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新的分子量为13KDa的人神经元线蛋白及其编码序列

基本信息

  • 申请号 CN00111453.0 
  • 公开号 CN1306006A 
  • 申请日 2000/01/18 
  • 公开日 2001/08/01 
  • 申请人 上海生元基因开发有限公司  
  • 优先权日期  
  • 发明人 毛裕民 谢毅  
  • 主分类号  
  • 申请人地址 200001上海市北京东路668号6楼 
  • 分类号  
  • 专利代理机构 上海市华诚律师事务所 
  • 当前专利状态 发明专利申请公布 
  • 代理人 徐申民 
  • 有效性 发明公开 
  • 法律状态
  •  

摘要

本发明公开了一种新的分子量为13KDa的人神经元线蛋白(Novel Human Neuronal Thread Protein 13KDa,简称“BioHNTP13”),编码此多肽的多核苷酸和经重组技术产生这种多肽的方法。
本发明还公开了将此多肽和多核苷酸用于治疗老年痴呆症、唐氏综合症、神经系统肿瘤、免疫紊乱、癌症等疾病的方法。
本发明还公开了抗此多肽的拮抗剂及其治疗作用。
本发明还公开了基于鉴别此核酸序列中的突变和此多肽表达水平改变的诊断测定方法。
本发明还公开了编码这种新的BioHNTP13的多核苷酸的用途。
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权利要求书

1、一种分离的人BioHNTP13多肽,其特征在于,它包括:具有SEQ ID N0.2所示 的氨基酸序列的多肽、或其多肽的片段、类似物或衍生物。
2、如权利要求1所述的多肽,其特征在于,它是具有SEQ ID NO.2所示的氨基酸 序列的多肽或其氨基酸变异不超过5%的衍生物。
3、如权利要求2所述的多肽,其特征在于,它是具有SEQ ID NO.2所示的氨基酸 序列的多肽。
4、一种分离的多核苷酸,其特征在于,所述多核苷酸是选自下组: (a)编码具有SEQ ID NO.2所示氨基酸序列的多肽或其片段、类似物、衍生物的多 核苷酸; (b)与多核苷酸(a)互补的多核苷酸; (c)与(a)或(b)有至少70%相同性的多核苷酸。
5、如权利要求4所述的多核苷酸,其特征在于,所述多核苷酸是编码具有SEQ ID NO.2 所示氨基酸序列的多核苷酸。
6、如权利要求4所述的多核苷酸,其特征在于,所述多核苷酸的序列是具有SEQ ID NO.1中107-460位的序列或具有SEQ ID NO.1中1-3513位的序列。
7、一种含有外源多核苷酸的重组载体,其特征在于,它是由权利要求4所述多核 苷酸与质粒、病毒或表达载体构建而成的重组载体。
8、一种含有外源多核苷酸的遗传工程化宿主细胞,其特征在于,它是选自于下列 一种宿主细胞: (a)用权利要求7所述的重组载体转化或转导的宿主细胞; (b)用权利要求4所述多核苷酸转化或转导的宿主细胞。
9、一种具有BioHNTP13活性的多肽的制备方法,其特征在于,所述方法包括: (a)在适合表达BioHNTP13条件下,培养权利要求8所述的工程化宿主细胞; (b)从培养物中分离出具有BioHNTP13活性的多肽。
10、一种能与多肽结合的抗体,其特征在于,所述抗体是能与BioHNTP13特异性结 合的抗体。
11、一类模拟或调节多肽活性或表达的化合物,其特征在于,它是模拟BioHNTP13 的活性化合物,或促进BioHNTP13的活性的化合物,或拮抗BioHNTP13的活性的化合物, 或抑制BioHNTP13的活性的化合物。
12、如权利要求11所述的化合物,其特征在于,它是SEQ ID NO.1所示的多核苷 酸序列或其片段的反义序列。
13、一种权利要求11所述化合物的应用,其特征在于,所述化合物用于调节 BioHNTP13在体内、体外活性的方法。
14、一种检测与权利要求1所述的BioHNTP13多肽相关的疾病或疾病易感性的方法, 其特征在于,是通过选自下组的方法来检测相关的疾病或疾病的易感性: (a)间接或直接检测所述多肽表达量是否异常; (b)间接或直接检测所述多肽活性是否异常; (c)直接或间接检测多核苷酸中引起所述多肽表达量或活性异常的核苷酸变异。
15、如权利要求1所述多肽的应用,其特征在于,它应用于筛选BioHNTP13的模拟 物、激动剂、拮抗剂或抑制剂;或者用于肽指纹图谱鉴定。
16、如权利要求4所述的核酸分子的应用,其特征在于,它作为引物用于核酸扩增 反应,或者作为探针用于杂交反应,或者用于制造基因芯片或微阵列。
17、一种药物组合物,其特征在于,它含有安全有效量的权利要求1所述的多肽和 /或权利要求4所述的多核苷酸以及药学上可接受的载体。
18、如权利要求1所述的多肽的应用,其特征在于,用所述多肽制备用于治疗老年 痴呆症、唐氏综合症、神经系统肿瘤、免疫紊乱、癌症等疾病的药物。
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说明书

本发明属于生物技术领域和遗传工程领域,具体地说,本发明涉及了一种新的多肽 ——分子量为13KDa的人神经元线蛋白(Novel Human Neuronal Thread Protein 13KDa, 简称“BioHNTP13”),以及编码此多肽的多核苷酸序列。
本发明还涉及此多核苷酸和多 肽的制备方法和应用。
神经元线蛋白(NTP)是一个在神经轴突萌发时表达的磷蛋白家族。
神经元线蛋白积累 在老年痴呆症患者、唐氏综合症患者的脑组织中,在神经元和星形细胞中均有发现,它在正 常和病变的神经轴突萌发时均起关键作用。
其中15-18KD的神经元线蛋白与神经元的分化 和发展有关,在成熟的中枢神经系统受损后的神经元再生过程中起作用。
神经元线蛋白可能 受到中枢神经系统损害和休克的调节[de la Monte SM,et al.,J Cereb Blood Flow Metab 1997;17:623-35]。
神经元线蛋白构成一个表达在脑和原始神经外胚层肿瘤细胞株中的分子家族。
在老年痴 呆症患者的神经元核周质、神经纤维、轴突中它有高水平表达。
在老年痴呆症患者中, AD7c-NTP单抗可标记退化的神经元、轴突球、营养不良神经炎和不规则神经纤维等[De La Monte SM,et al.,J Neuropathol Exp Neurol 1996;55:1038-50]。
NTP的表达受DNA合成、 神经轴突萌发、神经元分化等调节。
乙醇可能抑制与中枢神经系统的神经元分化有关的NTP 表达[Xu YY,et al.,Biochem J 1995;310:125-32]。
研究发现,神经元线蛋白及其编码的多核苷酸与老年痴呆症、唐氏综合症、神经系统 肿瘤等疾病有关。
因此,为治疗目的研究和开发人的神经元线蛋白有重要意义。
本发明的一个目的是提供分离的新的多肽——分子量为13KDa的人神经元线蛋白(简 称为“BioHNTP13”)以及其片段、类似物和衍生物。
本发明的另一个目的是提供编码该BioHNTP13多肽的多核苷酸。
本发明的另一个目的是提供含有编码BioHNTP13的多核苷酸的重组载体。
本发明的另一个目的是提供含有编码BioHNTP13的多核苷酸的基因工程化宿主细胞。
本发明的另一个目的是提供生产BioHNTP13的方法。
本发明的另一个目的是提供针对本发明的BioHNTP13多肽的抗体。
本发明的另一个目的是提供了针对本发明BioHNTP13多肽的模拟化合物、拮抗剂、 激动剂、抑制剂。
本发明的另一个目的是提供诊断和治疗与BioHNTP13异常相关的疾病的方法。
在本发明的第一方面,提供新颖的分离出的分子量为13KDa的人神经元线蛋白 (BioHNTP13),该多肽是人源的,它包含:具有SEQ ID NO:2氨基酸序列的多肽、或其 保守性变异多肽、或其活性片段、或其活性衍生物、类似物。
较佳地,该多肽是具有SEQ ID NO:2氨基酸序列的多肽或其氨基酸变异不超过5%的衍生物。
在本发明的第二方面,提供分离的编码这些多肽的多核苷酸,该多核苷酸包含一核 苷酸序列,该核苷酸序列与选自下组的一种核苷酸序列有至少70%相同性:(a)编码上述 BioHNTP13的多核苷酸;(b)与多核苷酸(a)互补的多核苷酸。
较佳地,该多核苷酸编码 具有SEQ ID NO:2所示氨基酸序列的多肽。
更佳地,该多核苷酸的序列是选自下组的一 种:(a)具有SEQ ID NO:1中107-460位的序列;和(b)具有SEQ ID NO:1中1-3513位 的序列。
在本发明的第三方面,提供了含有上述多核苷酸的载体,以及被该载体转化或转导 的宿主细胞或者被上述多核苷酸直接转化或转导的宿主细胞。
本发明的其它方面由于本文的技术的公开,对本领域的技术人员而言是显而易见 的。
下列附图用于说明本发明的具体实施方案,而不用于限定由权利要求书所界定的本 发明范围。
图1是本发明的分子量为13KDa的人神经元线蛋白(BioHNTP13)和Homo sapiens的 神经元线蛋白(AF010144)的氨基酸序列同源性比较图。
相同氨基酸在两个序列间用单字 符氨基酸表示,相似氨基酸用“+”表示。
图2为分离的分子量为13KDa的人神经元线蛋 白(BioHNTP13)的聚丙烯酰胺凝胶电泳图(SDS-PAGE)。
13kDa为蛋白质的分子量,箭头所指 为分离出的蛋白条带。
如本发明所用,“分离的”是指物质从其原始环境中分离出来(如果是天然的物质, 原始环境即是天然环境)。
例如,活体细胞内的天然状态下的多聚核苷酸和多肽是没有分 离纯化的,但同样的多聚核苷酸或多肽如从天然状态中同存在的其他物质中分开,则为 分离纯化的。
如本文所用,“分离的BioHNTP13蛋白或多肽”是指BioHNTP13基本上不含天然与 其相关的其它蛋白、脂类、糖类或其它物质。
本领域的技术人员能用标准的蛋白质纯化 技术纯化BioHNTP13。
基本上纯的多肽在非还原聚丙烯酰胺凝胶上能产生单一的主带。
BioHNTP13多肽的纯度能用氨基酸分析确定。
本发明提供了一种新的多肽——BioHNTP13多肽,其基本上是由SEQ ID NO:2所示 的氨基酸序列组成的。
本发明的多肽可以是重组多肽、天然多肽、合成多肽,优选重组 多肽。
本发明的多肽可以是天然纯化的产物,或是化学合成的产物,或使用重组技术从 原核或真核宿主(例如,细菌、酵母、高等植物、昆虫和哺乳动物细胞)中产生。
根据重 组生产方案所用的宿主,本发明的多肽可以是糖基化的,或可以是非糖基化的。
本发明 的多肽还可包括或不包括起始的甲硫氨酸残基。
本发明还包括BioHNTP13的片段、衍生物和类似物。
如本发明所用,术语“片段”、 “衍生物”和“类似物”是指基本上保持本发明天然的BioHNTP13相同的生物学功能或 活性的多肽。
本发明多肽的片段、衍生物或类似物可以是:(ⅰ)有一个或多个保守或非保 守性氨基酸残基(优选保守性氨基酸残基)被取代的多肽,而这样的取代的氨基酸残基可 以是也可以不是由遗传密码编码的,或(ⅱ)在一个或多个氨基酸残基中具有取代基团的 多肽,或(ⅲ)成熟多肽与另一个化合物(比如延长多肽半衰期的化合物,例如聚乙二醇) 融合所形成的多肽,或(ⅳ)附加的氨基酸序列融合到此多肽序列而形成的多肽(如前导序 列或分泌序列或用来纯化此多肽的序列或蛋白原序列)。
根据本文的教导,这些片段、衍 生物和类似物属于本领域熟练技术人员公知的范围之内。
本发明还提供了分离的核酸(多核苷酸),该多核苷酸基本由编码具有SEQ ID NO:2氨 基酸序列的多肽的多核苷酸组成。
较佳地,本发明的多核苷酸序列具有SEQ ID NO:1的 核苷酸序列。
本发明的多核苷酸可以是DNA形式或是RNA形式。
DNA形式包括cDNA、基因组DNA 或人工合成的DNA。
DNA可以是单链的或是双链的。
DNA可以是编码链或非编码链。
编码 成熟多肽的编码区序列可以与SEQ ID NO:1所示的编码区序列相同或者是简并的变异体。
如本发明所用,“简并的变异体”在本发明中是指编码具有SEQ ID NO:2的蛋白质或多 肽,但与SEQ ID NO:1所示的编码区序列有差别的核酸序列。
编码SEQ ID NO:2的成熟多肽的多核苷酸包括:只有成熟多肽的编码序列;成熟多 肽的编码序列和各种附加编码序列;成熟多肽的编码序列(和任选的附加编码序列)以及 非编码序列。
术语“编码多肽的多核苷酸”是指包括编码此多肽的多核苷酸和包括附加编码和/ 或非编码序列的多核苷酸。
本发明还涉及上述多核苷酸的变异体,其编码与本发明有相同的氨基酸序列的多肽 或多肽的片段、类似物和衍生物。
此多核苷酸的变异体可以是天然发生的等位变异体或 非天然发生的变异体。
这些核苷酸变异体包括取代变异体、缺失变异体和插入变异体。
如本领域所知的,等位变异体是一种多核苷酸的替换形式,它可能是一个或多个核苷酸 的取代、缺失或插入,但不会从实质上改变其编码的多肽的功能。
本发明还涉及与以上所描述的序列杂交的多核苷酸(两个序列之间具有至少50%,优 选具有70%的相同性)。
本发明特别涉及在严格条件下与本发明所述多核苷酸可杂交的多 核苷酸。
在本发明中,“严格条件”是指:(1)在较低离子强度和较高温度下的杂交和洗 脱,如0.2×SSC,0.1%SDS,60℃;或(2)杂交时加有变性剂,如50%(v/v)甲酰胺,0.1%小 牛血清/0.1%Ficoll,42℃等;或(3)仅在两条序列之间的相同性至少在95%以上,更好是 97%以上时才发生杂交。
并且,可杂交的多核苷酸编码的多肽与SEQ ID NO:2所示的成 熟多肽有相同的生物学功能和活性。
本发明还涉及与以上所描述的序列杂交的核酸片段。
如本发明所用,“核酸片段” 的长度至少含10个核苷酸,较好是至少30个核苷酸,更好是至少50个核苷酸,最好是 至少100个核苷酸以上。
核酸片段也可用于核酸的扩增技术(如PCR)以确定和/或分离编 码BioHNTP13的多核苷酸。
本发明中的多肽和多核苷酸优选以分离的形式提供,更佳地被纯化至均质。
本发明的编码BioHNTP13的特异的多核苷酸序列能用多种方法获得。
例如,用本领 域熟知的杂交技术分离多核苷酸。
这些技术包括但不局限于:1)用探针与基因组或cDNA 文库杂交以检出同源的多核苷酸序列,和2)表达文库的抗体筛选以检出具有共同结构特 征的克隆的多核苷酸片段。
本发明的DNA片段序列也能用下列方法获得:1)从基因组DNA分离双链DNA序列; 2)化学合成DNA序列以获得所述多肽的双链DNA。
上述提到的方法中,分离基因组DNA最不常用。
DNA序列的直接化学合成是经常选 用的方法。
更经常选用的方法是cDNA序列的分离。
分离感兴趣的cDNA的标准方法是从 高表达该基因的供体细胞分离mRNA并进行逆转录,形成质粒或噬菌体cDNA文库。
提取 mRNA的方法已有多种成熟的技术,试剂盒也可从商业途径获得(Qiagene)。
而构建cDNA 文库也是通常的方法(Sambrook,et al.,Molecular Cloning,A Laboratory Manual,Cold Spring Harbor Laboratory.New York,1989)。
还可得到商业供应的eDNA文库,如Clontech 公司的不同cDNA文库。
当结合使用聚合酶链反应技术时,即使极少的表达产物也能克隆。
可用常规方法从这些cDNA文库中筛选本发明的基因。
这些方法包括(但不限于): (1)DNA-DNA或DNA-RNA杂交;(2)标志基因功能的出现或丧失;(3)测定BioHNTP13转录 本的水平;(4)通过免疫学技术或测定生物学活性,来检测基因表达的蛋白产物。
上述方 法可单用,也可多种方法联合应用。
在第(1)种方法中,杂交所用的探针是与本发明的多 核苷酸的任何一部分同源,其长度至少10个核苷酸,较好是至少3个核苷酸,更好是至 少50个核苷酸,最好是至少100个核苷酸。
此外,探针的长度通常在2000个核苷酸之 内,较佳的为1000个核苷酸之内。
此处所用的探针通常是在本发明的基因序列信息的基 础上化学合成的DNA序列。
本发明的基因本身或者片段当然可以用作探针。
DNA探针可 用放射性同位素、荧光素或酶(如碱性磷酸酶)等进行标记。
在第(4)种方法中,检测BioHNTP13基因表达的蛋白产物可用免疫学技术如Western 印迹法,放射免疫沉淀法,酶联免疫吸附法(ELISA)等。
应用PCR技术扩增DNA/RNA的方法(Saiki,et al.Science 1985;230:1350-1354) 被优选用于获得本发明的基因。
特别是很难从文库中得到全长的cDNA时,可优选使用RACE 法(RACE-cDNA末端快速扩增法)。
用于PCR的引物可根据本文所公开的本发明的多核苷 酸序列信息适当地选择,并可用常规方法合成。
可用常规方法如通过凝胶电泳分离和纯 化扩增的DNA/RNA片段。
如上所述得到的本发明的基因或其各种DNA片段的核苷酸序列,可用常规方法如双 脱氧链终止法(Sanger et al.PNAS,1977,74:5463-5467)测定。
这类多核苷酸序列测 定也可用商业测序试剂盒。
为了获得全长的cDNA序列,测序需反复进行。
有时需要测定 多个克隆的cDNA序列,才能拼接成全长的cDNA序列。
本发明也涉及包含本发明的多核苷酸的载体,以及用本发明的载体或直接用 BioHNTP13编码序列经基因工程产生的宿主细胞,以及经重组技术产生本发明所述多肽 的方法。
本发明中,编码BioHNTP13的多核苷酸序列可插入到载体中,以构成含有本发明所 述多核苷酸的重组载体。
术语“载体”指本领域熟知的细菌质粒、噬菌体、酵母质粒、 植物细胞病毒、哺乳动物细胞病毒如腺病毒、逆转录病毒或其它载体。
在本发明中适用, 的载体包括但不限于:在细菌中表达的基于T7启动子的表达载体(Rosenberg,et al.Gene, 1987,56:125);在哺乳动物细胞中表达的pMSXND表达载体(Lee and Nathans,J Bio Chem. 263:3521,1988)和在昆虫细胞中表达的来源于杆状病毒的载体。
总之,只要能在宿主体 内复制和稳定,任何质粒和载体都可以用于构建重组表达载体。
表达载体的一个重要特 征是通常含有复制起始点、启动子、标记基因和翻译调控元件。
可用本领域的技术人员熟知的方法来构建含编码BioHNTP13的DNA序列和合适的转 录/翻译调控元件的表达载体。
这些方法包括体外重组DNA技术、DNA合成技术、体内重 组技术等(Sambroook,et al.Molecular Cloning,a Laboratory Manual,Cold Spring Harbor Laboratory.New York,1989)。
所述的DNA序列可有效连接到表达载体中的适 当启动子上,以指导mRNA合成。
这些启动子的代表性例子有:大肠杆菌的1ac或trp启 动子;λ噬菌体的PL启动子;真核启动子包括CMV立即早期启动子、HSV胸苷激酶启动 子、早期和晚期SV40启动子、反转录病毒的LTRs和其它一些已知的可控制基因在原核 细胞或真核细胞或其病毒中表达的启动子。
表达载体还包括翻译起始用的核糖体结合位 点和转录终止子等。
在载体中插入增强子序列将会使其在高等真核细胞中的转录得到增 强。
增强子是DNA表达的顺式作用因子,通常大约有10到300个碱基对,作用于启动子 以增强基因的转录。
可举的例子包括在复制起始点晚期一侧的100到270个碱基对的SV40 增强子、在复制起始点晚期一侧的多瘤增强子以及腺病毒增强子等。
此外,表达载体优选地包含一个或多个选择性标记基因,以提供用于选择转化的宿 主细胞的表型性状,如真核细胞培养用的二氢叶酸还原酶、新霉素抗性以及绿色荧光蛋 白(GFP),或用于大肠杆菌的四环素或氨苄青霉素抗性等。
本领域一般技术人员都清楚如何选择适当的载体/转录调控元件(如启动子、增强子 等)和选择性标记基因。
本发明中,编码BioHNTP13的多核苷酸或含有该多核苷酸的重组载体可转化或转导 入宿主细胞,以构成含有该多核苷酸或重组载体的基因工程化宿主细胞。
术语“宿主细 胞”指原核细胞,如细菌细胞;或是低等真核细胞,如酵母细胞;或是高等真核细胞, 如哺乳动物细胞。
宿主细胞的代表性例子有:大肠杆菌,链霉菌属;细菌细胞如鼠伤寒 沙门氏菌;真菌细胞如酵母;植物细胞;昆虫细胞如果蝇S2或Sf9;动物细胞如CHO、 COS或Bowes黑素瘤细胞等。
用本发明所述的DNA序列或含有所述DNA序列的重组载体转化宿主细胞可用本领域 技术人员熟知的常规技术进行。
当宿主为原核生物如大肠杆菌时,能吸收DNA的感受态 细胞可在指数生长期后收获,用CaCl2法处理,所用的步骤在本领域众所周知。
也可用MgCl2 进行。
如果需要,转化也可用电穿孔的方法进行。
当宿主是真核生物,可选用如下的DNA 转染方法:磷酸钙共沉淀法,或者常规机械方法如显微注射、电穿孔、脂质体包装等。
通过常规的重组DNA技术(Science,1984;224:1431),利用本发明的多核苷酸序 列可用来表达或生产重组的BioHNTP13。
一般来说有以下步骤: (1).用本发明的编码人BioHNTP13的多核苷酸(或变异体),或用含有该多核苷酸的 重组表达载体转化或转导合适的宿主细胞; (2).在合适的培养基中培养转化或转导的宿主细胞; (3).从培养基或细胞中分离、纯化蛋白质。
在步骤(2)中,根据所用的宿主细胞,培养中所用的培养基可选自各种常规培养基。
在适于宿主细胞生长的条件下进行培养。
当宿主细胞生长到适当的细胞密度后,用合适 的方法(如温度转换或化学诱导)诱导选择的启动子,将细胞再培养一段时间。
在步骤(3)中,重组多肽可包被于细胞内、或在细胞膜上表达、或分泌到细胞外。
如果需要,可利用其物理的、化学的和其它特性通过各种分离方法分离和纯化重组的蛋 白。
这些方法是本领域技术人员所熟知的。
这些方法包括但并不限于:常规的复性处理、 蛋白沉淀剂处理(盐析方法)、离心、渗透破菌、超声波处理、超离心、分子筛层析(凝胶 过滤)、吸附层析、离子交换层析、高效液相层析(HPLC)和其它各种液相层析技术及这些 方法的结合。
本发明的多肽以及该多肽的拮抗剂、激动剂和抑制剂可直接用于疾病治疗。
BioHNTP13 蛋白或多肽可做为药物治疗神经元线蛋白功能低下或丧失所致的疾病。
BioHNTP13的拮 抗剂可用来治疗或预防神经系统退行性疾病,疾病包括但(不局限于):老年痴呆症、帕金 森氏病、舞蹈症、健忘症、亨延顿病、癫痫症、痴呆症等。
BioHNTP13的拮抗剂、激动剂和抑制剂可用来治疗或预防神经系统肿瘤,疾病包括但 (不局限于):星形细胞瘤、室管膜瘤、髓母细胞瘤、脑膜瘤、胶质细胞瘤、听神经瘤、血 管源性肿瘤、脑垂体腺瘤等。
BioHNTP13的片段或衍生物、拮抗剂、激动剂或抑制剂可用来治疗或预防癌症,癌 症包括(但并不局限于):腺癌、白血病、淋巴瘤、黑色素瘤、肉瘤等;尤其是肾、膀胱、 胰腺、骨、脑、乳腺、子宫、胆囊、肝、肺、甲状腺、食道、睾丸、皮肤、肠系膜等部 位有关的癌症。
与BioHNTP13特异性结合的抗体可直接用作拮抗剂,或间接以靶向或传 递机制将药剂带到表达BioHNTP13的细胞或组织中。
BioHNTP13的拮抗剂或片段或衍生 物可用来治疗或预防癌症免疫紊乱。
本发明也提供了筛选化合物以鉴定提高(激动剂)或阻遏(拮抗剂)BioHNTP13的药剂 的方法。
激动剂提高BioHNTP13刺激细胞增殖等生物功能,而拮抗剂阻止和治疗与细胞 过度增殖有关的紊乱如各种癌症。
例如,在药物的存在下,将哺乳动物细胞与标记的 BioHNTP13一起培养,然后测定药物提高或阻遏BioHNTP13作用的能力,从而鉴别出激 动剂或拮抗剂。
BioHNTP13的拮抗剂包括筛选出的抗体、化合物、受体缺失物和类似物等。
BioHNTP13 的拮抗剂可以与BioHNTP13多肽结合并消除其功能,或是抑制该多肽的产生,或是与该 多肽的活性位点结合使该多肽不能发挥生物学功能。
在筛选作为拮抗剂的化合物时,可以将BioHNTP13加入生物分析测定中,通过测定 化合物对BioHNTP13和其受体之间相互作用的影响来确定化合物是否是拮抗剂。
用上述 筛选化合物的同样方法,可以筛选出起拮抗剂作用的受体缺失物和类似物。
能与 BioHNTP13结合的多肽分子可通过筛选由各种可能组合的氨基酸结合于固相物组成的随 机多肽库而获得。
筛选时,一般应对BioHNTP13分子进行标记。
本发明提供了用多肽,及其片段、衍生物、类似物或它们的细胞作为抗原以生产抗 体的方法。
这些抗体可以是多克隆抗体或单克隆抗体。
本发明还提供了针对BioHNTP13 抗原决定簇的抗体。
这些抗体包括(但不限于):多克隆抗体、单克隆抗体、嵌合抗体、 单链抗体、Fab片段和Fab表达文库产生的片段。
多克隆抗体的生产可用BioHNTP13直接注射免疫动物(如家兔,小鼠,大鼠等)的方 法得到。
有多种佐剂可用于增强免疫反应,其中包括但不限于弗氏佐剂等。
制备BioHNTP13 的单克隆抗体的技术包括(但不限于):杂交瘤技术(Kohler and Milstein.Nature,1975, 256:495-497),三瘤技术,人B-细胞杂交瘤技术,EBV-杂交瘤技术等。
将人恒定区和非 人源的可变区结合的嵌合抗体可用已有的技术生产(Morrison et al, PNAS,1985,81:6851)。
而已有的生产单链抗体的技术(U.S.Pat No.496778)也可用于生 产抗BioHNTP13的单链抗体。
抗BioHNTP13的抗体可用于免疫组织化学技术中,检测活检标本中的BioHNTP13。
与BioHNTP13结合的单克隆抗体也可用放射性同位素标记,注入体内可跟踪其位置和分 布。
这种放射性标记的抗体可作为一种非创伤性诊断方法用于肿瘤细胞的定位和判断是 否有转移。
抗体还可用于设计针对体内某一特殊部位的免疫毒素。
如BioHNTP13高亲和性的单 克隆抗体可与细菌或植物毒素(如白喉毒素,蓖麻蛋白,红豆碱等)共价结合。
一种通常 的方法是用巯基交联剂如SPDP,攻击抗体的氨基,通过二硫键的交换,将毒素结合于抗 体上,这种杂交抗体可用于杀灭BioHNTP13阳性的细胞。
本发明中的抗体可用于治疗或预防与BioHNTP13相关的疾病。
给予适当剂量的抗体 可以刺激或阻断BioHNTP13的产生或活性。
本发明还涉及定量和定位检测BioHNTP13水平的诊断试验方法。
这些试验是本领域 所熟知的,且包括FISH测定和放射免疫测定。
试验中所检测的BioHNTP13水平,可以用 作解释BioHNTP13在各种疾病中的重要性和用于诊断BioHNTP13起作用的疾病。
本发明的多肽还可用作肽谱分析。
例如,多肽可用物理的、化学或酶进行特异性切 割,并进行一维或二维或三维的凝胶电泳分析,更好的是进行质谱分析。
编码BioHNTP13的多核苷酸也可用于多种治疗目的。
基因治疗技术可用于治疗由于 BioHNTP13的无表达或异常/无活性表达所致的细胞增殖、发育或代谢异常。
重组的基因 治疗载体(如病毒载体)可设计用于表达变异的BioHNTP13,以抑制内源性的BioHNTP13 活性。
例如,一种变异的BioHNTP13可以是缩短的、缺失了信号传导功能域的BioHNTP13, 虽可与下游的底物结合,但缺乏信号传导活性。
因此重组的基因治疗载体可用于治疗 BioHNTP13表达或活性异常所致的疾病。
来源于病毒的表达载体如逆转录病毒、腺病毒、 腺病毒相关病毒、单纯疱疹病毒、细小病毒等可用于将编码BioHNTP13的多核苷酸转移 至细胞内。
构建携带编码BioHNTP13的多核苷酸的重组病毒载体的方法可见于已有文献 (Sambrook,et al.)。
另外重组编码BioHNTP13的多核苷酸可包装到脂质体中然后再转移 至细胞内。
多核苷酸导入组织或细胞内的方法包括:将多核苷酸直接注入到体内组织中;或在 体外通过载体(如病毒、噬菌体或质粒等)先将多核苷酸导入细胞中,再将细胞移植到体 内等。
抑制BioHNTP13 mRNA的寡核苷酸(包括反义RNA和DNA)以及核酶也在本发明的范围 之内。
核酶是一种能特异性分解特定RNA的酶样RNA分子,其作用机制是核酶分子与互 补的靶RNA特异性杂交后进行核酸内切作用。
反义的RNA和DNA及核酶可用已有的任何 RNA或DNA合成技术获得,如固相磷酸酰胺化学合成法合成寡核苷酸的技术已广泛应用。
反义RNA分子可通过编码该RNA的DNA序列在体外或体内转录获得。
这种DNA序列已整 合到载体的RNA聚合酶启动子的下游。
为了增加核酸分子的稳定性,可用多种方法对其 进行修饰,如增加两侧的序列长度,核糖核苷之间的连接应用磷酸硫酯键或肽键而非磷 酸二酯键。
编码BioHNTP13的多核苷酸可用于诊断与BioHNTP13相关的疾病。
编码BioHNTP13 的多核苷酸可用于检测BioHNTP13的表达与否或在疾病状态下BioHNTP13的异常表达。
如编码BioHNTP13的DNA序列可用于对活检标本进行杂交以判断BioHNTP13的表达状况。
杂交技术包括Southern印迹法,Northern印迹法、原位杂交等。
这些技术方法都是公 开的成熟技术,相关的试剂盒都可从商业途径得到。
本发明的多核苷酸的一部分或全部 可作为探针固定在微阵列(microarray)或DNA芯片(又称为“基因芯片”)上,用于分析 组织中基因的差异表达分析和基因诊断。
用BioHNTP13特异的引物进行RNA-聚合酶链反 应(RT-PCR)体外扩增也可检测BioHNTP13的转录产物。
检测BioHNTP13基因的突变也可用于诊断BioHNTP13相关的疾病。
BioHNTP13突变 的形式包括与正常野生型BioHNTP13 DNA序列相比的点突变、易位、缺失、重组和其它 任何异常等。
可用已有的技术如Southern印迹法、DNA序列分析、PCR和原位杂交检测 突变。
另外,突变有可能影响蛋白的表达,因此用Northern印迹法、Western印迹法可 间接判断基因有无突变。
本发明的序列对染色体鉴定也是有价值的。
该序列会特异性地针对某条人染色体具 体位置且并可以与其杂交。
目前,需要鉴定染色体上的各基因的具体位点。
然而,现在 只有很少的基于实际序列数据(重复多态性)的染色体标记物可用于标记染色体位置。
根 据本发明,为了将这些序列与疾病相关基因相关联,其重要的第一步就是将这些DNA序 列定位于染色体上。
简而言之,根据cDNA制备PCR引物(优选15-35bp),可以将序列定位于染色体上。
然后,将这些引物用于PCR筛选含各条人染色体的体细胞杂合细胞。
只有那些含有相应 于引物的人基因的杂合细胞会产生扩增的片段。
体细胞杂合细胞的PCR定位法,是将DNA定位到具体染色体的快捷方法。
使用本发 明的寡核苷酸引物,通过类似方法,可利用一组来自特定染色体的片段或大量基因组克 隆而实现亚定位。
可用于染色体定位的其它类似策略包括原位杂交、用标记的流式分选 的染色体预筛选和杂交预选,从而构建染色体特异的cDNA库。
将cDNA克隆与中期染色体进行荧光原位杂交(FISH),可以在一个步骤中精确地进 行染色体定位。
此技术的综述,参见Verma等,Human Chromosomes:a Manual of Basic Techniques,Pergamon Press,New York(1988)。
一旦序列被定位到准确的染色体位置,此序列在染色体上的物理位置就可以与基因 图数据相关联。
这些数据可见于例如,V.Mckusick,Mendelian Inheritance in Man(可 通过与Johns Hopkins University Welch Medical Library联机获得)。
然后可通过连 锁分析,确定基因与业已定位到染色体区域上的疾病之间的关系。
接着,测定患病和未患病个体间的cDNA或基因组序列差异。
如果在一些或所有的 患病个体中观察到某突变,而该突变在任何正常个体中未观察到,则该突变可能是疾病 的病因。
比较患病和未患病个体,通常涉及首先寻找染色体中结构的变化,如从染色体 水平可见的或用基于cDNA序列的PCR可检测的缺失或易位。
根据目前的物理作图和基因 定位技术的分辨能力,被精确定位至与疾病有关的染色体区域的cDNA,可以是50至500 个潜在致病基因间之一种(假定1兆碱基作图分辨能力和每20kb对应于一个基因)。
可以将本发明的多肽、多核苷酸及其模拟物、激动剂、拮抗剂和抑制剂与合适的药 物载体(药学上可接受的载体)组合后使用。
这些载体可以是水、葡萄糖、乙醇、盐类、 缓冲液、甘油以及它们的组合。
组合物包含安全有效量的本发明多肽或拮抗剂以及不影 响药物效果的载体和赋形剂。
这些组合物可以作为药物用于疾病治疗。
本发明还提供含有一种或多种容器的药盒或试剂盒,容器中装有一种或多种本发明 的药用组合物成分。
与这些容器一起,可以有由制造、使用或销售药品或生物制品的政 府管理机构所给出的指示性提示,该提示反映出生产、使用或销售的政府管理机构许可 其在人体上施用。
此外,本发明的多肽可以与其它的治疗化合物结合使用。
药物组合物可以方便的方式给药,如通过局部、静脉内、腹膜内、肌内、皮下、鼻 内或皮内等的给药途径。
BioHNTP13以有效地治疗和/或预防具体的适应症的量来给药。
施用于患者的BioHNTP13的量和剂量范围将取决于许多因素,如给药方式、待治疗者的 健康条件和诊断医生的判断。
在本发明的一个实例中,提供了一种分离的多核苷酸,它编码具有SEQ ID NO:2 所示氨基酸序列的成熟多肽。
该多核苷酸是从人胎脑组织的cDNA文库中发现的,多核苷 酸序列全长为3513个碱基,其开放读框(107-460)编码了117个氨基酸。
根据氨基酸序 列同源比较发现,此多肽与Homo sapiens的神经元线蛋白有54%的同源性,由此推断本 发明新的人BioHNTP13具有神经元线蛋白基因家族相似的结构和功能。
本发明所提供的人BioHNTP13的cDNA、寡聚核苷酸、多肽及抗体等,对于研究不同 组织和细胞中神经元线蛋白的作用、诊断神经元线蛋白失调的相关性疾病、筛选抑制剂 或药物治疗这些疾病有重要价值。
此外,由于本发明的人BioHNTP13蛋白具有源自人的天然氨基酸序列,因此,与来 源于其他物种的同族蛋白相比,预计在施用于人时将具有更高的活性和/或更低的副作用 (例如在人体内的免疫原性更低或没有)。
下面结合具体实施例,进一步阐述本发明。
应理解,这些实施例仅用于说明本发明 而不用于限制本发明的范围。
下列实施例中未注明具体条件的实验方法,通常按照常规 条件如Sambrook等人,分子克隆:实验室手册(New York:Cold Spring Harbor Laboratory Press,1989)中所述的条件,或按照制造厂商所建议的条件。
实施例1:BioHNTP13 cDNA的克隆 用异硫氰酸胍/酚/氯仿一步法提取人胎脑总RNA。
用Quick mRNA分离试剂盒 (Qiegene公司产品)从总RNA中分离poly(A)mRNA。
2ug poly(A)mRNA经逆转录形成 cDNA。
用Smart cDNA克隆试剂盒(购自Clontech)将cDNA片段定向插入到pBSK(+)载体 (Clontech公司产品)的多克隆位点上,转化DH5α细菌形成cDNA文库。
用染料终止循环 反应测序试剂盒(Perkin-Elmer公司产品)和ABI 377自动测序议(Perkin-Elmer公司) 测定所有克隆的5’和3’末端的序列。
将测定的cDNA序列与已有的公共DNA序列数据库 (Genbank)进行比较,结果发现其中一个克隆(0094f02)的cDNA序列为新的DNA。
通过合 成一系列引物对该克隆所含的插入cDNA片段进行双向测定。
结果表明,0094f02克隆所 含的全长cDNA为3513bp(如SEQ ID NO:1所示),从第107bp至460bp有一个354bp的 开放阅读框架(0RF),编码一个新的蛋白质(如SEQ ID NO:2所示)。
此克隆被命名为 pBS-0094f02,其编码的蛋白质命名为分子量为13KDa的人神经元线蛋白(简称为 “BioHNTP13”)。
实施例2:cDNA克隆的同源检索 将本发明的人BioHNTP13基因的核苷酸序列及其编码的蛋白序列,用Blast程序 (Basic local Alignment search tool)[Altschul,SF et al.J.Mol. Biol.1990;215:403-10],在Genbank、Swissport等数据库进行同源检索。
与本发明的 人BioHNTP13基因同源性最高的基因是一种已知的Homo sapiens的神经元线蛋白的基因, 其编码的蛋白在Genbank的准入号为AF010144。
蛋白质同源比较结果示于图1,两者高度, 同源,其相同性为54%;相似性为60%。
这表明,本发明的新多肽具有神经元线蛋白的结 构和功能。
实施例3:用RT-PCR方法克隆BioHNTP13基因 用胎脑细胞总RNA为模板,以oligo-dT为引物进行逆转录反应合成cDNA,用Qiagene 的试剂盒纯化后,用下列引物进行PCR扩增: 引物1:5’-GACATACTTTTGAATAACTA-3’(SEQ ID NO.3) 引物2:5’-AAAGGCCACAGCACAAAATT-3’(SEQ ID NO.4) 引物1对应于SEQ ID NO:1的5’端的第1bp开始的正向序列;引物2对应于SEQ ID NO:1 中的3’端反向序列。
扩增反应的条件:在50μl的反应体积中含有50mmol/L KCl,10mmol/LT ris-Cl,(pH8.5),1.5mmol/L MgCl2,200μmol/L dNTP,10pmol引物,1U的Taq DNA聚合酶 (Clontech公司产品)。
在PE9600型DNA热循环仪(Perkin-Elmer公司)上按下列条件反应25 个周期:94℃ 30sec;55℃,30sec;72℃ 2min。
在RT-PCR时同时设β-肌动蛋白为阳性 对照和模板空白为阴性对照。
扩增产物用QIAGEN公司的试剂盒纯化,用TA克隆试剂盒连 接到pCR载体上(Invitrogen公司产品)。
DNA序列分析结果表明,PCR产物的DNA序列与SEQ ID NO:1所示的1-3513bp完全相同。
实施例4:Northern印迹法分析BioHNTP13基因的表达: 用一步法提取总RNA[Anal.Biochem 1987,162,156-159]。
该法包括酸性硫氰酸 胍苯酚-氯仿抽提。
即用4M异硫氰酸胍-25mM柠檬酸钠,0.2M乙酸钠(pH4.0)对组织进行 匀浆,加入1倍体积的苯酚和1/5体积的氯仿-异戊醇(49∶1),混合后离心。
吸出水相 层,加入异丙醇(0.8体积)并将混合物离心得到RNA沉淀。
将得到的RNA沉淀用70%乙醇 洗涤,干燥并溶于水中。
用20μg RNA,在含20mM 3-(N-吗啉代)丙磺酸(pH7.0)-5mM乙酸钠-1mM EDTA-2.2M 甲醛的1.2%琼脂糖凝胶上进行电泳。
然后转移至硝酸纤维素膜上。
用α-32p dATP通过随 机引物法制备32p-标记的DNA探针。
所用的DNA探针为SEQ 1所示的PCR扩增的BioHNTP13 编码区序列(107bp至460bp)。
32p-标记的探针(约2×106cpm/ml)与转移了RNA的硝酸 纤维素膜在溶液中于42℃杂交过夜,该溶液包含50%甲酰胺-25mM KH2PO4(pH7.4)- 5×SSC-5×Denhardt’s溶液和200μg/ml鲑精DNA。
杂交之后,将滤膜在1×SSC-0.1%SDS 中于55℃洗30min。
然后,用Phosphor Imager进行分析和定量。
实施例5:重组BioHNTP13的体外表达、分离和纯化 根据SEQ ID NO:1的编码区序列(107-460位),设计出一对特异性扩增引物,序列 如下: 引物3:5’-CCCGGATCCATGTGCCCCTGGTGGAGAAT-3’(SEQ ID No 5) 引物4:5’-CCCGCGGCCGCGGAAGAAGAGAGTTACGTTT-3’(SEQ ID No 6) 此两段引物的5’端分别含有BamHⅠ和NotⅠ酶切位点,其后分别为目的基因5’端 和3’端的编码序列,BamHⅠ和NotⅠ酶切位点相应于表达载体质粒pET-28b(+)(Novagen公 司产品,Cat.No.69865.3)上的选择性内切酶位点。
以含有全长目的基因的pBS-0094f02, 质粒为模板,进行PCR反应。
PCR反应条件为:总体积50μl中含pBS-0094f02质粒10pg、 引物3和引物4分别为10pmmol、Advantage polymerase Mix(Clontech公司产品)1μl。
循环参数:94℃20s,60℃30s,68℃2min,共25个循环。
用BamHⅠ和NotⅠ分 别对扩增产物和质粒pET-28(+)进行双酶切,分别回收大片段,并用T4连接酶连接。
连 接产物转化用氯化钙法大肠杆细菌DH5α,在含卡那霉素(终浓度30μg/ml)的LB平板培 养过夜后,用菌落PCR方法筛选阳性克隆,并进行测序。
挑选序列正确的阳性克隆(pET- 0094f02)用氯化钙法将重组质粒转化大肠杆菌BL21(DE3)plySs(Novagen公司产品)。
在 含卡那霉素(终浓度30μg/ml)的LB液体培养基中,宿主菌BL21(pET-0094f02)在37℃培 养至对数生长期,加入IPTG至终浓度1mmol/L,继续培养5小时。
离心收集菌体,经超 声波破菌,离心收集上清,用能与6个组氨酸(6His-Tag)结合的亲和层析柱His.Bind Quick Cartridge(Novagen公司产品)进行层析,得到了纯化的目的蛋白BioHNTP13。
经 SDS-PAGE电泳,在13kDa处得到一单一的条带。
将该条带转移至PVDF膜上用Edams水 解法进行N-端氨基酸序列分析,结果N-端15个氨基酸与SEQ ID NO:2所示的N-端15 个氨基酸残基完全相同。
实施例6:抗BioHNTP13抗体的产生 用多肽合成仪(PE公司产品)合成下述BioHNTP13特异性的多肽:Met-Cys-Pro-Trp- Trp-Arg-Ile-Leu-Leu-Gln-Pro-Leu-Cys-Cys-Phe(SEQ ID NO:7)。
将该多肽分别与血蓝蛋白和 牛血清白蛋白耦合形成复合物,方法参见:Avrameas,et al.Immunochemistry,1969; 6:43。
用4mg上述血蓝蛋白多肽复合物加上完全弗氏佐剂免疫家兔,15天后再用血蓝蛋 白多肽复合物加不完全弗氏佐剂加强免疫一次。
采用经15μg/ml牛血清白蛋白多肽复合 物包被的滴定板做ELISA测定兔血清中抗体的滴度。
用蛋白A-Sepharose从抗体阳性的 家兔血清中分离总IgG。
将多肽结合于溴化氰活化的Sepharose 4B柱上,用亲和层析法 从总IgG中分离抗多肽抗体。
免疫沉淀法证明纯化的抗体可特异性地与BioHNTP13结合。
实施例7:本发明的多核苷酸片段用作杂交探针的应用 从本发明的多核苷酸中挑选出合适的寡核苷酸片段用作杂交探针有多方面的用途,如 用该探针可与不同来源的正常组织或病理组织的基因组或cDNA文库杂交以鉴定其是否含有 本发明的多核苷酸序列和检出同源的多核苷酸序列,进一步还可用该探针检测本发明的多核 苷酸序列或其同源的多核苷酸序列在正常组织或病理组织细胞中的表达是否异常。
本实施例的目的是从本发明的多核苷酸SEQ ID NO:1中挑选出合适的寡核苷酸片段用 作杂交探针,并用滤膜杂交方法鉴定一些组织中是否含有本发明的多核苷酸序列或其同源 的多核苷酸序列。
滤膜杂交方法包括斑点印迹法、Southern印迹法、Northern印迹法和复 印方法等,它们都是将待测的多核苷酸样品固定在滤膜上后使用基本相同的步骤杂交。
这 些相同的步骤是:固定了样品的滤膜首先用不含探针的杂交缓冲液进行预杂交,以使滤膜 上样品的非特异性的结合部位被载体和合成的多聚物所饱和。
然后预杂交液被含有标记探 针的杂交缓冲液替换,并保温使探针与靶核酸杂交。
杂交步骤之后,未杂交上的探针被一 系列洗膜步骤除掉。
本实施例利用较高强度的洗膜条件(如较低盐浓度和较高的温度),以 使杂交背景降低且只保留特异性强的信号。
本实施例选用的探针包括两类:第一类探针是 完全与本发明的多核苷酸SEQ ID NO:1相同或互补的寡核苷酸片段;第二类探针是部分与 本发明的多核苷酸SEQ ID NO:1相同或互补的寡核苷酸片段。
本实施例选用斑点印迹法将 样品固定在滤膜上,在较高强度的的洗膜条件下,第一类探针与样品的杂交特异性最强而 得以保留。
一、探针的选用 从本发明的多核苷酸SEQ ID NO:1中选择寡核苷酸片段用作杂交探针,应遵循以下原 则和需要考虑的几个方面: 1,探针大小优选范围为18-50个核苷酸; 2,GC含量为30%-70%,超过则非特异性杂交增加; 3,探针内部应无互补区域; 4,符合以上条件的可作为初选探针,然后进一步作计算机序列分析,包括将该初选探针分    别与其来源序列区域(即SEQ ID NO:1)和其它已知的基因组序列及其互补区进行同源    性比较,若与非靶分子区域的同源性大于85%或者有超过15个连续碱基完全相同,则该    初选探针一般就不应该使用; 5,初选探针是否最终选定为有实际应用价值的探针还应进一步由实验确定。
完成以上各方面的分析后挑选并合成以下二个探针: 探针1(probe1),属于第一类探针,与SEQ ID NO:1的基因片段完全同源或互补 (41Nt):GACATACTTTTGAATAACTAAATACATTTCTCAGAATCATT。
探针2(probe2),属于第二类探针,相当于SEQ ID NO:1的基因片段或其互补片 段的替换突变序列(41Nt):TTAGAGACATGAAATACATAACTATTAAGATAGTAGTATCT。
与以下具体实验步骤有关的其它未列出的常用试剂及其配制方法请参考文献:DNA PROBES G.H.Keller;M.M.Manak;Stockton Press,1989(USA)以及更常用的分子克隆实验 手册书籍如《分子克隆实验指南》(1998年第二版)[美]萨姆布鲁克等著,科学出版社。
样品制备: 1,从新鲜或冰冻组织中提取DNA 步骤:1)将新鲜或新鲜解冻的人胎脑组织放入浸在冰上并盛有磷酸盐缓冲液(PBS) 的平皿中。
用剪刀或手术刀将组织切成小块。
操作中应保持组织湿润。
2)以1000g离心切 碎组织10分钟。
3)用冷匀浆缓冲液(0.25mol/L蔗糖;25mmol/L Tris-HCl,pH7.5; 25mmol/LnaCl;25mmol/L MgCl2)悬浮沉淀(大约10ml/g)。
4)在4℃用电动匀浆器以全速 匀浆组织悬液,直至组织被完全破碎。
5)1000g离心10分钟。
6)用重悬细胞沉淀(每0.1g 最初组织样品加1-5ml),再以1000g离心10分钟。
7)用裂解缓冲液重悬沉淀(每0.1g最初 组织样品加1ml),然后接以下的苯酚抽提法。
2,DNA的苯酚抽提法 步骤:1)用1-10ml冷PBS洗细胞,1000g离心10分钟。
2)用冷细胞裂解液重悬浮沉淀 的细胞(1×108细胞/ml)最少应用100ul裂解缓冲液。
3)加SDS至终浓度为1%,如果在重 悬细胞之前将SDS直接加入到细胞沉淀中,细胞可能会形成大的团块而难以破碎,并降低的 总产率。
这一点在抽提>107细胞时特别严重。
4)加蛋白酶K至终浓度200ug/ml。
5)50℃保 温反应1小时或在37℃轻轻振摇过夜。
6)用等体积苯酚∶氯仿∶异戊醇(25∶24∶1)抽提, 在小离心机管中离心10分钟。
两相应清楚分离,否则重新进行离心。
7)将水相转移至新管。
8)用等体积氯仿∶异戊醇(24∶1)抽提,离心10分钟。
9)将含DNA的水相转移至新管。
然后进行DNA的纯化和乙醇沉淀。
3,DNA的纯化和乙醇沉淀 步骤:1)将1/10体积2mol/L醋酸钠和2倍体积冷100%乙醇加到DNA溶液中,混匀。
在-20℃ 放置1小时或至过夜。
2)离心10分钟。
3)小心吸出或倒出乙醇。
4)用70%冷乙醇500ul洗 涤沉淀,离心5分钟。
5)小心吸出或倒出乙醇。
用500ul冷乙醇洗涤沉淀,离心5分钟。
6) 小心吸出或倒出乙醇,然后在吸水纸上倒置使残余乙醇流尽。
空气干燥10-15分钟,以使表 面乙醇挥发。
注意不要使沉淀完全干燥,否则较难重新溶解。
7)以小体积TE或水重悬DNA 沉淀。
低速涡旋振荡或用滴管吹吸,同时逐渐增加TE,混合至DNA充分溶解,每1-5×106细 胞所提取的大约加1ul。
以下第8-13步骤仅用于必须除去污染时,否则可直接进行第14步骤。
8)将RNA酶A加到DNA溶液中,终浓度为100ug/ml,37℃保温30分钟。
9)加入SDS和蛋白酶K, 终浓度分别为0.5%和100ug/ml。
37℃保温30分钟。
10)用等体积的苯酚∶氯仿∶异戊醇(25∶ 24∶1)抽提反应液,离心10分钟。
11)小心移出水相,用等体积的氯仿∶异戊醇(24∶1) 重新抽提,离心10分钟。
12)小心移出水相,加1/10体积2mol/L醋酸钠和2.5体积冷乙醇, 混匀置-20℃1小时。
13)用70%乙醇及100%乙醇洗涤沉淀,空气干燥,重悬核酸,过程同 第3-6步骤。
14)测定A260和A280以检测DNA的纯度及产率。
15)分装后存放于-20℃。
样膜的制备: 1)取4×2张适当大小的硝酸纤维素膜(NC膜),用铅笔在其上轻轻标出点样位置及样号, 每一探针需两张NC膜,以便在后面的实验步骤中分别用高强度条件和强度条件洗膜。
2)吸取及对照各15微升,点于样膜上,在室温中晾干。
3)置于浸润有0.1mol/LNaOH,1.5mol/LNaCl的滤纸上5分钟(两次),晾干置于浸润有 0.5mol/L Tris-HCl(pH7.0),3mol/LNaCl的滤纸上5分钟(两次),晾干。
4)夹于干净滤纸中,以铝箔包好,60-80℃真空干燥2小时。
探针的标记 1)3μlProbe(0.10D/10μl),加入2μlKinase缓冲液,8-10uCiγ-32p-dATP+2U Kinase, 以补加至终体积20μl。
2)37℃保温2小时。
3)加1/5体积的溴酚蓝指示剂(BPB)。
4)过Sephadex G-50柱。
5)至有32p-Probe洗出前开始收集第一峰(可用Monitor监测)。
6)5滴/管,收集10-15管。
7)用液体闪烁仪监测同位素量 8)合并第一峰的收集液后即为所需制备的32P-Probe(第二峰为游离γ-32P-dATP)。
预杂交:将样膜置于塑料袋中,加入3-10mg预杂交液(10×Denhardt’s;6×SSC,0.1mg/ml CT DNA(小牛胸腺DNA)。
),封好袋口后,68℃水浴摇2小时。
杂交:将塑料袋剪去一角,加入制备好的探针,封好袋口后,42℃水浴摇过夜。
洗膜: 高强度洗膜: 1)取出已杂交好的样膜。
2)2×SSC,0.1%SDS中,40℃洗15分钟(2次)。
3)0.1×SSC,0.1%SDS中,40℃洗15分钟(2次)。
4)0.1×SSC,0.1%SDS中,55℃洗30分钟(2次),室温晾干。
低强度洗膜: 1)取出已杂交好的样膜。
2)2×SSC,0.1%SDS中,37℃洗15分钟(2次)。
3)0.1×SSC,0.1%SDS中,37℃洗15分钟(2次)。
4)0.1×SSC,0.1%SDS中,40℃洗15分钟(2次),室温晾干。
X-光自显影:-70℃,X-光自显影(压片时间根据杂交斑放射性强弱而定)。
实验结果:采用低强度洗膜条件所进行的杂交实验,以上四个探针杂交斑放射性强弱 没有明显区别;而采用低强度洗膜条件所进行的杂交实验,探针1的杂交斑放射性强度明显 强于其它三个探针杂交斑的放射性强度。
因而可用探针1定性和定量地分析本发明的多核苷 酸在不同组织中的存在和差异表达。
在本发明提及的所有文献都在本申请中引用作为参考,就如同每一篇文献被单独引用 作为参考那样。
此外应理解,在阅读了本发明的上述讲授内容之后,本领域技术人员可以对 本发明作各种改动或修改,这些等价形式同样落于本申请所附权利要求书所限定的范围。
序列表 (1)一般信息:   (ⅰ)发明名称:新的人分子量为13KDa的神经元线蛋白及其编码序列   (ⅱ)序列数目:7 (2)SEQ ID NO:1的信息:   (ⅰ)序列特征: (A)长度:3513bp (B)类型:核酸 (C)链性:双链 (D)拓扑结构:线性   (ⅱ)分子类型:cDNA  (ⅲ)序列描述:SEQ ID NO:1:    1.GACATACTTTTGAATAACTAAATACATTTCTCAGAATCATTTAATTAAAAAGCCTGAAGT   61  AGTTAGTACCTTGAAAGAAGTTGGCTGTTCTTAGGTTGAATTGTAAATGTGCCCCTGGTG  121  GAGAATCTTGCTGCAGCCTTTGTGTTGTTTTATTTTATTTTATTTTTTTGAGACAGAGTC  181  TCGCTCTGTTGCCCAGGCTGGAGTGCAGTGGCGCGATCTTGGCTCACTGCAACCTCCCAG  241  GTTCAAGCGGTTCTCCTGCCTCAGCCTCCCAAGTGGCTCGGATTACAGGCATGTGCACCA  301  TGCCTGGTTAATTTTTGTATTTTTAGTGGAGACGGGGTTTTGCCATGTTGGCCAGGCTGG  361  TCTCGAACTCCTGACCTCACGTGATCCACCCGCCTTGGCCTTCCAGAGTGTTGGAATTGC  421  AGGCATGAGCCACCATGCCTGGCCTTTTGCATTGTTTTAAAACGTAACTCTCTTCTTCCA  481  ACCCCCAAAAATATGTTTTCATTTACCCTTCAAAGTTAACTTTAGAATGTTACCACAGCT  541  TTATAACAAGGAATGTTTATTCACAATTAACAAAGGATGCTTTATTCAAATGCAAATATG  601  TTGACTCAAATATTTTCAAATTTATGGAATTATCAAAAAGCAGCCAAAAATGAAACAAAG  661  TTTGAGGCATGTAATTCATACCTAATAAGTTAATAATATATCTGAGATGGAATCATACAC  721  ATACAGATCTTTTTATTACAGTTTGAAAAAAAATAAGCAGGAAAAACTGAGTCATGAATG  781  AATTCTTATTATGCTCTGTACTTATTTAACCTAGTTTATATAAATTGAACCACATGTTTA  841  CGTTTAAAAGGACTTTGCATGTTGATTAATGAATTAGACACATTGGGTTTATTGCAGGGT  901  TTTTTTGGTCATCTCTTTAAACTCTTGTTTTCTTTGCAGGTTAAAAGAATGGCAAATTCA  961  TATCTATATTTTTAATAACTTTGTATCTCTTTTTAGATTTGTATTGAACGATGTCTTGAG 1021  AGGGGAAAGAGTAGTGGTAGGAGTGATGACAACAGAGAGAGCTTGGAAAAGAGGTGCTTG 1081  GCAGTTTTTACATACAACCACTTCAATCCCAGACCTGCCTTATTTGGTACAGGAATAAAA 1141  GAGTCACATTTAAACATGTAAAATGGCTTGTTTAAGATGTTAGGTCAATCAGTCGGGGCA 1201  GATCCAGTGTTCTGTGAGCTCTCCTATAACATGTAGAAGAAAGGATAGATACCTAGAACC 1261  TTGCAATATTTACTTCTTTTGCAGAATTCAGACCTACCTTCAGTCAACAAAGCCAATTAT 1321  TGACTTATATGAAGAAATGGGGAAAGTCAAGAAAATAGATGCTTCTAAATCTGTTGATGA 1381  AGTTTTTGATGAAGTTGTGCAGATTTTTGACAAGGAAGGCTAATTCTAAACCTGAAAGCA 1441  TCCTTGAAATCATGCTTGAATATTGCTTTGATAGCTGCTATCATGACCCCTTTTTAAGGC 1501  AATTCTAATCTTTCATAACTACATCTCAATTAGTGGCTGGAAAGTACATGGTAAAACAAA 1561  GTAAATTTTTTTATGTTCTTTTTTTTGGTCACAGGAGTAGACAGTGAATTCAGGTTTAAC 1621  TTCACCCTAGTTATGGTGCTCACCAAACGAAGGGTATCAGCTATTTTTTTTTAAATTCAA 1681  AAAGAATATCCCTTTTATAGTTTGTGCCTTCTGTGAGCAAAACTTTTTAGTACGCGTATA 1741  TATCCCTCTAGTAATCACAACATTTTAGGATTTAGGGATACCCGCTTCCTCTTTTTCTTG 1801  CAAGTTTTAAATTTCCAACCTTAAGTGAATTTGTGGACCAAATTTCAAAGGAACTTTTTG 1861  TGTAGTCAGTTCTTGCACAATGTGTTTGGTAAACAAACTCAAAATGGATTCTTAGGAGCA 1921  TTTTAGTGTTTATTAAATAACTGACCATTTGCTGTAGAAAGATGAGAAAACTTAAGCTTT 1981  GTTTTACTACAACTTGTACAAAGTTGTATGACAGGGCATATTCTTTGCTTCCAAGATTTG 2041  GGTTGGGGGCACTAGGGGTTCAGAGCCTGGCAGAATTGTCAGCTTTAGTCTGACATAATC 2101  TAAGGGTATGGGGCAAGGATCACATCTAATGCTTGTGTTCCTTATACTCTATTATATAGT 2161  GTTATTCATGATTCAGCTGATCTTAACAAAATTCGTAGCAGTGGAACCTTGAAATGCATG 2221  TGGCTAGATTTATGCTAAAATGATTCTCAGTTAGCATTTTAGTAACACTTCAAAGGTTTT 2281  TTTTTGTTTGTTTTCTAGACTTAATAAAAGCTTAGGATTAATTAGAAGAAGCAATCTAGT 2341  TAAATTTCCCATTTGTATTTTATTTTCTTGAATACTTTTTTCATAGTTATTTGTTTAAAA 2401  AGATTTAAAAATCATTGCACTTTGGTCAGAAAAATAATAAATATATCTTATAAATGTTTG 2461  ATTCCCTTCCTTGCTATTTTTATTCAGTAGATTTTTGTTTGGCATCATGTTGAAGCACCG 2521  AAAGATAAATGATTTTTAAAAGGCTATAGAGTCCAAAGGAATATTCTTTTACACCAATTC 2581  TTCCTTTAAAAATCTCTGAGGAATTTGTTTTCGCCTTACTTTTTTTTCTTCTGTCACAAT 2641  GCTAAGTGGTATCCGAGGTTCTTAATATGAGATTTAAAATCTTAAAATGTTTCTTATTTT 2701  CAGCACTTACATCATTTGGTACACAGGGTCAAATAGGGCAAATAATTTTGTCTTTGTATA 2761  ATAGATTTGATATTTAAAGTCACTGGAAATAGGACAAGTTAATGGATGTTTTTATATTTT 2821  AATAGAATCATTTATTTCTATGTGTTATGAAATTCACTTAATGATAAATTTTTCAACATA 2881  CTTGCCATTAGAAAACAAAGTATTGCTAAGTACTATAACATATTGGCCACTAAAATTCAT 2941  ATTGAGATTATCTTGGTTTCTTGGAAGAGATAGGAATGAGTTCTTATCTAGTGTTGCAGG 3001  CCAGCAAATACAGAGGTGGTTTGATCAAACAGCTCTAGTATGAAGCAAGAGTAAAGACTA 3061  AGGTTTCGAGAGCATTCCTACTCACATAAGTGAAGAAATCTGTCAGATAGGAATCTAAAT 3121  ATTTATAGTGAGATTGTGAAAGCAACCTTAAAGTTTTGAAGAAGACTGATGAGACTAGGT 3181  GCTTTGCTTCCTTTCATCAGGTATCTTTCTGTGGCATTTGAGAACAGAAACCAAGAAACA 3241  TGGTAATTACTAAATTATGAGGCTTTGCTTTTTGTTTGCTTTTAAGTAGAAAAACATGTT 3301  GGCAACATTGAGTTTTGGAGTTGATTGAGATAATATGACTTAACTAGTTTTGTCATTCCA 3361  TTTGTTAAAGATACAGTCACCAAGAATGTTTTGAGTTTTTTGAAAGACCCCAATTTAAGC 3421  CTTGCTTATTTTTAAATTATTTCCATTCAGTGATGTTGGATGTATATCAGTTATTTAGTA 3481  AATAATCTCAATAAATTTTGTGCTGTGGCCTTT (2)SEQ ID N0:2的信息:   (ⅰ)序列特征: (A)长度:117个氨基酸 (B)类型:氨基酸 (D)拓扑结构:线性   (ⅱ)分子类型:多肽   (ⅲ)序列描述:SEQ ID N0:2:   1 Met Cys Pro Trp Trp Arg Ile Leu Leu Gln Pro Leu Cys Cys Phe  16 Ile Leu Phe Tyr Phe Phe Glu Thr Glu Ser Arg Ser Val Ala Gln  31 Ala Gly Val Gln Trp Arg Asp Leu Gly Ser Leu Gln Pro Pro Arg  46 Phe Lys Arg Phe Ser Cys Leu Ser Leu Pro Ser Gly Trp Asp Tyr  61 Arg His Val His His Ala Trp Leu Ile Phe Val Phe Leu Val Glu  76 Thr Gly Phe Cys His Val Gly Gln Ala Gly Leu Glu Leu Leu Thr  91 Ser Gly Asp Pro Pro Ala Leu Ala Phe Gln Ser Val Gly Ile Ala 106 Gly Met Ser His His Ala Trp Pro Phe Ala Leu Phe (2)SEQ ID NO:3的信息   (ⅰ)序列特征 (A)长度:20个碱基 (B)类型:核酸 (C)链性:单链 (D)拓扑结构:线性   (ⅱ)分子类型:寡核苷酸   (ⅲ)序列描述:SEQ ID NO:3: GACATACTTTTGAATAACTA                                           20 (2)SEQ ID NO:4的信息   (ⅰ)序列特征 (A)长度:20个碱基 (B)类型:核酸 (C)链性:单链 (D)拓扑结构:线性   (ⅱ)分子类型:寡核苷酸   (ⅲ)序列描述:SEQ ID NO:4: AAAGGCCACAGCACAAAATT                                           20 (2)SEQ ID NO:5的信息   (ⅰ)序列特征 (A)长度:29个碱基 (B)类型:核酸 (C)链性:单链 (D)拓扑结构:线性   (ⅱ)分子类型:寡核苷酸   (ⅲ)序列描述:SEQ ID NO:5: GCCGGATCCATGTGCCCCTGGTGGAGAAT                                      29 (2)SEQ ID NO:6的信息   (ⅰ)序列特征 (A)长度:31个碱基 (B)类型:核酸 (C)链性:单链 (D)拓扑结构:线性   (ⅱ)分子类型:寡核苷酸   (ⅲ)序列描述:SEQ ID NO:6: CCCGCGGCCGCGGAAGAAGAGAGTTACGTTT                                    31 (2)SEQ ID NO:7的信息:   (ⅰ)序列特征: (A)长度:15个氨基酸 (B)类型:氨基酸 (D)拓扑结构:线性   (ⅱ)分子类型:多肽   (ⅲ)序列描述:SEQ ID NO:7: Met-Cys-Pro-Trp-Trp-Arg-Ile-Leu-Leu-Gln-Pro-Leu-Cys-Cys-Phe        15 展开

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