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耐缺铁性稻类的构建

基本信息

  • 申请号 CN00810004.7 
  • 公开号 CN1298853C 
  • 申请日 2000/07/04 
  • 公开日 2007/02/07 
  • 申请人 独立行政法人科学技术振兴机构  
  • 优先权日期  
  • 发明人 森敏 中西启仁 高桥美智子 西泽直子  
  • 主分类号  
  • 申请人地址 日本琦玉县川口市 
  • 分类号  
  • 专利代理机构 中原信达知识产权代理有限责任公司 
  • 当前专利状态 发明专利权部分无效宣告的公告 
  • 代理人 杨青 
  • 有效性 失效 
  • 法律状态 失效
  •  

权利要求书


1.生产耐缺铁性转基因禾本科植物的方法,包括用编码烟酰胺氨 基转移酶的基因转化禾本科植物,所述基因携带在双元载体上,所述 载体包含在农杆菌中复制用的ori,nos启动子和nos终止子。

2.权利要求1的方法,其中双元载体进一步包括启动子CaMV35S。

3.权利要求1的方法,其中酶是大麦烟酰胺氨基转移酶。

4.权利要求3的方法,其中酶选自: (A)具有氨基酸序列SEQ ID NO:1的酶; (B)具有氨基酸序列SEQ ID NO:2的酶; (C)由碱基序列SEQ ID NO:3编码的酶。

5.一种由权利要求1-4任一项的方法生产的转基因禾本科植物的 转化细胞。

6.一种在缺铁地区耕作的方法,其中将由权利要求1-4任一项的方 法生产的转基因禾本科植物种植在缺铁地区。
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说明书

技术领域 本发明涉及耐缺铁性禾本科植物的生产方法、经此法获得的禾本 科植物、种植所述禾本科植物的方法以及经此法获得的作物。
更具体而言,本发明涉及通过引入基因来生产耐缺铁性禾本科植 物,其中所述基因编码禾本科植物的麦根酸(mugineic acid)合成途径 中的酶,更优选所述酶是烟酰胺氨基转移酶。
背景技术 地球上90%的土壤是存在某种问题的不良土壤。
通常,不良土壤 根本性地和在一定程度上缺乏植物生长所必需的元素,因此,植物生 长受阻,或者因土壤含有大量重金属而发生生长紊乱。
典型的不良土 壤是旱地盐积土(salt accumulated soil)。
在这种土壤中,因人为漫灌 或长期干旱而积聚了NaCl和Na2CO3,或者在表土层中积聚了CaCO3或CaSO4
盐成土引起盐密度紊乱,石灰性土壤引起缺铁紊乱。
地球上约30%的耕作土壤据说是潜在的缺铁地区(Wallence等 (1960))。
半干旱地区的石灰性土壤具有因毛细管效应从地心物质中洗 脱出的石灰质成分,其积聚到地表面上。
在此土壤中,pH升高成碱性, 因此,土壤中的铁以Fe(OH)3的形式存在并具有极低的溶解度。
在这些土壤中生长的植物由于低溶性铁具有缺铁失绿症,其生长 受阻或者死亡。
高等植物的获铁体系分为两类:策略I体系和策略II体系。
策略 I体系是除禾本科植物外的高等植物的获铁体系,其中,土壤中不可溶 的三价铁被存在于根部细胞表面上的三价铁还原酶还原,然后被二价 铁转运蛋白吸附。
在具有该体系的那些植物中,有些具有如下体系, 其释放质子到根围中,通过降低根围的pH来增加三价铁还原酶的活 性;有些具有如下体系,其释放酚类化合物到根围中,并通过Fe(III)- 酚化合物螯合物来向细胞表面上的三价铁还原酶提供Fe(III)。
近期的 研究分离了二价铁转运蛋白IRT1(Eibe等(1996)),其特异性地出现 在arabidopsis thaliana的根部,并分离了arabidopsis thaliana的三价铁 还原酶的基因(Robinson等(1997))。
策略II体系是仅在单子叶植物中的禾本科植物中观察到的获铁体 系。
禾本科植物释放出在缺铁环境中具有三价铁螯合活性的麦根酸, 并从根吸收作为“Fe(III)-麦根酸”复合体的铁(Takagi等(1984))。
已 知有7种麦根酸类(MA):麦根酸(MA)、2’-脱氧麦根酸(DMA)、 3-羟基麦根酸(HMA)、3-表羟基麦根酸(epiHMA)、燕麦蛋白酸(avenin acid;AVA)、distichon acid和表羟基脱氧麦根酸(epiHDMA)。
如 图1所示,所有这些麦根酸(MA)都是用甲硫氨酸作为前体合成的 (Shojima等(1999),Ma等(1998))。
麦根酸的分泌具有昼夜节律(Takagi等,同上),在日出后其分泌达 到顶峰,而在夜间不分泌。
此外,观察到在缺铁性大麦根中在分泌前 颗粒膨胀,在分泌后颗粒萎缩(Nishizawa等(1987))。
因此相信,麦 根酸是在所述颗粒中合成的。
这些事实说明禾本科植物对缺铁作出的 反应不仅是通过麦根酸的合成来形成的,而且还是通过一种复杂系统 来形成的,所述复杂系统例如为缺铁信号的传递和根部形状的变化。
据报道,烟酰胺合成酶的基因已被分离且该基因是受缺铁诱导的, 所述烟酰胺合成酶是一种与麦根酸合成途径相关的酶。
(Higuchi等 (1999))。
此外,烟酰胺氨基转移酶(NAAT)基因已被分离且其是受 缺铁诱导的(Takahashi等(1997))。
此外,通过使用从缺铁大麦根和对照大麦根中提取的mRNA进行 示差筛选,分离了专一地在缺铁条件下被诱导出的基因Ids1、Ids2和 Ids3。
Ids1是编码金属硫蛋白的基因(Okumura等(1991))。
Ids2是一 个这样的基因,其中从其遗传序列推出的氨基酸序列与氢氧化酶是同 源的(Okumura等(1994))。
Ids3也是这样一个基因,其中从其遗传序 列推出的氨基酸序列与氢氧化酶是同源的(Nakanishi等(1993))。
在 表羟基麦根酸合成途径中存在两种氢氧化物反应,相信催化该反应的 酶是由此基因编码的。
此外,由大麦根缺铁所诱导的蛋白的例子是IDS3蛋白、腺嘌呤- 核糖-磷酸转移酶(Itai等(1999))、甲酸脱氢酶(Suzuki等(1998))和 36kDa蛋白(Irifune(1991))。
禾本科植物在缺铁条件下生物合成麦根 酸。
此时,相信根部所含的甲硫氨酸减少,以便在甲硫氨酸循环中合 成了甲硫氨酸,同时为了将产生的腺嘌呤转化成AMP,诱导出腺嘌呤- 核糖-磷酸转移酶(Itai等,同上)。
甲酸脱氢酶分解在甲硫氨酸循环中产生的甲酸。
据报道,缺铁性 禾本科植物的根部中的线粒体变形,电子传输系统的能量降低(Mori 等(1991))。
相信甲酸脱氢酶是受缺铁产生的厌氧条件所诱导的,NADH 是作为能量来源而被提供的。
随着人口的增加,食物增产是未来人类生存条件的一个重要的问 题。
从古代以来,禾本科植物就是最重要的食物之一,但是,事实上, 禾本科植物很难在缺铁地区生长。
如果有可能在缺铁地区种植禾本科 植物,食物增产将是可能的,因此,其作为一种增加食物产量的办法 已受到人们的关注。
发明公开 本发明的一个目的是提供可在缺铁地区生长的耐缺铁性禾本科植 物。
更具体而言,本发明的一个目的是通过将禾本科植物的麦根酸生 物合成途径中的一种酶的基因导入禾本科植物中来提供耐缺铁性禾本 科植物,所述禾本科植物即使在石灰性碱性土壤中仍旺盛地生长。
本发明涉及通过将编码麦根酸生物合成途径中的酶的基因导入禾 本科植物来生产具有改善的铁吸收性的禾本科植物的方法,更具体而 言,涉及通过导入基因naat来生产具有改善的铁吸收性的禾本科植物 的方法,其中所述酶是烟酰胺(nicotianamine)氨基转移酶(NAAT)。
此外,本发明涉及可通过上述方法生产的禾本科植物。
具体而言, 本发明涉及通过将编码麦根酸生物合成途径中的酶的基因导入禾本科 植物而具有改善的铁吸收性的禾本科植物,更具体而言,涉及通过导 入编码该酶的基因naat而具有改善的铁吸收性的禾本科植物,其中所 述酶是烟酰胺氨基转移酶(NAAT)。
此外,本发明还涉及所述具有改善的铁吸收性的禾本科植物的生 长方法,以及经所述生长获得的作物。
附图简述 图1显示了缺铁大麦根的麦根酸生物合成途径及其根围环境。
图2显示了用于禾本科植物转化的双元载体pIG121Hm的遗传序 列,其中插入了naat-A的cDNA。
图3是照片而非图片,其中显示了通过Southern杂交方法检测所 导入的基因的结果。
图3中的WT显示了野生型禾本科植物的情况, 对照显示了其中仅导入载体的对照禾本科植物。
1-5、1-6、1-7、8-1和 15-2显示了具有35S启动子的转化子。
图4显示了测量在水培溶液中在含铁(+Fe)和缺铁(-Fe)条件 下培育的根中的NAAT活性的结果。
在图4中,透明部分显示了+Fe的情况,阴影部分显示了-Fe的情况。
WT显示了野生型禾本科植物, 1-5、1-6和1-7显示的是转化子的情形。
图5是照片而非图片,其中显示了移植至碱性土8周后的各禾本 科植物的生长状态,图5中的对照显示了其中仅导入载体的对照禾本 科植物,右边的禾本科植物是被转化的禾本科植物。
图6是显示移植至碱性土后的各禾本科植物的高度变化过程的 图。
黑点显示了转化子15-2,黑正方形显示了转化子8-1,白点显示了 其中仅导入载体的对照禾本科植物。
图7显示了包括分离的基因组naat的噬菌体DNA的限制性酶图 谱。
在图7中,E表示EcoRI,H表示HindIII,B表示BamHI,N表示 NotI。
在两个位置处的NotI位点是位于λFIXII臂上的NotI。
图8显示了用于禾本科植物转化的双元载体pBIGRZ1的遗传序 列,其中插入了NAAT基因组的片段。
在图8中,NPTII是卡那霉素 抗性基因,HPT是潮霉素抗性基因,GUS是具有内含子的β葡糖醛酸糖 苷酶基因,LacZ是β半乳糖苷酶基因,35P是35S启动子,NP是NOS 启动子,NT是NOS终止子,MCS是多克隆位点,Riori是Ri质粒复 制起点。
图9是显示所得基因组naat的碱基序列的图。
图10是显示通过比较naat cDNA序列和naat基因组序列而确定的 naat碱基序列、naat-A和naat-B的5’上游、外显子、内含子和3’下游 的碱基序列的图。
在图10中,大写字母显示了在cDNA上转录的外显 子部分,小写字母显示了其余的部分。
图11是所得基因组片段的示意图。
在图11中,E是EcoRI,H是 HindIII,B是BamHI。
图12显示了naat-A和naat-B的cDNA中的内含子的位置和大小。
图13显示了以单字母密码表示的从cDNA推定的NAAT-A的氨 基酸序列的氨基酸。
图14显示了以单字母密码表示的从cDNA推定的NAAT-B的氨 基酸序列的氨基酸。
图15是照片而非图片,其显示了移植至碱性土后10周的导入了 基因组naat的各禾本科植物的生长状态,在图15中,对照是其中仅导 入了载体的对照禾本科植物,右边的禾本科植物是用基因组naat转化 的禾本科植物。
图16是显示移植至碱性土后的其中导入了基因组naat的各禾本科 植物的高度变化过程的图。
在图16中,左边的禾本科植物是用基因组 naat转化的禾本科植物,右边的禾本科植物是其中仅导入了载体的对照 禾本科植物。
发明的最佳实施方案 所述策略II是在单子叶植物中仅在禾本科植物中观察到获铁体 系,其利用了生物合成并释放麦根酸的方法来获得铁。
因此,研究了 提高麦根酸生物合成途径(参见图1)中的酶的方法。
本发明人首先注意到了作为麦根酸合成途径中的一个酶的烟酰胺 氨基转移酶(NAAT),然后努力导入基因naat。
奇迹般地发现导入了 所述基因的禾本科植物即使在石灰性碱性土中仍能旺盛生长。
利用XbaI和SacI位点,将烟酰胺氨基转移酶(NAAT)naat-A的 cDNA整合到pIG121Hm中,制备了图2中所示的双元载体。
通过导入 到农杆菌中,所得载体被用于转化。
禾本科植物的转化按照Hiei等的方法进行(Hiei等(1994)),并将 “Tsukinohikari”用作所述材料。
从胚盘中诱导出的愈伤组织沉浸入所述 转入的农杆菌悬浮液中并在其中感染,获得再生体(T1植物)。
最后, 从种子获得34株经转化的禾本科植物。
通过Southern杂交方法检测所导入的基因。
结果如图3所示。
在 图3中,WT显示了野生型禾本科植物的情况,对照显示了其中仅导入 载体的对照禾本科植物。
1-5、1-6、1-7、8-1和15-2显示了具有35S 启动子的转化子。
如图3所示,所有转化子具有过表达的naat-A。
此 外,发现在这些35S转化的禾本科植物中,8-1和15-2分别具有所导 入naat的至少5个拷贝和2个拷贝。
与野生型和其中仅导入载体的禾本科植物相比,导入了基因naat 的禾本科植物被认为存在烟酰胺氨基转移酶(NAAT)的过度释放,由 此,麦根酸合成途径被激活,从而大量产生对于铁摄取所必需的麦根 酸。
因此,首先研究了这些植物种中的NAAT活性。
发芽后3周的幼 苗(T2)在水培溶液中在含铁(+Fe)和缺铁(-Fe)条件下培育2周。
NAAT活性的测量结果如图4所示。
在图4中,透明部分显示了+Fe的情况,阴影部分显示了-Fe的情况。
WT显示了野生型禾本科植物的 情况,1-5、1-6和1-7显示了转化子的情况。
结果,对于+Fe和-Fe两种情况,经转化的禾本科植物比非转化的 野生型禾本科植物(WT)具有较高的比活,此外,还发现在-Fe条件 下所述比活进一步增加。
这说明基因导入不仅导致了高NAAT活性, 而且在缺铁条件或不可溶性铁的条件下转化子的NAAT活性得以显著 促进。
换言之,认为它已成为对缺铁环境或不可溶性铁的环境具有高 耐受性的物种。
基于以上描述,发现基因naat的导入提高了NAAT的活性。
尽管 如此,仍调查了这些转化子是否能在实际缺铁土壤中生长。
当将 35S-naat-A转化的禾本科植物移植至不溶性铁条件的碱性土后,其叶子 在移植后至多2周内变黄,然而,在4-5周后,新叶子变成暗绿色并开 始恢复。
图5是显示移植至碱性土8周后的生长状态的照片。
在图5 中,对照显示了其中仅导入载体的对照禾本科植物,右边的禾本科植 物是经转化的禾本科植物。
发现与对照相比,经转化的禾本科植物具 有显著较好的生长。
此外,在图6中显示了移植至碱性土后的各禾本 科植物的高度变化过程。
在图6中,Y轴显示植物的高度(cm),X 轴显示其移植至碱性土后的天数。
黑点显示转化子15-2,黑正方形显 示转化子8-1,白点显示其中仅导入载体的对照禾本科植物。
如上所述,35S转化的禾本科植物8-1具有所导入naat基因的至 少5个拷贝,35S转化的禾本科植物15-2具有所导入naat基因的至少 2个拷贝。
从图6中的植物高度判断,基因的拷贝数是不相关的,表示 只要导入了所述基因,禾本科植物就获得了耐缺铁性。
如上所述,所述基因的导入提高了禾本科植物的麦根酸合成途径 中的酶的活性,此外还发现由此附加了耐缺铁性。
对于在本发明麦根酸合成途径中的酶,只要其是图1所示麦根酸 生物合成途径中的酶且编码所述酶基因的导入增加其活性,就是可接 受的。
如上所述,在候选物中,烟酰胺氨基转移酶(NAAT)和烟酰胺 合成酶是可取的。
编码本发明禾本科植物的麦根酸合成途径中的酶的 基因是cDNA或从基因组衍生的基因。
如下文所述,基因组的应用是 本发明的优选实例。
因此,对于本发明的禾本科植物,只要其是可经策略II体系吸收 铁的植物就是可接受的,且不限于理论意义上的禾本科植物。
本发明 禾本科植物的优选实例是稻类植物、玉米、高粱、小麦、大麦和燕麦。
这些禾本科植物可应用本发明的方法而不论其品种,并可生产出具有 所导入的靶基因的禾本科植物。
本发明的启动子不受限制,只要其可产生靶酶。
可使用35S启动 子,更具体而言,可使用CaMV35S启动子。
本发明的载体不受具体的限制,只要其可在转化过程中被优选使 用。
本发明转化方法不限于所述使用农杆菌方法的方法,可使用多种 (例如,使用粒子枪)的转化方法等。
所形成的禾本科植物的细胞不 限于来自所述愈伤组织的细胞,可使用各种细胞,但是,通常优选使 用来自愈伤组织的细胞。
本发明所述及的缺铁性可以是其中缺乏铁的一种状态,但是优选 其是这样一种状态,其中铁的存在形式很难被植物吸收,根据植物的 类型,可确定其缺铁与否。
因此,本发明中的耐缺铁性的定义是指受 测植物对很难吸收土壤中的铁这一困难环境的抵抗力。
然后,本发明人努力将大麦的基因组naat代替naat的cDNA来进 行导入。
对于基因组naat,使用利用从大麦(Horudeum vulgare L.var.Igri) 中提取的基因组DNA来制备的文库(由Stratagen Corp.生产)。
利用 限制性酶Sau3AI部分切割所述文库,并将其导入λFIXII载体的XhoI 位点。
对于探针,使用提前分离的naat-A的完整cDNA。
将大肠杆菌 XL1-Blue MRA(大肠杆菌XL1-Blue MRA(P2))用作宿主。
作为筛选的结果,获得了5个噬菌体。
从中分离了各噬菌体DNA, 并进行限制性酶作图。
发现在所有情况下相同的片段增加。
即,发现 所得的5个噬菌体来自基因组的相同部分。
其被认为含有在探针中使 用的naat。
因此,测定其中之一的碱基序列,如图7所示。
图7所示的噬菌体DNA被插入到质粒载体pBIGRZ1的NotI位点, 其中可插入10kb或更大的片段,可使用农杆菌进行禾本科植物的转化 (参见图8)。
此外,将图7所示的至多11.0kb的片段分成4部分,即A-D,将 它们导入质粒载体pBluescript SK(-)的EcoRI位点(B、C)或NotI和 EcoRI位点(A、D)。
对于片段A-D,使用基于质粒上的序列的引物(M13正向引物, M13反向引物)从片段的两端确定了碱基序列。
为了确定DNA碱基序 列,使用Shimadzu,Ltd.的DNA测序仪DSQ-2000L。
序列测定详见实施例。
序列表中的SEQ ID NO:1显示了所确定的10966bp碱基序列。
此外,完整序列如图9所示(无碱基编号)。
基于所得的碱基序列,该10966bp基因被发现是编码所获得的 naat-A和naat-B的大麦基因组的片段。
其位次为naat-B、naat-A。
图10中显示了通过cDNA比较确定的naat-A和naat-B的5’上游、 外显子、内含子和3’下游。
在图10中,大写字母显示了在cDNA上转 录的外显子部分,小写字母显示了其余的部分。
外显子部分的碱基编 号见下。
图11是所得基因组片段的示意图。
外显子部分以阴影部分表示。
两个基因均包含6个内含子和7个外显子。
此外,内含子的插入位置 对于各基因是同源的。
图12显示了内含子在cDNA中的位置和内含子 的大小。
由cDNA推定的naat-A和naat-B的氨基酸序列分别如图13和14 所示。
按照所述35S转化的禾本科植物的转化方法来进行禾本科植物的 转化,其中将所得的大麦基因组naat导入。
然后,对导入所得基因组naat的禾本科植物的耐缺铁性进行检查。
在所得的再生体(T1)中,使用了39个植株和15个其中仅导入载体 的对照,以与35S转化的植物相似的方法进行检查。
从移植后第5周 起,每周或隔周测量植物的高度。
每4-5周将它们两次移植至其中土壤 尺寸渐增的罐中。
到移植至碱性土后第2周,经转化的具有基因组naat的禾本科植 物的叶子变黄,但在第4-5周,新叶子变成暗绿色并开始恢复,然后他 们开始旺盛生长。
与此相比,其中仅导入载体的对照组在很长的时间 内带有黄叶,从约第8周,新叶开始变绿。
图15是显示移植至碱性土后第10周的禾本科植物的生长状态的 照片。
图15中的对照显示的是其中仅导入了载体的对照禾本科植物。
右边的禾本科植物是用基因组naat转化的禾本科植物。
图16显示移植至碱性土后的禾本科植物的高度变化过程。
在图 16中,Y轴显示植物的高度(cm),X轴显示其移植至碱性土后的天 数。
在图16中,左边的禾本科植物是用基因组naat转化的禾本科植物, 右边的禾本科植物是其中仅导入了载体的对照禾本科植物。
基于以上描述,发现基因组naat的导入使得禾本科植物具有附加的 耐缺铁性。
实施例 使用以下实施例对本发明进行详细地描述,但本发明并不限于这 些实施例。
实施例I:禾本科植物的转化方法,其中存在具有CaMV35S启动子 的过表达的Naat。
图2所示的双元载体是通过使用XbaI和SacI位点将遗传naat的 cDNA整合到pIGl21Hm中来制备的。
将这些载体导入农杆菌中用于转 化。
禾本科植物的转化按照Hiei等的方法进行(Hiei等(1994)),并将 “Tsukinohikari”用作所述材料。
首先,带壳种子灭菌,在包含N6无机盐、 30g/L N6维生素、2mg/L蔗糖,2,4-D和2g/L脱乙酰吉兰糖胶的愈伤组 织诱导性培养基(pH 5.8)上的种子在25℃下在60μmol/m2s和16小时光 照/8小时避光条件下培养3周,从胚盘中诱导出愈伤组织。
在愈伤组织移植到新的培养基中在25℃下在光亮处培养3天后,用 农杆菌悬浮液培养基(pH5.8)(20g/L AA无机盐、氨基酸、B5维生素、2 mg/L蔗糖、0.2mg/L 2,4-D、10mg/L细胞分裂素和乙酰丁香酮)使愈伤 组织沉浸入农杆菌悬浮液中。
然后,在用纸巾使其变干后,其在共存 培养基(pH5.2)(30g/L N6无机盐和N6维生素、10g/L蔗糖、2mg/L葡萄 糖、10mg/L 2,4-D和2g/L乙酰丁香酮脱乙酰吉兰糖胶)中在暗处于28℃ 感染3天。
然后,通过用含500mg/L Claforan的无菌洗涤溶液漂洗来去除农杆 菌,将愈伤组织放置到含50mg/L潮霉素(pH5.8)的选择性培养基中(30 g/L N6无机盐和N6维生素、2mg/L蔗糖、2g/L 2,4-D、500mg/L脱乙酰 吉兰糖胶、50mg/L Claforan和潮霉素),并在25℃下在光亮处培养3周。
培养后,将其转移到再分化培养基(pH5.8)中(30g/L MS无机盐和 MS维生素、30g/L蔗糖、2g/L山梨糖醇、1mg/L水解酪蛋白氨基酸、2 mg/L NAA、500mg/L BAP、50mg/L Claforan、4g/L潮霉素和脱乙酰 吉兰糖胶),将在3-5周内被再分化的再生体(T1植物)转移至检查培养 基。
检查培养基(pH5.8)包含30g/L MS无机盐和MS维生素、50mg/L 蔗糖、8g/L潮霉素和琼脂。
将生长至充满培养皿的植物定植(establish)4-5天,转移至混有 1∶1比例的合成培养土(BONSOL 1,Sumitomo Chemical Co.,Ltd.)和蛭 石的土壤中,获取种子。
从而获得34株经转化的禾本科植物。
实施例2:使用Southern杂交方法检测所导入的基因 研磨在实施例1中获得的T1植物的叶子,通过改进的C-TAB方法提 取基因组。
用Hind III处理所提取的基因组,通过使用0.8%琼脂糖凝胶 电泳来进行分离。
将这些印迹到尼龙膜上。
使用在探针上的naat内部序 列产生的引物,以及通过PCR用32P标记的探针,进行杂交。
然后使用 BAS 2000(Fuji Photo Film Co.,Ltd.)检测条带。
Southern杂交方法的结果如图3所示。
在图3中,WT显示野生型禾 本科植物,对照显示其中仅导入载体的对照禾本科植物。
1-5、1-6、1-7、 8-1和15-2是其中具有35S启动子的naat-A过表达的禾木科植物的情况。
基于图3所示的结果,发现在35S转化的禾本科植物中,至少5个naat 拷贝和至少2个naat拷贝被分别引入到8-1和15-2中。
实施例3:使用碱性土检查耐缺铁性 使用包括以下组合物的古壳层土(fossil shell soil)作为样品土。
水含量                        0.48% 总磷酸盐                      0.12% 总钾                          0.12% 总硅酸盐                      22.79% 总石灰                        37.82% 总镁                          0.91% 总锰                          0.018% 总硼                          0.003% 碱                            38.80% 盐酸不溶性物质                28.88% 氧化铁                        0.99% 氧化铝                        5.59% 锌                        0.002% 所述土壤中的可溶性铁含量是2.2ppm,pH是8.78,电阻是0.03 mΩ。
如下进行对35S转化的植物的检查,首先,从该转化的植物的再 生体(T1)获得的种子播种在含50mg/L的MS固体培养基上并进行 筛选,在它们定植后,使用生长到20-25cm的幼苗植物(T2)。
对27个品种的34株植物中的16个进行耐缺铁性检查。
检查方法 如下:将纸巾和滤纸剪成圆形,并放置到塑料黑罐(0.5L)的底部, 用碱性土添满。
将植物转移到罐中,然后从罐底部放入位于罐底2-3cm 处的水培溶液(Kasugai溶液:7×10-4M K2PO4,1×10-4M KCl,1× 10-4M KH2PO4,2×10-3M Ca(NO3)2,5×10-4M MgSO4,1×10-5M H3BO3, 5×10-7M MnSO4,5×10-7M ZnSO4,2×10-4M CuSO4,1×10-8M (NH4)3MoO24,1.5×10-4M Fe-EDTA)中,在温室中生长,白天30℃, 夜晚25℃。
将碱性土在3-4周后增加至1L,在8-9周后增加至2L并转 移。
从移植后第2周,每周或隔周测量植物高度。
对在+Fe(铁存在)或-Fe(缺铁)水培溶液中生长的经转化的禾 本科植物(35S-naat禾本科植物)的NAAT比活的测量如下进行。
发 芽后3周的幼苗植物(T2)在+Fe和-Fe水培溶液中生长两周,测量各 植物根部的NAAT活性。
结果如图4所示。
在图4中,透明部分显示 了+Fe的情况,阴影部分显示了-Fe的情况。
WT显示了野生型禾本科 植物的情况,1-5、1-6和1-7显示了转化子的情况。
对于+Fe和-Fe两种情况,经转化的禾本科植物比非转化的野生型 (WT)禾本科植物具有较高的比活,在-Fe条件下其比活甚至更高(参 见图4)。
实施例4:使用碱性土检查耐缺铁性 将35S-naat-A转化的禾本科植物转移至碱性土并观察其生长情 况。
35S-naat-A转化的禾本科植物叶子变黄,直至移植后第二周,然 而,在第4-5周,新叶子变成暗绿色并开始恢复。
因此发现naat的导 入使禾本科植物具有耐缺铁性。
图5是显示移植至所述土壤8周后的禾本科植物的生长状态的照 片。
在图5中,对照显示了其中仅导入载体的对照禾本科植物,右边 的禾本科植物是经转化的禾本科植物。
图6是显示移植至碱性土后的禾本科植物的高度变化过程的图。
在图6中,Y轴显示植物的高度(cm),X轴显示其移植至碱性土后 的天数。
黑点显示转化子15-2,黑正方形显示转化子8-1,白点显示其 中仅导入载体的对照禾本科植物。
发现通过导入基因naat,可给禾本科植物添加耐缺铁性(参见图5 和6)。
实施例5:分离naat-A和B基因组克隆 按照“Cloning and Sequence”(Nosonbunka)进行筛选。
将从Srtratagene Corp.购买的λFIXII文库用作文库。
其是使用从大 麦(Horudeum vulgare L.var.Igri)提取的基因组DNA制备的。
基因组 DNA用限制性酶Sau3AI部分切割并导入λFIXII载体的XhoI位点。
文库 的插入片段大小是9-23kb。
(1)大肠杆菌(XL1-BLUE MRA(P2))在NZCYM液体培养基(10g NZ胺、5g NaCl、1g水解酪蛋白氨基酸、5g细菌用酵母抽提物、2g MgSO47H2O和约6mL 1N NaOH用1L蒸馏水(pH 7.5)稀释并用高压 灭菌)中培养过夜,然后离心,然后悬浮在20mL 10mM MgSO4溶液中。
(2)100mL的该大肠杆菌悬浮液和100mL的噬菌体稀释液(其量在 筛选平板(9cm×13cm)上产生25,000个噬斑进行混合,37℃放置20分钟, 然后与8mL的50℃0.7%上层琼脂(每100mL加入0.7g琼脂糖)混合,并 播种到筛选板上(9cm×13cm)。
板放置在37℃,然后培养直至噬斑大 小达到0.5mm。
(3)将尼龙膜HYBOND-N(Amersham Corp.)剪成板的大小,然后放 置到上层琼脂糖的上部30秒。
将其放到用变性液(0.5M NaOH、1.5M NaCl)浸过的滤纸上,并使表面与噬斑的上面接触。
将另一膜放置到上 层琼脂上,放置1分钟。
类似地,将其放到用变性液浸过的滤纸上。
在 放置5分钟后,将第二个膜移至用中和液(0.5M Tris-HCl,pH 8.0,1.5M NaCl)浸过的滤纸上。
在放置5分钟后,用2xSSPE(0.02M NaH2PO4 pH 7.4、0.3M NaCl、2mM EDTA)充分洗涤两次,然后干燥。
(4)为了使用提前分离的naat-A的全长cDNA作为探针,将位于质粒 载体pYH23的HindIII位点和NotI位点上的那些切下并纯化。
使用随机引 物DNA标记试剂盒VER.2(Takara Shuzo CO.,Ltd))用[α-32P]dATP对其 进行标记。
用预热至65℃的30mL杂交缓冲液(6x SSPE、5x Denhart溶液、 0.1%SDS、100mg/mL已变鲑精DNA)在65℃进行预杂交1小时,然后 更换为杂交缓冲液(25mL)。
将上述探针加入该溶液中,在65℃杂交12小时。
膜用预热至65℃ 的清洗液(5x SSPE)清洗两次,共10分钟,用65℃的高度严格清洗液(2X SSPE、0.1%SDS)清洗一次。
膜用莎伦包装膜包裹,过夜显影至成像板 (Fuji Photo Film Co.,Ltd.),用影像分析仪(Fuji Photo Film Co.,Ltd.)获得 结果。
使用的试剂为20X SSPE(0.2M NaH2PO4 pH 7.4、3M NaCl和 20mM EDTA)、50x denhart溶液、5g FICOLL 400、5g聚乙烯吡咯烷酮 (MW 360,000)和5g小牛血清白蛋白,其溶解在500mL蒸馏水中,用0.45 mm滤器过滤。
(5)将在两种膜上均出现噬斑的情况确定为阳性,将与所述位置相 符的噬斑从培养皿中切下。
将切下的噬斑放入SM溶液(50mM Tris-HClpH7.5、0.1M NaCl、7mM MgSO4和0.01%明胶),并在4℃下保存。
然后, 使用该噬菌体溶液以相似的方法进行第二和第三次筛选。
最后,得到5 个噬菌体。
分离上述获得的5个噬菌体中的每一个的DNA,并进行限制性酶 作图。
发现对于所有情况,相同的片段增加。
即,发现所得的5个噬 菌体来自基因组的相同部分。
此外,其被认为含有用于探针的naat。
因 此,测定其中之一的碱基序列,如图7所示。
在图7中,E表示EcoRI, H表示HindIII,B表示BamHI,N表示NotI。
在两个位置处的NotI位 点是位于λFIXII臂上的NotI。
实施例6:亚克隆化和碱基序列的确定 (1)图7所示的噬菌体DNA被插入到质粒载体pBIGRZ1的NotI 位点,其中可插入10kb或更大的片段,可使用农杆菌进行禾本科植物 的转化。
将第1个NotI位点至图7所示噬菌体DNA 11.0kb处的NotI 位点的11.0kbp片段切下并插入质粒载体pBIGRZ1的NotI位点(参见 图8)。
在图8中,NPTII是卡那霉素抗性基因,HPT是潮霉素抗性基 因,GUS是具有内含子的β葡糖醛酸糖苷酶基因,LacZ是β半乳糖苷酶 基因,35P是35S启动子,NP是NOS启动子,NT是NOS终止子, MCS是多克隆位点,Riori是Ri质粒复制起点。
换言之,确定了该11.0kb片段的碱基序列。
对于其余禾本科植物 的转化,使用由此产生的构建体。
(2)pBIGRZ1稳定地维持在大肠杆菌(XL1-BLUE)中。
对含有 该构建体的大肠杆菌进行培养,使用质粒调节剂PI-50α(Kurashiki Boseki Co.,Ltd.)从中提取质粒。
(3)将图7所示至多11.0kb的片段分成4部分,即A-D,将它 们导入质粒载体pBluescript SK(-)的EcoRI位点(B、C)或NotI和 EcoRI位点(A、D)。
(4)对于片段A-D,使用基于质粒上的序列的引物(M13正向引 物,M13反向引物)从片段的两端确定碱基序列。
使用Shimadzu,Ltd. 的DNA测序仪DSQ-2000L来确定DNA碱基序列。
(5)对各片段确定对碱基序列的上述部分进行进一步读码的引物 并制备该引物,制备用于证实已读序列的反向引物,依次确定碱基序 列。
最后,从5’和3’端双向确定所有片段的序列。
用于确定各片段碱 基序列的引物序列如下所示。
为应用于DSQ-2000L,用异硫氰酸荧光素FITC在5’端标记这些 引物。
片段A的引物 名称:序列F-A1F:FITC-5′-gct act agt agt att cct ggt gta g 名称:序列F-A1R:FITC-5′-gga gta cta cta gac tac acc agg a 名称:序列F-A2F:FITC-5′-aca tgc gca tgc atg aat tgc cg 名称:序列F-A2R:FITC-5′-caa ttc atg cat gcg cat gtg cc 片段B的引物 名称:序列F-B1F:FITC-5′-ggt caa gta tgc agt atg ttg gaa c 名称:序列F-B1R:FITC-5′-gtt cca aca tac tgc ata ctt gac c 名称:序列F-B2F:FITC-5′-cta gaa gcc tat gga tgt ttc ttt tgg 名称:序列F-B2R:FITC-5′-cca aaa gaa aca tcc ata ggc ttc tag 名称:序列F-B3F:FITC-5′-agt tct tat caa ttt ccg aga tga c 名称:序列F-B3R:FITC-5′-ata gtc atc tcg gaa att gat aag a 名称:序列F-B4F:FITC-5′-agt ggt cac cat gcg gac caa cac c 名称:序列F-B4R:FITC-5′-ggt gtt ggt ccg cat ggt gac cac t 片段C的引物 名称:序列F-C1F:FITC-5′-cac cgg cca gtt caa ctg cta cgc 名称:序列F-C1R:FITC-5′-gcg tag cag ttg aac tgg ccg gtg 名称:序列F-C2F:FITC-5′-ttt gga gga gat cca tga cga cat a 名称:序列F-C2R:FITC-5′-tat gtc gtc atg gat ctc ctc caa a 名称:序列F-C3F:FITC-5′-tct tct cat atg cta ctg tgg gga t 名称:序列F-C3R:FITC-5′-tga cat gca aca cag gga cat gag c 片段D的引物 名称:序列F-D1F:FITC-5′-cat gct gac gaa gag cga ggt cat a 名称:序列F-D1R:FITC-5′-ccc agg ata tga cct tag tgg ttg g (6)对于不能完全确定的序列部分,使用ABI PRISMTM 310基因 分析仪,新合成了以下引物,所述分析仪是PerkinElmer Japan,Inc.的自 动DNA测序仪。
片段B的引物 名称:序列B5F:5′-gaa tgg caa act ggg tcc gca tta c 名称:序列B5R:5′-gta atg cgg acc cag ttt gcc att c 名称:序列B6F:5′-ctg gtt gtt gtg gcc tgg acg aaa c 名称:序列B6R:5′-gtt tcg tcc agg cca caa caa cca 9 名称:序列B7F:5′-agc aca aac cct acc tat gtt agg c 名称:序列B7R:5′-gcc taa cat agg tag ggt ttg tgc t 片段C的引物 名称:序列C4F:5′-tgg aat ttc gcc cgg ggc aag gac 名称:序列C4R:5′-ccc tgt gac aag tgc tct gct acg 名称:序列C5F:5′-tct ggg atc tca gtg cat cca aca 名称:序列C5R:5′-gaa gca tat atc agt caa aca taa cc 此外,为确定片段A和B间以及片段B和C间的连接区,制备了 以下引物。
使用PerkinElmer Japan,Inc.的自动DNA测序仪ABI PRISMTM 310基因分析仪确定了在(1)中所制备的构建体的碱基序 列。
对于片段A和B间的边界区 名称:序列A-eF:5′-cac atc ctt tgc ctt gct gaa tat gg 名称:序列B-tR:5′-cag tag tac taa tta atc acc tta gta gc 对于片段B和C间的边界区 名称:序列B-eF:5′-caC gat caa cca aag aat gtc ctc c 名称:序列C-tR:5′-tac ttg tat atgcag ctc cag cac (7)已确定的10,966bp碱基序列在序列表中SEQ ID NO:1已显 示。
完整的序列参见图9(无碱基编号)。
基于所得的碱基序列,发现这10,966bp基因是迄今获得的编码 naat-A和naat-B的大麦基因组的片段。
次序是naat-B和naat-A。
图10中显示了通过与所示cDNA比较得以确定的naat-A和naat-B 的5’上游、外显子、内含子和3’下游。
在图10中,大写字母表示在cDNA 上转录的外显子,小写字母代表其余的部分。
外显子部分的碱基编号 如下。
naat-B 第1外显子579-1299(起始密码子6518) 第2外显子1483-1825 第3外显子1922-2140 第4外显子2244-2303 第5外显子2761-2916 第6外显子3263-3356 第7外显子3735-4033(终止密码子3868) naat-A 第1外显子6457-6897(起始密码子6518) 第2外显子7029-7371 第3外显子7479-7697 第4外显子7784-7843 第5外显子8285-8440 第6外显子8738-8831 第7外显子9414-9732(终止密码子9547) 示意图如图11所示。
阴影部分为外显子部分。
两个基因均是由6 个内含子和7个外显子形成的。
此外,内含子的插入位置是同源的。
图 12显示了在cDNA中插入内含子的位置和插入内含子的大小。
图13和14 显示了由cDNA推定的naat-A和naat-B的氨基酸序列。
实施例7:导入大麦基因组naat的禾本科植物的转化方法 除了以下(1)至(3)点之外,以与35S转化的禾本科植物相似的 方式实施上述实施例6中获得的大麦基因组naat导入禾本科植物的转化 方法。
(1)愈伤组织的诱导在28℃在暗处进行,愈伤组织诱导培养基包 含0.3g/L N6无机盐和N6维生素、30g/L水解酪蛋白氨基酸、2mg/L蔗 糖、2.8g/L 2,4-D、4g/L脯氨酸和脱乙酰吉兰糖胶(pH5.8)。
(2)其用农杆菌在25℃感染,共存培养基包含30g/L N6无机盐和 N6维生素、10g/L蔗糖、1g/L葡萄糖、2mg/L水解酪蛋白氨基酸、20mg/L 2,4-D、2g/L乙酰丁香酮和脱乙酰吉兰糖胶(pH5.2)。
该过程是通过滤 纸敷在上面而进行。
(3)选择时,使用选择培养基,第1周含10mg/L潮霉素,第2周 含30μg/L潮霉素,最后2周含50mg/L潮霉素,在28℃下在暗处培养。
使用包含1g/L N6无机盐和N6维生素、水解酪蛋白氨基酸、30g/L 蔗糖、2mg/L 2,4-D、250mg/L Claforan、10-50mg/L潮霉素和2g/L脱 乙酰吉兰糖胶(pH5.8)的选择培养基,使用包含30g/L MS无机盐和MS 维生素、30g/L蔗糖、30g/L山梨糖醇、2g/L水解酪蛋白氨基酸、1.1g/L MES、2mg/L NAA、1mg/L细胞分裂素、250mg/L CLAFORAN、50mg/L 潮霉素和4g/L脱乙酰吉兰糖胶(pH5.8)的再分化培养基,在28℃培养。
实施例8:检查具有所导入的基因组Naat的禾本科植物的耐缺铁性 以与35S转化的植物相似的方式,对所得再生体(T1)中具有所导 入的基因组Naat的禾本科植物的39个植株和15个仅导入载体的对照进 行检查,检查它们的耐缺铁性。
从移植后的第5周起,每周或隔周测量 植物的高度。
每4-5周将它们两次转移到土壤尺寸渐增的罐中。
到移植至碱性土后第2周,经转化具有基因组naat的禾本科植物 的叶子变黄,但在第4-5周,新叶子变成暗绿色并开始恢复,然后他们 开始旺盛生长。
与此相比,其中仅导入载体的对照组在很长的时间内 带有黄叶,从约第8周,新叶开始变绿。
基于这一事实,发现naat的 导入使禾本科植物具有耐缺铁性(参见图15和16)。
图15是显示移植至碱性土后第10周的禾本科植物的生长状态的 照片。
图15中的对照显示了其中仅导入了载体的对照禾本科植物。
右边 的禾本科植物是用基因组naat转化的禾本科植物。
图16显示移植至碱性土后的禾本科植物的高度变化过程。
在图 16中,Y轴显示植物的高度(cm),X轴显示其移植至碱性土后的天 数。
在图16中,左边的禾本科植物是用基因组naat转化了的禾本科植 物,右边的禾本科植物是其中仅导入了载体的对照禾本科植物。
基于这一事实,发现naat的导入使禾本科植物的耐缺铁性增强。
工业实用性 本发明提供了具有耐缺铁性的新禾本科植物,并提供了可在缺铁 栽培区生长的新禾本科植物。
此外,本发明提供了可通过向禾本科植物中导入编码麦根酸合成 途径中的酶的基因来获得的具有改善的铁吸收性的禾本科植物的新技 术。
                      序列表 <110>科学技术振兴事业团(Japan Science and Technology Corporation) <120>耐缺铁性稻类的构建(Construction of rice tolerant to iron deficiency) <130>SCT011604-09 <140>PCT/JP00/04425 <141>2000-07-04 <150>JP11-190318 <151>1999-07-05 <160>37 <170>PatentIn version 3.3 <210>1 <211>461 <212>PRT <213>Hordeum vulgare <220> <221> <223>NAAT-A <400>1 Met Val His Gln Ser Asn Gly His Gly Glu Ala Ala Ala Ala Ala Ala 1               5                   10                  15 Asn Gly Lys Ser Asn Gly His Ala Ala Ala Ala Asn Gly Lys Ser Asn              20                  25                  30 Gly His Ala Ala Ala Ala Ala Val Glu Trp Asn Phe Ala Arg Gly Lys          35                  40                  45 Asp Gly Ile Leu Ala Thr Thr Gly Ala Lys Asn Ser Ile Arg Ala Ile      50                  55                  60 Arg Tyr Lys Ile Ser Ala Ser Val Glu Glu Ser Gly Pro Arg Pro Val 65                  70                  75                  80 Leu Pro Leu Ala His Gly Asp Pro Ser Val Phe Pro Ala Phe Arg Thr                  85                  90                  95 Ala Val Glu Ala Glu Asp Ala Val Ala Ala Ala Leu Arg Thr Gly Gln             100                 105                 110 Phe Asn Cys Tyr Ala Ala Gly Val Gly Leu Pro Ala Ala Arg Ser Ala         115                 120                 125 Val Ala Glu His Leu Ser Gln Gly Val Pro Tyr Lys Leu Ser Ala Asp     130                 135                 140 Asp Val Phe Leu Thr Ala Gly Gly Thr Gln Ala Ile Glu Val Ile Ile 145                 150                 155                 160 Pro Val Leu Ala Gln Thr Ala Gly Ala Asn Ile Leu Leu Pro Arg Pro                 165                 170                 175 Gly Tyr Pro Asn Tyr Glu Ala Arg Ala Ala Phe Asn Lys Leu Glu Val             180                 185                 190 Arg His Phe Asp Leu Ile Pro Asp Lys Gly Trp Glu Ile Asp Ile Asp         195                 200                 205 Ser Leu Glu Ser Ile Ala Asp Lys Asn Thr Thr Ala Met Val Ile Ile     210                 215                 220 Asn Pro Asn Asn Pro Cys Gly Ser Val Tyr Ser Tyr Asp His Leu Ala 225                 230                 235                 240 Lys Val Ala Glu Val Ala Arg Lys Leu Gly Ile Leu Val Ile Ala Asp                 245                 250                 255 Glu Val Tyr Gly Lys Leu Val Leu Gly Ser Ala Pro Phe Ile Pro Met             260                 265                 270 Gly Val Phe Gly His Ile Ala Pro Val Leu Ser Ile Gly Ser Leu Ser         275                 280                 285 Lys Ser Trp Ile Val Pro Gly Trp Arg Leu Gly Trp Val Ala Val Tyr     290                 295                 300 Asp Pro Thr Lys Ile Leu Glu Lys Thr Lys Ile Ser Thr Ser Ile Thr 305                 310                 315                 320 Asn Tyr Leu Asn Val Ser Thr Asp Pro Ala Thr Phe Val Gln Glu Ala                 325                 330                 335 Leu Pro Lys Ile Leu Glu Asn Thr Lys Ala Asp Phe Phe Lys Arg Ile             340                 345                 350 Ile Gly Leu Leu Lys Glu Ser Ser Glu Ile Cys Tyr Arg Glu Ile Lys         355                 360                 365 Glu Asn Lys Tyr Ile Thr Cys Pro His Lys Pro Glu Gly Ser Met Phe     370                 375                 380 Val Met Val Lys Leu Asn Leu His Leu Leu Glu Glu Ile His Asp Asp 385                 390                 395                 400 Ile Asp Phe Cys Cys Lys Leu Ala Lys Glu Glu Ser Val Ile Leu Cys                 405                 410                 415 Pro Gly Ser Val Leu Gly Met Glu Asn Trp Val Arg Ile Thr Phe Ala             420                 425                 430 Cys Val Pro Ser Ser Leu Gln Asp Gly Leu Glu Arg Val Lys Ser Phe         435                 440                 445 Cys Gln Arg Asn Lys Lys Lys Asn Ser Ile Asn Gly Cys     450                 455                 460 <210>2 <211>551 <212>PRT <213>Hordeum vulgare <220> <221> <223>NAAT-B <400>2 Met Ala Thr Val Arg Gln Ser Asp Gly Val Ala Ala Asn Gly Leu Ala 1               5                   10                  15 Val Ala Ala Ala Ala Asn Gly Lys Ser Asn Gly His Gly Val Ala Ala             20                  25                  30 Ala Val Asn Gly Lys Ser Asn Gly His Gly Val Asp Ala Asp Ala Asn         35                  40                  45 Gly Lys Ser Asn Gly His Gly Val Ala Ala Asp Ala Asn Gly Lys Ser     50                  55                  60 Asn Gly His Ala Glu Ala Thr Ala Asn Gly His Gly Glu Ala Thr Ala 65                  70                  75                  80 Asn Gly Lys Thr Asn Gly His Arg Glu Ser Asn Gly His Ala Glu Ala                 85                  90                  95 Ala Asp Ala Asn Gly Glu Ser Asn Glu His Ala Glu Asp Ser Ala Ala             100                 105                 110 Asn Gly Glu Ser Asn Gly His Ala Ala Ala Ala Ala Glu Glu Glu Glu         115                 120                 125 Ala Val Glu Trp Asn Phe Ala Gly Ala Lys Asp Gly Val Leu Ala Ala     130                 135                 140 Thr Gly Ala Asn Met Ser Ile Arg Ala Ile Arg Tyr Lys Ile Ser Ala 145                 150                 155                 160 Ser Val Gln Glu Lys Gly Pro Arg Pro Val Leu Pro Leu Ala His Gly                 165                 170                 175 Asp Pro Ser Val Phe Pro Ala Phe Arg Thr Ala Val Glu Ala Glu Asp             180                 185                 190 Ala Val Ala Ala Ala Val Arg Thr Gly Gln Phe Asn Cys Tyr Pro Ala         195                 200                 205 Gly Val Gly Leu Pro Ala Ala Arg Ser Ala Val Ala Glu His Leu Ser     210                 215                 220 Gln Gly Val Pro Tyr Met Leu Ser Ala Asp Asp Val Phe Leu Thr Ala 225                 230                 235                 240 Gly Gly Thr Gln Ala Ile Glu Val Ile Ile Pro Val Leu Ala Gln Thr                 245                 250                 255 Ala Gly Ala Asn Ile Leu Leu Pro Arg Pro Gly Tyr Pro Asn Tyr Glu             260                 265                 270 Ala Arg Ala Ala Phe Asn Arg Leu Glu Val Arg His Phe Asp Leu Ile         275                 280                 285 Pro Asp Lys Gly Trp Glu Ile Asp Ile Asp Ser Leu Glu Ser Ile Ala     290                 295                 300 Asp Lys Asn Thr Thr Ala Met Val Ile Ile Asn Pro Asn Asn Pro Cys 305                 310                 315                 320 Gly Ser Val Tyr Ser Tyr Asp His Leu Ser Lys Val Ala Glu Val Ala                 325                 330                 335 Lys Arg Leu Gly Ile Leu Val Ile Ala Asp Glu Val Tyr Gly Lys Leu             340                 345                 350 Val Leu Gly Ser Ala Pro Phe Ile Pro Met Gly Val Phe Gly His Ile         355                 360                 365 Thr Pro Val Leu Ser Ile Gly Ser Leu Ser Lys Ser Trp Ile Val Pro     370                 375                 380 Gly Trp Arg Leu Gly Trp Val Ala Val Tyr Asp Pro Arg Lys Ile Leu 385                 390                 395                 400 Gln Glu Thr Lys Ile Ser Thr Ser Ile Thr Asn Tyr Leu Asn Val Ser                 405                 410                 415 Thr Asp Pro Ala Thr Phe Ile Gln Ala Ala Leu Pro Gln Ile Leu Glu             420                 425                 430 Asn Thr Lys Glu Asp Phe Phe Lys Ala Ile Ile Gly Leu Leu Lys Glu         435                 440                 445 Ser Ser Glu Ile Cys Tyr Lys Gln Ile Lys Glu Asn Lys Tyr Ile Thr     450                 455                 460 Cys Pro His Lys Pro Glu Gly Ser Met Phe Val Met Val Lys Leu Asn 465                 470                 475                 480 Leu His Leu Leu Glu Glu Ile Asp Asp Asp Ile Asp Phe Cys Cys Lys                 485                 490                 495 Leu Ala Lys Glu Glu Ser Val Ile Leu Cys Pro Gly Ser Val Leu Gly             500                 505                 510 Met Ala Asn Trp Val Arg Ile Thr Phe Ala Cys Val Pro Ser Ser Leu         515                 520                 525 Gln Asp Gly Leu Gly Arg Ile Lys Ser Phe Cys Gln Arg Asn Lys Lys     530                 535                 540 Arg Asn Ser Ser Asp Asp Cys 545                 550 <210>3 <211>10966 <212>DNA <213>Hordeum vulgare <220> <221>外显子 <222>(578)..(1299) <223>NAAT-B的第1外显子 <220> <221>外显子 <222>(1483)..(1825) <223>NAAT-B的第2外显子 <220> <221>外显子 <222>(1922)..(2140) <223>NAAT-B的第3外显子 <220> <221>外显子 <222>(2244)..(2303) <223>NAAT-B的第4外显子 <220> <221>外显子 <222>(2761)..(2916) <223>NAAT-B的第5外显子 <220> <221>外显子 <222>(3263)..(3356) <223>NAAT-B的第6外显子 <220> <221>外显子 <222>(3735)..(4033) <223>NAAT-B的第7外显子 <220> <221>外显子 <222>(6457)..(6897) <223>NAAT-A的第1外显子 <220> <221>外显子 <222>(7029)..(7371) <223>NAAT-A的第2外显子 <220> <221>外显子 <222>(7479)..(7697) <223>NAAT-A的第3外显子 <220> <221>外显子 <222>(7784)..(7843) <223>NAAT-A的第4外显子 <220> <221>外显子 <222>(8285)..(8440) <223>NAAT-A的第5外显子 <220> <221>外显子 <222>(8738)..(8831) <223>NAAT-A的第6外显子 <220> <221>外显子 <222>(9414)..(9732) <223>NAAT-A的第7外显子 <400>3 ctcgatccca ttgcaatggt atgattagct atcaaacgaa agaaagagat ggcatgtgcc    60 ctgtgtgtca tccctcactg gcttggcgaa tggcgatacc gagttaggta gagtgttttt   120 ttagcatgat gtctgccggc actgccaaga aaactgcgtg cagcggactg caggagagtt   180 gagcgatgca tgctttgtga tgagcggagc tgagtgggtg tcactaactg aacccaatca   240 gcattgggtg agtcgagtcg agaagcatca tgcttcctgc gtcccgatcc gcttatcttt   300 ttctcccaaa ttattaaaga gggatagatg atggtgtgct gggttgggta gagtacgtgc   360 atagaaccaa agcgaggcgc cgaaaatatg ccggggataa tggtggcagg ccgcaacggc   420 cacgcccgtc agctggcagc ggcgtgccag agcgtgccag agcgtgcgcg cgtgcgtgct   480 tcttgctgcc ggccccggtt cgtgtgcggt cagagcaacg gctatatagg accgtcaatc   540 accgctactc aatccgtccc caactcgttt cctattaccg ctactagtag tattcctggt   600 gtagtctagt agtactcctc ctcctccttc tcctcctacc cgtttcctc atg gcc acc   658                                                     Met Ala Thr                                                     1 gta cgc cag agc gac gga gtc gcc gcg aac ggc ctt gcc gtg gcc gca     706 Val Arg Gln Ser Asp Gly Val Ala Ala Asn Gly Leu Ala Val Ala Ala     5                   10                  15 gcc gcg aac ggc aag agc aac ggc cat ggc gtg gct gcc gcc gtg aac     754 Ala Ala Asn Gly Lys Ser Asn Gly His Gly Val Ala Ala Ala Val Asn 20                  25                  30                  35 ggc aag agc aac ggc cat ggc gtg gat gcc gac gcg aac ggc aag agc     802 Gly Lys Ser Asn Gly His Gly Val Asp Ala Asp Ala Asn Gly Lys Ser                 40                  45                  50 aac ggc cat ggc gtg gct gcc gac gcg aac ggc aag agc aac ggc cat     850 Asn Gly His Gly Val Ala Ala Asp Ala Asn Gly Lys Ser Asn Gly His             55                  60                  65 gcc gag gcc act gcg aac ggc cac ggc gag gcc act gcg aac ggc aag     898 Ala Glu Ala Thr Ala Asn Gly His Gly Glu Ala Thr Ala Asn Gly Lys         70                  75                  80 acc aac ggc cac cgc gag agc aac ggc cat gct gag gcc gcc gac gcg     946 Thr Asn Gly His Arg Glu Ser Asn Gly His Ala Glu Ala Ala Asp Ala     85                  90                  95 aac ggc gag agc aac gag cat gcc gag gac tcc gcg gcg aac ggc gag     994 Asn Gly Glu Ser Asn Glu His Ala Glu Asp Ser Ala Ala Asn Gly Glu 100                 105                 110                 115 agc aac ggg cat gcg gcg gcg gcg gca gag gag gag gag gcg gtg gag    1042 Ser Asn Gly His Ala Ala Ala Ala Ala Glu Glu Glu Glu Ala Val Glu                 120                 125                 130 tgg aat ttc gcg ggt gcc aag gac ggc gtg ctg gcg gcg acg ggg gcg    1090 Trp Asn Phe Ala Gly Ala Lys Asp Gly Val Leu Ala Ala Thr Gly Ala             135                 140                 145 aac atg agc atc cgg gcg ata cgg tac aag atc agc gcg agc gtg cag    1138 Asn Met Ser Ile Arg Ala Ile Arg Tyr Lys Ile Ser Ala Ser Val Gln         150                 155                 160 gag aag ggg ccg cgg ccc gtg ctg ccg ctg gcc cac ggg gac ccg tcc    1186 Glu Lys Gly Pro Arg Pro Val Leu Pro Leu Ala His Gly Asp Pro Ser     165                 170                 175 gtg ttc ccg gcc ttc cgc acg gcc gtc gag gcc gag gac gcc gtc gcc     1234 Val Phe Pro Ala Phe Arg Thr Ala Val Glu Ala Glu Asp Ala Val Ala 180                 185                 190                 195 gcc gcg ctg cgc acc ggc cag ttc aac tgc tac ccc gcc ggc gtc ggc     1282 Ala Ala Leu Arg Thr Gly Gln Phe Asn Cys Tyr Pro Ala Gly Val Gly                 200                 205                 210 ctc ccc gcc gca cga ag gtaacaacaa caacaacaca agaacaattt             1329 Leu Pro Ala Ala Arg Ser             215 ccttttcgcg tgtcgtgtcg cgcggcaatc catgcatgcg catgtgccgc tttcacgtgt   1389 ccgtccgtcc gtccaccgtt ccttcctcct ccctacgccc atgagaaatc tgaccttctc   1449 ccaccttata ccaaacaaaa caaaaaaaca cag c gcc gtg gca gag cac ctg      1501                                        Ala Val Ala Glu His Leu                                                220 tcg cag ggc gtg ccg tac atg cta tcg gcc gac gac gtc ttc ctc acc     1549 Ser Gln Gly Val Pro Tyr Met Leu Ser Ala Asp Asp Val Phe Leu Thr     225                 230                 235 gcc ggc ggg acc cag gcg atc gag gtc ata atc ccg gtg ctg gcc cag     1597 Ala Gly Gly Thr Gln Ala Ile Glu Val Ile Ile Pro Val Leu Ala Gln 240                 245                 250                 255 acc gcc ggc gcc aac att ctg ctc ccc agg cca ggc tac cca aac tac     1645 Thr Ala Gly Ala Asn Ile Leu Leu Pro Arg Pro Gly Tyr Pro Asn Tyr                 260                 265                 270 gag gcg cgc gcc gcg ttc aac agg ctg gag gtc cgg cat ttc gac ctc     1693 Glu Ala Arg Ala Ala Phe Asn Arg Leu Glu Val Arg His Phe Asp Leu             275                 280                 285 atc ccc gac aag ggg tgg gag atc gac atc gac tcg ctg gaa tcc atc     1741 Ile Pro Asp Lys Gly Trp Glu Ile Asp Ile Asp Ser Leu Glu Ser Ile         290                 295                 300 gcc gac aag aac acc acc gcc atg gtc atc ata aac ccc aac aac ccg     1789 Ala Asp Lys Asn Thr Thr Ala Met Val Ile Ile Asn Pro Asn Asn Pro     305                 310                 315 tgc ggc agc gtt tac tcc tac gac cat ctg tcc aag gtttcacatc         1835 Cys Gly Ser Val Tyr Ser Tyr Asp His Leu Ser Lys 320                 325                 330 ctttgccttg ctgaatatgg attcagttca gtgcacctgc tgaattcttt ttgccaatcg  1895 catactgact gatgttgctc aattag gtc gcg gag gtg gcg aaa agg ctc gga   1948                              Val Ala Glu Val Ala Lys Arg Leu Gly                                          335                 340 ata ttg gtg att gct gac gag gta tac ggc aag ctg gtt ctg ggc agc    1996 Ile Leu Val Ile Ala Asp Glu Val Tyr Gly Lys Leu Val Leu Gly Ser                 345                 350                 355 gcc ccg ttc atc cca atg gga gtg ttt ggg cac atc acc cct gtg ctg    2044 Ala Pro Phe Ile Pro Met Gly Val Phe Gly His Ile Thr Pro Val Leu             360                 365                 370 tcc ata ggg tct ctg tcc aag tca tgg ata gtg cct gga tgg cgg ctt    2092 Ser Ile Gly Ser Leu Ser Lys Ser Trp Ile Val Pro Gly Trp Arg Leu         375                 380                 385 gga tgg gta gcg gtg tac gac ccc aga aag atc tta cag gaa act aag    2140 Gly Trp Val Ala Val Tyr Asp Pro Arg Lys Ile Leu Gln Glu Thr Lys     390                 395                 400 gtacttaaat ctctatatca ttcttttcaa atgctactaa ggtgattaat tagtactact  2200 gtacaatata tttgctaaat ttgtactgac atttttgtgg tag atc tct aca tca    2255                                                 Ile Ser Thr Ser                                                 405 att acg aat tac ctc aat gtc tcg aca gac cca gca acc ttc att cag    2303 Ile Thr Asn Tyr Leu Asn Val Ser Thr Asp Pro Ala Thr Phe Ile Gln     410                 415                 420 gtcagtcttt ggtatttacc tcgtttcaag aaataaagtc tttggtattt actcctcctt  2363 gtcctatttt gctccggtcc ctatgttgta ggcagcccac gtgcatgtca agtgaccgtt  2423 ttttcacatt aagtttgaaa gtcaaagtca gacacataca cttgtagtta ttttaccttt  2483 gtttgctttg atccgataaa ataaaaaaat acaaaaactg aacctactgt tgaatataac  2543 cactgttctt acaagatata catgattgca ctatgggcat gccatattct tttgggtcaa  2603 gtatgcagta tgttggaacc tcttttagaa aatagataca ttgtactatg agtataccat  2663 tttattaaga atttcatatt ttgatatcct tgatggtatt gttctcttgt gattcacacg  2723 atttacttgt ggttttttgt actatcaaat tgttcag gca gct ctt cct cag att   2778                                          Ala Ala Leu Pro Gln Ile                                          425                 430 ctt gag aac aca aag gaa gat ttc ttt aag gcg att att ggt ctg cta    2826 Leu Glu Asn Thr Lys Glu Asp Phe Phe Lys Ala Ile Ile Gly Leu Leu                 435                 440                 445 aag gaa tca tca gag ata tgc tac aaa caa ata aag gaa aac aaa tac    2874 Lys Glu Ser Ser Glu Ile Cys Tyr Lys Gln Ile Lys Glu Asn Lys Tyr             450                 455                 460 att aca tgt cct cac aag cca gaa gga tca atg ttt gtc atg            2916 Ile Thr Cys Pro His Lys Pro Glu Gly Ser Met Phe Val Met         465                 470                 475 gtaagcctat tttgtgaagt aaaaaaatct tagggagtgt cagtaatcat aaacttattt  2976 atataggatt aatctgggac cgaaatgcat ccaacataat tacttcaaat tcaaattcaa  3036 attacattct tccgtacata tttttgaaga tgcatgtatt ttaagaataa tgacgagagc  3096 taaagttatg ctacgactaa tcatctggat atcctttgtc catctttttg ttatactgtg  3156 gaatgttaat ggtcaaatca tattacacaa atatccatgc tagtttctag aaagattgat  3216 tatttttctg taaccatgaa ctccgtatta acttccatgt aaacag gtg aaa ctg     3271                                                    Val Lys Leu aac tta cat ctt ttg gag gaa ata gac gat gac att gat ttt tgc tgc    3319 Asn Leu His Leu Leu Glu Glu Ile Asp Asp Asp Ile Asp Phe Cys Cys 480                 485                 490                 495 aag ctc gca aaa gaa gaa tca gta atc tta tgc cca g gtaggaatcc       3366 Lys Leu Ala Lys Glu Glu Ser Val Ile Leu Cys Pro                 500                 505 attgttgatt tttgactgta tatgaagttc ttatcaattt ccgagatgac tatacatata  3426 aatgattacc atattatggt cagaaattgt ataacagtgt tagaatattc tgtgaagact  3486 tttttaacac aatattctgt gaagactaga tatcatgtac ttctccttgt tttcttgacc  3546 tgatgtcctt cgtcacatgt tgtgctcctc acaaaaaaat agcaagcaca tgtttcaaat  3606 aattgttaat aatataattt agcctttaat ttatatggtt ctattttgag atatttttgt  3666 agtccaactt atatatttgt gactattctc aaaaacaaaa cttatatatg tgtgcctctc  3726 aaatgtag gg agt gtt ctt gga atg gca aac tgg gtc cgc att act ttt    3775          Gly Ser Val Leu Gly Met Ala Asn Trp Val Arg Ile Thr Phe                  510                 515                 520 gct tgt gtt cca tct tct ctt caa gat ggt ctc gga agg atc aaa tca    3823 Ala Cys Val Pro Ser Ser Leu Gln Asp Gly Leu Gly Arg Ile Lys Ser             525                 530                 535 ttc tgt caa agg aac aag aag aga aat tcg agc gat gat tgc tag        3868 Phe Cys Gln Arg Asn Lys Lys Arg Asn Ser Ser Asp Asp Cys         540                 545                 550 ttgtatatct gactgaagct gtaaatcatt cccagtatcc ccatctatat ctttcaataa  3928 aatggaactt ttagttctct atgaatagaa gtcaacatct ccttgaatat gttctggttg  3988 ttgtggcctg gacgaaacat agtgaatgtt atgttagtga agttacattg gcgtcgaaga  4048 tctttgaagt tttttttttt ttttgggggg gggggggggg ggtgctttga tattactctt  4108 aagtacacgt tctctcaagt tatgtcaaag cactttgtaa acaattgtag atttggtatc  4168 atgatatgga ttaaactagt cagatacttg gtaagcacaa accctaccta tgttaggctc  4228 actaaggtgg cgtttggttc gagagagagg aaggatcagt tgatgatatc cccaatcatc  4288 gaagtaaatc atgtgttgtt gctaccactt ttctacaatc ctagtagctg catgcgttga  4348 gctactgatc aacaccactg cacaaccata ttctctgtgc aaaatcggca cccaaagatt  4408 acatctcaca gctgaagcaa ccaccaaatt tgaagagagg aaccctcaca aagacctttg  4468 agtgcccccc acaatgcatg gttaggccgc cgtcgcaggc cggagtggtc accatgcgga  4528 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ggaagcttct agaagcctat gaatgtttct tttggacatg tattatttgt gttttttctt  5368 tttcaaattg cacaatcttt tttcaaattc atgatttttg tgaaacttgt gattttttga  5428 atccgtgatt ttttttccta aatccgtgtt ttgaaaaaaa ctgtggactt ttccgaaatt  5488 aatgaacatt tgtttgcaag atcgatgatc cttttcaaat gagcgatttt tttctaaaat  5548 atccacatat ttttcatatt cataagcttt ccttttaatc gtgaactatc ttagcatttg  5608 gtgaactttt attaattttc tttataaaat gatttttttt caaaagccaa cggttaacgg  5668 ttgaccgctg aaccacaacc acaaaccggg gaaaccattg actcgctgaa cagggcaggg  5728 ctttcatatg attgggtggt ctaataccag cgcccctgac tactaaacga aggaattgca  5788 aattttacca accactacta tggtaaaaaa tgaatatcac gataaaaaag gggaaaaaaa  5848 actataccct gaaaatccct ctgtttctaa atatttgttg ttggggagaa ctaatctgaa  5908 agaactaatc tagttctccg caataacaaa tattatgatt cggggggagt ataactatta  5968 cacgatcaac caaagaatgt cctccaagaa aaacccaaag aaagtgctag agttttgttt  6028 tcaaggaccg aaagatagag atagcattct gaattaggtc catctttttc ccaaggattg  6088 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Ser Asn Gly His Ala Ala Ala Ala Ala Val Glu Trp Asn Phe Ala Arg             585                 590                 595 ggc aag gac ggc atc ctg gcg acg acg ggg gcg aag aac agc atc cgg    6703 Gly Lys Asp Gly Ile Leu Ala Thr Thr Gly Ala Lys Asn Ser Ile Arg         600                 605                 610 gcg ata cgg tac aag atc agc gcg agc gtg gag gag agc ggg ccg cgg    6751 Ala Ile Arg Tyr Lys Ile Ser Ala Ser Val Glu Glu Ser Gly Pro Arg     615                 620                 625 ccc gtg ctg ccg ctg gcc cac ggt gac ccg tcc gtg ttc ccg gcc ttc    6799 Pro Val Leu Pro Leu Ala His Gly Asp Pro Ser Val Phe Pro Ala Phe 630                 635                 640                 645 cgc acg gcc gtc gag gcc gag gac gcc gtc gcc gcc gcg ctg cgc acc    6847 Arg Thr Ala Val Glu Ala Glu Asp Ala Val Ala Ala Ala Leu Arg Thr                 650                 655                 660 ggc cag ttc aac tgc tac gcc gcc ggc gtc ggc ctc ccc gcc gca cga    6895 Gly Gln Phe Asn Cys Tyr Ala Ala Gly Val Gly Leu Pro Ala Ala Arg             665                 670                 675 ag gtaacattta cagcttcacc gtaatgtatg cgtgagcatg catgcgccgg          6947 Ser tttacttacg tgcccgccgc tgttcttccc cggtgcgttc aaaattttaa ccttctataa  7007 gtaccttata aaaacaaaca g c gcc gta gca gag cac ttg tca cag ggc gtg  7059                           Ala Val Ala Glu His Leu Ser Gln Gly Val                               680                 685 ccc tac aag cta tcg gcc gac gac gtc ttc ctc acc gcc ggc gga act    7107 Pro Tyr Lys Leu Ser Ala Asp Asp Val Phe Leu Thr Ala Gly Gly Thr     690                 695                 700 cag gcg atc gaa gtc ata atc ccg gtg ctg gcc cag act gcc ggc gcc    7155 Gln Ala Ile Glu Val Ile Ile Pro Val Leu Ala Gln Thr Ala Gly Ala 705                 710                 715                 720 aac ata ctg ctt ccc cgg cca ggc tat cca aat tac gag gcg cga gcg    7203 Asn Ile Leu Leu Pro Arg Pro Gly Tyr Pro Asn Tyr Glu Ala Arg Ala                 725                 730                 735 gca ttc aac aag ctg gag gtc cgg cac ttc gac ctc atc ccc gac aag    7251 Ala Phe Asn Lys Leu Glu Val Arg His Phe Asp Leu Ile Pro Asp Lys             740                 745                 750 ggg tgg gag atc gac atc gac tcg ctg gaa tcc atc gcc gac aag aac    7299 Gly Trp Glu Ile Asp Ile Asp Ser Leu Glu Ser Ile Ala Asp Lys Asn         755                 760                 765 acc acc gcg atg gtc atc ata aac cca aac aat ccg tgc ggc agc gtt    7347 Thr Thr Ala Met Val Ile Ile Asn Pro Asn Asn Pro Cys Gly Ser Val     770                 775                 780 tac tcc tac gac cat ctg gcc aag gttttgcatc catgcatcct ctgcctcgtt   7401 Tyr Ser Tyr Asp His Leu Ala Lys 785                 790 gatcgaccgg tctgtttgaa catagtatat ggattgcgtt tgctaatcgt gtgctgatga  7461 tgctgtttgg ttatcag gtc gcg gag gtg gca agg aag ctc gga ata ttg     7511                    Val Ala Glu Val Ala Arg Lys Leu Gly Ile Leu                            795                 800 gtg atc gct gac gag gtt tac ggc aaa ctg gtt ctg ggc agc gcc ccg    7559 Val Ile Ala Asp Glu Val Tyr Gly Lys Leu Val Leu Gly Ser Ala Pro     805                 810                 815 ttt atc ccg atg ggc gtc ttt ggg cac att gcc ccg gtc ttg tcc att    7607 Phe Ile Pro Met Gly Val Phe Gly His Ile Ala Pro Val Leu Ser Ile 820                 825                 830                 835 gga tct ctg tcc aag tcg tgg ata gtg cct gga tgg cga ctt gga tgg    7655 Gly Ser Leu Ser Lys Ser Trp Ile Val Pro Gly Trp Arg Leu Gly Trp                 840                 845                 850 gtg gcg gtg tac gac ccc aca aag att tta gag aaa act aag            7697 Val Ala Val Tyr Asp Pro Thr Lys Ile Leu Glu Lys Thr Lys             855                 860                 865 gtagctttag ctccctatca ttcttctcat atgctactgt ggggattagt atttttgcta  7757 aatttgtact gcctttgttt attcag atc tct acg tct att acg aat tac ctt   7810                              Ile Ser Thr Ser Ile Thr Asn Tyr Leu                                              870 aat gtc tca acg gac cca gca acc ttc gtt cag gttagtcttt ggttcttgcc  7863 Asn Val Ser Thr Asp Pro Ala Thr Phe Val Gln 875                 880                 885 ctattttgct catgtccctg tgttgcatgt caaatgaccg gcttcaagtt agtatataga  7923 gtttttgtta agtgtgaatg tcgaagtcca acatgatgga agaaagatac atctattttt  7983 agtcattccc ctttgtttgt ttgattccat aaaataaata aacacaaagc cagaaccaac  8043 tattgaatag aactattttt cttagaaaat atacattgta ttttgagcat gccatattct  8103 tttcgatcaa gtatgcaata tattaaaact tgcattgtac tacgagtata ccatgttgtt  8163 aagaatttct ttacctacaa caccttgtct cgcatcttca tattttgata tccttgacat  8223 tattgttctc ttatgattca cacaacttaa ttatggattt ttgtgctatc aaattgttta  8283 g gaa gct ctt cct aaa att ctt gag aac aca aaa gca gat ttc ttt aag  8332 Glu Ala Leu Pro Lys Ile Leu Glu Asn Thr Lys Ala Asp Phe Phe Lys                 890                 895                 900 agg att att ggt cta cta aag gaa tca tca gag ata tgt tat agg gaa    8380 Arg Ile Ile Gly Leu Leu Lys Glu Ser Ser Glu Ile Cys Tyr Arg Glu             905                 910                 915 ata aag gaa aac aaa tat att acg tgt cct cac aag cca gaa gga tcg    8428 Ile Lys Glu Asn Lys Tyr Ile Thr Cys Pro His Lys Pro Glu Gly Ser         920                 925                 930 atg ttt gta atg gtaagctaag catagactta ctttttaagg ttaatctggg        8480 Met Phe Val Met     935 atctcagtgc atccaacaaa caatcaaatc aaaatataat tatgttttgc tatggatctt  8540 tttgaagatg catgcatttg aagaataatg aagagagttg aaattatttt aggactaatc  8600 ttcctgatat catttgtcca tttttttgtt attactgtaa attggtaaca ctcaaatcat  8660 attacaaaaa gtttcctccc atttttagta agattgactt cctttctata accatgtatt  8720 aacttccatg taaacag gtc aaa cta aac tta cat ctt ttg gag gag atc     8770                    Val Lys Leu Asn Leu His Leu Leu Glu Glu Ile                            940                 945 cat gac gac ata aat ttt tgc tgc aag ctc gca aag gaa gaa tct gta    8818 His Asp Asp Ile Asn Phe Cys Cys Lys Leu Ala Lys Glu Glu Ser Val     950                 955                 960 att tta tgt cca g gtaggaatgt atatggccat tttaaaggaa aactatatgg      8871 Ile Leu Cys Pro 965 aataataata tcttcttgtt atactaaaca atacttcctc catcctaaaa taaatgtctt   8931 acacttagca caattttata ctagatctag tacaaagttg aaacagttat tttgggacag   8991 agggagtagt atatattgtg tgagaacata aggttatgtt tgactgatat atgcttctta   9051 aatgtgaaac atgttctctt atgttttttg attgtatacg aagttcttat cagtttccga   9111 gatgactaca cataaatgat taccatatca ttgtcagaaa atgtattacc acattagaat   9171 attctttctt tttatgcaaa gactagcatg gcatgtactt ttccttgtac ctatgtgtct   9231 ttttttttct cgttacatgt ttgtgcttct cacaaaaata ataataccaa gcacatgttc   9291 caaatgatta ttaataattt tgaggtgttt ttcaaccaac ttatatactt tcatagttct   9351 aaaaaaaccg tatatatggt taactctaac aaaaacttat atatgttttc tctctaatac   9411 ag gg agt gtt ctt gga atg gaa aat tgg gtc cgt att act ttt gcc       9457    Gly Ser Val Leu Gly Met Glu Asn Trp Val Arg Ile Thr Phe Ala        970                 975                 980 tgc gtt cca tct tct ctt caa gat gga ctc gaa agg gtc aaa tca ttc     9505 Cys Val Pro Ser Ser Leu Gln Asp Gly Leu Glu Arg Val Lys Ser Phe     985                 990                 995 tgt caa agg aac aag aag aag aat tct ata aat ggt tgt tag             9547 Cys Gln Arg Asn Lys Lys Lys Asn Ser Ile Asn Gly Cys 1000                1005                1010 ttgtacacac ccctagttgt acatctgact gaagctgtaa atcatttcta gttatcccca   9607 tttatatatt tcaataaaac atattgtaat ggttctgttg tagctgtcca agtcatgtac   9667 tctacttttt gatgtatttg gcctcattgc cttgcatcag tttcaataaa aatggttgtg   9727 tacacaatga tgatgtagag gcgaggtgtt ttgaccacct tttcaacaaa aatctatatc   9787 tttcaacaaa tgaaaccttg agttcccttt gagtagaagt caacatactc cttgaatatg   9847 ctatggtttc catggtctgg atgaaacatg atgaatagaa gtgaagttat atccatgtca   9907 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