试区与质控区均显色,但测试区颜色与质控区颜色相同或 略深。
表明待测物中AFP含量大于阳性诊断值; 若测试区与质控区均不显色,说明试剂已经失效。
本发明的另一目的是公开了上述检测甲胎蛋白半定量快速诊断 试剂的制备方法,该方法包括下列步骤: (1)单抗的纯化:含单抗的腹水1份,经12000r/min离心10min 后取上清液加入2份0.06mol/L pH 4.0醋酸缓冲液,按33.3μl/ml腹 水比例加入正辛酸,4℃搅拌30min,离心12000r/min,30min,取 上清液过滤,用0.002mol/L pH7.4的NaCl透析48h;在紫外分光光 度计上测定A280和A260:根据公式:(1.45×A280-0.74×A260) ×稀释倍数,计算蛋白浓度;加入0.2%NaN3,分装,-20℃冻存; (2)多抗的纯化:抗AFP的抗血清1份加上4份0.06M pH 4.0醋酸缓冲液,再加入0.125份的正辛酸,4℃搅拌30min, 10000r/min离心30min,取上清过滤,加入1/10体积的PBS,调 pH至7.0;冷却至4℃,按每ml体积加0.277g比例加入硫酸铵,4 ℃搅拌1h,4000r/min离心15min,沉淀用1份生理盐水溶解,混 匀,再加1份生理盐水,透析,计算蛋白浓度,保存方法同单抗纯 化; (3)胶体金的制备:用柠檬酸还原法制备,配制1%的柠檬 酸钠溶液,按1.5%的比例加入到双蒸水中,煮沸后再按1%的比例 加入1%氯金酸溶液,继续煮沸15min,冷却备用; (4)金标抗体的制备:如上制备的胶体金溶液用0.1mol/L K2CO3调节pH至中性,加入1/10(V/V)的适当浓度的抗AFP抗 体I溶液,室温反应15min后,加入1%聚乙二醇(PEG); 12000r/min离心30min,吸去上清;用含1%BSA的磷酸盐缓冲液 洗涤2-4次;最后沉淀复悬于相当于原体积1/5的1%BSA溶液 中;4℃保存; (5)金标抗体的固定:取金标抗体液与1%BSA溶液1∶1 混匀,按比例加至吸水材料上,干燥; 在微孔膜上平行包被两种抗体,一种为抗AFP抗体II,包被浓 度为2mg/ml;另一种为兔抗鼠IgG,包被浓度为1.5mg/ml;干燥; (6)组合成试剂条:将上述固定着有色颗粒标记抗AFP抗体 I的吸水材料2(5mm*6mm)、包被着抗AFP抗体II和兔抗鼠IgG 的微孔膜3(5mm*20mm)、样品垫1(5mm*23mm)和吸水垫4 (5mm*31mm)按附图粘贴在底板5(5mm*77mm)上组合成试 剂条(见图1、图2); 首先,将微孔膜3粘贴在底板5上,距底板5的近B末端30mm, 然后将吸水垫4粘贴在底板5的近B端,吸水垫4与微孔膜3重叠 处为1mm,再将吸水材料2粘贴在底板5的近A端,吸水材料2与 微孔膜3重叠处为1mm;最后将样品垫1也粘贴在底板5的近A端, 样品垫1与吸水材料2重叠处为1mm。
本发明所述的微孔膜为尼龙膜、PVDF膜、聚酯膜、硝酸纤维 素膜、醋酸纤维素膜或硝酸纤维素与醋酸纤维素的混合膜;所述的 有色颗粒为胶体金、胶体硒或彩色胶乳;所述的抗体为单克隆抗体 或多克隆抗体。
本发明的试剂不需要用测试仪器,具有简便、快速、半定量的 优点,能判断被测体中AFP的含量范围,为临床上肝炎和肝癌的鉴 别诊断提供了更好的检测方法。
实施例1 单抗的纯化:含单抗的腹水1ml经12000r/min,10min离心后 将上清液移入小烧杯中,加2ml 0.06mol/L pH 4.0醋酸缓冲液, 再缓慢滴加33.3μl正辛酸,4℃搅拌30min,离心12000r/min, 30min,上清液经脱脂棉滤入透析袋,对0.002mol/L pH 7.4的NaCl透析48h。
取出纯化的单抗液经1∶20稀释后测A280,A260
根据 公式:(1.45×A280-0.74×A260)×稀释倍数,计算蛋白浓度。
加入0.2%NaN3,分装,-20℃冻存。
胶体金的制备;用柠檬酸还原法。
在100ml双蒸水中加入1% 柠檬酸钠溶液1.5ml,煮沸后再加入1%氯金酸溶液1ml,继续煮沸 15min,冷却备用。
金标抗体的制备:如上制备的胶体金溶液用0.1mol/L K2CO3调节pH至中性,加入1/10(V/V)的适当浓度的抗AFP单抗I溶 液,室温反应15min后,加入1%PEG。
12000r/min离心30min, 吸去上清。
用入1%BSA的磷酸盐缓冲液洗涤2-4次。
最后沉淀 复悬于20ml的1%BSA溶液中。
4℃保存。
金标抗体的固定:取金标抗体液400μl,加1%BSA溶液 400μl,混匀,加至0.6×20cm的玻璃纤维膜上,干燥。
在硝酸纤维素膜上平行包被两种抗体,一种为抗AFP单抗II, 包被浓度为2mg/ml;另一种为兔抗鼠IgG,包被浓度为1.5mg/ml。
干 燥。
将上述玻璃纤维膜、硝酸纤维素膜、样品垫和吸水垫按附图在 PVC底板上组装成试剂条。
实施例2 多抗的纯化:马抗AFP的抗血清1ml加上4ml 0.06M pH 4.0醋 酸缓冲液,再加入125μl的正辛酸,4℃搅拌30min,10000r/min离 心30min,取上清过滤,体积为4.5ml,加450μl PBS,调pH至7.0。
冷却至4℃,加入1.37克硫酸铵,4℃搅拌1h,4000r/min离心 15min,沉淀用1ml生理盐水溶解,混匀,再加1ml生理盐水,透 析,计算蛋白浓度,保存方法同单抗纯化。
金体抗体的制备:金标记抗体为马抗AFP,制备方法同实施例 1。
单抗纯化、胶体金的制备、金标抗体的固定等其余步骤均同实 施例1。
实施例3: 在硝酸纤维素膜上平行包被两种抗体,一种为马抗AFP,包被 浓度为2mg/ml;另一种为兔抗鼠IgG,包被浓度为1.5mg/ml,干燥。
其余步骤均同实施例1。
本发明不限于上述实施方式,还可把制成的试剂放入塑料盒中 组成试剂盒或试剂板,因此凡是利用本发明原理制成的试剂盒或试 剂板均应认为落在本发明的保护范围之内。
展开

查看更多专利详情信息请先登录或注册会员

相关专利类别推荐

获取手机验证码,即可注册成为会员

专利详情咨询

咨询内容

姓名

手机

验证码

用户登录

手机号

手机验证码

提示

不能再减了!!!

提交成功

八月瓜客服中心已经收到您的信息,正在为您派遣知识产权顾问。知识产权顾问会携带贴心的服务以闪电搬的速度与您联系。

扫一扫关注八月瓜微信 创业一手掌握