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用于抗药性高钙血症的治疗试剂

基本信息

  • 申请号 CN00810001.2 
  • 公开号 CN1399557A 
  • 申请日 2000/07/06 
  • 公开日 2003/02/26 
  • 申请人 中外制药株式会社  
  • 优先权日期  
  • 发明人 斋藤英美 恒成利明 小沼悦郎  
  • 主分类号  
  • 申请人地址 日本东京 
  • 分类号  
  • 专利代理机构 中原信达知识产权代理有限责任公司 
  • 当前专利状态 发明专利申请公布 
  • 代理人 丁业平 
  • 有效性 发明公开 
  • 法律状态
  •  

摘要

本发明提供一种用于抗药性高钙血症的治疗试剂,该试剂包括一种能够抑制甲状旁腺激素相关蛋白(PTHrP)与其受体结合的物质作为其中的活性组分。
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权利要求书


1.一种用于抗药性高钙血症的治疗试剂,其中包括一种作为活性 组分的能够抑制甲状旁腺激素相关蛋白(PTHrP)与其受体结合的物 质。

2.根据权利要求1的治疗试剂,其中的抗药性高钙血症对于除 能够抑制PTHrP和其受体结合的物质之外的用于高钙血症的治疗试剂 具有抗性。

3.根据权利要求1或2的治疗试剂,其中用于高钙血症的治疗 试剂为一种骨吸收抑制剂、一种钙排泄促进试剂、一种抑制肠内钙吸 收试剂或一种袢利尿剂。

4.根据权利要求1或2的治疗试剂,其中用于高钙血症的治疗 试剂为一种骨吸收抑制剂。

5.根据权利要求4的治疗试剂,其中的骨吸收抑制剂为双膦酸 盐或降钙素。

6.根据权利要求1到5中任一项的治疗试剂,其中所述的物质 为一种针对PTHrP受体的拮抗剂。

7.根据权利要求1到5中任何一项的治疗试剂,其中所述的物 质为一种抗PTHrP抗体。

8.根据权利要求1到5中任何一项的治疗试剂,其中所述的物 质为抗PTHrP抗体的片段和/或片段的修饰形式。

9.根据权利要求7的治疗试剂,其中的抗体为单克隆抗体。

10.根据权利要求7的治疗试剂,其中的抗体为人抗体或人源化 抗体或嵌合抗体。

11.根据权利要求7的治疗试剂,其中的抗体为人源化形式。

12.根据权利要求11的治疗试剂,其中的人源化抗体为人源化 #23-57-137-1抗体。

13.根据权利要求1到12中任何一项的治疗试剂,其中的抗药 性高钙血症由癌症造成。
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说明书

                            序列表 序列表 <110>中外制药株式会社(Chugaai Seiyaku Kabushiki Kaisha) <120>用于抗药性高钙血症的治疗试剂  (Therapeutic agent for treating drug-resistant hypercalcemia) <130>PH-946-PCT <150>JP11-192270 <151>1999-07-06 <160>75 <170>PatentIn Ver.2.0 <210>1 <211>20 <212>DNA <213>人工序列 <220> <223>合成DNA <400>1 aaatagccct tgaccaggca                                            20 <210>2 <211>38 <212>DNA <213>人工序列 <220> <223>合成DNA <400>2 ctggttcggc ccacctctga aggttccaga atcgatag                             38 <210>3 <211>28 <212>DNA <213>人工序列 <220> <223>合成DNA <400>3 ggatcccggg ccagtggata gacagatg                                        28 <210>4 <211>29 <212>DNA <213>人工序列 <220> <223>合成DNA <400>4 ggatcccggg tcagrggaag gtggraaca                                       29 <210>5 <211>17 <212>DNA <213>人工序列 <220> <223>合成DNA <400>5 gttttcccag tcacgac                                                      17 <210>6 <211>17 <212>DNA <213>人工序列 <220> <223>合成DNA <400>6 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<210>52 <211>118 <212>PRT <213>智人(Homo sapiens) <400>52 Gln Leu Val Leu Thr Gln Ser Pro Ser Ala Ser Ala Ser Leu Gly Ala   1               5                  10                  15 Ser Val Lys Leu Thr Cys Thr Leu Ser Ser Gln His Ser Thr Tyr Thr          20                  25                  30 Ile Glu Trp Tyr Gln Gln Gln Pro Glu Lys Gly Pro Lys Tyr Leu Met      35                  40                  45 Asp Leu Lys Gln Asp Gly Ser His Ser Thr Gly Asp Gly Ile Pro Asp  50                  55                  60 Arg Phe Ser Gly Ser Ser Ser Gly Ala Glu Arg Tyr Leu Thr Ile Ser  65                  70                  75                  80 Ser Leu Gln Ser Glu Asp Glu Ala Asp Tyr Ile cys Gly Val Gly Asp              85                  90                  95 Thr Ile Lys Glu Gln Phe Val Tyr Val Phe Gly Gly Gly Thr Lys Leu         100                 105                 110 Thr Val Leu Gly Gln Pro     115 <210>53 <211>118 <212>PRT <213>智人(Homo sapiens) <400>53 Gln Leu Val Leu Thr Gln Ser Pro Ser Ala Ser Ala Ser Leu Gly Ala   1               5                  10                  15 Ser Val Lys Leu Thr Cys Thr Leu Ser Ser Gln His Ser Thr Tyr Thr          20                  25                  30 Ile Glu Trp Tyr Gln Gln Gln Pro Glu Lys Gly Pro Arg Tyr Leu Met      35                  40                  45 Asp Leu Lys Gln Asp Gly Ser His Ser Thr Gly Asp Gly Ile Pro Asp  50                  55                  60 Arg Phe Ser Gly Ser Ser Ser Gly Ala Glu Arg Tyr Leu Thr Ile Ser  65                  70                  75                  80 Ser Leu Gln Ser Glu Asp Glu Ala Asp Tyr Ile Cys Gly Val Gly Asp              85                  90                  95 Thr Ile Lys Glu Gln Phe Val Tyr Val Phe Gly Gly Gly Thr Lys Leu         100                 105                 110 Thr Val Leu Gly Gln Pro     115 <210>54 <211>118 <212>PRT <213>智人(Homo sapiens) <400>54 Gln Leu Val Leu Thr Gln Ser Pro Ser Ala Ser Ala Ser Leu Gly Ala   1               5                  10                  15 Ser Val Lys Leu Thr Cys Thr Leu Ser Ser Gln His Ser Thr Tyr Thr          20                  25                  30 Ile Glu Trp Tyr Gln Gln Gln Pro Glu Lys Gly Pro Lys Tyr Val Met      35                  40                  45 Asp Leu Lys Gln Asp Gly Ser His Ser Thr Gly Asp Gly Ile Pro Asp  50                  55                  60 Arg Phe Ser Gly Ser Ser Ser Gly Ala Glu Arg Tyr Leu Thr Ile Ser  65                  70                  75                  80 Ser Leu Gln Ser Glu Asp Glu Ala Asp Tyr Ile Cys Gly Val Gly Asp              85                  90                  95 Thr Ile Lys Glu Gln Phe Val Tyr Val Phe Gly Gly Gly Thr Lys Leu         100                 105                 110 Thr Val Leu Gly Gln Pro     115 <210>55 <211>118 <212>PRT <213>智人(Homo sapiens) <400>55 Gln Leu Val Leu Thr Gln Ser Pro Ser Ala Ser Ala Ser Leu Gly Ala   1               5                  10                  15 Ser Val Lys Leu Thr Cys Thr Leu Ser Ser Gln His Ser Thr Tyr Thr          20                  25                  30 Ile Glu Trp Tyr Gln Gln Gln Pro Glu Lys Gly Pro Arg Tyr Val Met      35                  40                  45 Asp Leu Lys Gln Asp Gly Ser His Ser Thr Gly Asp Gly Ile Pro Asp  50                  55                  60 Arg Phe Ser Gly Ser Ser Ser Gly Ala Glu Arg Tyr Leu Thr Ile Ser  65                  70                  75                  80 Ser Leu Gln Ser Glu Asp Glu Ala Asp Tyr Ile Cys Gly Val Gly Asp              85                  90                  95 Thr Ile Lys Glu Gln Phe Val Tyr Val Phe Gly Gly Gly Thr Lys Leu         100                 105                 110 Thr Val Leu Gly Gln Pro     115 <210>56 <211>118 <212>PRT <213>智人(Homo sapiens) <400>56 Gln Val Gln Leu Val Glu Ser Gly Gly Gly Val Val Gln Pro Gly Arg   1               5                  10                  15 Ser Leu Arg Leu Ser Cys Ala Ala Ser Gly Phe Thr Phe Ser Ser Tyr          20                  25                  30 Gly Met Ser Trp Val Arg Gln Ala Pro Gly Lys Gly Leu Glu Trp Val      35                  40                  45 Ala Thr Ile Ser Ser Gly Gly Ser Tyr Thr Tyr Tyr Pro Asp Ser Val  50                  55                  60 Lys Gly Arg Phe Thr Ile Ser Arg Asp Asn Ser Lys Asn Thr Leu Tyr  65                  70                  75                  80 Leu Gln Met Asn Ser Leu Arg Ala Glu Asp Thr Ala Val Tyr Tyr Cys              85                  90                  95 Ala Arg Gln Thr Thr Met Thr Tyr Phe Ala Tyr Trp Gly Gln Gly Thr         100                 105                 110 Leu Val Thr Val Ser Ser     115 <210>57 <211>411 <212>DNA <213>小家属(Mus musculus) <220> <221>CDS <222>(1)..(411) <220> <221>mat_肽 <222>(58)..(411) <400>57 atg aac ttc ggg ctc agc ttg att ttc ctt gcc ctc att tta aaa ggt  48 Met Asn Phe Gly Leu Ser Leu Ile Phe Leu Ala Leu Ile Leu Lys Gly             -15                 -10                  -5 gtc cag tgt gag gtg caa ctg gtg gag tct ggg gga gac tta gtg aag  96 Val Gln Cys Glu Val Gln Leu Val Glu Ser Gly Gly Asp Leu Val Lys      -1   1               5                  10 cct gga ggg tcc ctg aaa ctc tcc tgt gca gcc tct gga ttc act ttc  144 Pro Gly Gly Ser Leu Lys Leu Ser Cys Ala Ala Ser Gly Phe Thr Phe  15                  20                  25 agt agc tat ggc atg tct tgg att cgc cag act cca gac aag agg ctg  192 Ser Ser Tyr Gly Met Ser Trp Ile Arg Gln Thr Pro Asp Lys Arg Leu  30                  35                  40                  45 gag tgg gtc gca acc att agt agt ggt ggt agt tac acc tac tat cca  240 Glu Trp Val Ala Thr Ile Ser Ser Gly Gly Ser Tyr Thr Tyr Tyr Pro              50                  55                  60 gac agt gtg aag ggg cga ttc acc atc tcc aga gac aat gcc aag aac  288 Asp Ser Val Lys Gly Arg Phe Thr Ile Ser Arg Asp Asn Ala Lys Asn          65                  70                  75 acc cta tac ctg caa atg agc agt ctg aag tct gag gac aca gcc atg  336 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Pro Gly Arg Ser Leu Arg Leu Ser Cys Ala Ala Ser Gly Phe Thr Phe  15                  20                  25 agt agc tat ggc atg tct tgg gtc cgc cag gct cca ggc aag ggg ctg  192 Ser Ser Tyr Gly Met Ser Trp Val Arg Gln Ala Pro Gly Lys Gly Leu  30                  35                  40                  45 gag tgg gtg gca acc att agt agt ggt ggt agt tac acc tac tat cca  240 Glu Trp Val Ala Thr Ile Ser Ser Gly Gly Ser Tyr Thr Tyr Tyr Pro              50                  55                  60 gac agt gtg aag ggg cga ttc acc atc tcc aga gac aat tcc aag aac  288 Asp Ser Val Lys Gly Arg Phe Thr Ile Ser Arg Asp Asn Ser Lys Asn          65                  70                  75 acg ctg tat ctg caa atg aac agc ctg aga gct gag gac acg gct gtg  336 Thr Leu Tyr Leu Gln Met Asn Ser Leu Arg Ala Glu Asp Thr Ala Val      80                  85                  90 tat tac tgt gcg aga cag act act atg act tac ttt gct tac tgg ggc  384 Tyr Tyr Cys Ala Arg Gln Thr Thr Met Thr Tyr Phe Ala Tyr Trp Gly  95                 100                 105 cag gga acc ctg gtc acc gtc tcc tca                              411 Gln Gly Thr Leu Val Thr Val Ser Ser 110                 115 <210>59 <211>11 <212>PRT <213>智人(Homo sapiens) <400>59 Lys Ala Ser Gln Asp Val Asn Thr Ala Val Ala   1               5                  10 <210>60 <211>7 <212>PRT <213>智人(Homo sapiens) <400>60 Ser Ala Ser Asn Arg Tyr Thr   1               5 <210>61 <211>9 <212>PRT <213>智人(Homo sapiens) <400>61 Gln Gln His Tyr Ser Thr Pro Phe Thr   1               5 <210>62 <211>5 <212>PRT <213>智人(Homo sapiens) <400>62 Pro Tyr Trp Met Gln   1               5 <210>63 <211>16 <212>PRT <213>智人(Homo sapiens) <400>63 Ser Ile Phe Gly Asp Gly Asp Thr Arg Tyr Ser Gln Lys Phe Lys Gly   1               5                  10                  15 <210>64 <211>11 <212>PRT <213>智人(Homo sapiens) <400>64 Gly Leu Arg Arg Gly Gly Tyr Tyr Phe Asp Tyr   1               5                  10 <210>65 <211>411 <212>DNA <213>小家属(Mus musculus) <220> <221>CDS <222>(1)..(411) <220> <221>mat_肽 <222>(58)..(411) <400>65 atg gcc tgg act cct ctc ttc ttc ttc ttt gtt ctt cat tgc tca ggt  48 Met Ala Trp Thr Pro Leu Phe Phe Phe Phe Val Leu His Cys Ser Gly             -15                 -10                  -5 tct ttc tcc caa ctt gtg ctc act cag tca tct tca gcc tct ttc tcc  96 Ser Phe Ser Gln Leu Val Leu Thr Gln Ser Ser Ser Ala Ser Phe Ser      -1   1               5                  10 ctg gga gcc tca gca aaa ctc acg tgc acc ttg agt agt cag cac agt  144 Leu Gly Ala Ser Ala Lys Leu Thr Cys Thr Leu Ser Ser Gln His Ser  15                  20                  25 acg tac acc att gaa tgg tat cag caa cag cca ctc aag cct cct aag  192 Thr Tyr Thr Ile Glu Trp Tyr Gln Gln Gln Pro Leu Lys Pro Pro Lys  30                  35                 40                   45 tat gtg atg gat ctt aag caa gat gga agc cac agc aca ggt gat ggg  240 Tyr Val Met Asp Leu Lys Gln Asp Gly Ser His Ser Thr Gly Asp Gly              50                  55                  60 att cct gat cgc ttc tct gga tcc agc tct ggt gct gat cgc tac ctt  288 Ile Pro Asp Arg Phe Ser Gly Ser Ser Ser Gly Ala Asp Arg Tyr Leu          65                  70                  75 agc att tcc aac atc cag cca gaa gat gaa gca atg tac atc tgt ggt  336 Ser Ile Ser Asn Ile Gln Pro Glu Asp Glu Ala Met Tyr Ile Cys Gly      80                  85                  90 gtg ggt gat aca att aag gaa caa ttt gtg tat gtt ttc ggc ggt ggg  384 Val Gly Asp Thr Ile Lys Glu Gln Phe Val Tyr Val Phe Gly Gly Gly  95                 100                 105 acc aag gtc act gtc cta ggt cag ccc                              411 Thr Lys Val Thr Val Leu Gly Gln Pro 110                 115 <210>66 <211>411 <212>DNA <213>智人(Homo sapiens) <220> <221>CDS <222>(1)..(411) <220> <221>mat_肽 <222>(58)..(411) <400>66 atg gcc tgg act cct ctc ttc ttc ttc ttt gtt ctt cat tgc tca ggt  48 Met Ala Trp Thr Pro Leu Phe Phe Phe Phe Val Leu His Cys Ser Gly             -15                 -10                  -5 tct ttc tcc cag ctt gtg ctg act caa tcg ccc tct gcc tct gcc tcc  96 Ser Phe Ser Gln Leu Val Leu Thr Gln Ser Pro Ser Ala Ser Ala Ser      -1   1               5                  10 ctg gga gcc tcg gtc aag ctc acc tgc acc ttg agt agt cag cac agt  144 Leu Gly Ala Ser Val Lys Leu Thr Cys Thr Leu Ser Ser Gln His Ser  15                  20                  25 acg tac acc att gaa tgg cat cag cag cag cca gag aag ggc cct cgg  192 Thr Tyr Thr Ile Glu Trp His Gln Gln Gln Pro Glu Lys Gly Pro Arg  30                  35                  40                  45 tac ttg atg aaa ctt aag caa gat gga agc cac agc aca ggt gat ggg  240 Tyr Leu Met Lys Leu Lys Gln Asp Gly Ser His Ser Thr Gly Asp Gly              50                  55                  60 att cct gat cgc ttc tca ggc tcc agc tct ggg gct gag cgc tac ctc  288 Ile Pro Asp Arg Phe Ser Gly Ser Ser Ser Gly Ala Glu Arg Tyr Leu          65                  70                  75 acc atc tcc agc ctc cag tct gag gat gag gct gac tat tac tgt ggt  336 Thr Ile Ser Ser Leu Gln Ser Glu Asp Glu Ala Asp Tyr Tyr Cys Gly      80                  85                  90 gtg ggt gat aca att aag gaa caa ttt gtg tac gtg ttc ggc gga ggg  384 Val Gly Asp Thr Ile Lys Glu Gln Phe Val Tyr Val Phe Gly Gly Gly  95                 100                 105 acc aaa ctg acc gtc cta ggt cag ccc                              411 Thr Lys Leu Thr Val Leu Gly Gln Pro 110                 115 <210>67 <211>411 <212>DNA <213>智人(Homo sapiens) <220> <221>CDS <222>(1)..(411) <220> <221>mat_肽 <222>(58)..(411) <400>67 atg gcc tgg act cct ctc ttc ttc ttc ttt gtt ctt cat tgc tca ggt  48 Met Ala Trp Thr Pro Leu Phe Phe Phe Phe Val Leu His Cys Ser Gly             -15                 -10                  -5 tct ttc tcc cag ctt gtg ctg act caa tcg ccc tct gcc tct gcc tcc  96 Ser Phe Ser Gln Leu Val Leu Thr Gln Ser Pro Ser Ala Ser Ala Ser      -1   1               5                  10 ctg gga gcc tcg gtc aag ctc acc tgc acc ttg agt agt cag cac agt  144 Leu Gly Ala Ser Val Lys Leu Thr cys Thr Leu Ser Ser Gln His Ser  15                  20                  25 acg tac acc att gaa tgg tat cag cag cag cca gag aag ggc cct aag  192 Thr Tyr Thr Ile Glu Trp Tyr Gln Gln Gln Pro Glu Lys Gly Pro Lys  30                  35                  40                  45 tac ctg atg gat ctt aag caa gat gga agc cac agc aca ggt gat ggg  240 Tyr Leu Met Asp Leu Lys Gln Asp Gly Ser His Ser Thr Gly Asp Gly              50                  55                  60 att cct gat cgc ttc tca ggc tcc agc tct ggg gct gag cgc tac ctc 288 Ile Pro Asp Arg Phe Ser Gly Ser Ser Ser Gly Ala Glu Arg Tyr Leu          65                  70                  75 acc atc tcc agc ctc cag tct gag gat gag gct gac tat tac tgt ggt  336 Thr Ile Ser Ser Leu Gln Ser Glu Asp Glu Ala Asp Tyr Tyr Cys Gly      80                  85                  90 gtg ggt gat aca att aag gaa caa ttt gtg tac gtg ttc ggc gga ggg  384 Val Gly Asp Thr Ile Lys Glu Gln Phe Val Tyr Val Phe Gly Gly Gly 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背景技术 在恶性体液高钙血症(HHM)的药物治疗中(即药物治疗),辅助注 射一种袢利尿剂或一种骨吸收抑制剂(如双膦酸盐或降钙素)来给药。
当今药物治疗的趋势是单独给予降钙素或双膦酸盐,或者是降钙素和 双膦酸盐联合给药。
给予降钙素有着非常迅速的药力发作,治疗效果在给药后几个小 时内表现出来。
降钙素的药效主要是由于其骨吸收抑制作用。
实际应 用中,降钙素以每天两次(早晨和晚上),每次40到80单位的剂量通 过肌肉注射或静脉注射向病人给药。
双膦酸盐是一种化合物,其药效是由于具有非常强的骨吸收抑制 作用。
其药力发作较慢,需要3到4天才表现出治疗效果。
于是,也 使用一种包括降钙素和双膦酸盐(其药力发作慢,但具有较强的骨吸收 抑制作用)的联合治疗方法。
但不幸的是,双膦酸盐和降钙素在使用中有如下限制。
(1)双膦酸盐: ·尽管它可以抑制骨吸收,但不能改善肾中的钙排泄。
·药力发作较慢,在表现出治疗效果前需要3到4天。
·对于具有血内高水平PTHrP(12pmol/L或更高)的病人效果较 差,而且作用持续时间短。
·当重复给药时,药效作用减弱。
对于重复给药,需要间隔至 少一周时间以证实由初次给药的反应。
·有时可能会造成低血钙症。
(2)降钙素: 在给药后12到24小时其降低钙水平的效果达到最大。
但是,当 随后进行重复给药时,其效果在给药4到5天后才表现出重新上升的 效果,这被称为“逃逸现象”。
因上面所述的原因,由于重复给药或药物造成的抗性使药效减弱 而限制着这些药物在临床上的应用。
而且,这些药物不能满足改善HHM 病人的QOL。
发明公开 本发明的目的是提供一种抗药性高钙血症的治疗试剂,该试剂包 括一种能够抑制甲状旁腺激素相关蛋白(PTHrP)与其受体结合的物质 作为活性组分。
本发明人进行了具有深度和广度的研究以克服上文所述的缺点。
结果,本发明人发现了能抑制甲状旁腺激素相关蛋白(PTHrP)与其受 体结合的物质也能够改善对现存的治疗药物如骨吸收抑制剂具有抗性 的高钙血症。
这个发现导致本发明的完成。
相应的,本发明提供一种抗药性高钙血症的治疗试剂,该试剂包 括一种能够抑制甲状旁腺激素相关蛋白(PTHrP)与其受体结合的物质 作为其中的活性组分。
在这点上,抗药性的高钙血症可以对除抑制甲 状旁腺激素相关蛋白(PTHrP)与其受体结合的物质之外的其它治疗高 钙血症的药物具有抗性。
这种物质可以为PTHrP受体的拮抗剂,一种 抗PTHrP的抗体,抗体可以是单克隆或为多克隆,优选的为单克隆抗 体。
单克隆抗体可以为人源化或者为嵌合的单克隆抗体或者为人的抗 体,或者为抗体的一个片段和/或片段的修饰变体形式。
人源化抗体可 以为人源化#23-57-137-1抗体。
抗药性高钙血症可以是由癌症所引起 的。
“抗药性高钙血症”中的“药物”可以是任何药物或试剂,只要 它对高钙血症具有治疗效应,例如骨吸收抑制剂,钙排泄促进剂,抑 制胃肠进行钙吸收的试剂或袢利尿剂。
“抗药性高钙血症”在此是指一类高钙血症,当重复给药时其能 够表现出对具有治疗效力的药物的抗性,例如高钙血症对下列药物的 抗性:骨吸收抑制剂,钙排泄促进剂,抑制胃肠进行钙吸收的试剂或 袢利尿剂,优选的为骨吸收抑制剂。
骨吸收抑制剂包括双膦酸盐,降钙素等。
双膦酸盐包括,例如阿仑磷酸钠,帕米膦酸二钠,英卡磷酸二钠。
降钙素包括,例如降钙素,依降钙素,鲑降钙素。
钙排泄促进剂包括降钙素和袢利尿剂。
抑制胃肠进行钙吸收的试剂包括糖皮质激素和无机磷酸盐。
袢利尿剂包括呋喃苯氨酸。
破骨细胞抑制剂包括抗癌试剂,例如放线菌素D,顺铂和光神霉 素。
在下文中,将详尽的阐明本发明。
本说明书包括日本专利申请号为No.11-192270的专利申请中的 说明书和/或附图所公布的部分或全部内容,这为本申请的优先权文 件。
本发明与一种抗药性高钙血症的治疗药物相关,该药物包括一种 能够抑制甲状旁腺激素相关蛋白(下文中,被指代为“PTHrP”)与其受 体(下文中,被指代为“PTHrP受体”)结合的物质作为其中的活性组 分。
“PTHrP受体”这一术语在此定义为任何一种能够结合PTHrP(如 那些在日本国家阶段公开号No.6-506598中所描述的)的受体,而不论 PTHrP受体在靶器官(如骨,肾)中是否存在。
“能够抑制甲状旁腺激素相关蛋白(PTHrP)与其受体(即PTHrP受 体)结合的物质”这一术语在此定义为任何能够结合PTHrP来阻止 PTHrP与PTHrP受体结合的物质,例如抗PTHrP抗体;以及任何能 够结合PTHrP受体来阻止PTHrP受体与PTHrP结合的物质,例如针 对PTHrP受体的拮抗剂(PTHrP拮抗剂),特别是具有至少一个氨基酸 替换或缺失的PTHrP多肽,或PTHrP多肽的部分序列;或其组合。
抗PTHrP抗体包括任何已知的类型,例如人源化抗体,人抗体(WO 96/33735)或嵌合抗体(日本专利申请公开号No.4-228089),以及产自 于杂交瘤#23-57-137-1的抗体(即#23-57-137-1抗体)。
抗体可以为多克 隆类型或为单克隆类型,但优选的为单克隆类型。
PTHrP拮抗剂包括 但不限于一种多肽或为一种低分子量物质。
PTHrP拮抗剂的一个例子 为能够以拮抗PTHrP的方式结合到PTHrP受体上的物质,例如 PTHrP(7-34),PTHrP(8-34),PTHrP(9-34),PTHrP(10-34),或为至少 有一个氨基酸替换,缺失或插入的变体。
另外的例子包括如日本专利 申请公开号No.7-165790;日本国家阶段公开号No.5-509098; Peptides(美国),1995,16(6)1031-1037;和Biochemistry(美国)Apr. 28,1992,31(16)4026-4033中所述的具有针对PTHrP拮抗活性的多肽。
这些多肽可以有至少一个氨基酸的替换、添加或插入,只要它们保持 同等的PTHrP的拮抗活性水平;它们也包括在本发明的PTHrP拮抗 剂中。
本发明中,作为“能够抑制甲状旁腺激素相关蛋白(PTHrP)与其 受体结合的物质”的实例,一种抗PTHrP的抗体将在下文中详细阐述。
1.PTHrP的抗体 本发明中所使用的抗PTHrP的抗体可以为任何一种,只要其能 够表现出对抗药性高钙血症的治疗效果,而不论其来源、类型(单克隆 或多克隆)和构象。
本发明中所使用的抗PTHrP的抗体可以是单克隆或多克隆抗体, 并可以任何一种已知的方法生产。
抗PTHrP的抗体优选来自于哺乳动 物的单克隆抗体。
哺乳动物来源的单克隆抗体包括产白于杂交瘤的和 来自于使用遗传工程技术携带有抗体基因的重组表达质粒所转化的宿 主。
抗体能够结合到PTHrP上以阻止PTHrP和PTH/PTHrP受体的结 合,因此阻断了PTHrP的信号传导从而抑制了PTHrP的生物活性。
这种抗体的一个具体例子是由杂交瘤克隆子#23-57-137-1产生的 #23-57-137-1抗体。
杂交瘤克隆子#23-57-137-1被命名为“鼠-鼠杂交瘤#23-57-137- 1”,并依据布达佩斯条约于1996年8月15日保藏在日本工业科学 和技术机构--国立生命科学和人体技术研究所(1-3,Higashi 1-chome, Tsukuba-shi,Ibaraki,日本),保藏号:FERM BP-5631。
2.生产抗体的杂交瘤 生产单克隆抗体的杂交瘤可以按照下述方法产生。
也即,PTHrP 作为抗原用相应的常规免疫方法进行免疫。
利用常规的细胞融合的方 法将产生的免疫细胞与已知的亲代细胞融合,再利用常规的筛选方法 将能够产生单克隆抗体细胞从融合后的细胞中筛选出来。
首先,人的PTHrP作为生产抗体的敏化抗原,按照Suva,L.J.et al.,Science(1987)237,893文中所公开的PTHrP基因/氨基酸序列来表达 制备。
编码PTHrP的核酸序列被插入已知的表达载体,并将表达载体 转化到合适的宿主细胞内。
并按照已知的方法从转化的宿主细胞中或 转化的宿主细胞培养上清液中分离纯化得到PTHrP蛋白。
随后,纯化的PHTrP蛋白作为敏化抗原。
可替代的,PTHrP的 N末端区域的一段34氨基酸的多肽也能够被化学合成作为敏化抗原。
能够被敏化抗原所免疫的哺乳动物并没有特殊的限制。
但是,选 择哺乳动物优先考虑与用作细胞融合的亲代细胞的相容性。
一般采用 啮齿动物(如小鼠,大鼠,仓鼠)、兔或猴。
用敏化抗原对哺乳动物进行免疫可以按照已知方法进行,例如, 可以采用在哺乳动物的腹膜或皮下接种注射。
更具体的,敏化抗原用 磷酸盐缓冲液(PBS)或生理盐水进行合适的稀释或悬浮,所得到的稀 释液或悬浮液与适当量的常规佐剂相混合(如:弗氏完全佐剂)得到乳 剂。
乳剂被注射到哺乳动物数次,间隔为4到21天。
对于免疫接种 来说,敏化抗原可与合适的载体相结合。
免疫后,检测血清抗体水平。
当血清抗体水平达到所要的水平时, 从哺乳动物中分离免疫细胞用于进一步的细胞融合。
优选的免疫细胞 为脾细胞。
用于细胞融合的亲代细胞(即与免疫细胞发生融合的相应的细胞) 为来自于哺乳动物的骨髓瘤细胞。
骨髓瘤细胞是任何一种已知的细胞 系,例如P3(P3x63Ag8.653)(J.Immunol.(1979)123,1548-1550), P3x63Ag8U.1(Current Topics in Microbiology and Immunology (1978)81,1-7),NS-1(Kohler,G.and Milstein,C.Eur.J.Immunol. (1976)6,511-519),MPC-11(Margulies,D.H.et al.,Cell(1976)8, 405-415);SP2/0(Shulman,M.et al.,Nature(1978)276,269-270),FO(de St.Groth,S.F.et al.,J.Immunol.Methods(1980)35,1-21), S194(Trowbridge,I.S.,J.Exp.Med.(1978)148,313-323),或者为 R210(Galfre,G.et al.,Nature(1979)277,131-133)。
免疫细胞与骨髓瘤细胞的融合基本上根据任何已知的方法进行, 例如Milstein等的方法(Kohler,G.and Milstein,C.,Methods Enzymol.(1981)73,3-46)。
更具体的,细胞融合在细胞融合促进剂存在的情况下在常规的营 养培养基上进行。
细胞融合促进剂可以为多聚乙二醇(PEG)或仙台病 毒(日本红血球凝集病毒;HVJ)。
如果需要,为提高融合效率,可以 加入添加剂如二甲基亚砜。
用于细胞融合的免疫细胞与骨髓瘤细胞的比率可以是任意的。
例 如,所用的免疫细胞比骨髓瘤细胞多出1-10倍。
用于细胞融合的培养 基,例如为RPMI1640培养基或MEM培养基应适合上述的骨髓瘤细 胞系的生长,或者为其它通常用于培养这种细胞系的培养基。
如果需 要,血清添加物如胎牛血清可以加入到培养基中。
细胞融合的完成需要:将给定量的免疫细胞和骨髓瘤细胞在培养 基中完全混合,加入PEG溶液(如平均分子量为约1000-6000)(其被 预先加热到约37℃)到混合物中,通常浓度达到30-60%(w/v),随后将 溶液混合,即产生了所要的融合细胞(即杂交瘤)。
随后,在培养液中 依次加入适当的培养基,并离心除去上清液。
该步骤重复几次从培养 基中除去细胞融合促进剂或者类似的不利于杂交瘤生长的物质。
得到的杂交瘤可以在常规的选择性培养基中培养并选择出来,如 次黄嘌呤-氨基喋呤-胸苷(HAT)培养基。
杂交瘤在HAT培养基中培养 足够长的时间使得除所需要的杂交瘤之外的其它细胞(未能融合的细胞) 死亡,培养时间通常从几天到几周。
随后,用常规的限制稀释方法来 筛选和单一克隆分泌所需抗体的杂交瘤。
除了上述的用抗原免疫非人类的其它哺乳动物来制备杂交瘤的方 法之外,人类的淋巴细胞也可以在体外用PTHrP来敏化,并用敏化的 淋巴细胞与能够无限增殖的人源性骨髓瘤细胞融合,所产生的人抗体 具有抗PTHrP结合的活性(日本专利公开No.1-59878)。
可替代的,抗 PTHrP的人源抗体也可以通过将PTHrP作为抗原注入到转基因动物中 来制备,转基因动物具备人的全部抗体基因库,能够产生生产抗PTHrP 抗体的细胞,并通过使这种细胞永生化,从而从永生细胞中生产人抗 体(国际专利公开Nos.WO 94/25585,WO93/12227,WO92/03918和 WO94/02602)。
上述方法制备的生产单克隆抗体的杂交瘤可以在常规的培养基中 传代培养,并在液氮中长期保存。
为从杂交瘤中生产单克隆抗体,可使用如下一种方法:包括根据 常规技术培养杂交瘤以及从培养上清液中收集单克隆抗体;或者使用 另一种方法:包括将杂交瘤注射到与杂交瘤相容的哺乳动物中,使杂 交瘤在哺乳动物中生长并从哺乳动物的腹水中收集单克隆抗体。
前一 种方法适合于生产高纯度的抗体,后一种方法适合于大量生产抗体。
3.重组抗体 在本发明中,可以使用重组型的单克隆抗体,通过从杂交瘤中克 隆出抗体基因,并将抗体基因整合到合适的载体中,将载体转入宿主, 然后用常规的遗传重组技术从宿主中生产抗体(参见,例如 Vandamme,A.M.et al.,Eur.J.Biochem.(1990)192,767-775,1990)。
具体的,编码抗PTHrP抗体可变区(V区)的mRNA从生产抗PTHrP 抗体的杂交瘤中分离出来。
分离mRNA按照已知的制备全RNA的方 法进行,例如胍超速离心法(Chirgwin,J.M.et al.,Biochemistry (1979)18,5294-5299)和AGPC法(Chomczynski,P.et al.,Anal.Biochem. (1987)162,156-159),然后用mRNA纯化试剂盒(Pharmacia)或类似产品 将目的mRNA从全RNA中分离出来。
可替代的,mRNA也可以用 QuickPrep mRNA纯化试剂盒(Pharmacia)直接制备。
随后,将得到的mRNA用反转录酶合成抗体可变区(V区)的 cDNA。
用AMV反转录酶第一条链cDNA合成试剂盒(Seikagaku Corporation)或类似产品进行cDNA的合成。
cDNA的合成也可以通过 采用5’-RACE方法进行扩增合成(Frohman,M.A.et al.,Proc.Natl.Acad. Sci.USA(1988)85,8998-9002;Belyavsky,A.et al.,Nucleic Acids Res. (1989)17,2919-2932),使用5’-Ampli FINDER RACE Kit(CLONETECH) 试剂盒结合PCR方法,或使用类似产品。
从得到的PCR产物中分离并纯化目的DNA片段并将其连接到载 体DNA上以得到重组载体。
重组载体被转入宿主中,如大肠杆菌, 选择包含所需要的重组载体的克隆子。
重组载体中的目的DNA的核 酸序列如用双脱氧核酸链终止法确证。
一旦得到编码抗PTHrP抗体V区的DNA,将该DNA整合到含 有编码目的抗体稳定区(C区)的DNA的表达载体中。
为生产本发明中所用的抗PTHrP抗体,抗体基因被整合到表达 载体中以便于抗体基因能在表达控制区(如增强子,启动子)的调控下 进行表达。
宿主细胞用表达载体转化以表达抗体。
在抗体基因的表达中,编码抗体重链(H)的DNA和编码抗体轻链 (L)的DNA可以被整合到不同的表达载体中,然后用所得到的重组表 达载体共转染宿主细胞。
可替代的,编码抗体H链的DNA和编码抗 体L链的DNA可以一起整合到单一表达载体中,然后用重组表达载 体转化宿主细胞(WO94/11523)。
为生产重组抗体,除使用上述的宿主细胞,也可以使用转基因动 物作为宿主。
例如,抗体基因被插入到编码动物乳汁中产生的蛋白(如 山羊β-酪蛋白)的基因的预定位点以得到融合基因。
包含引入抗体基于 的融合基因的DNA片段被注射到山羊的胚胎中,随后将胚胎转入到 母山羊中。
带有这种胚胎的母山羊即怀着转基因山羊。
目的抗体被分 泌到转基因山羊或其后代的乳汁中。
为了增强转基因山羊的含抗体的 乳汁产量,可以给转基因山羊施用适当的激素(Ebert,K.M.et al., Bio/Technology(1994)12,699-702)。
4.修饰的抗体 本发明中,为降低对人体或类似物的异源性,使用经人工修饰过 的重组抗体,例如嵌合抗体和人源化抗体。
这些修饰抗体能用如下已 知的方法制备。
本发明中所使用的嵌合抗体制备:按照如上所制备的编码抗体V 区的DNA连接到编码人抗体C区的DNA上,将连接产物整合到表达 载体上,并将重组表达载体转化宿主以产生嵌合抗体。
人源化抗体也被称为“重构的人抗体”,其中非人类哺乳动物(如 小鼠)抗体的互补决定区(CDRs)被嫁接到人抗体CDRs上。
用于生产这 种人源化抗体的一般遗传重组过程也是已知的(EP 125023; WO96/02576)。
具体的,一段DNA序列用几种寡核苷酸作为引物进行RCR扩增。
在所述DNA序列中通过人抗体的构架区(FRs),小鼠的抗体CDRs被 连接。
引物已被设计成与CDRs和FRs的终止区有重叠区域。
得到的 DNA片段与编码人抗体C区的DNA连接,连接产物整合到表达载体 中。
所得到的重组表达载体被转入到宿主中,以生产人源化抗体(EP 239044;WO96/02576)。
通过CDRs相连接的人抗体FRs是经选择的,以便CDRs能够形 成合适的抗原结合位点。
如果需要,抗体V区的FRs中的一个氨基酸 可以被替换使得重构的人抗体的CDRs能够形成合适的抗原结合位点 (Saro,K.et al.,Cancer Res.(1993)53,851-856)。
嵌合抗体或人源化抗体的C区可以是任何一种人抗体的C区, 例如对于H链来说为Cγ1,Cγ2,Cγ3或Cγ4,对于L链来说为 Cκ或Cλ。
人抗体的C区可以被修饰为改进抗体的稳定生产。
嵌合抗体包括来源于非人的哺乳动物抗体的V区和来源于人抗体 的C区。
人源化抗体包括来源于非人的哺乳动物抗体的CDRs和来源 于人抗体的FRs和C区。
该人源化抗体可作为本发明的治疗试剂的 活性组分,因为该抗体针对人体的免疫原性被降低了。
可用于本发明的人源化抗体的一个具体例子为人源化#23-57-137- 1抗体;其CDRs是来源于鼠#23-57-137-1抗体;L链包括通过来源于 人抗体HSU03868(GEN-BANK,Deftos,M.et al.,Scand.J.Immunol.,39,95- 103,1994)的3个FR(FR1,FR2,FR3)和来源于人抗体S25755(NBRF- PDB)的1个FR(FR4)相连接的CDRs;H链包括通过来源于人抗体 S31679(NBRF-PDB,Cuisinier,A.M.et al.,Eur.J.Immunol.23,110-118,1993) 相连接的CDRs,其中FRs中的部分氨基酸残基被替换以便于重构的 人源化抗体能够表现出抗原结合活性。
包含携有编码人源化#23-57-137-1抗体H链和L链DNA质粒的 大肠杆菌分别被命名为大肠杆菌JM109(hMBC1HcDNA/pUC19)(对于 H链),和大肠杆菌JM109(hMBC1Lqλ/pUC19)(对于L链)。
这些菌株 依据布达佩斯条约于1996年8月15日保藏在日本工业科学和技术机 构--国立生命科学和人体技术研究所(1-3,Higashi 1-chome,Tsukuba-shi, Ibaraki,日本),对于大肠杆菌JM109(hMBC1HcDNA/pUC19),保藏号: FERM BP-5629,对于大肠杆菌JM109(hMBC1Lqλ/pUC19),保藏号: FERM BP-5630。
5.抗体变体 本发明所用的抗体可以为抗体的一个片段或片段的修饰形式,只 要它能够结合PTHrP并抑制PTHrP的活性。
例如,抗体的片段包括 Fab,F(ab’)2,Fv,或单链Fv(scFv),其由H链的Fv片段和L链的Fv片 段通过合适的连接物连接而成。
具体的,这些抗体片段可以通过酶(例 如木瓜蛋白酶,胃蛋白酶)将抗体酶切成抗体片段,或者通过构建编码 抗体片段的基因,并将基因插入到表达载体,随后将重组的表达载体 转入到合适的宿主细胞中,以表达抗体片段(参见,例如Co,M.S.,et al.,J.Immunol.(1994),152,2968-2976;Better,M.& Horwitz,A.H., Methods in Enzymology(1989),178,476-496,Academic Press,Inc.; Plueckthun,A.& Skerra,A.,Methods in Enzymology(1989),178, 476-496,Academic Press,Inc.;Lamoyi,E.,Methods in Enzymology (1989),121,652-663;Rousseaux,J.et al.,Methods in Enzymology (1989),121,663-669;Bird,R.E.et al.,TIBTECH(1991)9,132-137)。
scFv的产生可以通过用连接物,优选的为肽连接物 (Huston,J.S.,Proc.Natl.Acad.Sci.USA(1998)85,5879-5883)将H链的V 区和L链的V区连接起来。
scFv中的H链V区和L链V区可以来自 所述的任何一种抗体。
结合V区的多肽连接物可以为任何一种单链多 肽,例如12-19个氨基酸残基。
编码scFv的DNA的制备:首先分别扩增编码抗体H链V区的 DNA和编码抗体L链V区的DNA,使用编码包括V区在内的整个或 部分H链DNA片段,以及编码包括V区在内的整个或部分L链DNA 片段作为模板并使用定义了DNA片段的末端的引物对;然后扩增编 码多肽连接物的DNA,使用编码肽连接物的DNA片段作为模板并使 用定义了DNA片段的末端的引物对,以便肽连接物的末端能够分别 与H链的V区和L链的V区相连接。
一旦编码scFv的DNA被制备好,用常规方法制备携带DNA的 表达载体和转化有表达载体的宿主。
并可以通过常规方法从转化的宿 主中产生scFv。
抗体的片段的产生可以按照上述方法制备片段的基因并在合适的 宿主中表达。
抗体片段也包括在本发明的“抗体”的范围内。
作为上述抗体的一种修饰形式,例如,抗PTHrP抗体与任何分 子(如聚乙二醇)的结合也可以使用。
这种修饰的抗体也包括在本发明 的“抗体”的范围内。
修饰的抗体可以通过对抗体进行化学修饰来制 备。
适用于该目的的化学修饰技术也已经存在于现有技术中。
6.重组抗体或修饰抗体的表达和生产 上述构建的抗体基因可以按照已知的方法生产和表达。
对于在哺 乳动物细胞中的表达,常规可用的启动子,用于表达的抗体基因和 poly(A)信号(位于抗体基因的3’端下游)被可操控的连接。
例如,作为 可用的启动子/增强子系统,人巨细胞病毒立即早期启动子/增强子系 统被使用。
其它用于本发明的对抗体表达可用的启动子/增强子系统包括来 源于病毒的(如逆转录病毒,多瘤病毒,腺病毒和猴病毒40(SV40))和 来源于哺乳动物细胞(如人延伸因子1α(HEF1α)) 当使用SV40启动子/增强子系统,基因表达可以很容易的按照 Mulligan等(Nature(1979)277,108)的方法进行。
当使用HEF1α启动 子/增强子系统时,基因表达可以很容易的按照Mizushima等(Nucleic Acids Res.(1990)18,5322)的方法进行。
对于在大肠杆菌中表达,常规可用的启动子,用于分泌目的抗体 的信号序列和抗体基因被可操控的连接。
作为这种启动子,可以使用 lacZ启动子或araB启动子。
当使用lacZ启动子时,基因表达可按照 Ward等(Nature(1098)341.544-546;FASBE J.(1992)6,2422-2427)的方 法进行。
当使用araB启动子时,基因表达可按照Better等(Better et al., Science(1998)240,1041-1043)的方法进行。
关于抗体分泌的信号序列,当目的抗体被分泌到大肠杆菌的周质 空间中,可以使用pelB信号序列(Lei,S.P.et al., J.Bacteriol.(1987)169,4379)。
分泌到周质空间的抗体被分离并重新折叠 以便于该抗体形成适当可用的构象。
关于复制起点,可以使用来源于病毒的复制起点(如SV40,多瘤 病毒,腺病毒,牛乳头状瘤(BPV))或类似复制起点。
为了增加在宿主 细胞系统中基因的拷贝数,表达质粒进一步含有选择性标记基因,例 如氨基糖苷磷酸转移酶(APH)基因,胸苷激酶(TK)基因,大肠杆菌黄 嘌呤鸟嘌呤磷酸核糖异构酶(Ecogpt)基因和二氢叶酸还原酶(dhfr)基 因。
对于本发明中使用的抗体的生产,可以使用任何一种表达系统如 真核和原核细胞系统。
真核细胞包括已建立的动物细胞系(如哺乳动 物,昆虫,霉菌和真菌,酵母)。
真核细胞包括细菌细胞如大肠杆菌。
本发明所用的抗体优选的为在哺乳动物细胞中表达,如CHO, COS,骨髓瘤,BHK,Vero或Hela细胞。
随后,转化的宿主细胞在体外或体内培养以生产目的抗体。
宿主 细胞的培养可以使用任何已知的方法。
此处可以使用的培养基为 DMEM,MEM,RPMI1640或IMDM培养基。
培养基中可以包含血清 添加物,例如胎牛血清(FCS)。
7.抗体的分离和纯化 按照上述方法表达和生产的抗体可以从宿主细胞或宿主动物体内 分离并纯化成均一。
本发明所用的抗体的分离和纯化可以在一个亲和 柱中进行。
蛋白A柱的例子包括HyperD,POROS和Sepharose F.F.(Pharmacia)。
方法没有特别的限制,其它常规用于分离和纯化抗 体的方法也可以使用。
例如,除上述亲和层析柱之外,各种柱层析、 过滤、超滤、盐析和透析可以单独使用或组合使用来分离和纯化目的 抗体(Antibodies A Laboratory Manual.Ed.Harlow,David Lane,Cold Spring Harbor Laboratory,1998)。
8.抗体活性的测定 本发明所用抗体的抗原结合活性的测定(Antibodies A Laboratory Manual.Ed.Harlow,David Lane,Cold Spring Harbor Laboratory,1998),或 者对配基受体的抑制活性(Harada,A.et al.,International Immunology (1993)5,681-690)可以使用任何一种已知的方法进行。
测定本发明所用的抗PTHrP抗体的抗原结合活性的测定方法可 以是ELISA(酶联免疫吸附分析),EIA(酶免疫分析),RIA(放射免疫分 析)或荧光抗体。
例如,当使用酶免疫分析时,包含抗PTHrP抗体的 样本溶液(如产生抗PTHrP抗体的细胞培养上清液,或纯化形式的抗 PTHrP抗体)被加入到平板上,在其上预先包被着PTHrP(1-34)。
标 记着酶(如碱性磷酸酶)的二级抗体再被加入到平板中。
将平板温育并 洗涤。
酶的底物(如对硝基苯基磷酸)被加入到平板中,测量平板中溶 液的吸收值以评价抗体的抗原结合活性。
为了证实本发明中所用的抗体的活性,可测定抗体(如抗PTHrP 抗体)的中和活性。
9.给药途径和药物制备 本发明中的治疗试剂可以用于治疗或改善抗药性高钙血症。
抗药 性高钙血症可以是肿瘤诱发类型或为其它类型。
肿瘤诱发类型的一个 例子为恶性高钙血症。
非肿瘤诱发类型的例子包括妊娠围产期高钙血症和哺乳期妇女和 新生儿高钙血症。
治疗试剂包括抗PTHrP抗体作为活性成分,根据本发明其可以 通过口服给药或肠胃外方式,优选的为肠胃外方式。
治疗试剂可以采 用任何一种制剂形式,例如经肺的试剂(如在诸如雾化器设备的帮助下 使用试剂),经鼻的试剂,经皮的试剂(如膏剂,乳剂)或注射给药。
注 射的例子如全身或局部给药包括静脉注射(如滴注),肌肉注射,腹膜 注射和皮下注射。
给药途径可以根据病人的年龄和发病的情况来作出 恰当的选择。
有效的单一剂量可从0.001到1,000mg/kg体重范围内选 择,优选范围为0.1到50mg/kg体重,更优选为0.5-10mg/kg。
可替换 的,用于病人的剂量可在0.01到100,000mg/个体的剂量范围中选择, 更优选的为10到5000mg/个体。
但是,包含本发明的抗PTHrP抗体 的治疗试剂的剂量并不仅限制于这些范围里。
治疗试剂可以在病人的任何阶段给药,包括抗药性高钙血症发病 前和发病后。
在预见到会造成病人体重下降的阶段也可以施用治疗试 剂。
治疗试剂包括抗PTHrP抗体作为本发明中的活性组分,可以用 任何常规的方法制剂(Remington’s Pharmaceutical Science,latest edition, Mark Publishing Company,Easton,USA)。
制备过程进一步包括药剂学 上可接受的载体和添加剂。
这种载体和添加剂的实例包括水,药剂学上可接受的有机溶剂, 胶原,聚乙烯醇,聚乙烯吡咯烷酮,羧基乙烯基聚合物,羧甲基钠纤 维素,多聚(丙烯酸钠),精氨酸钠,水溶性右旋糖苷,羧甲基钠淀粉, 果胶,甲基纤维素,乙基纤维素,黄原胶,阿拉伯胶,酪蛋白,琼脂, 聚乙基乙二醇,甘油二醇,丙三醇,丙烯乙二醇,凡士林,石蜡,十 八烷基醇,硬脂酸,人血清白蛋白(HSA),甘露醇,山梨醇,乳糖和 可接受的作为药物添加剂的表面活性剂。
在实际应用中,从上述成员中选择适当的添加剂,或单独使用或 组合使用依赖于(不限制于)所用的试剂形式。
例如,对于用作注射形 式,抗PTHrP抗体的纯化形式溶解于溶剂中(如生理盐水,缓冲液, 葡萄糖溶液),然后加入防止吸收剂(如Tween80,Tween20,明胶,人血 清白蛋白)。
本发明中的治疗试剂可以采用可复溶的冻干形式,其可以 在使用前溶解。
对于冻干形式的制剂,可以加入一种诸如糖醇赋形剂(例 甘露醇,葡萄糖)或糖。
附图简述 图1该图表示双膦酸盐抗性的高钙血症模型动物上的药理学研 究结果。
图2该图表示双膦酸盐抗性的高钙血症模型动物上的药理学研究 结果。
图3该图表示降钙素抗性的高钙血症模型动物上的药理学研究结 果。
图4该图表示降钙素抗性的高钙血症模型动物上的药理学研究结 果。
实施本发明的最佳方式 在下文中,本发明将被更详尽的描述,参照下面的参考例和实施 例,但不应理解为对本发明的技术范围进行限制。
【实施例1】双膦酸盐抗性的高钙血症模型动物上的药理学研究 (1)研究目的 为产生双膦酸盐抗性的高钙血症模型动物,使用了高钙血症模型 动物(人肿瘤移植的裸鼠),并检测了人源化抗PTHrP对模型动物体内 血钙水平的治疗效果。
(2)方法 作为模型动物,使用了植入人大细胞肺癌LC-6的裸鼠(购自 Central Institute for Experimental Animals)。
已知植入人大细胞肺癌LC-6 肿瘤的裸鼠伴随着肿瘤体积的增长会表现出血钙水平增长和体重下降 等。
当确证已发生高钙血症后,向模型动物重复给予阿仑磷酸钠(一种 双膦酸盐),直到观察到血钙水平无改善,也就是说模型动物获得了对 双膦酸盐的抗性。
按这种方式,产生了双膦酸盐抗性的高钙血症模型 动物。
用BALB/c-nu/nu裸鼠(CLEA Japan,Inc.)在体传代培养人大细胞 肺癌LC-6。
人源化单克隆抗体在具有双膦酸盐抗性的高钙血症的模型大鼠 中,改善效果用大鼠的体重和血钙水平来评价。
对于评价人源化单克隆抗体的药理学作用,购买了5周龄大的雄 性F344/N Jcl-rnu裸鼠(CLEA Japan.Inc)并使之适应环境一周。
所得的 6周龄大的裸鼠被植入肿瘤,血钙水平升高、体重减轻的裸鼠被用来 作为高钙血症的模型动物。
产生的双膦酸盐抗性的高钙血症模型动物 按照下面的方法分组。
传代培养的人大细胞肺癌LC-6从裸鼠上去除, 被仔细切成3毫米立方的小块。
所得的肿瘤小块被皮下植入到每一只 大鼠体侧面,每只鼠植入一块。
在植入后约一个半月,血钙水平升高 同时体重下降的大鼠(即高钙血症模型动物)被分组,以使得每组中大 鼠的血钙水平和体重达到平均值。
阿仑磷酸钠以一种已知的针对高钙血症的药物制剂形式向每组高 钙血症模型动物给药(阿仑磷酸钠水化注射液,“Teiroc Iniection”来 自Teijin Limited),通过尾静脉以2.5mg/kg的剂量水平每周注射两次。
作为对照,磷酸盐缓冲液(PBS)通过尾静脉每周注射两次向另一组每 一个高钙血症模型动物给药。
在阿仑磷酸钠给药组模型动物中,在使 用阿仑磷酸钠五次后(即在第0,3,7,10和14天给药)仍未发现血钙 水平有所改善的动物被认为是双膦酸盐抗性的高钙血症模型动物。
在 第17天,这些模型动物被分组,以使得每组中鼠的血钙水平和体重 达到平均值。
检测对双膦酸盐抗性的高钙血症的治疗效果按照如下方式进行。
在双膦酸盐抗性的高钙血症模型动物实验组中(已按前述方法产生并分 组),每只模型动物通过尾静脉给予3mk/kg的人源化抗PTHrP抗体或 2.5mg/kg的双膦酸盐。
在对照组中,通过尾静脉向每只模型动物给予 PBS。
在给予阿仑磷酸钠或PBS后第3,7,10,14和17天分别测定 血钙水平和体重。
在第17天,将使用阿仑磷酸钠的模型动物分组使 得每组中鼠的血钙水平和体重达到平均值。
在每个实验组中,人源化 单克隆抗体或阿仑磷酸钠被给予。
在对照组中,给予PBS。
在使用人 源化单克隆抗体或阿仑磷酸钠后第4天和第7天,测量每只动物的血 钙水平以及体重以检测药理学效率。
血钙水平的测量为全血离子化钙水平,用血球压积管在每只动物 的尾静脉取血,并将血加入到643型全自动Ca/pH分析仪(CIBA- CORNING)。
(3)结果 通过重复给予双膦酸盐(共5次,每次间隔两周),双膦酸盐抗性 的高钙血症模型动物被成功建立。
本发明中的人源化单克隆抗体能够 改善双膦酸盐抗性的高钙血症模型动物的血钙水平(图1)。
在抗体给予 组,也观察到体重的恢复(图2)。
从这些结果可以发现人源化单克隆抗 PTHrP抗体可作为对双膦酸盐获得抗药性的恶性高钙血症的治疗试 剂。
【实施例2】降钙素抗性的高钙血症模型动物上的药理学试验 (1)试验目的 为产生降钙素抗性的高钙血症模型动物,使用了高钙血症模型动 物(人肿瘤移植的裸鼠),并检测了人源化单克隆抗PTHrP抗体对模型 动物体内血钙水平的治疗效果。
(2)方法 作为模型动物,使用了植入人大细胞肺癌LC-6的裸鼠(购自 Central Institute for Experimental Animals)。
已知植入人大细胞肺癌LC-6 的裸鼠会伴随着肿瘤体积的增长表现出血钙水平增长和体重下降等。
当确证已发生高钙血症后,向模型动物重复给予依降钙素,一种降钙 素,直到观察到血钙水平无改善,也就是说模型动物获得了对降钙素 的抗性。
按这种方式,产生了降钙素抗性的高钙血症模型动物。
用 BALB/c-nu/nu裸鼠(CLEA Japan,Inc.)在体内传代培养人大细胞肺癌 LC-6。
人源化单克隆抗体在降钙素抗性的高钙血症模型大鼠中的改善效 果用鼠的体重和血钙水平来评价。
对于评价人源化单克隆抗体的药理学作用,购买了5周龄大的雄 性F344/N Jcl-rnu裸鼠(CLEA Japan,Inc.)并使之适应环境一周。
所得6 周龄大的大鼠被植入肿瘤,血钙水平升高、体重减轻的大鼠被用来作 为高钙血症的模型动物。
产生的降钙素抗性的高钙血症模型动物按照 下面的方法分组。
传代培养的人大细胞肺癌LC-6从裸鼠上去除,被 仔细切成3毫米立方的小块。
肿瘤小块被皮下植入到每一只大鼠侧面, 每只鼠植入一块。
在植入后约一个半月,血钙水平升高和体重下降大 鼠(即高钙血症模型动物)被分组,以使得每组中鼠的血钙水平和体重 达到平均值。
依降钙素向每组每只高钙血症模型动物给药(“Elcatonin Injection”来自Asahi Chemical Industry Co.,Ltd.),通过尾静脉以10U/kg 的剂量水平每天注射两次(每次间隔12小时)。
作为对照,磷酸盐缓冲 液(PBS)通过尾静脉每周注射两次向另一组每只的高钙血症模型动物 给药。
在依降钙素给药组模型动物中,在给依降钙素十二次后(即在第 0,1,2,3,4,5天,每天两次)仍未发现血钙水平有所改善的动物 被认为是降钙素抗性的高钙血症模型动物。
这些模型动物被分组,以 使得每组中动物中血钙水平和体重达到平均值。
检测对降钙素抗性的高钙血症的治疗效果按照如下方式进行。
在 降钙素抗性的高钙血症模型动物实验组中(已按前述方法产生并分 组),每只模型动物通过尾静脉给予3mk/kg的人源化单克隆抗PTHrP 抗体或PBS。
在对照组中,通过尾静脉向每只模型动物给予PBS。
在给予降钙素或PBS后第0.5,1,2,3,4,5和6天分别测定 血钙水平。
在给予降钙素或PBS后第0.5,1,1.5,2,2.5,3,3.5, 4,4.5,5,5.5和6天分别测定体重。
在第6天,将使用降钙素的模 型动物组分组使得每组中动物的血钙水平和体重达到平均值。
在每个 实验组中,人源化单克隆抗体或PBS被给予。
在对照组中,给予PBS。
在使用人源化单克隆抗体或PBS后第1天或第3天,测量每只动物的 血钙水平以及体重以检测药理学效率。
血钙水平的测量为全血离子化 钙水平,用血球压积管在每只动物的尾静脉取血,并将血加入到643 型全自动Ca/pH分析仪(CIBA-CORNING)。
(3)结果 通过连续给予降钙素(共12次,间隔为每天两次),降钙素抗性的 高钙血症模型动物被成功建立。
本发明中的人源化单克隆抗体能够成 功改善降钙素抗性的高钙血症模型动物的血钙水平(图3)。
在抗体给予 组,也观察到体重的恢复(图4)。
从这些结果可以发现人源化单克隆抗 PTHrP抗体作为获得对降钙素抗药性的恶性高钙血症的治疗试剂是有 用的。
【参考例1】制备生产抗PTHrP(1-34)小鼠单克隆抗体的杂交 瘤 能够生产抗人的PTHrP(1-34)(SEQ ID NO:75)的杂交瘤#23-57-154 和#23-57-137-1按照如下方法制备(参见Sato,K.et al.,J.Bone Miner.Res.8,849-860,1993)。
人PTHrP的氨基酸序列显示在SEQ ID NO:75。
作为免疫源用途,可以用碳化二亚胺(Dojinn)将PTHrP(Peninsula) 连接到载体蛋白甲状腺球蛋白上。
与甲状腺球蛋白相连的PTHrP(1- 34)透析得到含有蛋白质浓度2μg/ml的溶液。
所得溶液与弗氏佐剂 (Difco)按照1∶1的混合比例混合得到乳剂。
这种乳剂注射16只BALB/C 雌鼠11次,在背部皮下注射或腹膜下以每次注射100微克/小鼠的剂 量,从而免疫小鼠。
为激发免疫,可以使用弗氏完全佐剂;为增强免 疫,可以使用弗氏不完全佐剂。
每只被免疫的小鼠按照如下方法测定血清中抗体滴度。
即每只小 鼠通过尾静脉取血,并从血中分离抗血清。
抗血清用RIA缓冲液稀释 并与125I标记的PTHrP(1-34)混合来测定结合活性。
证实有足够增加滴 度的小鼠被以50μg/小鼠的剂量腹膜注射不含载体蛋白的PTHrP(1-34) 来进行最终的免疫接种。
最终的免疫接种三天后,鼠被处死并从中取出脾脏。
根据已知的 常规方法,用50%聚乙二醇4000使脾细胞和鼠骨髓瘤细胞系P3× 63Ag8U.1融合。
制备的融合细胞接种到96孔板的85个孔中每一个 孔达到密度2×104/孔。
杂交瘤用HAT培养基按照如下的方法筛选。
在培养于HAT培养基中且能观察到有细胞生长的孔中,用固相 RIA方法测定在培养上清液中PTHrP识别抗体的存在,从而筛选出杂 交瘤。
从已证实有结合PTHrP识别抗体结合活性的孔中收集杂交瘤。
得到的杂交瘤悬浮于含有15%FCS并添加有OPI-辅助剂(Sigma)的 RPMI-1640培养基中,随后用限制稀释法使杂交瘤一致化。
因此,可 以得到两种类型的杂交瘤克隆,#23-57-154和#23-57-137-1,两种都 具有高的PTHrP(1-34)结合活性。
杂交瘤克隆子#23-57-137-1被命名为“鼠-鼠杂交瘤#23-57-137- 1”,并依据布达佩斯条约于1996年8月15日保藏在日本工业科学 和技术机构--国立生命科学和人体技术研究所(1-3,Higashi 1- chome,Tsukuba-shi,Ibaraki,日本);保藏号:FERM BP-5631。
【参考例2】编码抗人的PTHrP(1-34)小鼠单克隆抗体V区的DNA 的克隆 编码抗人的PTHrP(1-34),#23-57-137-1,小鼠单克隆抗体V区 的DNA的克隆按照如下方法进行。
(1)mRNA的制备 用Quick Prep mRNA Purification Kit(Pharmacia Biotech)从杂交瘤 #23-57-137-1制备mRNA。
即,用提取缓冲液将杂交瘤#23-57-137-1 细胞充分均质化,根据试剂盒内的说明用oligo(dT)-Cellulose Spun Column分离和纯化mRNA。
所得的溶液用乙醇沉淀得到沉淀物 mRNA。
mRNA沉淀物被溶解于洗脱缓冲液。
(2)用于编码小鼠H链V区基因的cDNA的产生和扩增 (i)#23-57-137-1抗体H链V区的cDNA克隆 编码抗人PTHrP的小鼠单克隆抗体H链V区的基因用5’-RACE 方法克隆(Frohman,M.A.et al.,Proc.Natl.Acad.Sci.USA,85,8998- 9002,1998;Belyavsky,A.et al.,Nucleic Acids Res.17,2919- 2932,1989)。
5’-RACE方法根据试剂盒内的说明用5’-Ampli FINDER RACE Kit(CLONETECH)来进行。
在此方法中,用于合成cDNA的引 物为MHC2引物(SEQ ID NO:1),其能够与小鼠H链C区杂交。
上述 制备的mRNA(约2μg),为cDNA合成的模板,与MHC2引物(10pmol) 混合。
得到的混合物与逆转录酶在52℃反应30分钟使mRNA逆转录 为cDNA。
在得到的反应溶液中加入6N的NaOH来水解其中任何残留的 RNA(65℃30分钟),然后用乙醇沉淀分离和纯化沉淀物cDNA。
纯化 的cDNA在5’端相连接到Ampli FINDER Anchor(SEQ IDNO:42),用 T4 RNA连接酶于37℃反应6小时并在室温放置16小时来进行反应。
作为PCR方法中扩增cDNA的引物,使用了Anchor引物(SEQ ID NO:2) 和MHC-G1引物(SEQ ID NO:3)(S.T.Jones,et al.,Biotechnology,9,88, 1991)。
PCR溶液包括(每50μl)10mMTris-HCl(pH8.3),50mM KCl,0.25mM dNTPs(dATP,dGTP,dCTP,dTTP),1.5mM MgCl2,2.5单位TakaRa Taq(Takara Shuzo Co.,Ltd.),10pmols Anchor引物,和1μl MHC-G1 引物和Amplic FINDER Anchor引物已连接于cDNA的反应混合物, 在PCR溶液上加入矿物油(50μl)。
PCR反应在Thermal Cycler Model 480J(Perkin Elmer)上按照条件:94℃45秒;60℃45秒;72℃2分 钟,进行30次循环。
(ii)#23-57-137-1抗体L链V区的cDNA克隆 编码抗人PTHrP的小鼠单克隆抗体L链V区的基因用5’-RACE 方法克隆(Frohman,M.A.et al.,Proc.Natl.Acad.Sci.USA,85,8998- 9002,1998;Belyavsky,A.et al.,Nucleic Acids Res.17,2919- 2932,1989)。
5’-RACE方法根据试剂盒内的说明用5’-Ampli FINDER RACE Kit(CLONETECH)来进行。
在此方法中,用于合成cDNA的引 物为oligo-dT引物。
上述制备的mRNA(约2μg),为合成cDNA的模 板,与oligo-dT引物混合。
得到的混合物与逆转录酶在52℃反应30 分钟使mRNA逆转录为cDNA。
在反应溶液中加入6N的NaOH来水 解其中任何残留的RNA(65℃30分钟),然后用乙醇沉淀分离和纯化沉 淀物cDNA。
所合成的cDNA在5’端相连接于Ampli FINDER Anchor, 用T4 RNA连接酶于37℃反应6小时并在室温放置16小时来进行反 应。
PCR引物MLC(SEQ ID NO:4)基于小鼠L链λ链C区的保守序列 设计并用394DNA/RNA合成仪合成(ABI)。
PCR溶液包括(每 100μl)10mM Tris-HCl(pH8.3),50mM KCl,0.25mM dNTPs(dATP,dGTP, dCTP,dTTP),1.5mM MgCl2,2.5单位AmpliTaq(PERKIN ELMER), 50pmols Anchor引物(SEQ ID NO:2),和1μl MLC引物(SEQ ID NO:4) 和Amplic FINDER Anchor引物与cDNA相连接的反应混合物,在PCR 溶液上加入矿物油(50μl)。
PCR反应在Thermal Cycler Model 480J(Perkin Elmer)上按照条件:94℃45秒;60℃45秒;72℃2分 钟,进行35次循环。
(3)PCR产物的纯化和片段化 由上述PCR方法扩增得到的DNA片段用3%Nu Sieve GTG琼 脂(FMC Bio.Products)进行琼脂凝胶电泳来分离。
对于每一个H链的 V区和L链的V区,包含约550bpDNA片段的琼脂部分被从胶上切下。
每个琼脂部分用GENECLEAN II Kit(Bio101)根据试剂盒中的说明纯 化目的DNA片段。
纯化的DNA用乙醇沉淀,DNA沉淀物溶解于20μl 包含10mMTris-HCl(pH7.4)和1mM EDTA的溶液中。
一部分DNA溶 液(1μl)用限制性酶XmaI(New England Biolabs)37℃反应1小时酶切, 并用限制性酶EcoRI(Takara Shuzo Co.,Ltd.)37℃反应1小时进一步酶 切。
酶切溶液用苯酚和氯仿抽提并用乙醇沉淀以收集DNA。
在此方法中,两条分别包含编码小鼠H链V区和L链V区的基 因的DNA片段被得到,且两条在5’末端都含有EcoRI识别序列和在 3’末端的XmaI识别序列。
两条分别包含编码小鼠H链V区和L链V区的基因的EcoRI-XmaI DNA片段被分别连接到pUC19载体上,该载体已用EcoRI和XmaI 酶切,用DNA Ligation Kit ver.2(Takara Shuzo Co.,Ltd.)并根据试剂盒 的说明于16℃连接反应1小时。
一部分连接混合物(10μl)被加入到100μl 包含大肠杆菌,JM109(Nippon Gene Co.,Ltd.)的感受态细胞溶液中。
细 胞混合物放置在冰上15分钟,然后42℃1分钟,然后在冰上放置1 分钟。
所得的细胞混合物中加入300μl SOC培养基(Molecular Cloning: A Laboratory Manual,Sambrook,et al.,Cold Spring Harbor Laboratory Press,1989)然后在37℃温育30分钟。
所得的细胞溶液涂板于LB琼 脂培养基上或2×YT琼脂培养基上(Molecular Cloning:A Laboratory Manual,Sambrook,et al.,Cold Spring Harbor Laboratory Press,1989),培 养基中包含100或50μg/ml氨苄青霉素,0.1mM的IPTG和20μg/ml X-gal,然后在37℃温育过夜。
用这种方法制备大肠杆菌转化子。
转化子在包含100或50μg/ml氨苄青霉素的2ml LB或2×YT培 养基中37℃培养过夜。
部分细胞用Plasmid Extracter PI-100(Kurabo Industries,Ltd.)或者QIAprep Spin Plasmid Kit(QIAGEN)来提取质粒 DNA。
质粒DNA按照如下方法进行测序。
(4)编码小鼠抗体V区的基因的序列测定 质粒携带的cDNA编码区的核酸序列用Dye Terminator Cycle Sequencing Kit(Perkin-Elmer)在DNA测序仪373A(ABI,Perkin-Elmer) 进行测定。
M13引物M4(Takara Shuzo Co.,Ltd.)(SEQ ID NO:5)和M13 引物RV(Takara Shuzo Co.,Ltd.)(SEQ ID NO:6)被用作测序引物,核酸 序列在两个方向都进行证实。
包含编码来自于骨髓瘤#23-57-137-1小鼠H链V区基因的质粒被 命名为“MBC1H04”,包含编码来自于骨髓瘤#23-57-137-1的小鼠L 链V区基因的质粒被命名为“MBC1L24”。
在质粒MBC1H04编码来 自于小鼠#23-57-137-1抗体的H链V区的基因和在质粒MBC1L24编 码来自于小鼠#23-57-137-1抗体的L链V区的基因的核酸序列(包括相 应的氨基酸序列)分别如SEQ.ID Nos:57和65所示。
对于H链V区 和L链V区的多肽的氨基酸序列分别如SEQ.ID Nos:46和45所示。
包含质粒MBC1H04和质粒MBC1L24的大肠杆菌分别被命名为 “大肠杆菌JM109(MBC1H04)”和“大肠杆菌JM109(MBC1L24)”。
这些大肠杆菌依据布达佩斯条约于1996年8月15日已保藏在日本工 业科学和技术机构--国立生命科学和人体技术研究所(1-3,Higashi 1- chome,Tsukuba-shi,Ibaraki,日本),保藏号:FERM BP-5628(大肠杆菌 JM109(MBC1H04));和FERM BP-5627(大肠杆菌JM109(MBC1L24))。
(5)杂交瘤#23-57-137-1产生的抗人PTHrP鼠单克隆抗体的CDRs 的鉴定 H链的V区和L链的V区具有彼此相似的总体结构,每个都有 四个通过3个高度可变区(即互补决定区,CDRs)相连接的框架区 (FRs)。
FR区的氨基酸序列相对非常保守,尽管CDRs的氨基酸序列 具有极高的可变性(Kabat E.A.et al.,“Sequence of Proteins of Immunological Interest”,US Dept.Health and Human Services,1983)。
由于这些事实,在抗人PTHrP的小鼠单克隆抗体的V区之间的 氨基酸相似性可以被鉴定,通过参照由Kabat等建立的抗体氨基酸序 列数据库。
因此,V区的CDRs测定数据在表1中显示。
L链V区中CDRs1-3的氨基酸序列分别出示在SEQ ID Nos:59-61; H链V区中CDRs1-3的氨基酸序列分别出示在SEQ ID Nos:62-64。
                       表1  V区
SEQ ID Nos
 CDR1
 CDR2
 CDR3
 H链V区
57
 31-35
 50-66
 99-107
 L链V区
65
 23-34
 50-60
 93-105
【参考例3】构建嵌合抗体 (1)嵌合抗体H链的构建 (i)H链V区的构建 为连接到含有人H链C区Cγ1基因组DNA的表达载体上,已 克隆的编码小鼠H链V区的DNA用PCR方法修饰。
一种反向引物 MBC1-S1(SEQ ID NO:7)被设计出来并与编码V区引导序列5’端的 DNA杂交,所述反向引物还含有Kozak共有序列(Kozak,M.et al.,J.Mol. Biol.,1996,947-950,1987)和HindIII识别序列。
一种正向引物MBC1- a(SEQ ID NO:8)被设计出来并与编码J区3’端的DNA杂交,所述 正向引物还含有供体剪切序列和BamHI识别序列。
用TaKaRa Ex Taq(Takara Shuzo Co.,Ltd.)和附加的缓冲液进行PCR反应。
PCR溶液 包括(每50μl)0.07μg质粒MBC1H04作为模板DNA,缓冲液中包括 50pmol的MBC1-a和50pmol的MBC1-S1作为引物,2.5U TaKaRa Ex Taq和0.25mM dNTPs,在其上加入50μl矿物油。
PCR反应按照条件: 94℃1分钟;55℃1分钟;72℃2分钟,进行30次循环。
PCR方法 扩增得到的DNA片段用3%Nu Sieve GTG Agarose(FMC Bio.Products) 进行琼脂糖凝胶电泳分离。
然后,包含437bp DNA片段的琼脂糖凝胶部分被切割,用 GENECLEAN II Kit(BIO101)并按照试剂盒中的说明纯化DNA片段。
纯化的DNA用乙醇沉淀收集,随后溶解于20μl包含10mM  Tris-HCl(pH7.4)和1mM EDTA的溶液中。
一部分(1μl)所得DNA溶液用 限制性酶BamHI和HindIII(Takara Shuzo Co.,Ltd.)37℃酶切1小时。
酶切溶液用苯酚和氯仿抽提并用乙醇沉淀收集目的DNA。
得到的HindIII-BamHI酶切DNA片段,其包含编码小鼠H链V 区的基因,被亚克隆到已预先被HindIII-BamHI酶切过的pUC19载体 上。
所得的质粒用Dye Terminator Cycle Sequencing Kit(Perkin-Elmer) 在DNA测序仪373A(Perkin-Elmer)上进行测序,M13引物M4和M14 引物RV被用作测序引物。
结果,得到了携带F确的编码来源于杂交 瘤#23-57-137-1小鼠H链V区基因核酸序列的质粒,其上含有一个5’ 端HindIII识别位点序列和Kozak序列以及3’端BamHI识别序列,质 粒被命名为“MBC1H/pUC19”。
(ii)用于制备小鼠-人嵌合H链的cDNA型的H链V区的构建 为连接到人H链C区Cγ1cDNA上,按上述方法构建的编码小 鼠H链V区的DNA用PCR方法修饰。
V区的一种反向引物 MBC1HVS2(SEQ ID NO:9)被设计出来并使得编码H链V区的引导 序列的前端部分中第二个氨基酸(天冬氨酸)被甘氨酸取代,同时该引 物还包括一段Kozak共有序列(Kozak,M.et al.,J.Mol.Biol.,196,947- 950,1987)和HindIII及EcoRI识别序列。
H链V区的一种正向引物 MBC1HVR2(SEQ ID NO:10)被设计出来并与编码J区3’端的DNA 杂交,同时还编码C区的5’端和包括ApaI和SmaI识别序列。
用TaKaRa Ex Taq(Takara Shuzo Co.,Ltd.)和附加的缓冲液进行 PCR反应。
PCR溶液(每50μl)包括0.6μg质粒MBC1H/pUC19作为 模板DNA,缓冲液中包括50pmol的MBC1HSV2和50pmol的 MBC1HVR2作为引物,2.5U TaKaRa Ex Taq和0.25mM dNTPs,在 其上加入50μl矿物油。
PCR反应按照条件:94℃1分钟;55℃1分 钟;72℃1分钟,进行30次循环。
PCR方法扩增得到的DNA片段 用1%Sea Kem GTG Agarose(FMC Bio.Products)进行琼脂糖凝胶电 泳分离。
然后,包含456bp DNA片段的琼脂糖凝胶部分被切割,用 GENECLEAN II Kit(BIO101)并按照试剂盒中的说明纯化DNA片段。
纯化的DNA用乙醇沉淀收集,随后溶解于20μl包含10mM  Tris-HCl(pH7.4)和1mM EDTA的溶液中。
所得的DNA溶液(1μg)用限制性酶EcoRI和SmaI(Takara Shuzo Co.,Ltd.)37℃酶切1小时。
酶切溶液用苯酚和氯仿抽提并用乙醇沉淀 收集DNA。
得到的EcoRI-SmaI酶切DNA片段,其包含编码小鼠H 链V区的基因,被亚克隆到已预先被EcoRI和SmaI酶切过的pUC19 载体上。
所得的质粒用Dye Terminator Cycle Sequencing Kit(Perkin- Elmer)在DNA测序仪373A(Perkin-Elmer)进行测定。
M13引物M4和 M14引物RV被用作测序引物。
结果,得到了携带正确的编码来源于 杂交瘤#23-57-137-1小鼠H链V区基因核酸序列的质粒,该质粒5’端 具有HindIII和BamHI识别位点序列和Kozak序列,3’端具有ApaI和 SmaI识别序列,质粒被命名为“MBC1Hv/pUC19”。
(iii)嵌合抗体H链表达载体的构建 包含人抗体H链C区Cγ1的cDNA按照如下方法制备。
将编码 人源化PM1抗体H链V区和人抗体H链C区IgG1(N.Takahashi et al., Cell 29,671-679,1982)的基因组DNA的表达载体DHFR-ΔE-RVh-PM- 1-f(参见WO 92/19759);编码人源化PM1抗体L链V区和人抗体L 链κ链C区的基因组DNA的表达载体RV1-PM1a(参见WO 92/19759) 引入CHO细胞,从转入上述两种表达载体的CHO细胞中制备mRNA。
为了使用mRNA,通过RT-PCR方法克隆得到包含人源化PM1抗体 H链V区和人抗体H链C区Cγ1的cDNA,然后将其亚克隆到质粒 pUC19的HindIII-BamHI位点上。
测序后,得到含有正确核酸序列的 质粒,该质粒被命名为“pRVh-PM1f-cDNA”。
表达载体DHFR-ΔE-RVh-PM-1-f中缺失了位于SV40启动子和 DHFR基因之间的HindIII位点以及位于EF-1α启动子和人源化PM1 抗体H链V区基因之间的EcoRI位点,制备该表达载体用于构建包 含人源化PM1抗体H链V区基因和人抗体H链C区Cγ1基因的cDNA 表达载体。
得到的质粒(pRVh-PM1f-cDNA)用BamHI酶切,并用Klenow酶 补平末端,然后进一步用HindIII酶切,得到平末端HindIII-BamHI酶 切片段。
将平末端HindIII-BamHI酶切片段连接到上述HindIII和EcoRI 位点缺失的表达载体DHFR-ΔE-RVh-PM1-f上,该载体预先用HindIII 和BamHI酶切。
于是,构建得到包含编码人源化PM1抗体H链V区 和人抗体C区Cγ1的cDNA表达载体RVh-PM1f-cDNA。
包含编码人源化PM1抗体H链V区和人抗体C区Cγ1的cDNA 表达载体pRVh-PM1f-cDNA用ApaI和BamHI酶切,并收集包含H 链C区的DNA片段。
得到的DNA片段被插入到已预先用ApaI和 BamHI酶切的质粒MBC1Hv/pUC19中。
制备得到的质粒被命名为 “MBC1HcDNA/pUC19”。
该质粒包含编码小鼠抗体H链V区和人 抗体C区Cγ1的cDNA,以及5’端EcoRI和HindIII识别序列和3’端 BamHI识别序列。
质粒MBC1HcDNA/pUC19用EcoRI和BamHI酶切得到包含编码 嵌合抗体H链核酸序列的DNA片段。
得到的DNA片段被插入到已 预先用EcoRI和BamHI酶切的表达载体pCOS1中,从而得到嵌合抗 体的表达质粒,命名为“MBC1HcDNA/pCOS1”。
在此,进行表达载 体pCOS1的构建:从HEF-PMh-gγ1(参见WO 92/19759)中通过用 EcoRI和Smai酶切去除抗体基因并将之连接于EcoRI-NotI-BamHI衔 接序列上(Takara Shuzo Co.,Ltd.)。
为制备用于CHO细胞表达的质粒,质粒MBC1HcDNA/pUC19 用EcoRI和BamHI酶切得到包含嵌合抗体H链基因的DNA片段。
得 到的DNA片段被插入到已预先用EcoRI和BamHI酶切的表达载体 pCHO1中,从而得到嵌合抗体的表达质粒,命名为 “MBC1HcDNA/pCHO1”。
在此,进行表达载体pCHO1的构建:从 DHFR-ΔE-rvH-PM1-f中(参见WO 92/19579)通过EcoRI和SmaI 酶切去除抗体基因并将之连接于EcoRI-NotI-BamHI衔接序列上(Takara Shuzo Co.,Ltd.)。
(2)人L链C区的构建 (i)克隆载体的制备 为构建包含人L链C区基因的pUC19载体,首先制备HindIII位 点缺失的pUC19载体。
pUC载体(2μg)在包含20mM Tris-HCl(pH8.5), 10mM MgCl2,1mM DTT,100mM KCl,8单位HindIII(Takara Shuzo Co.,Ltd.)的20μl溶液中于37℃酶切1小时。
所得的酶切溶液用苯酚 和氯仿抽提并用乙醇沉淀以收集目的DNA。
收集得到的DNA在50μl包括50mM Tris-HCl(pH7.5),100mM NaCl,1mM DTT,10mM MgCl2,0.5mM dNTPs和6单位Klenow片 段(GIBCO BRL)的反应溶液中在室温放置20分钟,使得DNA末端 补平。
反应后的混合物用苯酚和氯仿抽提并用乙醇沉淀以收集载体 DNA。
收集得到的载体DNA在10μl包括50mM Tris-HCl(pH7.6),10mM MgCl2,1mM ATP,1mM DTT,5%(v/v)聚乙二醇8000和0.5单位T4 DNA连接酶(GIBCO BRL)的溶液中在16℃温育2小时,使载体DNA 自连接。
反应溶液(5μl)加入到100μl包含大肠杆菌JM109(Nippon Gene Co.,Ltd.)感受态细胞溶液中,在冰上放置30分钟,42℃1分钟,再放 置于冰上1分钟。
将SOC培养液(500μl)加入到反应液中37℃温育1 小时。
所得的溶液涂板于2×YT琼脂培养基上,其中包含50μg/ml氨 苄青霉素、IPTG和X-gal(Molecular Cloning:A Laboratory Manual, Sambrook,et al.,Cold Spring Harbor Laboratory Press,1989),然后在37 ℃温育过夜,从而得到转化子。
转化子培养于2×YT培养基中(20ml),其中包含50μg/ml青霉素, 在37℃过夜培养。
从培养液里的细胞中,用Plasmid Mini Kit(QIAGEN) 试剂盒并根据盒中的说明分离纯化载体。
纯化的质粒用HindIII酶切。
证实缺失HindIII位点的质粒被命名为“pUC19ΔHindIII”。
(ii)编码人L链λ链C区的DNA的构建 人抗体L链λ链C区已知至少有4种同种型:Mcg+Ke+Oz-, Mcg-Ke-Oz-,Mcg-Ke-Oz+,Mcg-Ke+Oz-(P.Dariavach,et al.,Proc.Natl. Acad.Sci.USA,84,9074-9078,1987)。
从EMBL数据库中搜寻与#23- 57-137-1小鼠L链λ链C区同源的人抗体L链λ链C区。
结果发现人 抗体L链λ链C区的同种型Mcg+Ke+Oz-(入藏No.X57819)(P. Dariavach,et al.,Proc.Natl.Acad.Sci.USA,84,9074-9078,1987)表现出与 #23-57-137-1小鼠L链λ链C区的高度同源性,氨基酸序列同源性为 64.4%,核酸序列同源性为73.4%。
然后,编码人的抗体L链λ链C区的基因用PCR方法构建。
PCR 所用的引物用394DNA/RNA合成仪(ABI)合成。
合成的引物为: HLAMB1(SEQ ID NO:11)和HLAMB3(EQ ID NO:13),两者都有DNA 有义序列;以及HLAMB2(SEQ ID NO:12)和HLAMB4(EQ ID NO: 14),两者都有DNA反义序列,每个引物在两末端都包含20-23bp互 补序列。
外部引物HLAMBS(SEQ ID NO:15)和HLAMBR(EQ ID NO:16) 分别与引物HLAMB1和HLAMB4有序列同源性。
HLAMBS包括 EcoRI,HindIII和BlnI识别位点;HLAMBR包括EcoRI识别位点。
在第一轮PCR反应中,进行HLAMB1和HLAMB2之间以及HLAMB3 和HLAMB4之间的反应。
反应完成后,两种PCR反应产物等量混合, 进行第二轮PCR反应。
反应溶液中加入外部引物HLAMBS和 HLAMBR。
反应混合物进行第三轮PCR反应以扩增全长DNA。
每个PCR反应都用TaKaRa Ex Taq(Takara Shuzo Co.,Ltd.)并按照 试剂盒中的说明进行。
在第一轮PCR反应中,用100μl的反应液包括 5pmol的HLAMB1,0.5pmol的HLAMB2和5单位的TaKaRa Ex Taq(Takara Shuzo Co.,Ltd.)或包括0.5pmol的HLAMB3,5pmol的 HLAMB4和5单位的TaKaRa Ex Taq(Takara Shuzo Co.,Ltd.),在其上 加入50μl矿物油。
PCR反应按照条件:94℃1分钟;60℃1分钟; 72℃1分钟,进行5次循环。
在第二轮PCR反应中,用前述两个反应溶液的混合(每个50μl)进 行反应,在其上加入50μl矿物油。
PCR反应按照条件:94℃1分钟; 60℃1分钟;72℃1分钟,进行3次循环。
在第三轮PCR反应中,在反应溶液中加入外部引物HLAMBS和 HLAMBR(每个50pmol)。
PCR反应按照条件:94℃1分钟;60℃1 分钟;72℃1分钟,进行30次循环。
第三轮PCR反应所得的DNA片段用3%低熔点琼脂凝胶(NuSieve GTG Agarose,FMC)进行电泳,用GENECLEAN II Kit(BIO101)试剂盒 并根据试剂盒中的说明从凝胶中分离纯化。
DNA片段在包含50mM Tris-HCl(pH7.5),10mM MgCl2,1mM DTT,100mM NaCl,8单位EcoRI(Takara Shuzo Co.,Ltd.)的反应溶 液(20μl)中37℃酶切1小时。
酶切溶液用苯酚和氯仿抽提并用乙醇沉 淀以收集DNA。
DNA溶解于含10mM Tris-HCl(pH7.4)和1mM EDTA 的溶液(8μl)中。
前面所制备的质粒pUC19ΔHindIII(0.8μg)按照前述同样方法用 EcoRI酶切。
酶切溶液用苯酚-氯仿抽提并用乙醇沉淀,得到了酶切过 的质粒pUC19ΔHindIII。
酶切过的质粒在包含50mM Tris-HCl(pH9.0) 1mM MgCl2和碱性磷酸酶(E.coli C75;Takara Shuzo Co.,Ltd.)的反应溶 液(50μl)中于37℃反应30分钟以使质粒去磷酸化(即BAP处理)。
反应溶液用苯酚-氯仿抽提并用乙醇沉淀以收集DNA。
DNA溶解于含 10mM Tris-HCl(pH7.4)和1mM EDTA的溶液(10μl)中。
用DNA Ligation Kit Ver.2(Takara Shuzo Co.,Ltd.)将BAP处理过 的质粒pUC19ΔHindIII(1μl)和前面所得到的PCR产物(4μl)相连接。
所得质粒转入大肠杆菌JM109的感受态细胞中得到转化子。
转化子在 包含50μg/ml氨苄青霉素的2×YT培养基中(2ml)37℃过夜培养。
从培 养液里的细胞中,用QIAprep Spin Plasmid Kit(QIAGEN)试剂盒分离 质粒。
对所得质粒中克隆的DNA部分进行测序。
M13引物M4和M13 引物RV(Takara Shuzo Co.,Ltd.)被用作测序引物在373A DNA测序仪 (ABI)进行序列测定。
结果发现克隆的DNA具有12bp缺失片段。
质 粒被命名为“CλΔ/pUC19”。
然后,为弥补缺失的部分,重新合成 引物HCLMS(SEQ ID NO:17)和HCLMR(EQ ID NO:18)。
用这些引物 通过PCR方法重新构建正确的DNA序列。
在第一轮PCR反应中,具有DNA缺失的质粒CλΔ/pUC19作 为模板,反应在每个引物对HLAMBS和HCLMS之间以及HCLMS和 HLAMB4之间进行。
PCR产物被分别纯化。
在第二轮PCR反应中,PCR 产物被组合在一起。
在第三轮PCR反应中,第二轮PCR反应的反应 产物被加入外部引物HLAMBS和HLAMB4并扩增得到全长DNA。
在第一轮PCR反应中,用100μl的反应液包括0.1μg的质粒Cλ Δ/pUC19作为模板,每个引物HLAMBS和HCLMS各50pmol或每 个引物HCLMS和HLAMB4各50pmol,和5单位的TaKaRa Ex Taq(Takara Shuzo Co.,Ltd.),在其上加入50μl矿物油。
PCR反应按照 条件:94℃1分钟;60℃1分钟;72℃1分钟,进行30次循环。
第一轮PCR反应产物包括HLAMBS-HCLMR(236bp)和HCLMS- HLAMB4(147bp)用3%低熔点琼脂糖凝胶分别进行电泳以分离DNA 片段,用GENECLEAN II Kit(BIO101)试剂盒并根据试剂盒中的说明 将DNA片段分离纯化。
在第二轮PCR反应中,20μl反应溶液包括每 种纯化后的DNA片段各40ng和和1单位的TaKaRa Ex Taq(Takara Shuzo Co.,Ltd.),在其上加入矿物油(25μl)。
PCR反应按照条件:94℃ 1 分钟;60℃ 1分钟;72℃ 1分钟,进行5次循环。
第三轮PCR反应中,使用100μl的反应液包括2μl第二轮PCR 反应后的反应液,50pmol每种外部引物HLAMBS和HLAMB4,以及 5单位的TaKaRa Ex Taq(Takara Shuzo Co.,Ltd.),其上铺放50μl矿物 油。
PCR反应按照条件:94℃ 1分钟;60℃ 1分钟;72℃ 1分钟, 进行30次循环,得到357bp的DNA片段(第三轮PCR产物)。
DNA 片段用3%低熔点琼脂糖凝胶进行电泳分离DNA片段。
用GENECLEAN IIKit(BIO101)试剂盒并根据试剂盒中的说明将DNA片段收集纯化。
所得的DNA片段中的一部分(0.1μg)用EcoRI酶切,然后亚克隆 到经BAP处理过的pUC19ΔHindIII质粒上。
所得的质粒转入到大肠 杆菌JM109的感受态细胞中形成转化子。
转化子培养于包含50μg/ml 氨苄青霉素的2×YT培养基中过夜培养。
从培养液里的细胞中,用 QIAprep Spin Plasmid Kit(QIAGEN)试剂盒分离纯化质粒。
纯化的质粒用M13引物M4和M13引物RV(Takara Shuzo Co.,Ltd.) 作为测序引物在373A DNA测序仪(ABI)进行序列测定。
证实没有缺 失且序列正确的质粒被命名为“Cλ/pUC19”。
(iii)编码人L链κ链C区的基因的构建 编码L链κ链C区的DNA片段通过PCR方法从质粒HEF- PM1k-gk(WO 92/19759)中克隆得到。
设计的正向引物HKAPS(SEQ ID NO:19)包括EcoRI,HindIII和BlnI识别序列,以及反向引物 HKAPA(SEQ ID NO:20)包括EcoRI识别序列。
这些引物用 394DNA/RNA合成仪合成(ABI)。
100μl反应溶液中包括用0.1μg质粒HEF-PM1k-gk作为模板, HKAPS和HKAPA各50pmol作为引物,5单位的TaKaRa Ex Taq(Takara Shuzo Co.,Ltd.),在其上加入50μl矿物油,进行PCR反应。
PCR反应 按照条件:94℃1分钟;60℃1分钟;72℃1分钟,进行30次循环, 得到的PCR产物为360bp。
DNA片段用3%低熔点琼脂糖凝胶进行电 泳分离和纯化,用GENECLEAN II Kit(BIO101)试剂盒进行分离纯化。
所得的DNA片段用EcoRI酶切并克隆到经过BAP处理的质粒 pUC19(HindIII中。
所得的质粒转入到大肠杆菌JM109的感受态细胞 中形成转化子。
转化子培养于包含50μg/ml氨苄青霉素的2ml 2×YT 培养基中过夜培养。
从培养液里的细胞中,用QIAprep Spin Plasmid Kit(QIAGEN)试剂盒纯化质粒。
纯化的质粒用M13引物M4和M13引物RV(Takara Shuzo Co.,Ltd.) 作为测序引物在373A DNA测序仪(ABI)进行序列测定。
证实核苷酸 序列正确的质粒被命名为“Cκ/pUC19”。
(3)嵌合抗体L链表达载体的构建 构建嵌合#23-57-137-1抗体L链的表达载体。
编码#23-57-137-1L 链V区的基因被连接于质粒Cλ/pUC19和Cκ/pUC19的HindIII-BlnI 位点(位于人抗体C区的前方),得到的pUC19载体分别包括编码嵌合 #23-57-137-1抗体L链V区和L链λ链C区或L链κ链C区的DNA。
所得的每一种载体用EcoRI酶切分离嵌合抗体L链的基因。
该基因被 亚克隆到HEF表达载体上。
也即用PCR方法将编码#23-57-137-1抗体L链V区的DNA片段 从质粒MBC1L24上克隆出来。
用于PCR反应的引物分别用 394DNA/RNA合成仪合成(ABI)。
设计的反向引物MBCCHL1(SEQ ID NO:21)包括HindIII识别序列和一段Kozak共有序列(Kozak,M.et al., J.Mol.Biol.,1996,947-950,1987),以及正向引物MBCCHL3(SEQ ID NO:22)包括BgIII和EcoRI识别序列。
100μl P CR反应液包括10mMTris-HCl(pH8.3),50mM KCl,1.5mM MgCl2,0.2mM dNTPs(dATP,dGTP,dCTP,dTTP),0.1pgMBC1L24, 以及50pmolsMBCCHL1和MBCCHL3引物和1μlAmpliTaq(PERKIN ELMER),在其上加50μl矿物油,进行PCR反应。
PCR反应按照条 件:94℃ 45秒;60℃ 45秒;72℃ 2分钟,进行30次循环。
444bp的PCR产物用3%低熔点琼脂糖凝胶进行电泳,用 GENECLEAN II Kit(BIO101)进行收集和纯化。
纯化的PCR产物溶解 于含10mM Tris-HCl(pH7.4)和1mM EDTA的溶液(20μl)中。
PCR产 物(1μl)在包含10mM Tris-HCl(pH7.5),50mM NaCl,1mM DTT,10mM MgCl2,8单位HindIII(Takara Shuzo Co.,Ltd.)的反应溶液(20μl)中37 ℃酶切1小时。
酶切溶液用苯酚/氯仿抽提并用乙醇沉淀以收集目的 DNA。
DNA溶解于含10mM Tris-HCl(pH7.4)和1mM EDTA的溶液(8μl) 中。
按照同样的方式,质粒pUC19(1μg)用HindIII和EcoRI酶切, 并用苯酚/氯仿抽提,然后乙醇沉淀。
所得的酶切质粒用碱性磷酸酶进 行BAP处理(大肠杆菌C75;Takara Shuzo Co.,Ltd.)。
得到的反应液用 苯酚和氯仿抽提并用乙醇沉淀。
DNA溶解于含10mM Tris-HCl(pH7.4) 和1mM EDTA的溶液(10μl)中。
用DNA Ligation Kit ver.2(Takara Shuzo Co.,Ltd.)将BAP处理过的 pUC19(1μg)连接到上面所得到PCR产物(4μl)上。
所得到的质粒被加 入到大肠杆菌JM109(Nippon Gene Co.,Ltd.)的感受态细胞中。
按照前 面所述相同方法形成转化子。
转化子涂板于包含50μg/ml青霉素2×YT 琼脂培养基上在37℃温育过夜。
所得到转化子在含50μg/ml氨苄青霉 素的2ml 2×YT培养基中37℃培养过夜。
从培养液里的细胞中,用 QIAprep Spin Plasmid Kit(QIAGEN)试剂盒纯化质粒。
测定核酸序列 后,证实具有正确的核酸予列的质粒被命名为“CHL/pUC19”。
质粒Cλ/pUC19和Cκ/pUC19(各1μg)在包含20mM Tris-HCl(pH8.5),100mM KCl,1mM DTT,10mM MgCl2,8单位HindIII(Takara Shuzo Co.,Ltd.)的反应溶液(20μl)中37℃酶切1小时。
酶切溶液用苯酚 和氯仿抽提并用乙醇沉淀以收集DNA。
DNA经BAP处理37℃30分 钟。
反应液用酚和氯仿抽提,然后乙醇沉淀收集DNA。
DNA溶解于 含10mM Tris-HCl(pH7.4)和1mM EDTA的溶液(10μl)中。
包含编码#23-57-137-1L链V区DNA的质粒CHL/pUC19(8μg)按 照上述同样的方式用HindIII和BlnI酶切得到409bp的DNA片段。
该DNA片段用3%低熔点琼脂糖凝胶进行电泳,用GENECLEAN II Kit(BIO101)从凝胶中进行收集和纯化。
DNA溶解于包含10mM  Tris-HCl(pH7.4)和1mM EDTA的10μl溶液中。
L链V区的DNA(4μl)被分别亚克隆到1μl BAP处理过的Cλ /pUC19和Cκ/pUC19质粒,然后转入到大肠杆菌JM109的感受态细 胞中形成转化子。
转化子在3ml包含50μg/ml氨苄青霉素2×YT培养 基中培养过夜。
从培养液里的细胞中,用QIAprep Spin Plasmid Kit(QIAGEN)试剂盒分离纯化质粒。
制备的两个质粒分别被命名为 “MBC1L(λ)/pUC19”和“MBC1L(κ)/pUC19”。
质粒MBC1L(λ)/pUC19和MBC1L(κ)/pUC19用EcoRI酶切然 后用3%低熔点琼脂糖凝胶进行电泳。
743bp的DNA片段用 GENECLEAN II Kit(BIO101)从凝胶中进行分离和纯化。
然后,DNA 溶解于包含10mM Tris-HCl(pH7.4)和1mM EDTA的10μl溶液中。
表达载体(质粒HEP-PM1k-gk)(2.7μg)用EcoRI酶切,然后用苯酚 和氯仿抽提并用乙醇沉淀以收集DNA。
DNA片段经BAP处理,用1% 低熔点琼脂糖凝胶进行电泳。
从凝胶中用GENECLEAN II Kit(BIO101) 进行分离和纯化6561bp的DNA片段。
纯化的DNA片段溶解于包含 10mM Tris-HCl(pH7.4)和1mM EDTA的10μl溶液中。
将BAP处理过的HEF载体(2μl)与MBC1L(λ)/pUC19和 MBC1L(κ)/pUC19质粒的EcoRI片段(3μl)相连接。
所得连接产物转 入大肠杆菌JM109的感受态细胞中得到转化子。
转化子在包含50μg/ml 氨苄青霉素2ml 2×YT培养基中培养。
从培养液里的细胞中,用 QIAprep Spin Plasmid Kit(QIAGEN)试剂盒纯化质粒。
纯化的质粒用在包含20mM Tris-HCl(pH8.5),100mM KCl,1mM DTT,10mM MgCl2,8单位HindIII(Takara Shuzo Co.,Ltd.)和2单位 PvuI(Takara Shuzo Co.,Ltd.)的反应溶液(20μl)中37℃酶切1小时。
如 果片段插入为正确方向反应就会得到5104/2195bp的酶切片段,如果 插入为反向就会得到4378/2926bp的片段。
证实为正确方向插入的质 粒对于质粒MBC1L(λ)/pUC19命名为“MBC1L(λ)/neo”,对于质粒 MBC1L(κ)/pUC19命名为“MBC1L(κ)/neo”。
(4)COS-7细胞的转染 为评价嵌合载体的抗原结合活性和中和活性,上述制备的表达质 粒被分别在COS-7细胞中瞬时表达。
用质粒MBC1HcDNA/pCOS1和MBC1L(λ)/neo的组合以及质粒 MBC1HcDNA/pCOS1和MBC1L(κ)/neo的组合进行嵌合抗体的瞬时 表达,通过用Gene Pulser(Bio Rad)进行电转化将质粒和COS-7进行共 转染。
也即将质粒(各10μg)加入到PBS(-)中的COS-7细胞悬液(0.8ml;1 ×107细胞/毫升)。
用电容为1,500V和2μF的脉冲作用于所得溶液进 行电穿孔。
于室温下恢复反应10分钟后,电穿孔的细胞被悬浮于包 括2%Ultra Low IgG胎牛血清(GIBCO)的DMEM培养基(GIBCO)中, 然后在二氧化碳孵箱中用10-cm的培养皿培养。
培养后72小时,收 集培养上清液并离心去除细胞碎片,提供作为后续ELISA的样本。
此过程中,用AffiGel Protein A MAPSII Kit试剂盒(Bio Rad)并按照试 剂盒中的说明从COS-7细胞培养上清中纯化嵌合抗体。
(5)ELISA (i)抗体浓度的测定 用于测定抗体浓度的ELISA板按照如下方法制备。
96孔ELISA 板(Maxisorp,NUNC)中的每孔用100μl添加有1μg/ml山羊抗人IgG抗 体(TAGO)的包被缓冲液(0.1M NaHCO3,0.02%NaN3)进行包被,然后 用200μl稀释缓冲液[50mMTris-HCl,1mM MgCl2,0.1M NaCl, 0.05%Tween20,0.02%NaN3,1%牛血清白蛋白(BSA)pH7.2]进行封闭。
将有嵌合抗体表达的COS-7细胞系列稀释,并将每个浓度的细胞加入 到板上的各孔中,或者将纯化形式的嵌合抗体本身系列稀释,并将每 个浓度的细胞加入到板上的各孔中。
板于室温下温育1小时并用PBS- Tween20洗涤。
板上的每个孔加入100μl含着结合有碱性磷酸酶的山 羊抗人IgG抗体(TAGO)的溶液。
板在室温下温育1小时并用PBS- Tween20洗涤,板上的每个孔加入1mg/ml底物溶液(“Sigma 104”,对 硝基苯磷酸,SIGMA)。
用Microplate Reader(Bio Rad)在405nm测量 溶液的吸光度来测定抗体浓度。
在此测定中,纯化的Hu IgG1λ(结合 位点)作为标准物质。
(ii)抗原结合能力的测定 用于测定抗原结合能力的ELISA板按照如下方法制备。
96孔 ELISA板中的每孔用100μl添加有1μg/ml人PTHrP(1-34)(Peptide Reasearch Institute)的包被缓冲液进行包被,然后用200μl稀释缓冲液 进行封闭。
将有嵌合抗体表达的COS-7细胞系列稀释,并将每个浓度 的细胞加入到板上的各孔中,或者将纯化形式的嵌合抗体本身系列稀 释,并将每个浓度的细胞加入到板上的各孔中。
板于室温下温育1小 时并用PBS-Tween20洗涤,板上的每个孔分别加入100μl含着结合有 碱性磷酸酶的山羊抗人IgG抗体(TAGO)的溶液。
板在室温下温育1 小时并用PBS-Tween20洗涤。
板上的每个孔加入1mg/ml底物溶液 (“Sigma 104”,对硝基苯磷酸,SIGMA)。
用Microplate Reader(Bio Rad) 在405nm测量溶液的吸光度。
结果发现嵌合抗体具有结合人PTHrP(1-34)的能力并且克隆的鼠 抗体V区具有正确的结构(图5)。
还发现具有L链λ链C区的嵌合抗 体以及具有L链κ链C区的嵌合抗体两者在与PTHrP(1-34)的结合能 力没有明显差别。
因此,人源化抗体L链λ链用于构建人源化抗体的 L链C区的构建。
(6)能稳定产生嵌合抗体的CHO细胞系的建立 为建立能稳定产生嵌合抗体的CHO细胞系,上述制备的表达质 粒被转入到CHO细胞中(DXB11)。
为建立能稳定产生嵌合抗体的CHO细胞系,可以使用下面用于 CHO细胞的表达质粒的组合:MBC1HcDNA/pCHO1和 MBC1L(λ)/neo;和MBC1HcDNA/pCHO1和MBC1L(κ)/neo。
按照 下述方法用Gene Pulser(Bio Rad)通过电穿孔将质粒共转染到CHO细 胞中。
表达载体分别用限制性酶PvuI切成线性DNA。
所得的DNA用 苯酚和氯仿抽提并用乙醇沉淀以收集。
由此制备的DNA用于电穿孔。
即每种质粒DNA(每种10μg)加入到0.8mlCHO细胞的PBS悬液中(1× 107细胞/毫升)。
用电容为1,500V和2μF的脉冲作用于所得溶液进行 电转化。
于室温下恢复反应10分钟后,电穿孔的细胞被悬浮于包括10% 胎牛血清(GIBCO)MEMα培养基(GIBCO)中。
所得细胞悬液在二氧化 碳孵箱中用96孔板(Falcon)培养。
开始培养后,用选择性培养基[没有 核糖核酸或脱氧核糖核酸的MEMα培养基(GIBCO)包含10%胎牛血清 (GIBCO)和500mg/ml GENETICIN(G418硫酸盐;GIBCO)]替代原培 养基。
从培养基中选择抗体基因被转入的细胞。
并更换新鲜的选择性 培养基。
在培养基更换2周后,在显微镜下观察细胞。
当观察到足够 的细胞生长,用前述ELISA方法测定产生的抗体量。
从中筛选出能够 大量产生抗体的细胞。
然后,将建立起来的能稳定产生抗体的细胞系扩大规模培养,用 没有核糖核酸或脱氧核糖核酸的MEMα培养基(GIBCO)包含2%Ultra Low IgG胎牛血清在摇瓶中培养。
在培养的第三天和第四天,收集培 养上清液并用0.2μm滤器(Millipore)过滤去除细胞碎片。
在ConSepLC100(Millipore)上用POROS Protein A Column(PerSeptive Biosystems)按照试剂盒中的说明从CHO细胞培养 上清液中纯化嵌合抗体。
纯化的嵌合抗体用作测定中和活性的样本以 及在高钙血症模型动物上测定治疗效率的样本。
纯化的嵌合抗体的浓 度和抗原结合活性用前述ELISA系统进行测定。
【参考例4】人源化抗体的构建 (1)人源化抗体H链的构建 (i)人源化抗体H链V区的构建 通过CDR-嫁接技术用PCR方法生产人源化#23-57-137-1抗体H 链。
对于生产具有来源于人抗体S31679(NBRF-PDB;Cuisinier,A.M.et al.,Eur.J.Immunol.,23,110-118,1993)FRs的人源化#23-57-137-1抗体H 链(版本“a”),使用下述六个PCR引物:CDR-嫁接引物: MBC1HGP1(SEQ ID NO:23)和MBC1HGP3(SEQ ID NO:24)(两者都包 含有义DNA序列),MBC1HGP2(SEQ ID NO:25)和MBC1HGP4(SEQ ID NO:26)(两者都包含反义DNA序列),每个引物在其末端都包含15-21bp 的互补序列;外部引物:MBC1HVS1(SEQ ID NO:27)和 MBC1HVR1(SEQ ID NO:28)分别与CDR-嫁接引物MBC1HGP1和 MBC1HGP4有同源性。
CDR-嫁接引物MBC1HGP1,MBC1HGP2,MBC1HGP3和 MBC1HGP4可用尿素变性聚丙烯酰胺凝胶分离(Molecular Cloning:A Laboratory Manual,Sambrook,et al.,Cold Spring Harbor Laboratory Press,1989),并按照下述压碎和浸泡(crush-and-soak)方法抽提 (Molecular Cloning:A Laboratory Manual,Sambrook,et al.,Cold Spring Harbor Laboratory Press,1989)。
每种CDR-嫁接引物(1nmol)用6%尿素变性聚丙烯酰胺凝胶分离 以得到DNA片段。
从所得到的DNA片段中,用UV线辐射硅胶薄板 鉴定所要长度的DNA片段,然后用压碎和浸泡(crush-and-soak)方法 收集。
所得DNA片段溶解于包含10mM Tris-HCl(pH7.4)和1mM EDTA 的20μl溶液中。
用TaKaRa Ex Taq(Takara Shuzo Co.,Ltd.)进行PCR反 应。
100μl PCR溶液包括:1μl上述的每一种CDR-嫁接引物 MBC1HGP1,MBC1HGP2,MBC1HGP3和MBC1HGP4, 0.25mMdNTPs,2.5U TaKaRa Ex Taq及缓冲液。
PCR反应按照条件: 94℃1分钟;55℃1分钟;72℃1分钟,进行5次循环。
所得的溶 液中加入外部引物MBC1HVS1和MBC1HVR1(各50pmol)。
用这种反 应混合物,PCR反应按照同样条件进行30次循环。
扩增得到的DNA 片段用4%Nu Sieve GTG Agarose(FMC Bio.Products)利用琼脂糖凝胶 电泳使之分离。
包含421bp的DNA片段的琼脂凝胶部分被切割,用GENECLEAN II Kit(BIO101)并按照试剂盒中的说明纯化DNA片段。
纯化的DNA用 乙醇沉淀并溶解于20μl包含10mM Tris-HCl(pH7.4)和1mM EDTA的 溶液中。
所得的PCR反应混合物用于DNA片段亚克隆到已用BamHI 和HindIII酶切过的质粒pUC19上,随后对所得的质粒进行序列测定。
具有正确核酸序列的质粒被命名为“hMBCHv/pUC19”。
(ii)人源化H链cDNA的H链V区的构建 为连接到含有人源化H链C区Cγ1的cDNA上,将按照上述步 骤构建的人源化H链V区的DNA用PCR方法修饰。
对于PCR方法 一种反向引物MBC1HVS2被设计出来与编码V区引导序列5’端的 DNA杂交,同时还包括一段Kozak共有序列(Kozak,M.et al.,J.Mol. Biol.,196,947-950,1987)以及HindIII和EcoRI识别序列;一种正向引 物MBC1HVS2被设计出来与编码J区3’端的DNA以及编码C区5’ 端的DNA序列杂交,并具有ApaI和SmaI识别序列。
用TaKaRa Ex Taq(Takara Shuzo Co.,Ltd.)和附加的缓冲液进行 PCR反应。
PCR溶液包括0.4μg质粒hMBCHv/pUC19作为模板DNA, 缓冲液中包括50pmol的MBC1HVS2和50pmol的MBC1 HVR2作为 引物,2.5U TaKaRa Ex Taq和0.25mM dNTPs。
PCR反应按照条件:94 ℃1分钟;55℃1分钟;72℃1分钟,进行30次循环。
扩增得到的 DNA片段用3%Nu Sieve GTG Agarose(FMC Bio.Products)进行琼脂 糖凝胶电泳使之分离。
包含456bp DNA片段的琼脂凝胶部分被切割,用GENECLEAN II Kit(BIO101)并按照试剂盒中的说明纯化DNA片段。
纯化的DNA用 乙醇沉淀收集,随后溶解于20μl包含10mM Tris-HCl(pH7.4)和1mM EDTA的溶液中。
所得的PCR反应溶液用于将DNA片段亚克隆到已 预先被EcoRI中SmaI酶切过的pUC19载体上,然后对所得的质粒进 行核酸序列的测定。
结果,得到了携带编码来源于杂交瘤#23-57-137- 1小鼠H链V区DNA的质粒,质粒在5’端含有EcoRI和HindIII识 别序列以及Kozak序列,在3’端含有ApaI和SmaI识别序列,质粒被 命名为“hMBC1Hv/pUC19”。
(2)人源化抗体H链的表达载体的构建 携带hPM1抗体H链cDNA序列的质粒RVh-PM1f-cDNA用ApaI 和BamHI酶切得到的DNA片段包含编码H链C区的DNA。
将DNA 片段插入到已经ApaI和BamHI酶切过的质粒hMBC1Hv/pUC19。
得 到的质粒命名为“hMBC 1HcDNA/pUC19”。
该质粒包含编码人源化 #23-57-137-1抗体H链V区的DNA和编码人H链C区Cγ1的DNA, 以及在5’区的EcoRI和HindIII识别序列和在3’区的BamHI识别序列。
质粒hMBC1HcDNA/pUC19携带的人源化H链版本“a”的核酸序列 和其相对应的氨基酸序列分别显示在SEQ ID NO:58和SEQ ID NO:56 中。
质粒hMBC1HcDNA/pUC19用EcoRI和BamHI酶切得到的DNA 片段包含编码H链的DNA。
DNA片段被插入到已预先用EcoRI和 BamHI酶切的表达质粒pCOS1中。
结果得到人源化抗体的表达质粒, 被命名为“hMBC1HcDNA/pCOS1”。
为了产生用于在CHO细胞中表达的质粒,质粒hMBC1 HcDNA/pUC19用EcoRI和BamHI酶切得到一个含编码H链的DNA 的DNA片段。
该DNA片段转入到已被EcoRI和BamHI酶切的表达 载体pCHO1中。
结果获得了人源化抗体的质粒,其被命名为“hMBC1 HcDNA/pCHO1”。
(3)L链杂交V区的构建 (i)杂合抗体FR1,2/3,4的制备 构建具有人源抗体FR和小鼠(嵌合)抗体FR的FR杂合L链的基 因,并评价每个区的人源化。
在此步骤中,通过用位于CDR2的AflII 限制性位点制备了既包括来自于人抗体的FR1和FR2又包括来自于小 鼠抗体的FR3和FR4的杂合抗体。
质粒MBC1L(λ)/neo和质粒hMBC1L(λ)/neo(各10μg)被分别酶 切,100μl的反应溶液包括10mM Tris-HCl(pH7.5),10mM MgCl2,1mM DTT,50mM NaCl,0.01%(w/v)BSA,和10单位AflII(Takara Shuzo Co.,Ltd.)37℃酶切1小时。
反应溶液用2%低熔点琼脂糖凝胶电泳,从 质粒MBC1L(λ)/neo生成的6282bp的DNA片段(称为“c1”)和1022bp 的DNA片段(称为“c2”),或从质粒hMBC1L(λ)/neo生成的6282bp 的DNA片段(称为“h1”)和1022bp的DNA片段(称为“h2”)。
这些 DNA片段用GENECLEAN II Kit(BIO101)从凝胶中收集和纯化。
c1和h1片段(各1μg)经BAP处理。
DNA片段用苯酚和氯仿抽提 并用乙醇沉淀收集,随后溶解于10μl包含10mM Tris-HCl(pH7.4)和 1mM EDTA的溶液中。
BAP处理过的c1和h1DNA片段(各1μl)被分 别连接到h2和c2DNA片段(各4μl)(4℃过夜)。
每种连接产物被转入 到大肠杆菌JM109的感受态细胞中形成转化子。
转化子培养于包含 50μg/ml氨苄青霉素的2ml 2×YT培养基中。
从培养液里的细胞中, 用QIAprep Spin Plasmid Kit(QIAGEN)试剂盒纯化质粒。
对纯化的质粒进行酶切,20μl的反应溶液包括10mM Tris-HCl(pH7.5),10mM MgCl2,1mM DTT,和2单位ApaLI(Takara Shuzo Co.,Ltd.) 或8单位的BamHI(Takara Shuzo Co.,Ltd.)和HindIII(Takara Shuzo Co.,Ltd.)于37℃酶切1小时。
如果c1-h1被正确连接,预期酶切反应 会得到5560/1246/498bp片段(用ApaLI酶切)或7134/269bp片段(用 BamHI和HindIII酶切)。
根据这种预期,鉴别目的质粒。
编码人FR1,2/小鼠FR3,4杂合抗体L链的表达质粒被命名为 “h/mMBC1L(λ)/neo”。
另一方面,因为不能得到h1-c1克隆子,将 pUC载体重组并将所得的重组产物克隆到HEF载体上。
在此过程中, 包含编码人源抗体L链V区且没有任何氨基酸替换的DNA的质粒 hMBC1Laλ/pUC19和包含编码人源化抗体L链V区且在FR391位置 的酪氨酸被异亮氨酸替换(即根据Kabat的规定为第87个氨基酸)的 DNA的质粒hMBC1Ldλ/pUC19被用作模板。
质粒MBC1L(λ)/pUC19,hMBC1Laλ/pUC19和hMBC1Ldλ /pUC19(各10μl)被分别酶切,30μl的反应溶液包括10mM Tris-HCl(pH7.5),10mM MgCl2,1mM DTT,50mM NaCl,0.01%(w/v)BSA, 和16单位HindIII和4单位AflII 37℃酶切1小时。
反应溶液用2%低 熔点琼脂糖凝胶分别电泳,从质粒MBC1L(λ)/pUC19中生成215bp 的DNA片段(称为“c2”)和从质粒hMBC1Laλ/pUC19和hMBC1Ld λ/pUC19中生成的3218bp的DNA片段(分别称为“ha1”和“hd1”)。
这些DNA片段用GENECLEAN II Kit(BIO101)从凝胶中收集和纯化。
ha1和hd1片段被连接到c2片段上,然后被转入到大肠杆菌JM109 的感受态细胞中形成转化子。
转化子培养于包含50μg/ml氨苄青霉素 的2ml 2×YT培养基中。
从培养液里的细胞中,用QIAprep Spin Plasmid Kit(QIAGEN)试剂盒纯化质粒。
包含ha1片段的质粒被命名为 “m/hMBC1Laλ/pUC19”,包含hd1片段的质粒被命名为“m/hMBC1Ld λ/pUC19”。
质粒m/hMBC1Laλ/pUC19和m/hMBC1Ldλ/pUC19用EcoRI酶 切。
743bp的DNA片段用2%低熔点琼脂糖凝胶电泳,用GENECLEAN II Kit(BIO101)从凝胶中收集和纯化。
所得DNA片段溶解于含10mM Tris-HCl(pH7.4)和1mM EDTA的溶液(20μl)中。
每种DNA片段(各4μl)连接到前面所得到的经BAP处理过的HEF 载体(1μl)。
连接产物被转入到大肠杆菌JM109的感受态细胞中形成转 化子。
转化子培养于包含50μg/ml氨苄青霉素的2ml 2×YT培养基中。
从培养液里的细胞中,用QIAprep Spin Plasmid Kit(QIAGEN)试剂盒 纯化质粒。
对每一种纯化的质粒进行酶切,20μl的反应溶液包括20mM Tris-HCl(pH8.5),10mM MgCl2,1mM DTT,100mM KCl,8单位的 HindIII(Takara Shuzo Co.,Ltd.)和2单位PvuI(Takara Shuzo Co.,Ltd.)于 37℃酶切1小时。
如果DNA片段以正确的方向插入到质粒中,预期 酶切反应会生成5104/2195bp酶切片段,如果DNA片段以反方向插 入,预期酶切反应会生成4378/2926bp酶切片段。
根据这种预期,鉴 别目的质粒。
所得到的质粒为编码小鼠FR1,2/人FR3,4杂合抗体L链 的表达载体,分别被命名为表达载体“m/hMBC1Laλ/neo”和 “m/hMBC1Ldλ/neo”。
(ii)FR1/FR2杂合载体的制备 用位于CDR1的SnaBI限制性位点按照上面所述同样方式制备 FR1/FR2杂合抗体。
质粒MBC1L(λ)/neo和质粒h/mMBC1L(λ)/neo(各10μg)被分别 酶切,20μl的反应溶液包括10mM Tris-HCl(pH7.9),10mM MgCl2,1mM DTT,50mM NaCl,0.01%(w/v)BSA,和6单位SnaBI(Takara Shuzo Co.,Ltd.)37℃酶切1小时。
反应溶液进一步酶切,50μl的反应溶液包 括20mM Tris-HCl(pH8.5),10mM MgCl2,1mM DTT,100mM KCl, 0.01%(w/v)BSA,和6单位PvuI 37℃酶切1小时。
反应溶液用1.5%低熔点琼脂糖凝胶分开电泳,从质粒 MBC1L(λ)/neo得到的4955bp的DNA片段(m1)和2349bp的DNA片 段(m2),从质粒h/mMBC1L(λ)/neo得到的4955bp的DNA片段(hm1) 和2349bp的DNA片段(hm2)。
这些DNA片段用GENECLEAN II Kit(BIO101)从凝胶中收集和纯化。
所得每一个DNA片段溶解于40μl 包含10mMTris-HCl(pH7.4)和1mM EDTA的溶液中。
m1和hm1片段(各1μl)分别连接到hm2和m2片段上(各4μl)。
每 种连接产物被转入到大肠杆菌JM109的感受态细胞中形成转化子。
转 化子培养于包含50μg/ml氨苄青霉素的2ml 2×YT培养基中。
从培养 液里的细胞中,用QIAprep Spin Plasmid Kit(QIAGEN)试剂盒纯化质 粒。
对纯化的质粒进行酶切,20μl的反应溶液包括10mM Tris-HCl(pH7.5),10mM MgCl2,1mM DTT,和8单位的ApaI(Takara Shuzo Co.,Ltd.)或2单位的ApaLI(Takara Shuzo Co.,Ltd.)于37℃酶切1小时。
如果DNA片段连接正确,对于m1-hm2预期酶切反应会得到7304 bp(ApaI酶切)或5560/1246/498bp(ApaLI酶切),对于hm1-m2预期酶 切反应会得到6538/766 bp(ApaI酶切)或3535/2025/1246/498bp(ApaLI 酶切)。
根据这种预期,鉴别目的质粒。
结果得到编码人FR1/小鼠FR2,3,4 杂合抗体L链的表达载体(命名为“hmmMBC1L(λ)/neo”)以及编码 小鼠FR1/人F R2/小鼠FR3,4杂合抗体L链的表达载体(命名为 “mhmMBC1L(λ)/neo”) (4)人源抗体L链的构建 通过CDR-嫁接技术用PCR方法制备人源化#23-57-137-1抗体L 链。
对于制备具有来源于人抗体HSU03868(GEN-BANK,Deftos M.et al.,Scand.J.Immunol.,39,95-103,1994)FR1,FR2和FR3以及来源于人 抗体S25755(NBRF-PDB)FR4的人源化#23-57-137-1抗体L链(版本 “a”),使用下述六个PCR引物。
六个引物如下:CDR-嫁接引物:MBC1LGP1(SEQ ID NO:29)和 MBC1LGP3(SEQ ID NO:30)(都包含有义DNA序列),MBC1LGP2(SEQ ID NO:31)和MBC1LGP4(SEQ ID NO:32)(都包含反义DNA序列),每 个CDR-嫁接引物在两末端都包含15-21bp互补序列;外部引物: MBC1LVS1(SEQ ID NO:33)和MBC1LVR1(SEQ ID NO:34)分别与 CDR-嫁接引物MBC1LGP1和MBC1LGP4有同源性。
CDR-嫁接引物MBC1LGP1,MBC1LGP2,MBC1LGP3和 MBC1LGP4可用尿素变性聚丙烯酰胺凝胶分离(Molecular Cloning:A Laboratory Manual,Sambrook,et al..Cold Spring Harbor Laboratory Press,1989),并按照压碎和浸泡(crush-and-soak)方法提取(Molecular Cloning:A Laboratory Manual,Sambrook,et al.,Cold Spring Harbor Laboratory Press,1989)。
每种CDR-嫁接引物(各1nmol)用6%变性聚丙烯酰胺凝胶分离。
在硅胶薄板上用UV照射鉴定所要长度的DNA片段。
目的DNA片段 从凝胶中用压碎和浸泡(crush-and-soak)方法收集。
所收集的DNA 片段溶解于包含10mM Tris-HCl(pH7.4)和1mM EDTA的20μl溶液 中。
用TaKaRa Ex Taq(Takara Shuzo Co.,Ltd.)和附带的缓冲液进行 PCR反应。
PCR溶液包括(每100μl):1μl CDR-嫁接引物MBC1LGP1, MBC1LGP2,MBC1LGP3和MBC1LGP4,0.25mMdNTPs,2.5U TaKaRa Ex Taq及缓冲液。
PCR反应按照条件:94℃1分钟;55℃ 1分钟;72 ℃ 1分钟进行5次循环。
所得的溶液中加入外部引物MBC1LVS1和 MBC1LVR1(各50pmol)。
用这种反应混合物,PCR反应按照同样条件 进行30次循环。
扩增得到的DNA片段用3%Nu Sieve GTG Agarose (FMC Bio.Products)进行琼脂糖凝胶电泳使之分离。
包含421bp的DNA片段的琼脂凝胶部分被切割,用GENECLEAN II Kit(BIO101)并按照试剂盒中的说明纯化DNA片段。
所得的PCR反 应混合物用于亚克隆到预先已用BamHI和HindIII酶切过的质粒 pUC19上。
对所得的质粒进行序列测定。
所制备的质粒被命名为 “hMBCL/pUC19”。
但在这个质粒中,CDR4第104位置的氨基酸被 精氨酸替换(根据Kabat的规定相对应为第96个氨基酸)。
为将此氨基 酸校正为酪氨酸,设计并合成校正引物MBC1LGP10R(SEQ ID NO:35)。
用TaKaRa Ex Taq(Takara Shuzo Co.,Ltd.)和附带的缓冲液进 行PCR反应。
PCR溶液包括(每100μl):0.6μg质粒hMBCL/pUC19 作为模板DNA,50pmol的引物MBC1LVS1和MBC1LGP10R, 0.25mMdNTPs,2.5U TaKaRa Ex Taq及缓冲液,其上放置矿物油 (50μl)。
PCR反应按照条件:94℃1分钟;55℃1分钟;72℃1分钟, 进行30次循环。
所扩增的DNA片段用3%Nu Sieve GTG Agarose(FMC Bio.Products)进行琼脂糖凝胶电泳使之分离。
包含421bp的DNA片段的琼脂凝胶部分被切割,用GENECLEAN II Kit(BIO101)并按照试剂盒中的说明纯化DNA片段。
所得的PCR反 应混合物用于亚克隆到预先已用BamHI和HindIII酶切过的质粒 pUC19上。
用M13引物M4和M13引物RV对所得的质粒进行序列测定。
结果,证实了质粒具有正确的序列。
质粒用HindIII和BlnI进行酶切, 用1%琼脂糖凝胶进行电泳分离得到416bp的DNA片段。
该DNA片 段用GENECLEAN II Kit(BIO101)并按照试剂盒中的说明纯化,并插 入到预先用HindIII和BlnI酶切过的质粒Cλ/pUC19上。
所得质粒命 名为“hMBC1Laλ/pUC19”。
质粒用EcoRI酶切得到编码人源L链 的DNA片段。
DNA片段被插入到质粒pCOS1上使得人源L链的起 始密码子位于EF1α起动子的下游。
所得的质粒命名为“hMBC1Laλ /pCOS1”。
人源L链版本“a”的DNA序列(包括相应的氨基酸序列) 显示在SEQ ID NO:66。
版本“a”的氨基酸序列也显示在SEQ ID NO:47。
用PCR方法生成突变来制备人源L链版本“b”。
设计版本“b” 是将版本“a”中43位置的甘氨酸(根据Kabat的规定为第43个氨基 酸)用脯氨酸替换,第49位置的赖氨酸(根据Kabat的规定为第49个 氨基酸)用天冬氨酸替换。
用质粒hMBC1Laλ/pUC19作为模板,以突 变引物MBC1LGP5R(SEQ ID NO:36)和引物MBC1LVS1进行PCR反 应。
所得的DNA片段用BamHI和HindIII酶切,酶切片段亚克隆到 pUC19的BamHI和HindIII位点。
测序后,用HindIII和AflII酶切质 粒,得到的酶切片段连接到已预先用HindIII和AflII酶切的质粒 hMBC1Laλ/pUC19上。
得到的质粒命名为“hMBC1Lbλ/pUC19”。
该质粒用EcoRI酶 切得到DNA片段包含编码人源L链DNA。
该DNA片段插入到质粒 pCOS1中使得人源L链的启始密码子位于EF1α起动子的下游。
所得 的质粒命名为“hMBC1Lbλ/pCOS1”。
用PCR方法生成突变来制备人源L链版本“c”。
设计版本“c” 使84位置的丝氨酸(根据Kabat的规定为第80个氨基酸)用脯氨酸替 换。
用质粒hMBC1Laλ/pUC19作为模板,以突变引物 MBC1LGP6S(SEQ ID NO:37)和引物M13引物RV进行PCR反应。
所 得的DNA片段用BamHI和HindIII酶切,酶切片段亚克隆到已预先 用BamHI和HindIII酶切过的pUC19上。
测序后,用BstPI和Aor51HI酶切质粒,得到的酶切片段连接到 已预先用BstPI和Aor51HI酶切的质粒hMBC1Laλ/pUC19上。
所得 的质粒被命名为“hMBC1Lcλ/pUC19”。
该质粒用EcoRI酶切得到DNA 片段包含编码人源L链DNA。
DNA片段插入到质粒pCOS1中EcoRI 位点上使得人源L链的启始密码子位于EF1α起动子的下游。
所得的 质粒命名为“hMBC1Lcλ/pCOS1”。
同样用PCR方法生成突变来制备人源L链版本“d”,“e”和 “f”。
设计版本“d”,“e”和“f”分别使版本“a”,“b”和“c” 中91位置的酪氨酸(根据Kabat的规定为第87个氨基酸)用异亮氨酸 替换。
对版本“d”,“e”,“f”分别用质粒hMBC1Laλ/pCOS1(对 于版本“d”),质粒hMBC1Lbλ/pCOS1(对于版本“e”),质粒hMBC1Lc λ/pCOS1(对于版本“f”)作为模板,以突变引物MBC1LGP11R(SEQ ID NO:38)和引物M-S1(SEQ ID NO:44)进行PCR反应。
所得的DNA 片段用BamHI和HindIII酶切,酶切片段亚克隆到已预先用BamHI和 HindIII酶切过的pUC19上。
测序后,用HindIII和BlnI酶切质粒, 得到的酶切片段连接到已预先用HindIII和BlnI酶切的质粒Cλ/pUC19 上。
所得的质粒被分别命名为“hMBC1Ldλ/pUC19”(对于版本“d”), “hMBC1Leλ/pUC19”(对于版本“e”),“hMBC1Lfλ/pUC19”(对 于版本“f”)。
每种质粒用EcoRI酶切得到DNA片段包含编码人源L 链DNA。
该DNA片段插入到质粒pCOS1中EcoRI位点上使得人源L 链的启始密码子位于EF1α起动子的下游。
所得的质粒被分别命名为 “hMBC1Ldλ/pCOS1”(对于版本“d”),“hMBC1Leλ/pCOS1”(对 于版本“e”),“hMBC1Lfλ/pCOS1”(对于版本“f”)。
同样用PCR方法生成突变来制备人源L链版本“g”和“h”。
设计版本““g”和“h”分别使版本“a”和“d”中36位置的组氨酸(根 据Kabat的规定对应为第36个氨基酸)用酪氨酸替换。
用质粒hMBC1La λ/pUC19作为模板,以突变引物MBC1LGP9R(SEQ ID NO:39)和M13 引物RV作引物进行PCR反应。
并用所得的PCR产物和M13引物M4 作为引物以及质粒hMBC1Laλ/pUC19作为模板进行附加的PCR反 应。
所得的DNA片段用HindIII和BlnI酶切,酶切片段亚克隆到已 预先用HindIII和BlnI酶切过的质粒Cλ/pUC19上。
用此质粒作为模 板,用引物MBC1LGP13R(SEQ ID NO:40)和MBC1LVS1进行PCR反 应。
所得的PCR片段用ApaI和HindIII酶切,酶切片段亚克隆到已预 先用ApaI和HindIII酶切过的质粒hMBC1Laλ/pUC19或hMBC1Ldλ /pUC19上。
所得质粒测序。
证实为包含正确序列的质粒被分别命名为 “hMBC1Lgλ/pUC19”(对于版本“g”)和“hMBC1Lhλ/pUC19”(对 于版本“h”)。
每种质粒用EcoRI酶切得到DNA片段包含编码人源L 链DNA。
DNA片段插入到质粒pCOS1中的EcoRI位点使得人源L链 的启始密码子位于EF1α起动子的下游。
所得的质粒被分别命名为 “hMBC1Lgλ/pCOS1”(对于版本“g”)和“hMBC1Lhλ/pCOS1”(对 于版本“h”)。
同样用PCR方法生成突变来制备人源L链版本“i”,“j”,“k”, “1”,“m”,“n”和“o”。
用质粒hMBC1Laλ/pUC19作为模板, 以突变引物MBC1LGP14S(SEQ ID NO:41)和引物V1RV(λ)(SEQ ID NO:43)进行PCR反应。
所得的DNA片段用ApaI和BlnI酶切,然后 亚克隆到已预先用ApaI和BlnI酶切过的质粒hMBC1Lgλ/pUC19上。
对所得的质粒进行测序,对每个版本中被引入突变的克隆子进行筛 选。
所得的质粒被命名为“hMBC1Lxλ/pUC19(x=i,j,l,m,n或o)”。
每 种质粒用EcoRI酶切得到DNA片段包含编码人源L链DNA。
DNA 片段插入到质粒pCOS1中EocRI位点上使得人源L链的启始密码子 位于EF1α起动子的下游。
所得的质粒被命名为“hMBC1Lxλ /pCOS1(x=i,j,l,m,n或o)”。
版本“j”,“l”,“m”和“o”的DNA 序列(包括相应的氨基酸序列)被分别显示在SEQ ID NOs:67,68,69 和70。
这些版本的氨基酸序列也分别显示在SEQ ID Nos:48,49,50 和51。
设计人源化L-链版本“p”,“q”,“r”,“s”和“t”分别使 版本“i”,“j”,“m”,“l”和“o”中87位置的酪氨酸用异亮氨 酸替换。
这些版本的制备是利用FR3的Aor51MI限制性位点并用版 本“h”中的该位点替换每一版本“i”,“i”,“m”,“l”和“o” 中的该位点。
即,从表达质粒hMBC1Lxλ/pCOS1(x=i,j,m,l或o)去除 包含CDR3,一部分FR3和全部FR4的Aor51HI限制性片段(514bp)。
表达质粒hMBC1Lhλ/pCOS的Aor51 HI限制性片段(514bp),其包含 CDR3,一部分FR3和全部FR4被连接到除去的位点上,使91位置 的酪氨酸(根据Kabat的规定对应为第87个氨基酸)用异亮氨酸替换。
对所得的质粒进行测序。
筛选其91位置的酪氨酸(根据Kabat的规定 对应为第87个氨基酸)用异亮氨酸替换的每种版本“i”,“j”,“m”, “l”和“o”克隆子。
这些分别对应版本i”,“i”,“m”,“l”和 “o”的修饰版本分别命名为版本“p”,“q”,“s”,“r”和“t”。
所得的质粒被分别命名为“hMBC1Lxλ/pCOS1(x=p,q,s,r或t)”。
版 本“q”,“r”,“s”和“t”的DNA序列(包括相应的氨基酸序列) 被分别显示在SEQ ID NOs:71,72,73和74。
这些版本的氨基酸序列也 被分别显示在SEQ ID NOs:52,53,54和55。
质粒hMBC1Lqλ/pCOS1用HindIII和EcoRI酶切并亚克隆到已 预先用HindIII和EcoRI酶切的质粒pUC19上。
所得质粒被命名为 “hMBC1Lqλ/pUC19”。
人源L链各版本氨基酸替换位置显示在如下表2中。
                                  表2                        替换氨基酸在序列中的位置列表                        (氨基酸的编号根据Kabat的规定)    版本
    36
    43
    45
    47
    49
    80
    87
    a
    b
    P
    D
    c
    P
    d
    I
    e
    P
    D
    I
    f
    P
    I
    g
    Y
    h
    Y
    I
    i
    Y
    K
    j
    Y
    K
    D
    k
    Y
    K
    V
    l
    Y
    K
    V
    D
    m
    Y
    D
    n
    Y
    V
    o
    Y
    V
    D
    p
    Y
    K
    I
    q
    Y
    K
    D
    I
    r
    Y
    D
    I
    s
    Y
    K
    V
    D
    I
    t
    Y
    V
    D
    I
表2中的大写字母代表了下述氨基酸:Y:酪氨酸;P:脯氨酸; K:赖氨酸;V:缬氨酸;D:天冬氨酸;和I:异亮氨酸。
包含质粒hMBC1HcDNA/pUC19和hMBC1Lqλ/pUC19的大肠 杆菌分别被命名为“大肠杆菌JM109(hMBC1HcDNA/pUC19)”和“大 肠杆菌JM109(hMBC1Lqλ/pUC19”,这些大肠杆菌依据布达佩斯条 约已于1996年8月15日保藏在日本工业科学和技术机构--国立生命 科学和人体技术研究所(1-3,Higashi 1-chome,Tsukuba-shi,Ibaraki,日本) 保藏号:FERM BP-5629(对于大肠杆菌JM109(hMBC1HcDNA/pUC19)) 和FERM BP5630(对于大肠杆菌JM109(hMBC1Lqλ/pUC19)。
(5)转染COS-7细胞 为评价杂合抗体和人源#23-57-237-1抗体的抗原结合活性和中和 活性,上述制备的表达质粒在COS-7细胞中瞬时表达。
对于L链的杂 合抗体的瞬时表达,将下面的质粒组合用Gene Pulser(Bio Rad)通过电 穿孔共转染到COS-7细胞中:hMBC1HcDNA/pCOS1和h/m MBC1L(λ)/neo;hMBC1HcDNA/pCOS1和m/hMBC1Laλ/neo; hMBC1HcDNA/pCOS1和m/hMBC1Ldλ/neo;hMBC1HcDNA/pCOS1 和hmmMBC1L(λ)/neo;以及hMBC1HcDNA/pCOS1和 mhmMBC1L(λ)/neo。
也即将质粒组合(各10μg)加入到PBS(-)中的 COS-7细胞悬液(0.8ml;1×107细胞/毫升)。
用电容为1,500V和2μF的 脉冲作用于所得溶液进行电转化。
于室温下恢复反应10分钟后,电 穿孔的细胞被悬浮于包括2%Ultra Low IgG胎牛血清(GIBCO)的 DMEM培养基(GIBCO),然后在二氧化碳孵箱中用10-em的培养皿培 养。
培养后72小时,收集培养上清液并离心去除细胞碎片。
制得的 溶液提供为后续ELISA使用。
对于人源#23-57-237-1抗体的瞬时表达,按照所述对于杂合抗体 的相同方式将质粒hMBC1HcDNA/pCOS1和hMBC1Lxλ/pCOS1(x=a-t) 用Gene Pulser(Bio Rad)共转染到COS-7细胞中。
所制备的培养上清提 供后续ELISA使用。
用AffiGel Protein A MAPSII Kit试剂盒(Bio Rad)并按照试剂盒 中的说明从COS-7细胞培养上清中纯化杂合抗体和人源化抗体。
(6)ELISA (i)抗体浓度的测定 用于测定抗体浓度的ELISA板按照如下方法制备。
96孔ELISA 板(Maxisorp,NUNC)中的每孔用100μl添加有1μg/ml山羊抗人IgG抗 体(TAGO)的包被缓冲液(0.1M NaHCO3,0.02%NaN3)进行包被,然后 用200μl稀释缓冲液[50mMTris-HCl,1mM MgCl2,0.1M NaCl, 0.05%Tween20,0.02%NaN3,1%牛血清白蛋白(BSA),PH7.2]进行封 闭。
将有杂合抗体和人源化抗体表达的COS-7细胞上清系列稀释,并 将每个浓度的细胞加入到板上的各孔中,或者将纯化形式的杂合抗体 和人源化抗体系列稀释,并将每个浓度的细胞加入到板上的各孔中。
板于室温下温育1小时并用PBS-Tween20洗涤。
随后,板上的每个孔 加入100μl含着结合有碱性磷酸酶的山羊抗人IgG抗体(TAGO)的溶 液。
板在室温下温育1小时并用PBS-Tween20洗涤。
然后每个孔加入 1mg/ml底物溶液(“Sigma 104”,硝基苯磷酸,SIGMA)。
用Microplate Reader(Bio Rad)在405nm测量每孔溶液的吸光度来测定抗体浓度。
在 此测定中,纯化的Hu IgG1λ(结合位点)作为标准。
(ii)抗原结合能力的测定 用于测定抗原结合能力的ELISA板按照如下方法制备。
96孔 ELISA板(Maxisorp,NUNC)中的每孔用100μl添加有1μg/ml人 PTHrP(1-34)的包被缓冲液进行包被,然后用200μl稀释缓冲液进行封 闭。
随后,将有杂合抗体和人源化抗体表达的COS-7细胞上清系列稀 释,并将每个稀释浓度的细胞加入到板上的各孔中,或者将纯化形式 的杂合抗体和人源化抗体系列稀释,并将每个浓度的细胞加入到板上 的各孔中。
板于室温下温育1小时并用PBS-Tween20洗涤。
板上的每 个孔加入100μl结合有碱性磷酸酶的山羊抗人IgG抗体(TAGO)的溶 液。
板在室温下温育并用PBS-Tween20洗涤。
随后,板上的每个孔加 入1mg/ml底物溶液(“Sigma 104”,硝基苯磷酸,SIGMA)。
用Microplate Reader(Bio Rad)在405nm测量溶液的吸光度。
(7)活性确证 (i)人源H链的评价 发现具有人源H链版本“a”和嵌合L链的抗体表现出与嵌合抗 体相同水平的PTHrP结合活性。
此结果表明版本“a”H链V区的人 源化达到的程度足以进行人源化评价。
因此,人源化H链版本“a” 被提供作为下面试验中人源化抗体的H链。
(ii)杂合抗体的活性 (ii-a)FR1,2/FR3,4杂合抗体 当L链为h/mMBC1L(λ)时,没有观察到抗原结合活性。
相反, 当L链为m/hMBC1Laλ或m/hMBC1Ldλ时,观察到和嵌合#23-57- 237-1抗体相同水平的抗原结合活性(图7)。
这些结果表明FR3和FR4 能够作为人源化抗体,但FR1和FR2包含的氨基酸残基需要替换。
(ii-b)FR1/FR2杂合抗体 当L链为mhmMBC1L(λ)时,没有观察到抗原结合活性。
相反, 当L链为hmmMBC1L(λ)时,观察到和嵌合#23-57-237-1抗体相同水 平的抗原结合活性(图8)。
这些结果表明FRI能够作为人源化抗体, 但FR2包含的氨基酸残基需要替换。
(iii)人源化抗体的活性 分别测定具有L-链版本“a”到“t”的人源化抗体的抗原结合活 性。
结果发现具有L链版本“j”,“l”,“m”,“o”,“q”,“r”, “s”和“t”的人源化抗体表现出和嵌合抗体相同水平的抗原结合活 性。
(8)能够稳定生产抗体的CHO细胞系的建立 为建立能稳定产生人源化抗体的细胞系,上述制备的每一个表达 质粒被转入到CHO细胞中(DXB11)。
即为建立能稳定产生人源化抗体的细胞系,可以使用下面用于 CHO细胞的表达载体的组合质粒:hMBC1HcDNA/pCHO1和hMBC1Lm λ/pCOS1;hMBC1HcDNA/pCHO1和hMBC1Lqλ/pCOS1;以及 hMBC1HcDNA/pCHO1和hMBC1Lrλ/pCOS1。
用Gene Pulser(Bio Rad) 通过电穿孔将质粒共转染到CHO细胞中。
随后,表达载体分别用限 制性酶PvuI切成线性DNA。
片段所得的DNA片段用苯酚和氯仿抽提 并用乙醇沉淀。
由此制备的DNA片段用于随后的电穿孔。
即质粒DNA 片段(每种10μg)加入到0.8mlCHO细胞的PBS(-)悬液中(1×107细 胞/毫升)。
用电容为1,500V和2μF的脉冲作用于所得溶液进行电转化。
于室温下恢复反应10分钟后,经处理的细胞悬浮于包括10%胎牛血 清(GIBCO)MEMα培养基(GIBCO)中,并在二氧化碳孵箱中用96孔板 (Falcon)培养。
开始培养后,用选择性培养基[没有核糖核酸或脱氧核 糖核酸的MEMα培养基(GIBCO)包含10%胎牛血清(GIBCO)和 500mg/ml GENETICIN(G418硫酸盐;GIBCO)]替代原培养基。
从培 养基中选择抗体基因被转入的细胞。
并更换新鲜的培养基。
在培养基 更换2周后,在显微镜下观察细胞。
当观察到足够的细胞生长,用常 规ELISA如上所述测定抗体浓度方法测定产生的抗体量。
从中选择能 够大量产生抗体的细胞。
然后,将建立起来的能稳定产生抗体的细胞系扩大规模培养,用 没有核糖核酸或脱氧核糖核酸的MEMα培养基(GIBCO)包含2%Ultra Low IgG胎牛血清在摇瓶中培养。
在培养的第三天和第四天,收集培 养上清液并用0.2μm滤器(Millipore)过滤去除细胞碎片。
在 ConSepLC100(Millipore)上用POROS Protein A Column(PerSeptive Biosystems)按照试剂盒中的说明从CHO细胞培养上清液中纯化人源 化抗体。
人源化抗体用作测定中和活性以及在高钙血症模型动物上测 定治疗效率。
纯化的人源化抗体的浓度和抗原结合活性用前述ELISA 系统进行测定。
【参考例5】中和活性的测定 用大鼠骨髓瘤细胞系ROS17/2.8-5细胞来测定小鼠抗体,嵌合抗 体和人源化抗体的中和活性。
ROS17/2.8-5细胞在包含10%胎牛血清 (GIBCO)的Ham’S F-12培养基中(GIBCO)在CO2孵箱中培养。
ROS17/2.8-5细胞接种到96孔板每一个孔中,使每孔密度达到104细 胞/100μl/孔,并培养1天。
培养完成后,将培养基替换为包含4mM 氢化可的松和10%胎牛血清的Ham’S F-12培养基(GIBCO)。
培养3 到4天后,培养的细胞用260μlHam’S F-12培养基洗涤,然后加入80μl 包括1mM异丁基-1-甲基黄嘌呤(IBMX,SIGMA),10%胎牛血清和 10mM HEPES的Ham’S F-12培养基(GIBCO)。
所得的混合物温育在37 ℃30分钟。
用于中和活性检测的小鼠抗体,嵌合抗体和人源化抗体的培养基 按照如下稀释梯度进行系列稀释:[10μg/ml,3.3μg/ml,1.1μg/ml, 0.37μg/ml],[10μg/ml,2μg/ml,0.5μg/ml,和0.01μg/ml]和[10μg/ml, 5μg/ml,1.25μg/ml,0.63μg/ml和0.31μg/ml]。
每种稀释抗体样本溶液 和等量的4ng/ml的PTHrP(1-34)混合。
所得的混合溶液(80μl)加 入到每个孔中。
在每个孔中,每种抗体的最终浓度成为上述抗体浓度 的四分之一,相应的PTHrP(1-34)浓度变为1ng/ml。
在室温下处理10 分钟,去除上清并用PBS洗3次剩余物。
随后,用100μl0.3%HCl-95% 乙醇抽提细胞中cAMP,并用水喷射吸气器吸去HCl-乙醇。
剩余物溶 解于120μl cAMP EIA Kit(CAYMAN CHEMICAL’S)试剂盒附带的EIA 缓冲液以抽提cAMP。
用cAMP EIA Kit(CAYMAN CHEMICAL’S)试 剂盒并根据试剂盒中的说明来测定cAMP。
结果发现在具有和嵌合抗 体相同水平的抗原结合活性人源化抗体中,具有L链版本“q”,“r”, “s”和“t”的那些抗体(其91位置的酪氨酸被异亮氨酸替换)表现出 和嵌合抗体相似的中和活性,具有L链版本“q”的抗体表现出最强 的中和活性。
序列表中的自由文本: SEQ ID NO:1    合成的DNA SEQ ID NO:2     合成的DNA SEQ ID NO:3     合成的DNA SEQ ID NO:4     合成的DNA SEQ ID NO:5     合成的DNA SEQ ID NO:6     合成的DNA SEQ ID NO:7     合成的DNA SEO ID NO:8     合成的DNA SEQ ID NO:9     合成的DNA SEQ ID NO:10    合成的DNA SEQ ID NO:11    合成的DNA SEQ ID NO:12    合成的DNA SEQ ID NO:13    合成的DNA SEQ ID NO:14    合成的DNA SEQ ID NO:15    合成的DNA SEQ ID NO:16    合成的DNA SEQ ID NO:17    合成的DNA SEQ ID NO:18    合成的DNA SEQ ID NO:19    合成的DNA SEQ ID NO:20    合成的DNA SEQ ID NO:21    合成的DNA SEQ ID NO:22    合成的DNA SEQ ID NO:23    合成的DNA SEQ ID NO:24    合成的DNA SEQ ID NO:25    合成的DNA SEQ ID NO:26    合成的DNA SEQ ID NO:27    合成的DNA SEQ ID NO:28    合成的DNA SEQ ID NO:29    合成的DNA SEQ ID NO:30    合成的DNA SEQ ID NO:31    合成的DNA SEQ ID NO:32    合成的DNA SEQ ID NO:33    合成的DNA SEQ ID NO:34    合成的DNA SEQ ID NO:35    合成的DNA SEQ ID NO:36    合成的DNA SEQ ID NO:37    合成的DNA SEQ ID NO:38    合成的DNA SEQ ID NO:39    合成的DNA SEQ ID NO:40    合成的DNA SEQ ID NO:41    合成的DNA SEQ ID NO:42    合成的DNA SEQ ID NO:43    合成的DNA SEQ ID NO:44  合成的DNA 此处所引用的全部出版物,专利和专利应用在此引入作为参考。
工业实用性 如上所述,本发明提供用于抗药性高钙血症的治疗试剂。
该试剂 包括一种能够抑制甲状旁腺激素相关蛋白(PTHrP)与其受体结合的物 质作为活性组分。
根据当给予一种物质时,能观察到抗药性高钙血症模型动物的血 钙水平和体重改善的事实,发现该物质可以作为抗药性高钙血症的治 疗试剂。
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