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高分子嵌段共聚物-药物复合制剂

基本信息

  • 申请号 CN00121901.4 
  • 公开号 CN1288728A 
  • 申请日 1996/09/26 
  • 公开日 2001/03/28 
  • 申请人 科学技术振兴事业团 樱井靖久 日本化药株式会社  
  • 优先权日期  
  • 发明人 樱井靖久 横山昌幸 片冈一则 冈野光夫 福岛重人 植原隆治 阿久津智子 冈本一也 真柴洋子 町田芽久美 清水和久  
  • 主分类号  
  • 申请人地址 日本琦玉县 
  • 分类号  
  • 专利代理机构 上海专利商标事务所 
  • 当前专利状态 发明专利申请公布 
  • 代理人 沙永生 
  • 有效性 发明公开 
  • 法律状态
  •  

摘要

本发明公开可用碱处理使具有抗癌活性的蒽环类化合物直接相互化学结合而制得的蒽环类化合物的二聚物、三聚物或四聚物,以及一种高分子嵌段共聚物-药物复合制剂,其中具有亲水聚合物片段和疏水聚合物片段的高分子嵌段共聚物形成以亲水片段为外层的胶束,在其疏水内芯含有蒽环类化合物的二聚物、三聚物或四聚物,如有必要还含其它药物。
上述的药物制剂具有高的药效和低的毒性。
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权利要求书

1.一种高分子嵌段共聚物-药物复合制剂,其特征在于具有亲水聚合物片段 和疏水聚合物片段的高分子嵌段共聚物形成亲水片段为外层的胶束,在其疏水内 芯含有蒽环类化合物的二聚物、三聚物或四聚物,如有必要还含其它药物。
2.如权利要求1所述的高分子嵌段共聚物-药物复合制剂,其特征在于通过 用碱处理使具有抗癌活性的蒽环类化合物直接相互化学结合可制得蒽环类化合 物的二聚物、三聚物或四聚物。
3.如权利要求2所述的高分子嵌段共聚物-药物复合制剂,其特征在于所述 的蒽环类化合物至少包括一种选自阿霉素、柔红霉素、吡柔比星、表柔比星及其 酸式盐的化合物。
4.如权利要求1所述的高分子嵌段共聚物-药物复合制剂,其特征在于通过 用碱处理使阿霉素分子或其酸式盐直接化学相互结合或者使阿霉素或其酸式盐 与柔红霉素或其酸式盐直接化学相互结合可制得蒽环类化合物的二聚物。
5.如权利要求2所述的高分子嵌段共聚物-药物复合制剂,其特征在于蒽环 类化合物的相互结合模式是席夫碱键合模式。
6.如权利要求4所述的高分子嵌段共聚物-药物复合制剂,其特征在于所述 的二聚物具有如下结构式(AA): 7.如权利要求2所述的高分子嵌段共聚物-药物复合制剂,其特征在于通过 用碱处理使阿霉素分子或其酸式盐直接相互化学结合可制得阿霉素的三聚物,所 述的三聚物具有图7所示的质谱。
8.如权利要求2所述的高分子嵌段共聚物-药物复合制剂,其特征在于高分 子嵌段共聚物具有如下通式(1)或(2)的结构: 式中R1表示氢原子或低级烷基,R2表示连接基团,R3表示亚甲基或亚乙基, R4独立地表示羟基或具有抗癌活性的蒽环类化合物的残基,R5表示氢原子或保护 基团,n是5-1000之间的一个整数,m是2-300之间的一个整数,x是0-300之 间的一个整数,前提是x不大于m。
9.如权利要求8所述的高分子嵌段共聚物-药物复合制剂,其特征在于具有 抗癌活性的蒽环类化合物的残基是用如下通式(3)表示的基团: 式中Y表示-CH2OH或-CH3,Z表示H或 10.如权利要求1所述的高分子嵌段共聚物-药物复合制剂,其特征在于在由 高分子嵌段共聚物形成的胶束内芯中以高分子嵌段共聚物为基准含有2-60%重 量的蒽环类化合物二聚物、三聚物或四聚物。
11.如权利要求1所述的高分子嵌段共聚物-药物复合制剂,其特征在于在由 高分子嵌段共聚物形成的胶束内芯中含有重量比为1∶0.5~20的蒽环类抗癌药物和 蒽环类化合物的二聚物、三聚物或四聚物。
12.如权利要求11所述的高分子嵌段共聚物-药物复合制剂,其特征在于蒽 环类抗癌药物和蒽环类化合物的二聚物、三聚物或四聚物的重量比为1∶0.7~10。
13.如权利要求11所述的高分子嵌段共聚物-药物复合制剂,其特征在于蒽 环类抗癌药物和蒽环类化合物的二聚物、三聚物或四聚物的重量比为1∶1~5。
14.如权利要求11所述的高分子嵌段共聚物-药物复合制剂,其特征在于蒽 环类抗癌药物至少是一种选自阿霉素、柔红霉素、吡柔比星、表柔比星及其酸式 盐的药物。
15.一种高分子嵌段共聚物-药物复合制剂,其中具有亲水聚合物片段和疏水 聚合物片段的高分子嵌段共聚物形成亲水片段为外层的胶束,并且在其疏水内芯 含有蒽环类抗癌药物,其特征在于当将该药物制剂给7至9周龄CDF1鼠静脉注 射时,如果注射制剂中蒽环类抗癌药物的用量定为100,则注射1小时后1毫升 小鼠血浆中蒽环类抗癌药物的含量为10(%剂量/毫升)或更多。
16.如权利要求15所述的药物制剂,其特征在于注射1小时后1毫升小鼠血 浆中蒽环类抗癌药物的含量为20-60(%剂量/毫升)。
17.如权利要求15所述的药物制剂,其特征在于蒽环类抗癌药物至少是一种 选自阿霉素、柔红霉素、吡柔比星、表柔比星及其酸式盐的药物。
18.如权利要求1-17中任一项所述的药物制剂,其特征在于它用于治疗实体 癌症。
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说明书

本申请是国际申请号为PCT/JP96/02789,国际申请日为1996年9月26日的 PCT国际申请进入中国阶段后的国家申请号为96191130.1的中国专利申请的分 案申请。
本发明涉及新颖的蒽环类化合物衍生物和含有这种衍生物的高分子嵌段共 聚物-药物复合制剂。
已知由放线菌的培养液获得的柔红霉素(英国专利1003383,美国专利 3616242)、阿霉素(美国专利3590028,美国专利3803124)等是蒽环类(anthracycline) 抗癌药剂。
它们对实验肿瘤具有广谱的抗实验肿瘤性能,而且也广泛用作癌症化 学治疗药。
然而在另一方面,已知它们常引起严重的副作用,如白细胞减少症、 脱毛症、心肌疾病等。
为了解决这个问题,曾提出了各种衍生物。
例如,吡柔比星(通用名)通过在 阿霉素糖部分的4’位引入一个四氢吡喃基而企图减少其毒性。
同样,表柔比星(通用名)是这样一种化合物,在该化合物中使阿霉素糖部分 的4’位羟基与α位连接,从而企图减少其毒性。
然而,虽然这些药与阿霉素相比具有较低的毒性,但还未完全解决其问题, 如有限的总剂量等。
在另一方面,利用嵌段共聚物形成的高分子胶束改善微溶于水的药物的溶解 性是一种已知的技术。
现已证明在日本专利申请(公开)2-300133、日本专利申请(公 开)6-107565、日本专利申请(公开)5-955、日本专利申请(公开)5-124969、日本专 利申请(公开)5-117385、日本专利申请(公开)6-206830、日本专利申请(公开)7- 69900和日本专利申请(公开)6-206815中制得的高分子嵌段共聚物药物复合制剂 具有比阿霉素更好的抗癌作用。
本发明人曾对比现有高分子嵌段共聚物-药物复合制剂具有更高药效和更低 毒性的高分子嵌段共聚物-药物复合制剂进行了深入的研究。
结果完成了本发明。
因此,本发明涉及: (1)蒽环类化合物的二聚物、三聚物或四聚物,这种化合物可通过碱处理使具 有抗癌活性的蒽环类化合物互相直接化学键合而制得; (2)上述第(1)项所述的蒽环类化合物的二聚物、三聚物或四聚物,其中蒽环 类化合物至少含有选自阿霉素、柔红霉素、吡柔比星、表柔比星及其酸式盐的一 种化合物; (3)蒽环类化合物的二聚物,这种二聚物可通过碱处理使阿霉素分子或其酸式 盐直接相互化学键接或者使阿霉素或其酸式盐与柔红霉素或其酸式盐直接化学 键接而制得; (4)上述第(1)、(2)或(3)项所述的蒽环类化合物的二聚物、三聚物或四聚物, 其中蒽环类化合物的相互成键模式是席夫碱成键模式; (5)具有如下结构式(AA)的阿霉素二聚物: (6)通过碱处理使阿霉素分子或其酸式盐相互直接化学键接而制得并具有如 图7所示质谱的阿霉素三聚物; (7)一种高分子嵌段共聚物-药物复合制剂,其中具有亲水聚合物片段和疏水 聚合物片段的高分子嵌段共聚物形成亲水片段为外层的胶束,在其疏水内芯含有 蒽环类化合物的二聚物、三聚物或四聚物,如有必要还含其它药物; (8)如上述第(7)项所述的高分子嵌段共聚物-药物复合制剂,其中蒽环类化合 物的二聚物、三聚物或四聚物是上述第(1)、(2)、(3)、(4)、(5)或(6)项所述的蒽环 类化合物的二聚物、三聚物或四聚物; (9)如上述第(7)或(8)项所述的高分子嵌段共聚物-药物复合制剂,其中高分子 嵌段共聚物具有如下通式(1)或(2)的结构: 式中R1表示氢原子或低级烷基,R2表示连接基团,R3表示亚甲基或亚乙基, R4独立地表示羟基或具有抗癌活性的蒽环类化合物的残基,R5表示氢原子或保护 基团,n是5-1000之间的一个整数,m是2-300之间的一个整数,x是0-300之 间的一个整数,前提是x不大于m; (10)如上述第(9)项所述的高分子嵌段共聚物-药物复合制剂,其中具有抗癌活 性的蒽环类化合物残基是用如下通式(3)表示的一个基团: 式中Y表示-CH2OH或-CH3,Z表示H或 (11)如上述第(7)、(8)、(9)或(10)项所述的高分子嵌段共聚物-药物复合制剂, 其中在由高分子嵌段共聚物形成的胶束内芯中含有2-60%重量的蒽环类化合物 二聚物、三聚物或四聚物,以高分子嵌段共聚物为基准; (12)如上述第(7)、(8)、(9)、(10)或(11)项所述的高分子嵌段共聚物-药物复 合制剂,其中蒽环类化合物二聚物、三聚物或四聚物是阿霉素的二聚物; (13)如上述第(7)、(8)、(9)、(10)、(11)或(12)项所述的高分子嵌段共聚物-药 物复合制剂,其中在由高分子嵌段共聚物形成的胶束内芯中含有重量比为 1∶0.5~20的蒽环类抗癌药物和蒽环类化合物的二聚物、三聚物或四聚物; (14)如上述第(13)项所述的高分子嵌段共聚物-药物复合制剂,其中蒽环类抗 癌药物和蒽环类化合物的二聚物、三聚物或四聚物重量比为1∶0.7~10; (15)如上述第(13)项所述的高分子嵌段共聚物-药物复合制剂,其中含有重量 比为1∶1~5的蒽环类抗癌药物和蒽环类化合物的二聚物、三聚物或四聚物; (16)如上述第(13)、(14)或(15)项所述的高分子嵌段共聚物-药物复合制剂,其 中蒽环类抗癌药物至少是选自阿霉素、柔红霉素、吡柔比星、表柔比星及其酸式 盐的一个药物; (17)一种高分子嵌段共聚物-药物复合制剂,其中具有亲水聚合物片段和疏水 聚合物片段的高分子嵌段共聚物形成亲水片段为外层的胶束,并且在其疏水内芯 含有蒽环类抗癌药物,其特征在于当将该药物制剂给7至9周龄CDF1小鼠静脉 注射时,如果注射制剂中蒽环类抗癌药物的用量定为100,则注射1小时后1毫 升鼠血浆中蒽环类抗癌药物的含量为10(%剂量/毫升)或更多; (18)如上述第(17)项所述的药物制剂,其中注射1小时后1毫升小鼠血浆中 蒽环类抗癌药物的含量为20-60(%剂量/毫升); (19)如上述第(17)或(18)项所述的药物制剂,其中蒽环类抗癌药物至少是一种 选自阿霉素、柔红霉素、吡柔比星、表柔比星及其酸式盐的药物; (20)如上述第(7)至(19)中任一项所述的药物制剂,其特征在于用于治疗实体 癌(solid cancer)。
图1是阿霉素二聚物的红外吸收光谱图。
图2是阿霉素二聚物的紫外光谱图。
图3是阿霉素二聚物的质谱图。
图4是可能具有式(4)结构的化合物的红外吸收光谱图,它是用酸处理阿霉素 二聚物时与阿霉素一起产生的化合物。
图5是可能具有式(4)结构的化合物的紫外光谱图,它是用酸处理阿霉素二聚 物时与阿霉素一起产生的化合物。
图6是可能具有式(4)结构的化合物的质量色谱图(m/z=560),它是用酸处理 阿霉素二聚物时与阿霉素一起产生的化合物。
图7是阿霉素三聚物的质谱图。
图8、9、10或11分别是由实施例1(2)分离得到的组分的NMR分析得到的 1H一维谱、13C一维谱、COSY谱或CH COSY谱。
图12是柔红霉素和阿霉素的二聚物的质谱图。
图13是实施例3中制得的药物制剂的高压液相色谱图。
图14是实施例4中制得的药物制剂的高压液相色谱图。
图15是实施例5中制得的药物制剂的高压液相色谱图。
图16是应用例1中小鼠给予盐酸阿霉素后小鼠结肠(Colon)26腺癌的肿瘤生 长曲线图。
图17是应用例1中小鼠给予实施例3中制得的药物制剂后小鼠结肠 (Colon)26腺癌的肿瘤生长曲线图。
图18是实施例6中制得的药物制剂的高压液相色谱图。
图19是实施例7中制得的药物制剂的高压液相色谱图。
图20是实施例8中制得的药物制剂的高压液相色谱图。
图21是实施例9中制得的药物制剂的高压液相色谱图。
图22是实施例10中制得的药物制剂的高压液相色谱图。
图23是实施例11中制得的药物制剂的高压液相色谱图。
图24是实施例12中制得的药物制剂的高压液相色谱图。
图25、26或27分别是应用例3中小鼠给予盐酸阿霉素、实施例8中制得的 药物制剂或实施例12中制得的药物制剂后小鼠结肠(Colon)26腺癌的肿瘤生长曲 线图。
以下详细描述本发明。
根据本发明,能够获得具有比常规蒽环类抗癌药物或现有高分子嵌段共聚物 -药物复合制剂更高药效和更低毒性的药物制剂。
本发明中所用的具有抗癌活性的蒽环类化合物的例子包括阿霉素、柔红霉 素、吡柔比星、表柔比星及其酸式盐。
制备本发明蒽环类化合物的二聚物、三聚物或四聚物的方法没有特别限制, 例如对具有抗癌活性的蒽环类化合物进行碱处理就可获得所述的二聚物、三聚物 或四聚物。
碱处理时,通过相互直接化学键接(即不是用交联剂的化学键接,而是 通过蒽环类化合物的官能团间的反应形成的化学键接)可以得到蒽环类化合物的 二聚物、三聚物或四聚物。
蒽环类化合物的二聚物、三聚物或四聚物可以通过使相同或不同化合物分子 成键而制得。
所述的碱处理的例子有将蒽环类化合物溶解于一种溶剂中,然后加入碱的方 法。
只要能溶解所述的化合物,对所用的溶剂没有特别的限定。
它的例子包括水、 N,N-二甲基甲酰胺(DMF)、二甲亚砜(DMSO)、二噁烷、四氢呋喃(THF)、甲醇、 乙腈以及它们的混合溶剂。
如果所加入的碱能溶解于所述的溶剂,而且加入碱后的溶液具有7-14的pH 值,则对所加入的碱没有限制,可以为任何一种无机碱、有机碱及其盐。
对碱的 浓度也没有特别的限制。
所需碱的例子包括氢氧化钠、氢氧化钾、碳酸钠、碳酸 氢钠、碳酸钾、碳酸氢钾、磷酸钠、磷酸氢二钠、磷酸二氢钠、磷酸钾、磷酸氢 二钾、磷酸二氢钾、具有2-20个碳原子的仲胺或叔胺、及其酸式加成盐。
碱处理 时pH值为7-14,较好的为8-10。
如果溶液没有冻结或沸腾,对碱处理的温度没有特别的限定,但优选的为 0-50℃,更优选的为0-40℃。
处理时间为1分钟-120小时,较好的为10分钟至 24小时。
所得的蒽环类化合物的二聚物、三聚物或四聚物可以使用已知的纯化技术进 行提纯。
例如,可以通过冻干、沉淀等,或通过渗析交换溶剂或超滤后冻干、沉 淀等获得固体物质。
当需要进一步提纯所得固体物质时,可以使用薄层色谱、液 相色谱等。
当将既有羰基结构取代基又有氨基的化合物用作蒽环类化合物,或将具有羰 基结构取代基的化合物与另一种具有氨基的化合物组合使用时,通过上述的碱处 理得到蒽环类化合物经席夫碱成键相互化学结合的二聚物、三聚物或四聚物。
结 果将既有羰基结构取代基又有氨基的化合物或者与有氨基的化合物结合使用具 有羰基结构取代基的化合物作为蒽环类化合物,是令人满意的。
关于这一点,具 有羰基结构取代基的例子包括可被羟基或卤原子(如氟、氯、溴和碘原子)取代的 具有2-5个碳原子的酰基;或可被羟基或卤原子取代的具有3-10个碳原子的酰基 烷基。
当用酸处理蒽环类化合物经席夫碱成键相互结合而形成的二聚物、三聚物或 四聚物时,至少产生一种曾用作原料的蒽环类化合物。
所述的酸处理的例子有将 蒽环类化合物的二聚物、三聚物或四聚物溶解于溶剂中,并加入酸的方法。
只要 能溶解所述的化合物,对所用的溶剂没有特别的限制。
溶剂的例子包括水、N,N- 二甲基甲酰胺(DMF)、二甲亚砜(DMSO)、二噁烷、四氢呋喃(THF)、甲醇、乙腈 以及它们的混合溶剂。
任何一种无机酸(如盐酸、硝酸、硫酸和磷酸)或有机酸(如 甲酸、乙酸和三氟乙酸)都可用作所加入的酸。
酸处理时pH值较好的为2-4。
如果溶液不冻结或沸腾,对酸处理的温度也没 有特别的限制,但较好的为0-50℃,更好为20-40℃。
处理时间为1分钟-120小 时,更好为24-72小时。
具有图1中所示的红外吸收光谱和图2中所示的紫外光谱的阿霉素二聚物可 以列举为可通过上述碱处理使蒽环类化合物直接化学键接制得的本发明蒽环类 化合物的二聚物、三聚物或四聚物。
这种阿霉素二聚物也具有图3所示的质谱。
这种阿霉素二聚物具有上述结构式(AA)所示的结构。
红外吸收光谱:1676,1417,1217,1158cm-1; 紫外光谱:λmas=486nm; 质谱(ESI),m/z(%):1067(100),964(10),938(15),921(13),653(20),524(20), 506(50),488(98)。
关于这一点,用于测量这些光谱的仪器和测量条件如下。
红外吸收光谱用 Perkin-Elmer Co.制造的System 2000以及溴化钾压片法测量。
紫外光谱用Hitachi Co.制造的U3200型分光光度计在甲醇溶液中测量。
质谱用VG公司制造的 QUATTRO 2质谱仪和电喷雾法测量。
用酸处理时,该阿霉素二聚物产生阿霉素以及可能具有如下式(4)所示结构的 化合物: 可能具有通式(4)结构的化合物的红外吸收光谱、紫外光谱或质量色谱 (m/z=560,用液相色谱/质谱(LC/MS)得到)分别表示在图4、图5或图6中。
关于这一点,测量这些光谱和色谱所用的仪器和测量条件如下。
红外吸收光 谱用测量图1所示光谱所用的相同仪器和相同条件进行测量。
紫外光谱用Hitachi 公司制造的U3200型在苄醇溶液中进行测量。
用LC/MS测量质量色谱的仪器和 测量条件如下。
LC: 柱:C4.300埃/5微米,Waters Co.制造; 洗脱剂:乙腈/0.1%三氟乙酸+0.05%MS7(MS7;Gasukuro Kogyo Co.制造); 梯度洗脱: 时间(分)        0     20    25    30    35    36    40 乙腈浓度(%)    22    40    50    90    90    22    22 流速:1毫升/分 MS:VG公司制造的QUATTRO 2(电喷雾法)。
具有图7中所示的质谱,而且当用酸处理时能产生阿霉素的阿霉素三聚物可 以列举作为本发明的另一种可用上述碱处理方法使蒽环类化合物直接化学结合 而得到的蒽环类化合物二聚物、三聚物或四聚物的例子。
本发明高分子嵌段共聚物-药物复合制剂中所用的高分子嵌段共聚物的亲水 聚合物片段的结构可以包括聚乙二醇、多糖、聚丙烯酰胺、聚甲基丙烯酰胺、聚 乙烯醇、聚乙烯基吡咯烷酮、脱乙酰壳多糖等的结构,虽然只要具有亲水聚合物 的结构,对此并没有特别的限定。
特别优选的结构是聚乙二醇结构。
疏水高聚物片段的结构可以包括聚苯乙烯、聚氨基酸(聚天冬氨酸、聚谷氨 酸、聚赖氨酸等)、聚丙烯酸、聚甲基丙烯酸、聚马来酸、或其衍生物或其盐等的 结构,虽然只要具有疏水聚合物的结构,对此并没有特别的限定。
其中聚氨基酸、 其衍生物或其盐是优选的,聚天冬氨酸、聚谷氨酸、其衍生物或其盐是特别优选 的。
虽然没有特别的限定,所述盐的例子包括钠盐、钾盐等。
聚氨基酸结构的衍生物例子包括芳族胺、脂族胺、芳族醇、脂族醇、芳族硫 醇、脂族硫醇之类的疏水化合物被连接到其侧链上的衍生物,只要疏水基团能连 接到侧链上,并使聚氨基酸片段具有疏水性,对连接到侧链上的疏水基团并没有 特别的限制。
优选的衍生物是具有芳环的胺被连接到侧链上的聚天冬氨酸或聚谷 氨酸衍生物。
高分子嵌段共聚物的优选例子包括具有用通式(1)或(2)表示的上述化学结构 的高分子嵌段共聚物。
在上述通式(1)或(2)中,R1表示氢或低级烷基,其中低级烷基的例子是具有 1-3个碳原子的烷基,优选的为甲基。
用R2表示的连接基团具有与在聚乙二醇片段末端处形成聚氨基酸片段所用 的方法和化合物相应的结构,以便将形成聚乙二醇片段的化合物末端转化为适于 上述形成过程的结构。
它的例子包括具有1-8个碳原子的亚烷基,如亚甲基、亚 乙基、1,2-亚丙基、1,3-亚丙基和亚异丁基,其中1,3-亚丙基是优选的。
R3表示亚甲基、亚乙基,优选的是亚甲基。
R4独立地表示羟基或具有抗癌活性的蒽环类化合物的残基。
各种残基可用作 具有抗癌活性的蒽环类化合物的残基,对此没有特别的限定,可优选使用通式(3) 表示的基团。
用通式(3)表示的基团的示意性例子包括阿霉素残基、柔红霉素残 基、吡柔比星残基和表柔比星残基。
虽然R4独立地表示羟基或具有抗癌活性的蒽环类化合物的残基,但至少一 部分,较好的为5-80%高分子嵌段共聚物中存在的所有R4基团宜为具有抗癌活 性的蒽环类化合物的残基,更好的为20-60%的高分子嵌段共聚物中存在的R4基 团为上述蒽环类化合物的残基。
虽然R4独立地表示羟基或具有抗癌活性的蒽环类化合物的残基,但具有蒽 骨架或蒽醌骨架的基团,如日本专利申请(公开)6-206830中所揭示的具有蒽骨架 或蒽醌骨架的取代基,可用于代替上述蒽环类化合物的残基。
R5表示氢或保护基团,其中脂族或芳族酰基可列举为保护基团。
虽然没有特 别的限定,但保护基团可用已知的方法引入,如用酸酐进行的方法或用酰卤进行 的方法。
氢原子或乙酰基适用作R5
另外,n为5-1000,较好的为15-400,m为2-300,较好的为10-100,x为 0-300,较好的为0-100。
高分子嵌段共聚物的分子量较好的为1000-100000,更好的为5000-50000, 虽然当嵌段共聚物可溶于水时对分子量并没有特别的限定。
只要本发明药物制剂 能保持水溶解性,对高分子嵌段共聚物中亲水聚合物片段与疏水聚合物片段之比 没有特别限定,但较好的为1∶0.1~10(重量),更好的为1∶0.1~5(重量)。
虽然可包含在高分子嵌段共聚物胶束内芯的除蒽环类化合物二聚物、三聚物 或四聚物以外的药物并不一定是必要组分,但它的例子包括阿霉素、柔红霉素、 吡柔比星、表柔比星、氨甲蝶呤、丝裂霉素、依托泊甙、顺铂及其衍生物之类的 抗癌药物。
其中蒽环类抗癌药物是优选的,阿霉素、柔红霉素、吡柔比星、表柔 比星或其酸式盐是特别优选的。
高分子嵌段共聚物-药物复合制剂中蒽环类化合物的二聚物、三聚物或四聚 物的含量较好为1-100%重量,更好为2-60%重量(以高分子嵌段共聚物为基准)。
然而,只要不损害高分子嵌段共聚物-药物复合制剂的胶束形成能力,二聚物、三 聚物或四聚物尽可能大的用量是没有问题的。
高分子嵌段共聚物-药物复合制剂中蒽环类化合物二聚物、三聚物或四聚物 以外的其它药物的含量较好为0-100%重量,更好为2-60%重量,以高分子嵌段 共聚物为基准。
然而,只要不损害高分子嵌段共聚物-药物复合制剂的胶束形成能 力,所述其它药物尽可能大的用量是没有问题的。
当高分子嵌段共聚物-药物复合制剂含有“蒽环类化合物的二聚物、三聚物 或四聚物以外的药物”时,“蒽环类化合物的二聚物、三聚物或四聚物以外的药 物”与“蒽环类化合物的二聚物、三聚物或四聚物”的重量比一般为1∶0.05~100, 较好的为1∶0.5~20,更好的为1∶0.7~10,最好的为1∶1~5。
虽然对高分子嵌段共聚物胶束内芯所含的蒽环类化合物的二聚物、三聚物或 四聚物没有特别限定,但上述第(1)至(6)项中所述的蒽环类化合物的二聚物、三聚 物或四聚物是适宜的。
胶束内芯中可只含这些二聚物、三聚物或四聚物中的一 种,或胶束内芯中可含这些二聚物、三聚物或四聚物中的两种或多种。
制备高分子嵌段共聚物的方法是已知的,例如它可用如下方法制备,即可使 构成亲水聚合物片段的化合物(如聚乙二醇、多糖、聚丙烯酰胺、聚甲基丙烯酰胺、 聚乙烯醇、聚乙烯基吡咯烷酮、脱乙酰壳多糖等或其衍生物)或其末端改性的产物 与构成疏水聚合物片段的聚合物化合物反应,或使构成亲水聚合物片段的化合物 或其末端改性产物与可聚合单体反应,然后如有必要,进行衍生物形成反应之类 的化学反应。
当疏水聚合物片段具有聚合的羧酸结构时,衍生物形成反应的例子可以列举 为与疏水化合物的反应,以提高其疏水性。
疏水化合物形成酯键、酰胺键等,并 由此连接到高分子嵌段共聚物上。
这些反应可用酯化、酰胺化之类的常规已知方 法进行。
例如,当疏水化合物用酰胺键连接到具有亲水聚合物片段和聚合物羧酸 片段的高分子嵌段共聚物(原料共聚物)上时,可按称为肽键形成方法的常规方法 进行反应。
例如,可用酰卤法、酸酐法或偶合法等,其中使用缩合剂的偶合法是 适宜的。
对于缩合剂,可以使用1-乙基-(3-二甲基氨基丙基)碳化二亚胺(EDC)、 盐酸1-乙基-(3-二甲基氨基丙基)碳化二亚胺(EDC·HCl)、二环己基碳化二亚胺 (DCC)、羰基咪唑(CDI)、1-乙氧羰基-2-乙氧基-1,2-二羟基喹啉(EEDQ)、二苯基磷 酰叠氮(DPPA)等。
缩合剂的用量较好为0.5-20摩尔/摩尔疏水化合物,更好为1- 10摩尔/摩尔疏水化合物。
在这种情况下,可让N-羟基丁二酰亚胺(HONSu)、1- 羟基苯并三唑(HOBt)、N-羟基-5-降冰片烯-2,3-二羧酰亚胺(HONB)等共存。
当进行将疏水化合物连接到原料共聚物上的反应时,对疏水化合物的用量没 有特别的限定,但它的用量一般为0.1-2摩尔(以1当量原料共聚物中的羧基为基 准)。
缩合反应宜在溶剂中进行。
例如,N,N-二甲基甲酰胺(DMF)、二甲亚砜 (DMSO)、二噁烷、四氢呋喃(DMF)、水或其溶剂混合物可用作溶剂,对此没有特 别的限定。
虽然没有特别的限定,但溶剂的用量一般比原料共聚物的重量多1-500 倍。
缩合反应较好在-10-50℃,更好在-5-40℃的温度下进行。
当反应进行2-48 小时时,该反应可能已充分。
本发明高分子嵌段共聚物-药物复合制剂例如可用如下方法制备。
在第一种 方法中,将所得的高分子嵌段共聚物溶解在一种溶剂中。
所用溶剂的例子可包括 N,N-二甲基甲酰胺(DMF)、二甲亚砜(DMSO)、二噁烷、四氢呋喃(DMF)、水或其 溶剂混合物等。
其中DMF或DMF和水的混合溶剂是优选的。
这种溶液中蒽环类 化合物的二聚物、三聚物或四聚物的加入量为1-200%(重量)(以高分子嵌段共聚 物为基准),并将混合物搅拌。
当借助于渗析、超滤等方法用水代替混合物溶液中 的溶剂后,得到所需的高分子嵌段共聚物-药物复合制剂。
当也包含其它药物时, 可将其与蒽环类化合物的二聚物、三聚物或四聚物一起加入,其用量为为1-200 %(重量)(以高分子嵌段共聚物为基准)。
在第二种方法中,通过同时进行蒽环类化合物的二聚物、三聚物或四聚物的 合成和将其引入高分子嵌段共聚物中,也可制备高分子嵌段共聚物-药物复合制 剂。
例如,将高分子嵌段共聚物溶解于一种溶剂中,所用溶剂的例子可包括N,N- 二甲基甲酰胺(DMF)、二甲亚砜(DMSO)、二噁烷、四氢呋喃(DMF)、水或其溶剂 混合物等。
其中DMF或DMF和水的混合溶剂是优选的。
将蒽环类化合物或其盐 (如上述蒽环类抗癌药物)溶解于该溶液中,加入碱,然后加以搅拌。
当借助于渗 析、超滤等方法用水代替混合物溶液中的溶剂后,得到所需的高分子嵌段共聚物 -药物复合制剂。
在第二种方法中,高分子嵌段共聚物-药物复合制剂中蒽环类化合物的二聚 物、三聚物或四聚物与其它药物的组分比可用如下方法进行控制。
例如,所得高 分子嵌段共聚物-药物复合制剂中蒽环类化合物的二聚物、三聚物或四聚物与蒽环 类化合物(蒽环类抗癌药物)的组分比可通过改变蒽环类化合物或其盐(蒽环类抗 癌药物)的加入量(以高分子嵌段共聚物为基准),或改变pH值来加以控制。
本发明也涉及高分子嵌段共聚物-药物复合制剂,其中具有亲水聚合物片段 和疏水聚合物片段的高分子嵌段共聚物形成以亲水片段为外层的胶束,在其疏水 内芯含有蒽环类抗癌药物,其特征在于当将该药物制剂给7至9周龄的CDF1小 鼠静脉注射时,如果注射制剂中蒽环类抗癌药物的用量定为100,则注射1小时 后1毫升小鼠血浆中蒽环类抗癌药物的含量为10(%剂量/毫升)或更多,优选的为 20-60。
在胶束内芯中含有蒽环类化合物的二聚物、三聚物或四聚物以及蒽环类抗癌 药物的上述高分子嵌段共聚物-药物复合制剂可被列举为这种药物制剂。
当将一种市售的现有抗癌药物(如阿霉素)静脉注射到人体中时,它的血浓度 (bloodlevel)在极短的时间内就会减少。
与之相反,当静脉注射本发明的药物制剂 时,它的血浓度在较长的时间内维持在一个高的水平,结果蒽环类抗癌药物可被 大量进入到肿瘤组织中。
因此,可有效地治疗癌症。
当本发明的高分子嵌段共聚物-药物复合制剂用作抗癌药物时,具有高的药 理作用。
例如,剂量几乎相同时,它的抗癌活性比阿霉素高得多。
具体地说,它 可显示使实体癌症消失的显著作用。
因此,对治疗患肺癌、消化系统癌症、乳腺 癌、膀胱癌、骨原性肉瘤之类的固体癌的病人特别有效。
另外,本发明的高分子 嵌段共聚物-药物复合制剂的降低毒性的良好效果。
本发明的药物制剂可按常规所用的不同剂型进行使用,如固体配方、软膏、 液体配方等。
这些配方可通过将本发明的药物制剂与载体、填充剂、稀释剂、增 溶剂之类的药物上可接受的添加剂混合而制得。
而且当用作抗癌药物时,一般使 用注射剂型,该剂型较好含有99.99-1%的添加剂(以总的配方为基准)。
用蒽环类 化合物的二聚物、三聚物或四聚物和其它药物的总量表示,它的剂量约为10-200 mg/m2/周。
每周分1-3次给予。
实施例 参照如下实施例,对本发明作解释性的说明。
实施例1 (1)将10毫克盐酸阿霉素溶解于由3毫升DMF、1毫升水和10微升三乙胺组 成的混合溶剂,并于暗处和28℃反应12小时。
用公称分子量截留值(molecular weight cutoff)为1000的渗析膜,使反应溶液对水进行渗析,以便溶剂和水进行交 换。
用HPLC进行分离和纯化后,得到阿霉素二聚物的水溶液。
然后将其冻干, 得到具有式(AA)所表示的结构的阿霉素二聚物固体。
这种阿霉素二聚物具有上述的红外吸收光谱、紫外光谱和LC/MS质谱。
用1 %乙酸处理所得的阿霉素二聚物。
所得产物的质谱图表示在图6中。
关于这一点,HPLC分离和纯化以及测量光谱和色谱所用的仪器和条件同前 所述。
(2)将500毫克盐酸阿霉素溶解于由40毫升DMF和40毫升甲醇组成的混合 溶剂,在此溶液中加入1.2毫升三乙胺,并让其在25℃反应12小时。
反应溶液 用填充在内径为26毫米,长度为65厘米的玻璃管中的350毫升LH-20(Pharmacia 制造)制得的柱提纯。
在柱提纯过程中,甲醇用作流动相。
甲醇的流速为5毫升/ 分。
按每份5毫升收集洗脱液,合并第11份至第25份洗脱液,蒸发至干,用质 谱仪分析确定已形成阿霉素的二聚物。
高分辨质谱分析的结果表明,它的分子式 为C54H54N2O21
将这样获得的10毫克阿霉素二聚物溶解在2毫升甲醇中,在此溶液中加入1 毫克NaBH3CN,让其在室温下反应12小时,与3毫升1N盐酸混合,然后再反 应12小时。
反应溶液用LC/MS进行分析,分离m/z524的峰后,用NMR进行分 析。
NMR分析得到的1H一维谱表示在图8,13C一维谱表示在图9,COSY谱表 示在图10,以及CH COSY谱表示在图11。
在这些结果的基础上,确定该化合物是具有式(AA)结构的阿霉素二聚物。
(3)将500毫克盐酸阿霉素溶解于由40毫升DMF和40毫升甲醇组成的混合 溶剂中,在此溶液中加入1.2毫升三乙胺,并让其在25℃反应12小时。
反应溶 液用填充在内径为26毫米,长度为65厘米的玻璃管中的350毫升LH- 20(Pharmacia制造)制得的柱提纯。
在柱提纯过程中,甲醇用作流动相。
甲醇的流 速为5毫升/分。
按每份5毫升收集洗脱液,合并第5份至第9份洗脱液,蒸发至 干,用质谱仪分析得到图7所示的质谱。
该结果确证了阿霉素三聚物的形成。
实施例2 将5毫克盐酸阿霉素和5毫克盐酸柔红霉素溶解在由3毫升DMF、1毫升水 和10微升三乙胺组成的混合溶剂中,让其在28℃和暗处反应12小时。
不经提纯, 就用LC/MS对该反应溶液进行质谱分析,以确证阿霉素二聚物的形成和柔红霉 素和阿霉素二聚物的形成。
在这些产物中,阿霉素二聚物显示与上述相同的质谱。
柔红霉素和阿霉素二 聚物的质谱表示在图12中。
在这些反应条件下,没有形成柔红霉素二聚物。
关 于这一点,获得这些谱所用的仪器和条件与上述相同。
柔红霉素和阿霉素二聚物的质谱(ESI),m/z(%):1051(90),948(15),922(20), 904(10),653(20),524(30),506(50),488(100)。
实施例3 将20.0克一端带甲氧基,另一端带3-氨基丙基的聚乙二醇(PEG-NH2)(分子量 为13900)溶解于100毫升N,N-二甲基甲酰胺(DMF)。
在此溶液中加入15.0克β- 苄基-L-天冬氨酸-N-羧酸酐(BLA-NCA)。
在35℃水浴中搅拌时,让聚合反应进行 24小时。
然后,在冰浴中于搅拌下,将聚合反应溶液加入0.5N氢氧化钠水溶液, 并搅拌20分钟。
然后再加入2N盐酸将该溶液的pH值调节到大约为4,用蒸馏 水稀释至总体积为20升,然后再调至pH4。
接着,用空心纤维型超滤装置(Amicon CH2,超滤后分子量截留值为10000)重复进行浓缩和洗涤步骤。
然后,用磺酸型 离子交换树脂(Amberlite IR-120B)柱纯化所得的浓缩溶液。
在减压条件下浓缩所 得的洗脱液,然后冻干得到19.58克聚乙二醇-聚天冬氨酸嵌段共聚物(PEG- P(Asp.))。
将5.008克PEG-P(Asp.)溶解于83克DMF中,然后向其加入83毫升乙 腈。
在这溶液中加入8.979克二环己基碳化二亚胺(DCC),搅拌5分钟,然后再 加入由2.528克盐酸阿霉素溶解于167毫升DMF并加入786微升三乙胺制得的溶 液。
然后在室温搅拌下让其反应4小时。
反应后,加入16.7毫升1%磷酸水溶液, 搅拌5分钟。
用渗析膜(分子量截留值=12000~14000)渗析后,过滤除去由DCC 产生的沉淀。
所得的滤液用空心纤维型超滤装置(Amicon CH2,超滤膜分子量截 留值=10000)提纯。
该滤液进一步用ADVANTEC UK-50超滤膜(分子量截留值= 50000)超滤浓缩,得到177毫升按阿霉素计浓度为12毫克/毫升(由紫外分光光度 计在485纳米处测得的吸光度计算而得)的水溶液。
所得的PEG-P(Asp.)ADR具有 上述式(2)所示的结构,其中R1是甲基,R2为1,3-亚丙基,R3为亚甲基,一部分 R4为羟基,其余的为上述式(3)的残基(Y是CH2OH,Z是H),R5是氢,n=315, m=30,x=8。
阿霉素的含量为32.3%重量,它具有适当的水溶性。
将20毫升含 12毫克/毫升(按阿霉素计)所得PEG-P(Asp.)ADR的水溶液与由溶解于60毫升 DMF的258.8毫克盐酸阿霉素并加入100微升三乙胺制得的溶液混合,让该混合 物在室温和暗处搅拌2小时。
用渗析膜(分子量截留值=12000~14000)渗析后, 将所得溶液冻干。
通过将其重新溶解于水中和用ADVANTEC UK-50超滤膜(分子 量截留值=50000)超滤进行提纯和浓缩。
用0.45微米滤器进一步过滤后得到25.3 毫升嵌段共聚物-药物复合制剂的水溶液。
现已发现所得的水溶液具有图13所示 的HPLC色谱。
在该图谱中,峰①是阿霉素,峰②是阿霉素的二聚物,宽峰③是 连接到聚合物上的阿霉素。
阿霉素的浓度(峰①)为3.06毫克/毫升,阿霉素二聚物 的浓度(峰②)为3.18毫克/毫升。
阿霉素对阿霉素二聚物的重量比为1∶1.04。
HLPC的测量条件如下。
柱:C4.300埃/5微米,Waters Co.制造; 洗脱剂:乙腈/1%乙酸+40mM十二烷基硫酸钠; 梯度洗脱: 时间(分)        0     4     12    25    30    31 乙腈浓度(%)    15    35    35    85    85    15 检测:485纳米 流速:1毫升/分。
实施例4 将实施例3制备的含12毫克/毫升(按阿霉素计)的PEG-P(Asp.)ADR的水溶 液20毫升与在60毫升DMF中溶解102.4毫克阿霉素的盐酸盐并加入32微升三 乙胺形成的溶液混合,在暗处于室温下搅拌该混合物2小时。
用渗析膜(分子量截 留值=12,000-14,000)渗析后,冷冻干燥所得的溶液。
通过将其再溶解在水中,并 用超滤膜ADVANTEC UK-50(分子量截留值=50,000)进行超滤,来进行提纯和浓 缩。
用0.45微米的滤器进一步过滤,获得20.4毫升嵌段共聚物-药物复合制剂的 水溶液。
发现获得的水溶液具有图14所示的HPLC色谱图。
图中,峰1是阿霉 素,峰2是阿霉素的二聚物,宽峰3是连接在聚合物上的阿霉素。
阿霉素(峰1) 的浓度为3.01毫克/毫升,阿霉素二聚物(峰2)的浓度为0.39毫克/毫升。
阿霉素 与阿霉素二聚物的重量比为1∶0.13。
HPLC测定条件按实施例3所述。
实施例5 用20毫升水稀释20毫升实施例3制备的含12毫克/毫升(按阿霉素计)的 PEG-P(Asp.)ADR的水溶液,然后冷冻干燥。
再溶解在20ml水中,用醋酸和醋酸 钠水溶液调节溶液的pH值,使溶液最终成为40毫升30mM醋酸式盐缓冲液(pH 5.0)。
制备的溶液与128.0毫克阿霉素盐酸盐混合,在暗处于室温下搅拌2天。
用 渗析膜(分子量截留值=12,000-14,000)渗析后,用超滤膜ADVANTEC UK-50(分 子量截留值=50,000)进行超滤,来提纯和浓缩,获得16.7毫升嵌段共聚物-药物 复合制剂的水溶液。
发现获得的溶液具有图15所示的HPLC色谱图。
图中,峰1 是阿霉素,峰2是阿霉素的二聚物,宽峰3是连接在聚合物上的阿霉素。
阿霉素 (峰1)的浓度为2.99毫克/毫升,阿霉素二聚物(峰2)的浓度为0.27毫克/毫升。
阿 霉素与阿霉素二聚物的重量比为1∶0.09。
HPLC测定条件按实施例3所述。
应用例1 在每只CDF1雌性小鼠的腋下部位,皮下移植结肠26腺癌细胞。
当肿瘤体 积达到约100毫米3时,每当第四天时一天一次静脉给予药物,总共三次,药物 为实施例3、4或5合成的嵌段共聚物-药物复合制剂,或阿霉素盐酸盐,(由图中 的箭头指出),以考查药物的抗肿瘤活性。
使用前,每种药物需用生理盐水稀释。
按阿霉素在HPLC色谱图中峰1的量来决定每种药物的剂量。
根据肿瘤生长曲 线、肿瘤消失的小鼠的只数和化疗指数,评价每种药物的抗肿瘤效果。
结果列于 表1和2,图16和17。
与以阿霉素盐酸盐给药的情况相比,当以实施例3-5的嵌 段共聚物-药物复合制剂给药时,观察到在较宽的剂量范围内,肿瘤消失的小鼠的 只数较多。
特别是,实施例3的阿霉素二聚物含量较高的药剂,在完全治愈率和 化疗指数方面有最好的结果。
表1对小鼠结肠26腺癌的抗肿瘤活性     样品
    剂量(毫克/公斤)
    肿瘤消失的小鼠
    阿霉素盐酸盐

    5
    10
    0/5
    2/5
    实施例3的药剂


    2.5
    5
    10
    1/4
    5/5
    3/5
    实施例4的药剂


    2.5
    5
    10
    0/5
    1/5
    4/5
    实施例5的药剂


    2.5
    5
    10
    0/5
    2/5
    3/5
表2化疗指数的比较     样品
    LD50
    Min T/C421)
    化疗指标2)
    阿霉素盐酸盐
    15
    5.95
    2.52
    实施例3的药剂
    15
    2.59
    5.78
    实施例4的药剂
    15
    4.88
    3.08
    实施例5的药剂
    15
    6.02
    2.49
1)初次给予药后,在第14天T/C为42%或更小时的最小剂量 2)化疗指数:LD50/(最小T/C42) 实施例6 将20.0克一端有一个甲氧基,另一端有3-氨基丙基的聚乙二醇(PEG-NH2)(分 子量14,200)溶解在100毫升N,N-二甲基甲酰胺(DMF)中。
溶液中加入15.0克L- 天冬氨酸-β-苄基酯-N-羧酸酐(BLA-NCA),随后在35℃水浴中和搅拌下聚合反应 24小时。
然后,在冰浴中于搅拌下,将聚合物溶液加入到0.5N的氢氧化钠水溶 液中,搅拌20分钟。
加入2N的盐酸,调整pH值至约为4,用蒸馏水稀释溶液 至总体积为20升,pH值调整到4。
用空心纤维型的超滤装置(Amicon CH2,超滤 膜的分子量截留值=10,000)重复浓缩和清洗步骤。
随后,用磺酸型离子交换树脂 (Amberlite IR-120B)柱提纯浓缩后的溶液。
减压下浓缩产生的洗脱液,然后冷冻 干燥,得到21.26克聚乙二醇-聚天冬氨酸嵌段共聚物(PEG-P(Asp.))。
在125毫升 DMF中溶解7.501克PEG-P(Asp.),随后加入125毫升乙腈。
之后加入12.992克 二环己基碳化二亚胺(DDC),搅拌5分钟后,加入一溶液,该溶液为将3.654克 阿霉素盐酸盐溶解在250毫升DMF中,再加入1.14毫升三甲胺而制备。
在室温 下搅拌,使其反应4小时。
反应后,加入25毫升1%的磷酸水溶液,搅拌5分钟。
用渗析膜(分子量截留值=12,000-14,000)渗析后,过滤,除去由DCC生成的沉淀 物。
用空心纤维型超滤装置(Amicon CH2,超滤膜分子量截留值=10,000)提纯得 到的滤液,然后用超滤膜ADVANTEC UK-50(分子量截留值=50,000)浓缩,获得 270毫升浓度为12毫克/毫升阿霉素的水溶液(由紫外分光光度计测定的485nm的 吸光度计算)。
由此获得的PEG-P(Asp.)ADR具有上面提到的式(2)的结构,式(2) 中,R1是甲基,R2是1,3-亚丙基、R3是亚甲基、R4的一部分是羟基,其余部分 是上面提到的式(3)的残基[Y是CH2OH,Z是H],R5是氢,n=325,m=30和x =8。
阿霉素含量为32.4%,它显示适当的水溶性。
将由此获得的含12毫克/毫升 (按阿霉素计)的PEG-P(Asp.)ADR的水溶液1毫升与在3毫升DMF中溶解11.93 毫克14C标记的阿霉素盐酸盐并加入4.9微升三乙胺形成的溶液混合,在暗处于 室温下搅拌该混合物2小时。
用渗析膜(分子量截留值=12,000-14,000)渗析后, 用超滤膜ADVANTEC UK-50(分子量截留值=50,000)对生成的溶液进行提纯和 浓缩,获得3.0毫升嵌段共聚物-药物复合制剂的水溶液。
发现获得的溶液具有图 18所示的HPLC色谱图。
图中,峰1是阿霉素,峰2是阿霉素的二聚物,宽峰3 是连接在聚合物上的阿霉素。
阿霉素(峰1)的浓度为1.29毫克/毫升,阿霉素二聚 物(峰2)的浓度为1.36毫克/毫升。
阿霉素与阿霉素二聚物的重量比为1∶1.05。
HPLC测定条件按实施例3所述。
实施例7 将实施例6制备的含12毫克/毫升(按阿霉素计)的PEG-P(Asp.)ADR的水溶 液2.08毫升与在6.25毫升DMF中溶解9.86毫克14C标记的阿霉素盐酸盐,并加 入3.3微升三乙胺形成的溶液混合,在暗处于室温下搅拌该混合物2小时。
用渗 析膜(分子量截留值=12,000-14,000)渗析后,用超滤膜ADVANTEC UK-50(分子 量截留值=50,000)进行提纯和浓缩,获得2.3毫升嵌段共聚物-药物复合制剂的水 溶液。
发现获得的水溶液具有图19所示的HPLC色谱图。
图中,峰1是阿霉素, 峰2是阿霉素的二聚物,宽峰3是连接在聚合物上的阿霉素。
阿霉素(峰1)的浓 度为3.41毫克/毫升,阿霉素二聚物(峰2)的浓度为0.95毫克/毫升。
阿霉素与阿 霉素二聚物的重量比为1∶0.28。
HPLC测定条件按实施例3所述。
实施例8 将20.0克一端有一个甲氧基,另一端有3-氨基丙基的聚乙二醇(PEG-NH2)(分 子量14,500)溶解在100毫升N,N-二甲基甲酰胺(DMF)中。
溶液中加入15.0克L- 天冬氨酸-β-苄基酯-N-羧酸酐(BLA-NCA),随后在35℃水浴和搅拌下聚合反应24 小时。
然后,在冰浴中于搅拌下,将聚合物溶液加入到0.5N的氢氧化钠水溶液 中,搅拌20分钟。
加入2N的盐酸,调整pH值至约为4,用蒸馏水稀释溶液至 总体积为20升,然后将pH值调整到4。
用空心纤维型的超滤装置(Amicon CH2, 超滤膜的分子量截留值=10,000)重复浓缩和以水洗涤的步骤。
随后,用磺酸型离 子交换树脂(Amberlite IR-120B)柱提纯浓缩后的溶液。
减压下浓缩所得的洗脱 液,然后冷冻干燥,得到19.01克聚乙二醇-聚天冬氨酸嵌段共聚物(PEG-P(Asp.))。
在83毫升DMF中溶解5.010克PEG-P(Asp.),随后于其中加入83毫升乙腈。
之 后与8.693克二环己基碳化二亚胺(DDC)混合,搅拌5分钟后,加入一溶液,该 溶液为将2.445克阿霉素盐酸盐溶解在167毫升DMF中,并加入759微升三甲胺 制备。
之后在室温下搅拌,使其反应4小时。
反应后,加入16.7毫升0.5%的磷 酸水溶液,搅拌5分钟。
用渗析膜(分子量截留值=12,000-14,000)渗析后,过滤 除去由DCC形成的沉淀物。
所得滤液用超滤膜ADVANTEC UK-50(分子量截留 值=50,000)浓缩,获得185毫升浓度为12毫克/毫升以阿霉素计的水溶液(由紫外 分光光度计测定的485nm的吸光度计算)。
如此获得的PEG-P(Asp.)ADR具有上 面提到的式(2)的结构,式(2)中,R1是甲基,R2是1,3-亚丙基、R3是亚甲基、R4的一部分是羟基,其余部分是上面提到的式(3)的残基[Y是CH2OH,Z是H],R5是氢,n=350,m=32和x=8。
阿霉素含量为30.2%,它显示合适的水溶性。
将 含12毫克/毫升(按阿霉素计)的这样得到的PEG-P(Asp.)ADR的水溶液20毫升与 在60毫升DMF中溶解564.0毫克的阿霉素的盐酸盐并加入176微升三乙胺形成 的溶液混合,在黑暗处于室温下搅拌该混合物2小时。
用渗析膜(分子量截留值= 12,000-14,000)渗析后,冷冻干燥所得的溶液。
通过将其再溶解在水中,并用超滤 膜ADVANTEC UK-50(分子量截留值=50,000)对所得的溶液进行提纯和浓缩。
0.45微米的滤器进一步过滤,获得59.4毫升嵌段共聚物-药物复合制剂的水溶液。
发现获得的水溶液具有图20所示的HPLC色谱图。
图中,峰1是阿霉素,峰2 是阿霉素的二聚物,宽峰3是连接在聚合物上的阿霉素。
阿霉素(峰1)的浓度为 1.10毫克/毫升,阿霉素二聚物(峰2)的浓度为3.07毫克/毫升。
阿霉素与阿霉素二 聚物的重量比为1∶2.79。
HPLC测定条件按实施例3所述。
实施例9 将实施例8制备的含12毫克/毫升(按阿霉素计)的PEG-P(Asp.)ADR的水溶 液10毫升与在30毫升DMF中溶解32.0毫克阿霉素盐酸盐并加入10.0微升三乙 胺形成的溶液混合,在暗处于室温下搅拌该混合物2小时。
用渗析膜(分子量截留 值=12,000-14,000)渗析后,冷冻干燥所得的溶液。
再溶解在水中,用超滤膜 ADVANTEC UK-50(分子量截留值=50,000)进行提纯和浓缩。
用0.45微米的滤器 进一步过滤,获得9.1毫升嵌段共聚物-药物复合制剂的水溶液。
发现获得的水溶 液具有图21所示的HPLC色谱图。
图中,峰1是阿霉素,峰2是阿霉素的二聚 物,宽峰3是连接在聚合物上的阿霉素。
阿霉素(峰1)的浓度为1.98毫克/毫升, 阿霉素二聚物(峰2)的浓度为0.12毫克/毫升。
阿霉素与阿霉素二聚物的重量比为 1∶0.06。
HPLC测定条件按实施例3所述。
实施例10 将实施例8制备的含12毫克/毫升(按阿霉素计)的PEG-P(Asp.)ADR的水溶 液5毫升与在15毫升DMF中溶解51.4毫克阿霉素盐酸盐并加入16.0微升三乙 胺形成的溶液混合,在暗处于室温下搅拌该混合物2小时。
用渗析膜(分子量截留 值=12,000-14,000)渗析后,冷冻干燥所得的溶液。
再溶解在水中,用超滤膜 ADVANTEC UK-50(分子量截留值=50,000)进行提纯和浓缩。
用0.45微米的滤器 进一步过滤,获得15.2毫升嵌段共聚物-药物复合制剂的水溶液。
发现获得的水 溶液具有图22所示的HPLC色谱图。
图中,峰1是阿霉素,峰2是阿霉素的二 聚物,宽峰3是连接在聚合物上的阿霉素。
阿霉素(峰1)的浓度为1.04毫克/毫升, 阿霉素二聚物(峰2)的浓度为0.88毫克/毫升。
阿霉素与阿霉素二聚物的重量比为 1∶0.85。
HPLC测定条件按实施例3所述。
实施例11 在65毫升DMF中溶解103.5毫克实施例1(2)制备的阿霉素二聚物和49.1毫 克阿霉素盐酸盐,所得溶液与实施例8制备的含12毫克/毫升(按阿霉素计)的 PEG-P(Asp.)ADR的水溶液23毫升混合,在暗处室温下搅拌该混合物2小时。
用 渗析膜(分子量截留值=12,000-14,000)渗析后,用超滤膜ADVANTEC UK-50(分 子量截留值=50,000)进行提纯和浓缩。
用0.45微米的滤器进一步过滤,获得14.9 毫升嵌段共聚物-药物复合制剂的水溶液。
发现获得的水溶液具有图23所示的 HPLC色谱图。
图中,峰1是阿霉素,峰2是阿霉素的二聚物,宽峰3是连接在 聚合物上的阿霉素。
阿霉素(峰1)的浓度为1.13毫克/毫升,阿霉素二聚物(峰2) 的浓度为2.76毫克/毫升。
阿霉素与阿霉素二聚物的重量比为1∶2.44。
HPLC测定 条件按实施例3所述。
实施例12 在16.7毫升DMF中溶解1.0034克实施例8制备的PEG-P(Asp.),随后在其 中加入16.7毫升乙腈。
加入1.7504克二环己基碳化二亚胺(DDC),搅拌5分钟, 之后与在33.3毫升DMF中溶解474.4毫克柔红霉素盐酸盐并加入152微升三乙 胺制备的溶液混合,混合物在室温反应4小时。
反应后,加入3.3毫升0.5%的磷 酸水溶液,搅拌5分钟。
用渗析膜(分子量截留值=12,000-14,000)渗析后,过滤 除去由DCC生成的沉淀物。
用超滤膜ADVANTEC UK-50(分子量截留值=50,000) 浓缩产生的滤液,获得36毫升含有浓度为12毫克/毫升的柔红霉素的水溶液(按 紫外分光光度计在485nm测定的吸光度计算)。
因此获得的PEG-P(Asp.)DAM具 有上面提到的式(2)的结构,式(2)中,R1是甲基,R2是1,3-亚丙基、R3是亚甲基、 R4的一部分是羟基,其余部分是上面提到的式(3)的残基[Y是CH3,Z是H],R5是氢,n=350,m=32和x=8。
柔红霉素含量为30.3%,它显示合适的水溶性。
将由此获得的含12毫克/毫升(按柔红霉素计)的PEG-P(Asp.)DAM的水溶液7毫 升与在21毫升DMF中溶解179.8毫克的阿霉素盐酸盐并加入55.9微升三乙胺形 成的溶液混合,在暗处于室温下搅拌该混合物2小时。
用渗析膜(分子量截留值= 12,000-14,000)渗析后,冷冻干燥所得的溶液。
将其再溶解在水中,并用超滤膜 ADVANTEC UK-50(分子量截留值=50,000)进行提纯和浓缩,之后用0.45微米的 滤器进一步过滤,获得16.5毫升嵌段共聚物-药物复合制剂的水溶液。
发现获得 的水溶液具有图24所示的HPLC色谱图。
图中,峰1是阿霉素,峰2是阿霉素 的二聚物,宽峰3是连接在聚合物上的柔红霉素。
阿霉素(峰1)的浓度为1.07毫 克/毫升,阿霉素二聚物(峰2)的浓度为3.26毫克/毫升。
阿霉素与阿霉素二聚物的 重量比为1∶3.05。
HPLC测定条件按实施例3所述。
应用例2 在每只CDF1雌性小鼠的腋下部位,皮下移植结肠26腺癌细胞,移植后, 小鼠静脉给予药12天,药物为实施例6或7制备的嵌段共聚物-药物复合制剂, 或14C标记的阿霉素盐酸盐。
每种药物使用前用生理盐水稀释。
给药15分钟、1、 4、24和48小时后,采集血样,切除各种器官。
用液体闪烁计数器测定放射性来 测定血浆和每个内部器官中的药物浓度。
在这一试验中,阿霉素和阿霉素二聚物 都用14C标记。
将所给的药物制品中阿霉素和阿霉素二聚物的总量定为100时,1 毫升血浆中阿霉素和阿霉素二聚物总量的周期性变化(%剂量/毫升)列于表3。
当 仅给阿霉素盐酸化物时,用药后血浆中的药物迅速消失,而在用本发明的药剂的 情况,血浆中药物保持较长时间的较高水平。
实施例6的含有较高阿霉素二聚物 的药剂对药物保留的改进最为明显。
将所给的药物制剂中阿霉素和阿霉素二聚物 的总量定为100时,1克肿瘤组织中阿霉素和阿霉素二聚物总量的周期性变化(% 剂量/克)列于表4。
表5列出心脏中上述总量的周期变化(%剂量/克)。
与仅给阿霉 素盐酸盐的情况相比,以本发明的药剂作为给予的药物时,其最初浓度略低,在 心脏中随时间而降低,但在肿瘤区域,药物以高几倍的浓度积累并随时间而增 加。
实施例6的含有较高水平的阿霉素二聚物的药剂,在肿瘤中药物积累最为明 显。
应用例3 在每只CDF1雌性小鼠的腋下部位,皮下移植结肠26腺癌细胞。
当肿瘤体 积达到约100毫米3时,每当第四天时一天静脉给予药物一次,总共三次,药物 为实施例8或12制备的嵌段共聚物-药物复合制剂,或阿霉素盐酸盐(由图中的箭 头指出),以考查药物的抗肿瘤活性。
对实施例8的药剂,还考查仅第一次给药的 效果。
使用前,每种药物需用生理盐水稀释。
按HPLC色谱图中峰1的阿霉素量 来决定每种药物的剂量。
根据肿瘤生长曲线、肿瘤消失的小鼠的只数,评价每种 药物的抗肿瘤效果。
结果列于表6,图25、26和27。
与以阿霉素盐酸盐给药的 情况相比,当以实施例8或12的药剂给药时,观察到在较宽的剂量范围内,肿 瘤消失的小鼠的只数较多。
应用例4 在每只CDF1雌性小鼠的腋下部位,皮下移植结肠26腺癌细胞,移植后, 小鼠静脉给药8天,药物为实施例8或9制备的嵌段共聚物-药物复合制剂。
每种 药物使用前用生理盐水稀释。
给药15分钟和1、4、24和48小时后,采集血样, 切除各种器官。
通过用有机溶剂萃取药物并用HPLC测定,来测定血浆和肿瘤中 阿霉素和阿霉素二聚物的浓度。
当所给药物制剂中阿霉素的量定为100时,1毫 升血浆中阿霉素的周期性变化(%剂量/毫升),以及当所给药物制剂中阿霉素二聚 物的的量定为100时,1毫升血浆中阿霉素二聚物的量的周期变化(%剂量/毫升) 列于表7。
实施例8的含有较高阿霉素二聚物的量的药剂对血液中药物保留的改 进最为明显。
将所给的药物制剂中阿霉素的量定为100时,1克肿瘤组织中阿霉 素量的周期性变化(%剂量/克),以及当所给药剂中阿霉素二聚物的量定为100 时,1克肿瘤组织中阿霉素二聚物量的周期变化(%剂量/克)列于表8。
实施例8 的含有较高水平的阿霉素二聚物的药剂,肿瘤中药物的积累改善最为显著。
应用例5 在每只CDF1雌性小鼠的腋下部位,皮下移植结肠26腺癌细胞,移植后, 小鼠静脉给药11天,药物为实施例8、10或12制备的嵌段共聚物-药物复合制剂。
每种药物使用前用生理盐水稀释。
给药1或24小时后,采集血样,切除各种器 官。
通过用有机溶剂萃取药物并用HPLC测定,来测定血浆和肿瘤中阿霉素和阿 霉素二聚物的浓度。
当所给药物制剂中阿霉素的量定为100时,1毫升血浆中阿 霉素的周期性变化(%剂量/毫升),以及当所给药物制剂中阿霉素二聚物的量定为 100时,1毫升血浆中阿霉素二聚物量的周期变化(%剂量/毫升)列于表9。
实施例 8的药剂的结果几乎与应用例4所获得的结果相同。
由于实施例10的药剂中阿霉 素二聚物的比值低于实施例8的药剂的比值,其在血液中的保留值略低。
将所给 的药物制剂中阿霉素量定为100时,1克肿瘤组织中阿霉素的量的周期性变化(% 剂量/克),以及当所给药剂中阿霉素二聚物的量定为100时,1克肿瘤组织中阿霉 素二聚物的量的周期变化(%剂量/克)列于表10。
实施例8的药剂,其结果几乎与 应用例4所获得的结果相同。
由于实施例10的药剂中阿霉素二聚物的比值低于 实施例8的药剂的比值,其在肿瘤中的积累值也略低。
表3周期变化(%剂量/毫升)(血浆)     样品
                     给药后的时间
   15分钟
    1小时
    4小时
   24小时
   48小时
    (A)
    (B)
    (C)
    0.47
    61.6
    41.7
    0.29
    53.7
    29.2
    0.36
    39.2
    21.3
    0.10
    15.9
    8.2
    0.07
    4.7
    2.2
(A)阿霉素盐酸盐 (B)实施例6的药剂 (C)实施例7的药剂 表4周期变化(%剂量/克)(肿瘤)     样品
                     给药后的时间
   15分钟
   1小时
    4小时
   24小时
  48小时
    (A)
    (B)
    (C)
    2.3
    2.3
    2.3
    2.4
    3.8
    2.7
    1.7
    4.9
    4.9
    1.3
    9.6
    7.0
    1.0
    9.1
    4.0
(A)阿霉素盐酸盐 (B)实施例6的药剂 (C)实施例7的药剂 表5周期变化(%剂量/克)(心脏)     样品
                           给药后的时间
   15分钟
   1小时
   4小时
   24小时
  48小时
    (A)
    (B)
    (C)
    10.5
    4.9
    6.5
    7.0
    4.2
    5.4
    4.6
    3.3
    3.8
    1.1
    1.6
    1.4
    0.5
    1.0
    0.7
(A)阿霉素盐酸盐 (B)实施例6的药剂 (C)实施例7的药剂 表6对小鼠结肠26腺癌的抗肿瘤活性     样品
剂量(毫克/公斤)
肿瘤消失的小鼠
    阿霉素盐酸盐

    5
    10
    0/5
    2/5
    实施例8的药剂

    5
    10*
    5/5
    5/5
    实施例12的药剂



    1.25
    2.5
    5
    10
    0/5
    0/5
    4/5
    5/5
(*仅第一次给药) 表7周期变化(%剂量/毫升)(血浆) 样品
                            给药后的时间
   15分钟
    1小时
    4小时
   24小时
  48小时
 (A)(1)
    (2)
    44.9
    67.2
    32.9
    69.7
    20.7
    61.9
    3.8
    14.2
    2.0
    3.9
    (B)(1)
    (2)
    27.7
    23.0
    12.3
    22. 5
    5.3
    19.4
    1.9
    11.1
    0.5
    7.0
(A)实施例8的药剂 (B)实施例9的药剂 (1)阿霉素 (2)阿霉素二聚物 表8周期变化(%剂量/克)(肿瘤) 样品
                      给药后的时间
   15分钟
   1小时
   4小时
    24小时
   48小时
 (A)(1)
    (2)
    4.0
    1.1
    3.1
    1.0
    6.8
    6.4
    19.0
    14.1
    20.4
    12.2
    (B)(1)
    (2)
    1.3
    0.0
    2.1
    8.1
    1.9
    2.8
    2.2
    3.9
    1.2
    4.9
(A)实施例8的药剂 (B)实施例9的药剂 (1)阿霉素 (2)阿霉素二聚物 表9周期变化(%剂量/毫升)(血浆) 样品
       给药后的时间
    1小时
    24小时
 (A)(1)
    (2)
    36.7
    83.5
    6.8
    17.9
 (B)(1)
    (2)
    11.0
    65.3
    4.1
    16.2
 (C)(1)
 (2)
    40.6
    100.2
    10.2
    24.5
(2)阿霉素二聚物 表10周期变化(%剂量/克)(肿瘤)     样品
      给药后的时间
    1小时
    24小时
    (A)(1)
    (2)
    3.4
    1.8
    21.0
    16.1
    (B)(1)
    (2)
    2.6
    0.1
    4.5
    3.0
    (C)(1)
    (2)
    5.0
    2.1
    9.1
    6.3
(A)实施例8的药剂 (B)实施例10的药剂 (C)实施例12的药剂 (1)阿霉素 (2)阿霉素二聚物 通过在嵌段共聚物的胶束的内芯加入抗癌药等,赋予本发明含有二、三、四 聚物的高分子嵌段共聚物-药物复合制剂以较高的药效和较低的毒性。
因而本发明 可提供显著有效的药物制剂。
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