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可溶性共同刺激分子增强免疫应答的用途

基本信息

  • 申请号 CN00810038.1 
  • 公开号 CN1377279A 
  • 申请日 2000/05/05 
  • 公开日 2002/10/30 
  • 申请人 遗传研究所有限公司  
  • 优先权日期  
  • 发明人 K·斯图尔姆赫菲 S·F·沃尔夫 M·奥托勒  
  • 主分类号  
  • 申请人地址 美国麻萨诸塞州 
  • 分类号  
  • 专利代理机构 中国专利代理(香港)有限公司 
  • 当前专利状态 发明专利申请公布 
  • 代理人 张广育 
  • 有效性 暂失效-视为撤回 
  • 法律状态 审查中-公开
  •  

摘要

提供了增强免疫应答的方法,其中将共同刺激分子、例如B7分子的可溶形式给药,以增加对抗原、例如肿瘤细胞和感染性试剂的免疫应答。
该方法可用于受治疗者的预防性和治疗性免疫作用。
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权利要求书

1、预防性增强受治疗者对抗原的免疫应答的方法,包括:将包含共 同刺激分子细胞外结构域的可溶性组合物给药,以便增强受治疗者对抗 原的免疫应答。
2、治疗性增强受治疗者对抗原的免疫应答的方法,包括:将包含共 同刺激分子细胞外结构域的可溶性组合物给药,以便增强受治疗者对抗 原的免疫应答。
3、权利要求1或2的方法,其中该共同刺激分子选自由B7-1和B7-2 组成的组。
4、增强受治疗者对I类限制抗原的CD8+T细胞应答的方法,包括: 将包含I类限制抗原或其片段的第一种药物和包含B7分子细胞外结构 域的可溶性组合物给药,以便一旦对受治疗者给药,即增强对I类限制 抗原的CD8+T细胞应答。
5、权利要求4的方法,进一步包括将II类限制抗原对受治疗者给 药。
6、权利要求1、2或4任一项的方法,进一步包括将佐剂对受治疗 者给药。
7、权利要求1、2或4任一项的方法,其中该B7分子是B7-1分子。
8、权利要求1、2或4任一项的方法,其中该B7分子是B7-2分子。
9、权利要求1、2或4任一项的方法,其中该共同刺激分子是单特 异性的。
10、权利要求1、2或4任一项的方法,其中该共同刺激分子是二聚 体和二价的。
11、权利要求1、2或4任一项的方法,其中该可溶性共同刺激分子 是单特异性的和二聚体和二价的。
12、权利要求11的方法,其中B7分子细胞外部分是与包含免疫球 蛋白分子一部分的第二种蛋白质或多肽融合的。
13、权利要求12的方法,其中该免疫球蛋白分子的该部分包含半胱 氨酸残基。
14、权利要求12的方法,其中该免疫球蛋白分子的该部分包含人免 疫球蛋白分子的铰链区、CH2和CH3区。
15、权利要求12的方法,其中该免疫球蛋白分子的该部分包含人免 疫球蛋白分子的铰链区、CH1、CH2和CH3区。
16、权利要求12的方法,其中该免疫球蛋白分子已经经过修饰,减 少了补体固定和/或Fc受体结合。
17、权利要求1、2或4任一项的方法,其中该抗原是肿瘤细胞抗原。
18、权利要求2的方法,其中该受治疗者患有选自下组类型的癌症: 结肠癌、乳腺癌、前列腺癌、肾细胞癌、白血病、淋巴瘤、黑色素瘤、 肥大细胞瘤、肉瘤和膀胱癌。
19、权利要求1、2或4任一项的方法,其中该抗原选自由细菌抗原、 病毒抗原和寄生物抗原组成的组。
20、权利要求1、2或4任一项的方法,其中该免疫应答是细胞免疫 应答。
21、权利要求1、2或4任一项的方法,其中该免疫应答是体液免疫 应答。
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说明书

相关申请 本申请要求1999年5月6日提交的美国临时申请第60/132,944号的 优先权,其内容全文引用在此作为参考文献。
发明背景 T细胞为了响应外来蛋白质,抗原呈递细胞(APC)必须向静息T淋 巴细胞提供两种信号(Jenkins,M.和Schwartz,R.(1987)《实验医学杂志》 165,302-319;Mueller,D.L.等(1990)《免疫学杂志》144,3701-3709)。
第一种信号赋予免疫应答以特异性,它是在呈递在主要组织相容性复合 物(MHC)中的外来抗原肽的识别之后经由T细胞受体(TCR)转导的。
第 二种信号称为共同刺激,诱导T细胞增殖而成为功能性的(Lenschow 等1996《免疫学年评》14:233)。
共同刺激既不是抗原特异性的,也不 是MHC限制性的,据认为它是由一种或多种被APC表达的不同细胞表 面分子所提供的(Jenkins,M.K.等1988《免疫学杂志》140,3324-3330; Linsley,P.S.等1991《实验医学杂志》173,721-730;Gimmi,C.D.等1991 《美国国家科学院院报》88,6575-6579;Young,J.W.等1992《临床研究 杂志》90,229-237;Koulova,L.等1991《实验医学杂志》173,759-762; Reiser,H.等1992《美国国家科学院院报》89,271-275;van-Seventer,G.A. 等(1990)《免疫学杂志》144,4579-4586;LaSalle,J.M.等1991《免疫学 杂志》147,774-80;Dustin,M.I.等1989《实验医学杂志》169,503; Armitage,R.J.等1992《自然》357,80-82;Liu,Y.等1992《实验医学杂志》 175,437-445)。
如果T细胞是仅通过T细胞受体而被刺激的,没有接 收另外的共同刺激信号,那么它们会成为无应答性的、无反应性的,或 者死亡,导免疫应答的下调。
在APC上表达的CD80(B7-1)与CD86(B7-2)蛋白是决定性的共同刺 激分子(Freeman等1991《实验医学杂志》174:625;Freeman等1989《免 疫学杂志》143:2714;Azuma等1993《自然》366:76;Freeman等1993 《科学》262:909)。
B7-2似乎在初次免疫应答期间扮演主要角色,而 B7-1在免疫应答过程后期受到上调,它可能对延长初次T细胞应答或共 同刺激再次T细胞应答来说是重要的(Bluestone,1995《免疫》2:555)。
一种与B7-1和B7-2结合的配体是CD28,它在静息T细胞上组成 型表达,在活化之后表达增加。
通过T细胞受体发信号之后,CD28的 连接反应和共同刺激信号的转导诱导T细胞增殖和分泌IL-2(Linsley,P. S.等1991《实验医学杂志》173,721-730;Gimmi,C.D.等1991《美国国 家科学院院报》88,6575-6579;June,C.H.等1990《今日免疫学》11,211-6; Harding,F.A.等1992《自然》356,607-609)。
第二种配体称为CTLA4 (CD152),它与CD28是同源的,但不在静息T细胞上表达,而出现在T 细胞活化之后(Brunet,J.F.等1987《自然》328,267-270)。
与CD28 相反,CTLA4似乎对T细胞应答的负调节来说是决定性的(Waterhouse 等1995《科学》270:985)。
CTLA4的阻断已经发现可除去抑制信号, 而CTLA4的聚集已经发现可提供下调T细胞应答的抑制信号(Allison 和Krummel,1995《科学》270:932)。
对开发增强免疫应答的方法一直存在迫切需要。
例如,迄今为止利 用本领域公认的方法还难以增加对某些病毒和肿瘤细胞的免疫应答。
用 于普遍增强免疫应答、特别是增强对肿瘤抗原和感染因子(例如病毒、 细菌和/或寄生物抗原)的应答将大有裨益。
发明概述 本发明提供通过操纵共同刺激途径增强免疫应答的方法。
这些方法 对增加对肿瘤抗原和来自感染因子的抗原的应答来说是特别有效的。
本 发明至少在部分程度上基于这样的发现,共同刺激分子的可溶形式能够 预防性和治疗性增强免疫应答。
尽管本发明的可溶性共同刺激分子不是 在固相上给药的(例如不是在细胞上给药的),而且是在没有交联剂的 存在下给药的,也见到了这种增强作用。
这些发现是特别惊人的,因为 根据现有教导,B7-1和B7-2分子的可溶形式不能产生共同刺激应答 (Hayden等1996《组织抗原》48:242;U.S.专利5,580,756)。
因此,本发明在一方面提供预防性增强受治疗者对抗原的免疫应答 的方法,即,将包含共同刺激分子的细胞外结构域的可溶性组合物给 药,以便增强该受治疗者对该抗原的免疫应答。
本发明在另一方面提供治疗性增强受治疗者对抗原的免疫应答的方 法,即,将包含共同刺激分子的细胞外结构域的可溶性组合物给药,以 便增强该受治疗者对该抗原的免疫应答。
在一种实施方式中,该共同刺激分子选自由B7-1和B7-2组成的组。
另一方面,本发明提供增强受治疗者对I类限制性抗原的CD8+T细 胞应答的方法,即,将包含I类限制性抗原或其片段的第一种试剂和包 含B7分子的细胞外结构域的可溶性组合物给药,以便一旦对该受治疗 者给药即增强对I类限制性抗原的CD8+T细胞应答。
在一种实施方式中,这些方法进一步包括将II类限制性抗原对该受 治疗者给药。
在另一种实施方式中,这些方法进一步包括将佐剂对该受 治疗者给药。
在一种实施方式中,该B7分子是B7-1分子。
在另一种实施方式中, 该B7分子是B7-2分子。
在一种实施方式中,该共同刺激分子是单特异性的。
在另一种实施 方式中,该共同刺激分子是二聚体和二价的。
在一种实施方式中,该可 溶性共同刺激分子是单特异性的和二聚体和二价的。
在本发明的另外一种实施方式中,B7分子的细胞外部分是与包含免 疫球蛋白分子一部分的第二种蛋白质或多肽融合的。
在一种实施方式 中,该部分免疫球蛋白分子包含半胱氨酸残基。
在一种实施方式中,该 部分免疫球蛋白分子包含人免疫球蛋白分子的铰链区、CH2与CH3区。
在另一种实施方式中,该部分免疫球蛋白分子包含人免疫球蛋白分子的 铰链区、CH1、CH2与CH3区。
在一种实施方式中,该免疫球蛋白分子 已经经过修饰,减少了补体固定和/或Fc受体结合。
在一种实施方式中,该抗原是肿瘤细胞抗原。
在另一种实施方式中,该受治疗者患有选自下组类型的癌症:结肠 癌、乳腺癌、前列腺癌、肾细胞癌、白血病、淋巴瘤、黑色素瘤、肥大 细胞瘤、肉瘤和膀胱癌。
在一种实施方式中,该抗原选自由细菌抗原、病毒抗原和寄生物抗 原组成的组。
在一种实施方式中,该免疫应答是细胞免疫应答。
在另一种实施方 式中,该免疫应答是体液免疫应答。
图例说明 图1显示用II类限制肽免疫小鼠细胞的抗原特异性增殖应答,同时 有或没有B7-2Ig(100μg)的共同给药。
图2显示在初次免疫时接受单一B7-2Ig治疗的小鼠细胞在再次免疫 后比从未接受B7-2Ig的小鼠具有更大的增殖应答。
数据来自平行实验。
图3显示B7-2Ig的共同给药增强对I类限制肽免疫的CTL应答。
图4显示在有或没有II类限制肽和B7-2Ig治疗的存在下,用I类限 制肽免疫小鼠的CTL应答。
图5显示B7-IgG为脾细胞的体外增殖和淋巴因子分泌提供共同刺 激信号。
图6显示B7Ig在预防性肿瘤疫苗模型中是有效的佐剂。
图7显示用混合有B7-1-或B7-2-IgG的辐射处理P815肿瘤细胞治疗 性接种小鼠诱导肿瘤消退,延长存活期。
图8显示用以B7-IgG作为佐剂的治疗性辐射处理肿瘤细胞疫苗免 疫小鼠对若干不同的小鼠肿瘤模型是有效的。
图9显示单独的B7-IgG的治疗性给药对小鼠的抗肿瘤作用与其作 为疫苗佐剂的作用相当。
图10显示T或B细胞是B7-IgG-介导的抗肿瘤活性所需的。
图11显示CD8+、而非CD4+T细胞是介导B7-IgG抗肿瘤活性所需 的。
图12显示已建立肿瘤的B7-IgG疗法与宿主IFN-γ无关。
详细说明 本发明提供增强免疫应答的改进方法,即,将可溶性共同刺激分子 (例如B7分子的细胞外结构域或B7融合蛋白)给药,从而增强免疫应 答。
可溶性共同刺激分子在给药时没有交联剂,仍然惊人地刺激T细胞 应答。
事实上,申请人已经发现,本方法比呈递在表面上的共同刺激分 子增加了共同刺激水平,例如细胞表面上的共同刺激分子。
在发明的进一步说明之前,为了方便起见,这里收集了用在说明书、 实施例和附后权利要求书中的某些术语。
I、定义 本文所用的术语“预防性”包括共同刺激分子在接触抗原之前或与 此同时给药,针对该抗原形成、增加和/或增强免疫应答。
本文所用的术语“治疗性”包括共同刺激分子给药治疗现有或进行 中的感染或疾病(例如癌症或者病毒或细菌感染),用共同刺激分子治 疗将对该感染或疾病有益。
关于治疗性处理,将共同刺激分子在接触抗 原之后某一时间点给药,针对该抗原形成、增加和/或增强免疫应答。
不 言而喻,用共同刺激分子治疗性处理对受治疗者的免疫应答还可能具有 其他有益效果,例如不是该特定抗原所特有的。
本文所用的术语“免疫细胞”包括造血起源的并且在免疫应答中扮 演角色的细胞。
免疫细胞包括淋巴细胞,例如B细胞和T细胞;自然杀 伤细胞;骨髓细胞,例如单核细胞、巨噬细胞、嗜曙红细胞、肥大细胞、 嗜碱细胞和粒细胞。
本文所用的术语“免疫应答”包括T和/或B细胞应答,也就是细胞 和/或体液免疫应答。
在一种实施方式中,所要求保护的方法可以用于减 少T辅助细胞应答。
在另一种实施方式中,所要求保护的方法可以用于 减少细胞毒性T细胞应答。
所要求保护的方法可以用于减少初次与再次 免疫应答。
受治疗者的免疫应答例如可以通过测定抗体产生、免疫细胞 增殖、细胞因子的释放、细胞表面标记物的表达、细胞毒性等加以测定。
本文所用的关于活化免疫细胞的术语“共同刺激”包括共同刺激分 子提供第二种非活化受体介导信号(“共同刺激信号”)的能力,该信 号诱导增殖或效应器功能。
例如,共同刺激信号能够例如在已经接受T 细胞受体介导信号的T细胞中导致细胞因子分泌。
本文所用的术语“共 同刺激分子”包括存在于抗原呈递细胞上的分子(例如B7-1、B7-2、 B7RP-1(Yoshinaga等1999《自然》402:827)、B7h(Swallow等1999 《免疫》11:423)和/或有关分子(例如同系物)),它们与T细胞上 的共同刺激受体(例如CD28、CTLA4、ICOS(Hutloff等1999《自然》 397:263)、B7h配体(Swallow等1999《免疫》11:423)和/或有关分 子)。
本文也将这些分子总称为“B7分子”。
本文所用的措辞“B7”或“B7分子”包括天然存在的B7-1分子、 B7-2分子、B7RP-1分子(Yoshinaga等1999《自然》402:827)、B7h 分子(Swallow等1999《免疫》11:423)、结构上有关的分子、这些分 子的片段和/或其功能等价物。
术语“等价物”试图包括编码功能相当的 共同刺激分子的氨基酸序列,它们具有B7分子的活性,例如与免疫细 胞上的天然B7配体结合的能力,例如T细胞上的CTLA4、ICOS和/或 CD28,和/或调制免疫细胞共同刺激的能力。
本文所用的“多肽”指的是任意包含两个或多个氨基酸的肽或蛋白 质,这些氨基酸通过肽键或改性肽键彼此连接。
“多肽”指的是短链, 通常称为肽、寡肽和寡聚物,和长链,一般称为蛋白质。
多肽可以含有 除20种基因编码氨基酸以外的氨基酸。
“多肽”不仅包括经过自然过 程修饰的那些,例如加工和其他转译后修饰,而且包括经过化学修饰技 术修饰的那些。
这样的修饰充分描述在基础文章和更详细的专著以及长 篇研究文献中,它们是本领域技术人员所熟知的。
人们将领会到,在给 定的多肽中,相同类型的修饰可以在相同或不同程度上存在于若干位置 上。
而且,给定的多肽可以含有多种类型的修饰。
修饰可以发生在多肽 中的任意各处,包括多肽骨架、氨基酸侧链和氨基或羧基末端。
修饰例 如包括乙酰化、酰化、ADP-核糖基化、酰胺化、黄素的共价连接、血红 素部分的共价连接、核苷酸或核苷酸衍生物的共价连接、脂质或脂质衍 生物的共价连接、磷脂酰肌醇的共价连接、交联、环化、二硫键生成、 去甲基化、共价交联的生成、半胱氨酸的生成、焦谷氨酸盐的生成、甲 酰化、γ-羧基化、糖基化、GPI锚定物生成、羟基化、碘化、甲基化、 肉豆蔻酰化、氧化、蛋白水解加工、磷酸化、异戊烯基化、外消旋化、 脂质连接、硫酸化、谷氨酸残基的γ-羧基化、羟基化与ADP-核糖基化、 硒酸化、转运RNA介导的氨基酸加成为蛋白质(例如精氨酰化)和遍 在蛋白化。
例如参见《蛋白质——结构与分子性质》第2版,T.E. Creighton,W.H.Freeman and Company,New York(1993);Wold,F.“转译 后的蛋白质修饰:观点与展望”,《蛋白质的转译后共价修饰》pgs.1-12, B.C.Johnson,Ed.,Academic Press,New York(1983);Seifter等《酶学方 法》182:626-646(1990);Rattan等“蛋白质合成:转译后修饰与老化” 《Ann.N.Y.Acad.Sci.》663:48-62(1992)。
多肽可以是支链的或者是带 有或不带有分支的环状。
环状、支链和带有分支的环状多肽可以从转译 后的自然过程获得,也可以完全利用合成方法制备。
本文所用的“分离的多肽”或“分离的蛋白质”指的是这样的多肽 或蛋白质,当从细胞中分离后或者用重组DNA技术生产时,基本上不 含其他多肽、蛋白质、细胞材料和培养基,或者当用化学方法合成时, 基本上不含化学前体或其他化学品。
“分离的”或“纯化的”多肽或其 生物活性部分基本上不含来自该细胞或衍生B7多肽的组织来源的细胞 材料或其他污染性多肽,或者当用化学方法合成时,基本上不含化学前 体或其他化学品。
措辞“基本上不含细胞材料”包括其中该多肽是从该 细胞的细胞组分中分离的B7多肽制剂,从该细胞分离或者用重组方法 生产该多肽。
在一种实施方式中,措辞“基本上不含细胞材料”包括非 B7多肽(本文也称为“污染性多肽”)少于约30%(以干重计)的B7 多肽制剂,更优选为非B7多肽少于约20%,进而更优选为非B7多肽少 于约10%,最优选为非B7多肽少于约5%。
当B7多肽或其生物活性部 分是用重组方法生产的时,它还优选地基本上不含培养基,也就是说, 培养基占多肽制剂体积的不到约20%,更优选为少于约10%,最优选为 少于约5%。
措辞“基本上不含化学前体或其他化学品”包括其中该多肽是从参 与该多肽合成的化学前体或其他化学品中分离的B7多肽制剂。
在一种 实施方式中,措辞“基本上不含化学前体或其他化学品”包括化学前体 或非B7化学品少于约30%(以干重计)的B7多肽制剂,更优选为化学 前体或非B7化学品少于约20%,进而更优选为化学前体或非B7化学品 少于约10%,最优选为化学前体或非B7化学品少于约5%。
优选的B7核酸分子与多肽是“天然存在的”。
本文所用的“天然 存在的”分子指的是具有天然存在的核苷酸序列(例如编码天然B7多 肽)的B7分子。
另外,还有这些多肽与核酸分子的天然或非天然存在 的变体,它们保留了相同的功能活性,例如调制对应激反应的适应作用 和/或微生物毒力的能力。
这样的变体可以这样制备,例如利用本领域熟 知的技术进行突变。
作为替代选择,变体可以用化学方法合成。
本文所用的术语“变体”包括这样的核酸分子或多肽,它们在序列 上不同于参照核酸分子或多肽,但是保留其必要性质。
变体核苷酸序列 的变化可能改变、也可能不改变被参照核酸分子编码的多肽的氨基酸序 列。
核苷酸的变化可以导致在被参照序列编码的多肽中发生氨基酸的取 代、加成、删去、融合和截断,讨论见下。
典型的多肽变体在氨基酸序 列上不同于另一种参照多肽。
差异一般是有限的,以致参照多肽与变体 的序列总的说来是非常相似的,并且在很多区域是同一的。
变体和参照 多肽在氨基酸序列上可以通过任意组合的一种或多种取代、加成和/或删 去加以区别。
核酸分子或多肽的变体可以是天然存在的,例如等位变 体,或者它可以是未知是否天然存在的变体。
非天然存在的核酸分子与 多肽变体可以通过技术人员已知的诱变技术、直接合成和其他重组方法 加以制备。
例如,不言而喻的是,本文所述的B7多肽还包括其等价物。
这样 的变体例如可以这样制备,利用本领域已知的方法进行突变。
作为替代 选择,变体可以用化学方法合成。
例如,利用本领域熟知的技术可以制 备B7多肽的突变形式,它们在功能上是等价的(例如具有与CTLA4和 /或CD28结合的能力)。
突变例如可以包括至少一种分散的点突变,后 者可以引起取代,或者包括至少一种删去或插入。
例如,可以使用随机 诱变。
突变还可以通过随机诱变或者利用盒式诱变来完成。
关于前者, 分子的完整编码区被若干方法(化学、PCR、掺杂寡核苷酸合成)之一 诱变,对随机突变的分子集合进行选择或筛选操作。
关于后者,对相当 于所定义的结构或功能决定子的多肽分散区进行饱和或半随机诱变,再 将这些被诱变的盒重新引入到其他野生型等位基因构造中。
在一种实施 方式中,可以使用PCR诱变。
例如,可以使用大引物PCR(O.H.Landt, 1990《基因》96:125-128)。
本文所用的术语“增强免疫应答”包括利用所要求保护的方法治疗 受治疗者,增加T和/或B细胞应答,即细胞和/或体液免疫应答。
在一 种实施方式中,所要求保护的方法可以用于增强T辅助细胞应答。
在另 一种实施方式中,所要求保护的方法可以用于增强细胞毒性T细胞应 答。
所要求保护的方法可以用于增强初次与再次免疫应答。
优选地,当 与未经治疗的受治疗者或者未用所要求保护的方法治疗的受治疗者相 比,所要求保护的方法增加受治疗者的免疫应答。
免疫应答的增加例如 可以表现为一旦用所要求保护的方法治疗后,受治疗者免疫细胞对抗原 的应答增加。
受治疗者的免疫应答例如可以利用各种体外或体内免疫细 胞活化作用测量加以测定,例如测定抗体产生、免疫细胞增殖、细胞因 子的释放、细胞表面标记物的表达、细胞毒性等。
本文所用的术语“可溶性”包括不与细胞缔合的分子,例如共同刺 激分子。
从细胞缔合分子衍生的可溶性共同刺激分子保留了前者的功 能,也就是说它们能够与T细胞上的关连配体结合,经由T细胞上的 CD28和/或CTLA4介导信号转导,不过,它们是可溶性的,也就是不 与膜结合的。
优选地,可溶性组合物包含B7分子的细胞外结构域。
本文所用的术语“共同刺激分子的细胞外结构域”包括共同刺激分 子的一部分,它在共同刺激分子的细胞缔合形式中是细胞外的。
优选 地,共同刺激分子的细胞外结构域包含B7分子的细胞外结构域。
B7细 胞外结构域包括共同刺激分子介导与CD28和/或CTLA4结合的部分。
例如,人B7-1细胞外结构域包含成熟型B7-1的约氨基酸1至约氨基酸 208(SEQ ID NO:1),人B7-2细胞外结构域包含成熟型B7-2的约氨基酸 24至约氨基酸245(SEQ ID NO:2)。
在一种实施方式中,可溶性共同刺 激分子包含B7分子的细胞外结构域,进一步包含信号序列。
本文所用的术语“I类限制抗原”包括这样的抗原,它与主要组织 相容性复合物(MHC)I类沟结合,并且在MHC I类分子构造中被呈递给 T细胞。
I类限制抗原主要刺激CD8+T细胞。
本文所用的术语“II类限 制抗原”包括这样的抗原,它与MHC II类沟结合,并且在MHC II类分 子构造中被呈递给T细胞。
II类限制抗原主要刺激CD4+T细胞。
本文所用的术语“佐剂”包括强化对抗原的免疫应答的试剂。
佐剂 可以与共同刺激分子联合给药,以另外增加免疫应答。
本文所用的术语“单特异性”包括仅具有一种特异性的可溶性共同 刺激分子,也就是说,它们与T细胞上的关连配体结合,例如CD28或 CTLA4。
这样的单特异性试剂还不包括另外的特异性,因而不以定向方 式与其他细胞表面分子结合。
本文所用的术语“寡特异性”包括具有一 种以上特异性的可溶性共同刺激分子,例如对除B7配体以外的分子具 有另外的特异性,例如对细胞表面分子的特异性,例如肿瘤细胞抗原或 T细胞受体。
本文所用的术语“二价”包括每个可溶性共同刺激分子具 有两个结合位点,用于与其关连配体、例如CD28和/或CTLA4发生相 互作用。
本文所用的术语“二聚体”包括以同型二聚体存在的可溶形式, 也就是由两个相同的亚单位组成的单位,二者例如通过二硫键连接在一 起。
本文所用的术语“多聚的”包括具有两个以上亚单位的可溶形式。
II、可溶性共同刺激分子 B7抗原是在B淋巴细胞、专业的抗原呈递细胞(例如单核细胞、 树状细胞、朗格罕氏细胞)和向免疫细胞呈递抗原的细胞(例如角质形 成细胞、内皮细胞、星形细胞、成纤维细胞、少突胶质细胞)表面上发 现的一类共同刺激分子。
这些共同刺激分子与T细胞表面上的CTLA4、 CD28和/或ICOS或者免疫细胞上其他已知或尚不明确的受体结合。
这 类共同刺激分子的成员能够向活化的T细胞提供共同刺激作用,从而诱 导T细胞增殖和/或细胞因子分泌。
人们已经确立了B7分子的纯化技术,另外已经从许多物种克隆了 B7基因(cDNA),包括人和小鼠(例如参见Freeman,G.J.等(1993)《科 学》262:909-911;Azuma,M.等(1993)《自然》366:76-79;Freeman,G.J. 等(1993)《实验医学杂志》178:2185-2192)。
共同刺激分子的核苷酸序列是本领域已知的,可以在文献或数据库 中找到,例如GenBank。
例如参见B7-2(Freeman,G.J.等1993《科学》 262:909或GenBank入藏号P42081或A48754)、B7-1(Freeman等《实 验医学杂志》1991.174:625或GenBank入藏号P33681或A45803)、 CTLA4(例如参见Ginsberg等1985《科学》228:1401或GenBank入藏 号P16410或291929)、CD28(Aruffo和Seed《美国国家科学院院报》 84:8573或GenBank入藏号180091)、ICOS(Hutloff等1999《自然》 397:263;WO 98/38216)和相关的序列。
除了共同刺激分子的天然存在形式以外,术语“共同刺激分子”还 包括非天然存在的形式,例如共同刺激分子的变体或突变体形式,它们 保留有共同刺激分子的功能,例如与关连反受体结合的能力。
例如,在 避免与非共同刺激分子基因杂交的条件下(例如在等价于65℃5×SSC (1×SSC=150mM NaCl/0.15M柠檬酸钠)的条件下),能够与编码B7 分子的DNA杂交的DNA序列可以用于制备抗B7抗体。
作为替代选择, 在核酸分子编码蛋白质结构域的区域保留序列同一性的DNA序列可以 用于生产可用作免疫原的共同刺激蛋白,这些蛋白质结构域对共同刺激 分子的功能来说是重要的,例如与其他共同刺激分子结合。
优选地,非 天然存在的共同刺激分子与天然存在的共同刺激分子细胞外结构域的 氨基酸序列具有显著的氨基酸同一性(例如大于70%,优选为大于80%, 更优选为大于90-95%)。
为了测定可能对共同刺激分子与其反受体结合来说是重要的共同刺 激分子的氨基酸残基,可以对比包含不同物种、例如小鼠和人的共同刺 激分子的细胞外结构域的氨基酸序列,记录保守的(例如同一的)残基。
例如这可以利用任意的标准对比程序进行,例如MegAlign(DNA STAR)。
这样的对比程序详细描述如下。
这类保守或同一的残基对共同 刺激分子与其受体的正确结合来说可能是必要的,因而不可能会改变。
例如,对介导与CD28和CTLA4的功能相互作用来说是重要的B7-1 分子区域已经通过突变进行了鉴别。
B7-1V-样结构域中的两个疏水性残 基、包括在从各种物种克隆的所有B7-1与B7-2分子中都是保守的Y87 残基,被发现是决定性的(Fargeas等1995《实验医学杂志》182:667)。
利用这些或相似的技术,可以测定决定性共同刺激分子的细胞外结构域 的氨基酸残基,它们是决定性的,因此不会改变。
使用B7 cDNA分子,具有B7活性的肽可以利用标准技术加以生 产。
为表达肽而被转染的宿主细胞可以是任意的原核细胞或真核细胞。
例如,具有B7活性的肽可以在下列细胞内被表达:细菌细胞、例如大 肠杆菌,昆虫细胞(杆状病毒),酵母,或哺乳动物细胞、例如中国仓 鼠卵巢细胞(CHO)和NS0细胞。
其他适合的宿主细胞和表达载体可以参 见Goeddel,(1990),见上,或者是本领域技术人员已知的。
酿酒酵母内 的表达载体实例包括pYepSecl(Baldari等(1987)《欧洲分子生物学组织 杂志》6:229-234)、pMFa(Kurjan和Herskowitz,(1982)《细胞》30: 933-943)、pJRY88(Schultz等(1987)《基因》54:113-123)和pYES2 (Invitrogen Corporation,San Diego,CA)。
在所培养的昆虫细胞(SF9细 胞)内可用于蛋白质表达的杆状病毒载体包括pAc系列(Smith等(1983) 《分子细胞生物学》3:2156-2165)和pVL系列(Lucklow,V.A.和 Summers,M.D.,(1989)《病毒学》170:31-39)。
一般地,COS细胞(Gluzman, Y.,(1981)《细胞》23:175-182)与诸如pCDM8等载体(Seed,B.,(1987) 《自然》329:840)联合用于哺乳动物细胞内的短暂扩增/表达,而CHO (中国仓鼠卵巢)细胞与诸如pMT2PC等载体(Kaufman等(1987)《欧 洲分子生物学组织杂志》6:187-195)用于哺乳动物细胞内的稳定扩增/ 表达。
优选用于重组蛋白质生产的细胞系是NS0骨髓瘤细胞系,可从 ECACC获得(目录#85110503),描述在Galfre,G.和Milstein,C.中((1981) 《酶学方法》73(13):3-46;和《单克隆抗体的制备:策略与操作》Academic Press,N.Y.,N.Y.)。
载体DNA可以经由常规技术引入到哺乳动物细胞 内,例如磷酸钙或氯化钙共沉淀、DEAE-葡聚糖介导的转染、脂质转染 试剂或电穿孔。
适合于转化宿主细胞的方法可以参见Sambrook等(《分 子克隆实验室手册》第2版,Cold Spring Harbor Laboratory press(1989)) 和其他实验室教科书。
当用在哺乳动物细胞内时,表达载体的控制功能 经常由病毒材料提供。
例如,常用的启动子是从多瘤、腺病毒2、巨细 胞病毒衍生的,最常见的是猿病毒40。
在哺乳动物细胞或其他细胞内被表达的具有B7活性的肽可以按照 本领域的标准操作进行纯化,包括硫酸铵沉淀、分级柱色谱(例如离子 交换、凝胶过滤、电泳、亲和色谱等),最后包括结晶(一般参见“酶 的纯化与相关技术”《酶学方法》22:233-577(1971))。
用于制备本方法所用可溶性B7分子的B7分子可以来源于任意哺乳 动物物种,优选为人。
若干来源B7分子的核苷酸序列是本领域已知的。
人B7-1的完整DNA序列(CD80)的GenBank入藏号为L25259,公布在 Freeman等《科学》1993,262:9090或Azuma等《自然》1993,366:76 中(另见WO 96/40915关于B7-1和B7-2的序列)。
人B7-1和人B7-2 的核苷酸序列还如SEQ ID Nos 1与2(B7-1)和SEQ ID Nos 3与4(B7-2) 所示。
作为替代选择,这样一种序列可以这样测定,基于序列与已知的、 例如人B7序列杂交的能力,从所需来源分离B7核酸分子。
例如,可以 检测B7分子在高或低严格条件下与已知编码具有B7活性的肽的核酸分 子杂交的能力。
适当的促进DNA杂交的严格条件例如在约45℃下的6.0 ×氯化钠/柠檬酸钠(SSC),然后在50℃下用2.0×SSC洗涤,这些条件 是本领域技术人员已知的,或者可以参见《分子生物学流行方案》John Wiley & Sons,N.Y.(1989),6.3.1-6.3.6。
例如,洗涤步骤中的盐浓度可以 从约2.0×SSC 50℃的低严格条件到0.2×SSC 50℃的高严格条件中加以 选择。
另外,洗涤步骤中的温度可以从室温约22℃的低严格条件增加到 约65℃的高严格条件。
在优选的实施方式中,B7分子是人B7分子。
在一种实施方式中,可溶性共同刺激分子是从天然存在的B7-1或 B7-2分子衍生的。
具有如本文所述B7分子活性、并且因遗传密码的简 并性而具有不同于天然存在B7分子的序列的多肽也可以以可溶形式被 表达,也属于本发明的范围。
这样的核酸编码功能上等价于B7的多肽 (例如具有B7活性的多肽),但是在序列上不同于本领域已知的B7-1 或B7-2。
例如,大量氨基酸由一个以上三联体命名。
由于遗传密码的简 并性,可能存在指定相同氨基酸的密码子或同义密码子(例如CAU和 CAC是组氨酸的同义密码子)。
作为一个实例,B7分子核苷酸序列内 (尤其在密码子的第三个碱基内)的DNA序列多态性可能导致DNA中 的“沉默”突变,这并不影响所编码的氨基酸。
不过,预期在某一种群 内将存在确实引起B7抗原氨基酸序列改变的DNA序列多态性。
本领域 技术人员将认识到,由于天然的等位基因变异,在某一种群个体中可能 存在编码具有新颖B淋巴细胞抗原活性的肽的核酸的一种或多种核苷 酸中的这些变异(高达核苷酸的约3-4%)。
这样的核苷酸变异和所致 氨基酸多态性也属于本发明的范围。
此外,还可能存在一种或多种同种 型或有关的交叉反应性B7分子。
除了天然存在的等位基因变体以外,本发明范围内的B7分子可以 利用本领域公认的技术进行制备。
在另一种实施方式中,可溶性共同刺 激分子是B7-1或B7-2的修饰形式,它保留了B7共同刺激分子的功能, 也就是在功能上是完全相同的。
B淋巴细胞抗原的DNA序列经过遗传 技术修饰,可以产生氨基酸序列改变了的蛋白质或多肽。
这样的序列视 为属于本发明的范围,其中被表达的多肽能够与CTLA4和/或CD28结 合,并且调制T细胞介导的免疫应答和免疫功能。
例如,在一种实施方式中,按照大量方法的任意一种可以向DNA 分子中引入突变,包括用于产生简单的删去或插入、有系统的删去、碱 基簇的插入或取代或者单一碱基的取代,生成B淋巴细胞抗原DNA的 变体或修饰后的等价物。
例如,B7-1或B7-2 cDNA序列的改变、例如 氨基酸的取代或删去优选地是通过定向诱变而获得的。
定向诱变系统是 本领域熟知的。
方案和试剂在商业上可以从Amersham International PLC, Amersham,U.K.获得。
具有B7分子活性、也就是具有与B7分子的天然配体结合并且调制 T细胞介导免疫应答的能力的修饰后的多肽视为属于本发明的范围,这 种能力例如由已经接收初级活化信号的T细胞的细胞因子产生和/或T 细胞增殖作用所证实。
具有B7分子活性的肽的另一种修饰实例是半胱氨酸残基优选地被 丙氨酸、丝氨酸、苏氨酸、亮氨酸或谷氨酸残基取代,以减少经由二硫 键的二聚作用。
另外,具有B7活性的肽的氨基酸侧链可以用化学方法 修饰。
另一种修饰是肽的环化。
为了增强稳定性和/或反应性,具有B7活性的多肽经过修饰,可以 在抗原氨基酸序列中掺入一种或多种多态性,这是由任意天然的等位基 因变异所引起的。
另外,D-氨基酸、非天然氨基酸或非氨基酸类似物经 过取代或加成,可以产生属于本发明范围的修饰后的蛋白质。
此外,按 照A.Sehon及合作者的方法(Wie等,同上),肽可以用聚乙二醇(PEG) 修饰,产生与PEG共轭结合的肽。
另外,可以在肽的化学合成期间加入 PEG。
肽的其他修饰包括还原/烷基化(Tarr:《蛋白质微特性化方法》 J.E.Silver ed.,Humana Press,Clifton NJ 155-194(1986));酰化(Tarr, 同上);与适当载体的化学偶联(Mishell和Shiigi,eds《细胞免疫学精 选方法》WH Freeman,San Francisco,CA(1980),美国专利4,939,239) 或稀福尔马林处理(Marsh(1971)《国际变态反应与应用免疫学文献》 41:199-215)。
优选的B7多肽具有B7活性,并且与天然存在的B7氨基酸序列具 有至少约60%的同一性,优选为至少约70%的同一性,更优选为至少约 80%的同一性。
具有B7活性、并且与天然存在的B7分子具有至少约90% 同一性、优选为至少约95%、更优选为至少约98-99%同一性的多肽也 属于本发明的范围。
术语在给定位置上的氨基酸“同一性”指的是当对 比两种肽的氨基酸序列时,在对应位置上具有相同的氨基酸。
若所比较 的序列中某一位置被相同的氨基酸占据,则分子在该位置上是同一的。
序列之间同一性的程度(或百分率)是由这些序列共享的匹配或同一位 置数量的函数。
本领域普通技术人员能够轻易对比两种氨基酸序列,以提供生物学 有义对比。
序列的比较和两种序列之间同一性百分率的测定还可以利用 数学算法来完成。
在一种实施方式中,两种氨基酸序列之间的同一性百 分率是利用Needleman和Wunsch(《分子生物学杂志》(48):444-453 (1970))算法测定的,该算法已经结合在GCG软件包(可从 http://www.gcg.com获得)中的GAP程序内,采用Blossom 62矩阵或 PAM250矩阵,间距权重为16、14、12、10、8、6、5或4,长度权重 为1、2、3、4、5或6。
在另外一种实施方式中,两种核苷酸序列之间 的同一性百分率是利用GCG软件包(可从http://www.gcg.com获得)中 的GAP程序测定的,采用NWSgapdna.CMP矩阵,间距权重为40、50、 60、70或80,长度权重为1、2、3、4、5或6。
在另一种实施方式中, 两种氨基酸或核苷酸序列之间的同一性百分率是利用E.Meyers和W. Miller算法(CABIOS,4:11-17(1989))测定的,该算法已经结合在ALIGN 程序(2.0版)内,采用PAM120权重残基表,缺口长度补偿为12,缺 口补偿为4。
本发明的核酸与蛋白质序列可以进一步用作“查询序列”,以在公 用数据库内例如对其他家族成员或有关序列进行检索。
这样的检索可以 利用Altschul等(1990)《分子生物学杂志》215:403-10的NBLAST和 XBLAST程序(2.0版)进行。
BLAST核苷酸检索可以利用NBLAST程 序、得分=100、字长=12进行,以得到与本发明核酸分子同源的核苷酸 序列。
BLAST蛋白质检索可以利用XBLAST程序、得分=50、字长=3 进行,以得到与本发明B7蛋白质分子同源的氨基酸序列。
为了得到带 有缺口的对比以利比较,可以采用Gapped BLAST,如Altschul等(1997) 《核酸研究》25(17):3389-3402所述。
当采用BLAST和Gapped BLAST 程序时,可以使用各程序(例如XBLAST和NBLAST)的默认参数。
见http://www.ncbi.nlm.nih.gov。
“B7分子的至少一部分细胞外结构域”被定义为这样一种氨基酸序 列,它包含B7的完整细胞外结构域序列或其一部分,该序列编码具有 活性(也就是与免疫细胞上的天然B7配体结合的能力,例如与T细胞 上的CTLA4和/或CD28结合)的多肽。
具有B7活性的肽结合CTLA4 和/或CD28,调制T细胞介导的免疫应答,这例如得到与这些配体结合 或者诱导细胞因子产生和/或已经接收初级活化信号的T细胞增殖作用 的证实,如附后实施例所示。
在优选的实施方式中,“B7分子的至少一 部分细胞外结构域”包括这样一种多肽,它包含人B7抗原的完整细胞 外部分(例如B7-1序列的大约第1-208个氨基酸残基或B7-2序列的大 约第24-245个氨基酸残基),这部分可用于结合CTLA4和/或CD28。
除了仅包含天然存在的氨基酸的B7多肽以外,还提供了B7肽模拟 物。
肽类似物在药物工业中常用作非肽药物,具有类似于模板肽的性 质。
这些类型的非肽化合物称为“肽的模拟物”或“肽模拟物”(Fauchere, J.(1986)《药物研究进展》15:29;Veber和Freidinger(1985)《TINS》p.392; Evans等(1987)《医药化学杂志》30:1229,引用在此作为参考文献), 在开发中通常借助计算机分子建模。
在结构上与具有治疗价值的肽相似的肽的模拟物可以用于产生等价 的治疗或预防作用。
一般地,肽模拟物在结构上与多肽范例(也就是具 有生物或药理活性的多肽)、例如B7相似,但是其中一条或多条肽键 可选地被选自下组的键代替:-CH2NH-、-CH2S-、-CH2-CH2-、-CH=CH-(顺式与反式)、-COCH2-、-CH(OH)CH2-和-CH2SO-,方法是本领域 已知的,进一步描述在下列参考文献中:Spatola,A.F.《氨基酸、肽和 蛋白质的化学与生物化学》B.Weinstein,eds.,Marcel Dekker,New York, p.267(1983);Spatola,A.F.《Vega Data》(1983.3.),1卷,3期,“肽主链 修饰”(综述);Morley,J.S.《药物科学趋势》(1980)pp.463-468(综述); Hudson,D.等《国际肽与蛋白质研究杂志》(1979)14:177-185(-CH2NH-, CH2CH2-);Spatola,A.F.等《生命科学》(1986)38:1243-1249(-CH2-S); Hann,M.M.《英国化学会志柏尔金汇刊I》(1982)307-314(-CH-CH-,顺 式与反式);Almquist,R.G.等《医药化学杂志》(1980)23:1392-1398( -COCH2-);Jennings-White,C.等《四面体快报》(1982)23:2533(-COCH2-); Szelke,M.等,欧洲专利申请EP 45665(1982)CA:97:39405(1982)( -CH(OH)CH2-);Holladay,M.W.等《四面体快报》(1983)24:4401-4404 (-C(OH)CH2-);Hruby,V.J.《生命科学》(1982)31:189-199(-CH2-S-), 它们分别引用在此作为参考文献。
特别优选的非肽键是-CH2NH-。
这类肽的模拟物可以具有显著优于多肽实施方式的优点,例如包 括:生产更经济、化学稳定性更高、药理性质增强(半衰期、吸收、效 力、功效等)、特异性改变(例如广谱生物活性)、抗原性降低以及其 他等等。
肽模拟物的标记通常涉及一种或多种标记物直接或者通过间隔 基团(例如酰胺基)与肽模拟物上的非干扰性位置共价结合,这些位置 是通过定量结构-活性数据和/或分子建模来预测的。
这样的非干扰性位 置一般是这样的位置,它们不与大分子形成直接接触,而肽模拟物与这 些大分子结合产生治疗效果。
肽模拟物的衍生(例如标记)应当基本上 不干扰肽模拟物的所需生物或药理活性。
B7氨基酸序列的一个或多个氨基酸被相同类型的D-氨基酸有系统 地取代(例如D-赖氨酸代替L-赖氨酸),可以用于生成更稳定的分子。
另外,按照本领域已知的方法可以生成包含B7氨基酸序列或基本上同 一的序列变异的约束肽(Rizo和Gierasch(1992)《生物化学年评》61: 387,引用在此作为参考文献);例如,加入内在的半胱氨酸残基,这 些残基能够形成分子内二硫桥,使肽环化。
本领域技术人员无需过度的实验方法即可生产相当于B7肽序列及 其序列变体的多肽。
这类多肽可以这样生产,在原核动物或真核动物宿 主细胞中,表达编码B7肽序列的多核苷酸,经常作为更大多肽的一部 分。
作为替代选择,这样的肽可以用化学方法合成。
异种多肽在重组宿 主中的表达、多肽的化学合成和体外转译的方法是本领域熟知的,进一 步描述在Maniatis等《分子克隆:实验室手册》(1989)第2版,Cold Spring Harbor,N.Y.;Berger和Kimmel《酶学方法》152卷“分子克隆技术指南” (1987),Academic Press,Inc.,San Diego,Calif.;Merrifield,J.(1969)《美国 化学会志》91:501;Chaiken I.M.(1981)《CRC Crit.Rev.Biochem.》11:255; Kaiser等(1989)《科学》243:187;Merrifield,B.(1986)《科学》232:342; Kent,S.B.H.(1988)《生物化学年评》57:957;Offord,R.E.(1980)《半 合成蛋白质》Wiley Publishing,引用在此作为参考文献。
肽例如可以通过直接的化学合成加以生产。
肽可以被制成修饰的 肽,其中非肽部分通过共价键与N-端和/或C-端结合。
在某些优选的实 施方式中,羧基末端或氨基末端或二者都是经过化学修饰的。
末端氨基 与羧基的最普通的修饰分别是乙酰化和酰胺化。
氨基末端修饰例如酰化 (例如乙酰化)或烷基化(例如甲基化),羧基末端修饰例如酰胺化, 以及其他末端修饰,包括环化,这些都可以体现在本发明的各种实施方 式中。
某些氨基末端和/或羧基末端修饰和/或肽延长为核心序列,能够 提供有利的物理、化学、生物化学和药理性质,例如:稳定性增强、效 力和/或功效增加、耐受血清蛋白酶、可取的药动学性质以及其他等等。
本发明还提供B7嵌合或融合多肽。
本文所用的B7“嵌合多肽”或 “融合多肽”包含用手术方法与非B7多肽连接的B7多肽。
“B7多肽” 指的是具有相当于B7多肽的氨基酸序列的多肽,而“非B7多肽”指的 是具有相当于这样一种多肽的氨基酸序列的多肽,前者多肽与B7多肽 基本上不是同源的,例如不同于B7多肽并且来源于相同或不同生物体 的多肽。
在B7融合多肽内,B7多肽可以相当于B7多肽的全部或一部 分。
在优选的实施方式中,B7融合多肽包含B7多肽的至少一个生物活 性部分。
在融合多肽内,术语“用手术方法连接”意在表明B7多肽与 非B7多肽彼此是框架内融合的。
非B7多肽可以与B7多肽的N-端或C- 端融合。
优选的核酸片段编码长度为至少约40个氨基酸残基的B7多肽,优 选地长度为至少约80个氨基酸残基,更优选地长度为至少约120个氨 基酸残基。
特别优选的片段在长度上为至少约200个氨基酸,例如包含 B7分子的完整细胞外结构域。
大量方法可以用于生成分离DNA序列的 片段。
编码B7-1或B7-2蛋白质、例如1-30个碱基长度的核酸亚区或片 段可以按照标准的有机化学合成手段加以制备。
该技术也可用于制备引 物,引物用于生成更大的合成B7 DNA片段。
编码B淋巴细胞抗原的基因的更大亚区或片段可以这样被表达为 肽,利用聚合酶链反应(PCR)合成有关的DNA碎片(Sambrook,Fritsch 和Maniatis《分子克隆:实验室手册》第2版,Cold Spring Harbor,N.Y., (1989)),将所得DNA连接在适当的表达载体内。
利用PCR,生成了 所克隆的双链DNA的特定序列,克隆在表达载体内,然后测定 CTLA4/CD28结合活性。
例如,为了利用PCR表达人B7-1或B7-2蛋白 的分泌(可溶)形式,可以合成不编码蛋白质的跨膜与胞质区的DNA。
这种DNA分子可以连接在适当的表达载体内,引入到宿主细胞中,例 如CHO,在那里合成和分泌B7蛋白片段。
然后能够轻易地从培养基中 获得B7蛋白片段。
在一种实施方式中,编码B7分子的至少一部分、例如缺乏分子跨 膜部分的细胞外结构域部分的核酸分子被置于表达载体中,被宿主细胞 表达,以便B7分子不在细胞表面上被表达。
例如,编码B7分子细胞外 结构域的cDNA在合成时可以使用从公开的B7-1或B7-2序列(参见 Freeman等《免疫学杂志》1989.143:2714或《科学》1993.262:9090) 衍生的引物,利用聚合酶链反应(美国专利4,683,202)。
所得cDNA序 列然后可以装配成真核生物或原核生物表达载体,该载体可以用于定向 适当宿主细胞、例如COS或CHO细胞合成B7的细胞外结构域。
在另一种实施方式中,表达载体包括编码具有B7抗原活性的肽的 DNA和编码第二种多肽的DNA。
第二种多肽优选地不是从共同刺激分 子衍生的。
优选地,本发明的B7嵌合或融合蛋白是用标准的重组DNA 技术生产的。
例如,将编码不同多肽序列的DNA片段按照常规技术框 架内连接在一起,利用采用钝端或交错端进行连接,限制酶消化以提供 适当的末端,酌情填入粘端,碱性磷酸酶处理以避免不可取的连接,和 酶的连接。
在另一种实施方式中,融合基因可以用常规技术合成,包括 自动DNA合成仪。
作为替代选择,基因片段的PCR扩增可以利用锚定 引物进行,该引物引起两个连续基因片段之间的互补突出端,随后可以 进行退火和重新扩增,产生嵌合的基因序列(例如参见《分子生物学最 新方案》eds.Ausubel等John Wiley & Sons:1992)。
而且,很多表达载 体都是商业上可得到的,并且已经编码融合部分(例如GST多肽)。
编 码B7的核酸分子可以被克隆在这样的表达载体中,以便该融合部分与 B7蛋白质进行框架内连接。
例如,可以向肽中加入六-组氨酸,用于固 定化金属离子亲和色谱纯化(Hochuli,E.等(1988)《生物工程学》6: 1321-1325)。
另外,为了促进不含无关序列的B淋巴细胞抗原的分离, 可以在融合部分与肽的序列之间引入特异性内蛋白酶裂解位点。
增加肽 的溶解度可能是必要的,例如向肽中加入官能团,或者删去肽的疏水 区。
在一种实施方式中,将编码B7分子或其部分的DNA与编码免疫应 答所需抗原的DNA进行框架内连接,该抗原例如病毒抗原或肿瘤细胞 抗原。
在一种实施方式中,将编码相当于B7抗原细胞外结构域的氨基酸 序列的DNA与编码相当于免疫球蛋白分子恒定区的氨基酸序列的DNA 连接(例如参见美国专利5,580,756或WO 97/28267)。
第二种肽可以包 括免疫球蛋白恒定区,例如人Cγ1结构域或Cγ4结构域或Cμ或其部分 (例如人IgCγ1或人IgCγ4的铰链区、CH2和CH3区,例如参见Capon 等US 5,116,964,引用在此作为参考文献)。
所得B7Ig融合蛋白可以具 有改变了的溶解度、结合亲合性、稳定性和/或化合价(也就是每个分子 可利用的结合位点数),并且可以增加蛋白质纯化的效率。
在优选的实施方式中,免疫球蛋白恒定区中的半胱氨酸残基是保守 的,有助于二硫化物的键合和可溶性二聚B7Ig蛋白的生成。
在一种实 施方式中,B7分子的一部分与IgM抗体或其部分的恒定区融合,有助 于可溶性多聚形式的B7Ig蛋白的生成。
特别优选的B7Ig融合蛋白包括与免疫球蛋白恒定区偶联的人B7-1 或B7-2的细胞外结构域部分或可变区样结构域。
用在可溶性B7分子中 的免疫球蛋白恒定区可以含有遗传修饰,这些修饰减少或消除免疫球蛋 白结构固有的效应器活性(例如参见WO 97/28267)。
例如,编码B7- 1或B7-2的细胞外部分的DNA以及编码B7-1或B7-2的可变区样结构 域或者B7-1或B7-2的恒定区样结构域的DNA可以与编码经过位点定 向诱变修饰的人IgCγ1和/或IgCγ4的铰链区、CH2和CH3区的DNA连 接。
如果使用非人免疫球蛋白恒定区,优选地该恒定区被人源化。
用于 制备嵌合或人源化抗体的技术是本领域熟知的(例如参见Morrison等 《美国国家科学院院报》81:6851(1985);Takeda等《自然》314:452 (1985);Cabilly等美国专利No.4,816,567;Boss等美国专利No.4,816,397; Tanaguchi等欧洲专利公报EP 171496;欧洲专利公报0173494;英国专 利GB 2177096B;Teng等《美国国家科学院院报》80:7308-7312(1983); Kozbor等《今日免疫学》4:7279(1983);Olsson等《酶学方法》92:3-16 (1982);PCT公报WO 92/06193和EP 0239400)。
用于装配和表达编码相当于B7抗原和可溶性B7Ig分子的氨基酸序 列的DNA的技术例如寡核苷酸的合成、PCR、转化细胞、构建载体、 表达系统等,都已得到本领域的充分确认。
由重组技术生产的B7融合蛋白和多肽可以从含有蛋白质或肽的细 胞与培养基的混合物中分泌和分离。
作为替代选择,蛋白质或肽可以保 留在细胞质中,收获细胞,溶解,分离蛋白质。
细胞培养物通常包括宿 主细胞、培养基和其他成分。
适合于细胞培养的培养基是本领域熟知 的。
蛋白质和多肽可以从细胞培养基、宿主细胞中分离,或者利用本领 域已知的用于纯化蛋白质和多肽的技术。
用于转染宿主细胞和纯化蛋白 质与肽的技术在本文中有进一步详细描述。
III、结构相关的可溶性共同刺激分子的活性筛选 利用一种或多种若干不同的测定法可以完成结构相关的B7分子筛 选,如本文所述它们保留特有的B淋巴细胞抗原活性。
例如,肽的筛选 可以看出它们保持对与天然存在的B7分子结合的抗-B7单克隆抗体的 特异反应性。
具体来说,将适当的细胞、例如COS细胞可以用编码供 试多肽的DNA转染。
在免疫沉淀测定法中,可以利用抗-B7单克隆抗体 或CTLA4Ig或CD28融合蛋白评价分泌形式B7的产生。
通过移动,还 可以试验表达有关肽的细胞与CTLA4或CD28在平板上结合的能力。
作为替代选择,还可以试验供试肽与天然存在的B7分子竞争与CD28 或CTLA4结合的能力。
其他更优选的测定法试验B7抗原的功能特征。
已如前述,T细胞合 成细胞因子的能力不仅取决于T细胞受体对抗原的占据或交联(例如由 抗-CD3或佛波酯提供的“初级活化信号”,产生“活化的T细胞”), 而且取决于共同刺激信号的诱导,在这种情况下是由与B淋巴细胞抗原 的相互作用诱导的,例如B7-1或B7-2与T细胞上的CD28和/或CTLA4 分子的相互作用。
B7分子与T细胞上的已经经由T细胞受体接收信号 的其天然配体的结合具有传递信号给T细胞的作用,诱导产生细胞因 子、特别是白介素-2的水平增加,后者进而刺激T淋巴细胞的增殖。
其 他关于B7功能的测定法因而涉及测定细胞因子的合成,例如白介素-2、 白介素-4或其他细胞因子,和/或测定已经接收初级活化信号的CD28+T 细胞的T细胞增殖作用。
体外可以这样向T细胞提供第一或初级活化信号,使它们与抗-T3 单克隆抗体(例如抗-CD3)或佛波酯接触,或者更优选地,由与I类或 II类MHC分子有关的抗原提供。
已经接收初级活化信号的T细胞在本 文中称为活化的T细胞。
B7功能是这样测定的,向T细胞培养物中加 入B7源(例如表达具有B7活性的肽或B7的分泌形式的细胞)和初级 活化信号(例如与I类或II类MHC有关的抗原),测定功能结果,例 如测定培养物上清液中的白介素-2、γ-干扰素或其他已知或未知的细胞 因子。
例如,可以采用若干常规的白介素-2测定法的任意一种,例如《美 国国家科学院院报》86:1333(1989)所述测定法,有关部分引用在此作 为参考文献。
用于干扰素产生测定的试剂盒可从Genzyme Corporation (Cambridge,MA)获得。
还可以如下实施例所述测量T细胞增殖。
与缺乏 共同刺激信号的阴性对照相比,如本文所述保留B7抗原特征的肽可以 导致每个T细胞所产生的细胞因子增加,例如IL-2,还可以导致T细胞 增殖作用增强。
IV、可溶性共同刺激分子的给药方法 本文所述的组合物和/或药物对需要促进免疫应答的受治疗者给 药。
在一种实施方式中,可溶性B7分子是与抗原预防性给药的,例如 在被病原体感染之前或者对未患癌症的受治疗者给药。
在另一种实施方 式中,可溶性B7分子是治疗性给药的,例如对将从增强共同刺激获益 的患病受治疗者给药,例如患有癌症或被病原体感染的受治疗者。
在一种实施方式中,共同刺激分子是与抗原制剂共同给药的。
抗原 可以是蛋白质、多糖、脂多糖、脂肽,或者它可以是任意这些的组合。
例如,抗原可以包括天然蛋白或蛋白片段、合成蛋白或蛋白片段、或肽; 它可以包括糖蛋白、糖肽、脂蛋白、脂肽、核蛋白、核肽;它可以包括 肽-肽缀合物;或者它可以包括重组的核酸表达产物。
在一种实施方式中,抗原制剂包含抗原的混合物,例如抗原是以辐 射处理细胞(例如肿瘤细胞或病毒感染的细胞)、病毒颗粒或粗匀浆的 形式给药的。
在另一种实施方式中,将抗原肽或抗原肽的重组形式的纯 化制剂对受治疗者给药,例如病毒肽或肿瘤相关抗原。
在一种实施方式 中,抗原制剂包含I类MHC限制肽。
在另一种实施方式中,抗原制剂 包含II类MHC限制肽。
在另一种实施方式中,抗原制剂包含I类限制 肽与II类限制肽的组合,用于对受治疗者给药。
在一种实施方式中,抗原是通过“遗传免疫”给药的。
在这种实施 方式中,将编码有关肽的DNA表达载体注入宿主动物,例如注入受治 疗者的皮肤或肌肉。
基因产物被正确地合成和糖基化,折叠,被受治疗 者表达。
利用这种方法,可以将难以足量获得或纯化的抗原给药。
在一 种实施方式中,通过粒子轰击装置“基因枪”将DNA注入肌肉或者释 放到皮肤中,DNA是涂在金微粒上的。
已经显示遗传免疫诱导特异性体 液应答和细胞免疫应答(例如参见Mor等1995《免疫学杂志》155:2039; Xu和Liew.1995《免疫学》84:173;Davis等1994《疫苗》12:1503)。
可溶性B7分子的最优给药过程可以因所治疗的受治疗者而异。
例 如,可溶性B7分子可以与抗原给药和/或可以在抗原给药之前单独给 药,或者可以在抗原给药之后若干天单独给药。
在一种实施方式中,可 溶性B7分子可以“遗传”给药,也就是将编码可溶性B7分子或其部分 的核酸分子给药。
在另外一种实施方式中,可溶性B7分子与抗原是以 缀合物的形式给药的。
可溶性B7分子的给药剂量方案经过调整,可以为每名受治疗者提 供最佳治疗反应,无需进行过度的实验。
例如,可以测量对抗原的抗体 效价或对抗原的细胞免疫应答(例如DTH应答(Puccetti等1994《欧洲 免疫学杂志》24:1446)),以确定受治疗者是否对抗原正在形成免疫 应答或者正在表现增强了的免疫应答,相应地可以调整剂量方案。
活性药物或组合物还可以通过肠胃外或腹膜内方式给药。
药物例如 可以通过鼻内、口服、静脉内、肌内、皮下或黏膜方式给药。
还可以在 甘油、液体聚乙二醇及其混合物和油中制备分散系。
在普通的贮存和使 用条件下,这些制剂可以含有防腐剂,以防止微生物的生长。
适合注射的药物组合物包括无菌水溶液(若是水溶性的)或分散系, 和用于临时制备无菌注射溶液或分散系的无菌粉末。
本发明的药物组合 物经过配制,可以适合于特定的给药途径。
例如,在各种实施方式中, 本发明的药物组合物可以适合于注射、吸入或吹入(通过口或鼻),或 者适合于鼻内、黏膜、口服、颊、肠胃外、直肠、肌内、静脉内、腹膜 内和皮下释放。
药物或组合物将是无菌的。
另外,它们应当在制备和贮存条件下是 稳定的,应当防止微生物、例如细菌和真菌的污染作用。
载体可以是溶 剂或分散介质,例如含有水、乙醇、多元醇(例如甘油、丙二醇和液体 聚乙二醇等)及其适合的混合物。
适当的流动性可以这样保持,例如利 用包衣、例如卵磷脂,在分散系的情况下保持所需的粒径,和利用表面 活性剂。
各种抗细菌和抗真菌剂可以防止微生物的作用,例如对羟基苯 甲酸酯、氯丁醇、苯酚、抗坏血酸、硫汞撒等。
在很多情况下,优选的 是在组合物中包括等渗剂,例如糖,多元醇、例如甘露糖醇、山梨糖醇, 氯化钠。
在组合物中包括延迟吸收的试剂可以延长可注射组合物的吸 收,例如一硬脂酸铝和明胶。
无菌注射溶液可以这样制备,向适当的溶剂中加入所需量的活性组 合物或药物,以及根据需要的一种如上列举的成分或其组合,然后无菌 过滤。
一般地,分散系是这样制备的,向含有基本分散介质和如上列举 的所需其他成分的无菌载体中加入活性化合物(例如共同刺激分子和/ 或抗原和任意另外的药物)。
在用于无菌注射溶液制备的无菌粉末的情 况下,优选的制备方法是真空干燥和冷冻干燥,从其预先无菌过滤的溶 液中得到活性成分(例如药物或组合物)加任意另外的所需成分的粉 末。
药物或组合物在给药时可以是适用于无针注射药具的形式(这样的 药具是本领域已知的,例如参见5,383,851、5,581,198、5,846,233),例 如《分子医学》1998.4:109所述。
当活性药物或组合物被适当保护时,如上所述,蛋白质例如可以与 惰性稀释剂或可同化的食用载体一起口服给药。
本文所用的“药学上可 接受的载体”包括任意所有的溶剂、分散介质、包衣剂、抗细菌与抗真 菌剂、等渗剂和吸收延迟剂等。
这类介质和试剂关于药学活性物质的用 途是本领域熟知的。
除了与活性化合物不相容的那些常规介质或试剂以 外,其在治疗组合物中的用途是被期待的。
也可以向组合物中加入补充 的活性化合物。
尤其有利的是配制肠胃外组合物的剂量单元形式,有利于给药和剂 量的均匀。
本文所用的剂量单元形式指的是物理上不连续的单元,适合 作为哺乳动物受治疗者的单元剂量;每个单元含有预定量的活性化合物 以及所需的药物载体,该预定量经过计算,产生所需的治疗效果。
本发 明剂量单元形式的规范听命于和直接取决于(a)活性化合物的独特特征 和所要达到的治疗效果,和(b)复合这样一种活性药物或组合物用于个体 治疗领域所固有的限制。
本文所用的“药学上可接受的载体”例如包括溶剂、分散介质、包 衣剂、抗细菌与抗真菌剂、等渗剂和吸收延迟剂等。
这类介质和试剂关 于药学活性物质的用途是本领域熟知的。
也可以加入补充的试剂。
本发明的药物以适合于体内药物给药的生物学上可相容的形式对受 治疗者给药,以增强免疫应答。
“适合于体内给药的生物学上可相容的 形式”表示所要给药的蛋白质形式,其中药物的治疗效果重于任何毒性 作用。
术语受治疗者打算包括其中能够引起免疫应答的活生物体,例如 哺乳动物。
受治疗者的实例包括人、非人灵长类、狗、猫、小鼠、大鼠 及其转基因物种。
如本文所述具有B7分子活性的肽的给药可以是任意 药理学形式,其中包括治疗有效量的单独的可溶性B7肽、可溶性B7 肽与抗原的组合和可溶性B7肽与药学上可接受的载体的组合。
治疗或预防有效量的本发明组合物的给药被定义为在达到所需结果 所必要的剂量和时间阶段下有效的量。
优选地,可溶性B7分子的给药 (含有或不含抗原)导致对抗原(例如病毒或肿瘤细胞抗原)的免疫应 答增强。
受治疗者对抗原的免疫应答(例如细胞和/或体液免疫应答)可以利 用本领域公认的技术加以测量。
对抗原的免疫应答测量可以在体内或体 外进行。
例如,通过进行活组织检查并寻找细胞浸润,可以测量免疫细 胞对肿瘤细胞的反应性。
在感染部位或肿瘤部位附近或者在引流淋巴结 中可以进行原位细胞因子染色。
可以进行细胞的体外培养,以试验细胞 对抗原的反应性(例如在抗原存在下的增殖和/或细胞因子产生,和/或 对抗原的细胞毒活性)。
例如,具有B7活性的多肽的治疗或预防有效 量可因各种因素而异,例如个体的疾病状态、年龄、性别与体重、和肽 引起个体所需应答的能力。
剂量方案经过调整,可以提供最佳的治疗或 预防应答。
例如,可以每日分若干次给药或者可以适当减少剂量,这视 治疗情形的紧急程度而定。
活性化合物可以按适宜的方式给药,例如注射(皮下、静脉内等)、 口服给药、吸入、透皮用药或直肠给药。
根据给药途径,活性化合物可 以是包衣的,以保护化合物不受酶、酸和其他自然条件的作用,这些可 能使化合物失去活性。
本发明进一步涉及药物形式的活性化合物,用在本文所述的疗法 中。
活性化合物还可以用于治疗药物的制备。
V、其他药物的给药 治疗可以得到其他药物给药的补充,以进一步增加免疫应答。
例如, 可以将佐剂和/或细胞因子对受治疗者给药。
在一种实施方式中,可以将细胞因子给药,例如:粒细胞-巨噬细胞 集落刺激因子、巨噬细胞集落刺激因子、粒细胞集落刺激因子、白介素 1、白介素2、白介素3、白介素4、白介素5、白介素6、白介素7、白 介素10和/或白介素12。
也可以将干扰素给药,例如α、β和/或γ干扰素。
优选地,将诸如IL-12等细胞因子给药,它们有助于Th1-型T辅助应答 的形成和细胞免疫的形成。
在另一种实施方式中,可以将其他调制共同 刺激信号的药物对受治疗者给药,例如抗-CD28抗体。
在另一种实施方式中,可以将已知为佐剂的药物给药。
如今唯一广 泛用于人的佐剂是明矾(磷酸铝或氢氧化铝)。
其他佐剂例如皂甙及其 纯化组分Quil A、Freund完全佐剂和其他用于研究与兽医应用的佐剂在 人用疫苗中具有潜在的用途。
不过,也可以使用新的化学限定的制剂, 例如胞壁酰二肽、一磷酰基脂质A、磷脂缀合物(例如Goodman-Snitkoff 等《免疫学杂志》147:410-415(1991)所述的那些)、雷琐酚、非离子表 面活性剂(例如聚氧乙烯油酰醚和正十六烷基聚乙烯醚)、酶抑制剂(包 括胰蛋白酶抑制剂)、二异丙基氟代磷酸酯(DEP)和抑肽酶。
在将抗原 给药的实施方式中,抗原例如可以被包封在脂蛋白体内,如Miller等《实 验医学杂志》176:1739-1744(1992)所述,引用在此作为参考文献,或者 被包封在脂质囊中,例如Novasome TM脂质囊(Micro Vescular Systems, Inc.,Nashua,N.H.),以进一步增强免疫应答。
除非另有指示,本发明的实施将采用本领域常规的细胞生物学、细 胞培养、分子生物学、微生物学、重组DNA和免疫学技术。
这样的技 术在文献中有详细解释。
例如参见《遗传学:分子克隆实验室手册》第 2版Sambrook,J.等编(Cold Spring Harbor Laboratory Press(1989));《分子 生物学简明方案》第3版Ausubel,F.等编(Wiley,NY(1995));《DNA克 隆》第I和II卷(D.N.Glover编,1985);《寡核苷酸合成》(M.J.Gait编 (1984));Mullis等美国专利No:4,683,195;《核酸杂交》(B.D.Hames & S. J.Higgins编(1984));专著《酶学方法》(Academic Press,Inc.,N.Y.);《细 胞与分子生物学中的免疫化学方法》(Mayer和Walker编,Academic Press, London(1987));《实验免疫学手册》第I-IV卷(D.M.Weir和C.C. Blackwell编(1986));Miller,J.《分子遗传学实验》(Cold Spring Harbor Press,Cold Spring Harbor,N.Y.(1972))。
所有引述在本申请中的参考文献、未决专利申请和公布的专利的内 容据此特意加以引用作为参照。
本文公开的每篇参考文献都是全文引用 的。
作为本申请优先权基础的所有专利申请也都全文引用在此作为参考 文献。
下列实施例进一步阐述本发明,它们不应当被解释为进一步的限 制。
实施例 实施例1:可溶性共同刺激分子增强CTL应答 最佳的T细胞活化作用既要求通过T细胞受体发信号,也要求共同 刺激作用。
B7-1和B7-2是APC表面上的两种有力的共同刺激分子。
已 经检查了B7-2的可溶形式体内对T细胞应答的作用。
可溶性分子是一 种嵌合蛋白,含有B7-2的细胞外结构域,与小鼠IgG2a的Fc区融合。
在用II类限制肽免疫之时将B7-2Ig融合蛋白给药,显著增强抗原-特异 性T细胞增殖和细胞因子应答。
B7-2Ig给药还增强对I类限制肽免疫的 CTL应答。
在对II类限制肽的T辅助细胞应答的存在下,B7-2Ig对CTL 应答的增强作用显著增加。
这些发现证明了共同刺激分子、例如B7-2 的可溶性蛋白形式对多T细胞免疫应答参数的免疫刺激活性,并且证 明,这些分子在传染病和疫苗适应征中具有临床应用。
实施例1所用材料和方法: 小鼠 本研究使用7至10周龄的雌性BALB/cJ小鼠(Jackson Labs,Bar Harbor,ME)。
肽免疫原的制备 所用全部肽都是H-2d-限制的优势免疫表位,来自流感病毒 A/PR18/34的核蛋白(NP)。
借助HOBT/DCC氨基酸活化作用,利用标准 的Fmoc/NMP化学,在PE Biosystems 430A肽合成仪上合成I类限制肽 aa 147-155 TYQRTRALV(Taylor,P.M.等1987《免疫遗传学》26:267) 和II类限制肽aa 55-77 RLIQNSLTIERMVLSAFDERRNK-OH与aa 206- 229 FWRGENGRKTRIAYERMCNILKGK(Brett,S.J.等1991《免疫学杂 志》147:1647)。
在Beckman HPLC上分析和纯化,利用Bruker MALDI 质谱仪确认质量。
AIPR18/34病毒原种的制备 为了制备和滴定AIPR18/34流感病毒原种,将种病毒按104稀释比 注射到10天含胚鸡卵中。
培养42小时后,逐个收获被感染卵的尿囊液, 在血液琼脂板上加以无菌确认。
汇集无菌的尿囊液,制备等分试样,速 冻贮存在-70℃下。
在病毒的快速融化和稀释(在尿囊液中)之后进行噬 斑滴定(Bucher,D.J.等1991《临床微生物学杂志》29:2484)。
B7-2Ig融合蛋白 如前人所述表达和纯化B7-2Ig融合蛋白(Fields,P.E.等1998《免疫 学杂志》161:5268)。
简而言之,表达质粒pED是这样构建的,连接编 码小鼠B7-2的信号和细胞外结构域的cDNA与编码小鼠IgG2a铰链区、 CH2和CH3区的基因组DNA。
将表达载体转染到CHO细胞系中,用 前人所述技术扩增(Kaufman,R.J.等1988《生物化学杂志》263:6352)。
使浓缩后的细胞培养物上清液通过蛋白A琼脂糖快速流动柱(Pharmacia Biotech)。
将B7-2Ig用20mM柠檬酸盐pH3.0洗脱,用1M Tris(Sigma) pH8.0中和,通过缓冲交换配制在PBS pH7.2中。
利用280nm吸光度 计算蛋白质浓度,消光系数为1.33cm/mg/ml。
内毒素水平小于 0.25EU/mg,这是用凝胶凝块测定法测定的(Cape Cod Associates)。
多聚 体形式蛋白质的百分率小于1%,这是用TSK 3000 SWXL柱测定的(Toso Haas USA,Mongomeryville,PA)。
B7-2Ig的体外共同刺激活性已经得到 证实(Fields,P.E.等1998《免疫学杂志》161:5268)。
这里列举的实验 至少进行三次,结果是相似的。
每项实验至少重复进行一次,使用抗无 关人蛋白GDF-9的纯化小鼠单克隆IgG2a(Genetics Institute,Cambridge MA)作为B7-2Ig处理的对照。
肽免疫 将100μg指定肽或肽混合物按体积1∶1与IFA(Sigma)混合,乳化。
向尾根部皮下给以100μl抗原/IFA乳剂,致小鼠免疫。
在邻近肽免疫部 位的部位将100μl B7-2Ig皮下给药。
在收获淋巴结细胞的实验中,小鼠 在尾根部和颈后部都接受肽和B7-2Ig给药,如上所述。
每个治疗组由5 只小鼠组成。
所给药的是B7-2Ig的0.1氢氧化铝溶液(Rehydragel,Rehies, Dublin,Ireland)。
活病毒免疫和攻击 将Metafane(Mallinckrodt Veterinary,Mundelein,IL)通过头锥体给 药,直至小鼠丧失反射应答。
将稀释在PBS中的活病毒鼻内给药,最终 浓度为40μl。
病毒致死剂量(4,000PFU/小鼠)导致未免疫小鼠100%死 亡。
40PFU/小鼠的免疫剂量导致没有死亡,完全保护小鼠不受致死攻 击。
增殖测定 在指定日期收集淋巴结(肠系膜结除外)和脾脏,制备单细胞悬液, 在200μl RPMI 1640(Gibco/BRL)中,按5×105细胞/孔培养在平底96孔 平板中,培养基补充有5×10-5M 2ME、2mM L-谷氨酰胺、100U/ml青 霉素、100μg/ml链霉素(Gibco/BRL)和10%FCS。
在培养开始时按指定 浓度加入II类限制肽。
利用1450 Microbeta平板读数器(Wallac),通过 18小时脉冲处理(1μC/孔)后的3H胸苷结合作用测量增殖作用。
初次 免疫后第3、5、7和9天进行淋巴结细胞的增殖应答比较。
再次免疫后 三天收获脾脏,评估再次应答。
细胞因子测定 如上关于增殖测定所述培养细胞。
在第3天收获上清液,利用商业 上可得到的试剂盒,通过ELISA法测定IFN-γ、IL-5和IL-13的水平(IFN-γ 用Genzyme,Cambridge MA测定,IL-5用Endogen,Woburn MA测定, IL-13用R&D Systems,Minneapolis,MN测定)。
个别未分离的小鼠血细胞样本的CTL测定 初次免疫后两至三周,从Aerrane(Ohmeda Caribe,Inc,Guayama,PR) 麻醉的小鼠眼眶后放血,收集血液样本(每份150μl至200μl)。
将样 本用100μl含有50U肝素的PBS稀释。
取40μl样本进行白细胞计数。
样本的微分计数不是例行方法。
在研究期间不同时间取100份样本进行 微分计数,淋巴细胞占白细胞部分的百分率为69%±8%。
洗涤细胞,以 除去肝素。
将总计8×105WBC/小鼠重新悬浮在10ml如上关于增殖测定 所述经过补充的RPMI 1640培养基中,另外,为产生体外初次CTL应 答而作下列补充:4μg/ml抗-CD28(PV1.17)与10U/ml重组鼠IL-12 (rmIL-12,Genetics Institute,Cambridge,MA)、10U/ml IL-2与200U/ml IL-6(Genzyme,Cambridge,MA)、0.1pM I类限制肽(TYQRTRALV,aa 147-155)和1×106/ml辐射处理(2,000rads)同基因脾细胞,脾细胞用经 过0.017M Tris缓冲的0.17M NH4Cl处理过,以溶解RBC(Gajewski,T. F.1996《免疫学杂志》156:465)。
将体积为100μl的细胞平板接种在96孔圆底Costar平板中,每孔总 计8×103个白细胞。
每份血液样本总共平板接种80个孔。
每个平板上 有16个孔仅接受含有辐射处理脾细胞的培养基。
在培养的第7天,倒 置平板以倾泻上清液,搅拌平板以悬浮细胞颗粒。
将P815细胞用10μg/ml I类限制肽脉冲处理过夜,制备抗原-阳性(Ag-阳性)靶。
向50%孔的 100μl培养基中加入1×103Ag-阳性、51Cr标记的P815靶,向其余50% 加入1×103Ag-阴性、51Cr标记的对照P815靶。
每个平板不含效应细胞 的16个孔中,8个用来自发释放,8个用于最大释放测量。
加入20μl 10% Triton X100达到全体释放。
培养4小时后,将50μl上清液/孔收获到 Wallac 96孔平板(1450-401)内,加入125μl闪烁剂(OptiPhase SuperMix, Wallac,Turku,Finland),在Wallac Microbeta 1450中计数平板。
平均特异性溶胞率的计算 按照标准公式计算每孔的溶胞率: 其中全体释放是所有接受靶和triton-X100的孔的平均cpm,培养基释放 是所有仅接受靶和培养基的孔的平均cpm+SD。
按照下列公式计算每孔 的平均特异性溶胞率: 数据以平均特异性溶胞±SD表示,这是通过每组五只小鼠所得每孔 平均特异性溶胞值再取平均而计算得到的。
利用双尾学生t检验测定统 计学显著性。
结果: B7-2Ig增强对II类限制肽免疫的初次CD4+T细胞增殖应答 为了测定B7-2Ig是否会增强或抑制对肽免疫的初次T细胞应答,在 有或没有B7-2Ig给药的存在下将小鼠用肽免疫。
将来自A/PR/8/34流感 病毒NP的II类限制肽aa 55-77和aa 206-229在IFA中的混合物皮下给 药。
这些肽已经显示是免疫显性CD4+Th细胞表位(Brett,S.J.等1991 《免疫学杂志》147:1647,Brett,S.J.和J.P.Tite.1996)。
与及不与H-2 连接的基因都影响流感核蛋白表位被CD4+T细胞识别(《免疫学》87: 42)。
在邻近部位将B7-2Ig(0.1%明矾溶液)给药。
在预备研究中,在 免疫后第3、5、7和9天测量淋巴结细胞的肽特异性增殖应答。
应答的 动力学不受B7-2Ig给药的影响。
在免疫后第7和9天,B7-2Ig和对照处 理的小鼠都观察到最佳的增殖应答。
如图1所示,在肽免疫之时用B7- 2Ig处理导免疫9天后收获的淋巴结细胞的抗原特异性增殖应答显著增 加(p=0.014,体外用50μg/ml肽重新刺激)。
图1中,将每组五只小 鼠在两个皮下部位用IFA乳剂免疫,每次注射的IFA乳剂各含有100μg 两种II类限制肽或PBS。
在邻近免疫部位的部位将100μg B7-2IgG2a的 0.1%明矾溶液或单独的0.1%明矾给药。
将小鼠淋巴结细胞用单独的肽 免疫(-○-)、用单独的B7-2Ig处理(-△-)或者用肽免疫且用B7-2Ig处理(- ■-),在免疫9天后收获,体外各用指定浓度的免疫所用两种肽重新刺 激。
不接受B7-2Ig的肽免疫小鼠接受明矾作为对照。
通过3H-胸苷结合 作用测定增殖作用。
数据以每组5只小鼠的平均cpm/孔±SD表示。
当使 用IgG2a mAb小鼠作为对照时得到相似结果。
数据来自三次代表性实验 之一。
在没有免疫作用下的B7-2Ig给药不导致增殖应答,证明了B7-2Ig 作用在初次免疫后的抗原依赖性。
这些结果证明,B7-2Ig的体内给药增 强对肽免疫的CD4+Th细胞应答。
B7-2Ig增强回忆应答 为了试验初次抗原特异性增殖应答的B7-2Ig依赖性增强作用是否 增强回忆应答,在有或没有B7-2Ig处理的存在下将小鼠用肽免疫,四十 六天后加强,而没有进一步的B7-2Ig给药。
再次免疫后3天收集脾细胞, 测量肽特异性增殖应答。
如图2所示,在初次免疫之时已经接受单一 B7-2Ig处理的小鼠在再次免疫后比从未接受B7-2Ig的小鼠具有更大的 增殖应答(p=0.0006,体外用100pg/ml肽重新刺激)。
将每组五只小 鼠用单独的肽免疫(-○-)、用单独的B7-2Ig处理(-△-)或者用肽免疫且用 B7-2Ig处理(-■-)。
初次免疫后第46天,在没有B7-2Ig共同给药的存在 下将两组肽免疫小鼠都用肽重新免疫。
非免疫小鼠仅接受IFA。
重新免 疫后三天,将脾细胞体外各用指定浓度的免疫所用两种肽重新刺激。
通 过3H-胸苷结合作用测定增殖作用。
数据以每组5只小鼠的平均cpm/孔 ±SD表示。
数据来自两次重复实验之一。
这些数据表明,B7-2Ig当用作 初次T细胞应答的佐剂时,增强回忆应答。
B7-2Ig增强Th1与Th2依赖性初次细胞因子应答 为了测定作为免疫佐剂的B7-2Ig是否有差别地促进Th1或Th2应答 的形成,在免疫后第3、5、7和9天分析免疫小鼠淋巴结细胞在初次免 疫后的肽特异性细胞因子应答。
正如增殖应答一样,在第9天观察到最 佳的细胞因子应答。
如表I所示,在用肽免疫之时的B7-2Ig给药导致与 Th1有关的细胞因子IFN-γ(p=0.017)、与Th2有关的细胞因子IL-5 (p=0.011)和IL-13(p=0.002)的产生水平显著增加。
在来自用B7-2Ig处理 的未免疫小鼠的培养物中没有观察到抗原特异性细胞因子产生作用。
这 些结果表明,B7-2Ig增强Th1与Th2表型的初次T细胞应答。
B7-2Ig增强对I类限制肽的CTL应答 膜结合B7与CD28的相互作用已经显示可以在没有CD4+细胞的存 在下诱导体外CTL应答(Harding,F.A.等1993《实验医学杂志》177: 1791)。
为了试验B7-2Ig对初次CTL应答的作用,将小鼠用免疫显性I 类限制肽的IFA乳剂免疫,伴随或者不伴随B7-2Ig给药。
利用少量血 样测量未分离外周血细胞的肽特异性CTL应答,CTL测定如材料和方 法所述。
该测定有可能实现在单一实验中分析大量小鼠、评估组间的统 计学显著性差异、在免疫应答期间重复个别小鼠的CTL测定和研究CTL 应答与体内结果之间的相互关系。
数据以每只小鼠的单一数值(平均特异性溶胞率)表示(图3)。
将肽的IFA乳剂给药(100μg/小鼠)。
将B7-2Ig皮下共同给药(100μg 的0.1%明矾溶液/小鼠)。
免疫后三周收集未分离的血液,测量CTL。
数据以平均特异性溶胞率±SD表示。
活病毒免疫组的数值来自2只小鼠 的单一汇集物,在9项独立的实验中试验18只小鼠,得到该组的平均 特异性溶胞率为52±12。
所有其他组中,每组有五只小鼠。
所示数据来 自三次重复实验之一。
对I类限制肽IFA乳剂的应答不明显高于背景。
该发现与Fayolle等1991《免疫学杂志》147:406的发现是一致的,他 们指出在没有T细胞的帮助下,对I类限制肽IFA乳剂的CTL应答接近 于背景水平。
当在用I类限制肽IFA乳剂免疫之时将B7-2Ig给药时,观 察到应答有微小而统计学显著(p=0.013)的增加(图3)。
不过,与用活 病毒免疫的小鼠的肽特异性应答相比,用肽免疫且用B7-2Ig共同给药的 小鼠的肽特异性CTL应答的幅度小。
因此,100μg B7-2Ig的共同给药不 升高对I类限制肽免疫作用的应答至用有效活病毒免疫法所达到的最大 水平。
B7-2Ig对CTL应答的最佳增强作用需要T细胞的帮助 由于最佳的CTL应答取决于Th细胞(Fayolle,C.等1991《免疫学 杂志》147:4069;Keene,J.A.等1982《实验医学杂志》155:768;von Herrath,M.G.等1996《病毒学杂志》70:1072和Ossendorp,F.等1998《实 验医学杂志》187:693),因此在将小鼠用已知引起Th细胞应答的肽共 同免疫的条件下试验B7-2Ig对CTL应答的作用。
将小鼠用含有单独的I 类限制肽或I类限制肽与两种II类限制肽的混合物的IFA乳剂免疫,如 图1与2和下表I所述。
测量未分离的外周血细胞的CTL应答(图4)。
以单一的IFA乳剂形式进行肽免疫作用。
按指定方法将小鼠免疫和处 理。
三周后,测量外周血液的CTL应答。
数据以平均特异性溶胞率±SD 表示。
活病毒免疫组的数值来自2只小鼠的单一汇集物,在9项独立的 实验中试验18只小鼠,得到该组的平均特异性溶胞率为52±12。
所有其 他组中,每组有五只小鼠。
接受II类限制肽IFA乳剂和对照Ig明矾溶 液的组的平均特异性溶胞率减去接受对照Ig的组的平均特异性溶胞 率。
接受II类限制肽IFA乳剂和B7-2Ig明矾溶液的组的平均特异性溶 胞率减去接受B7-2Ig的组的平均特异性溶胞率。
所示数据来自四次重复 实验之一。
用I类与II类限制肽的混合物免疫的小鼠细胞的平均特异性溶胞率 显著高于用单独的I类限制肽免疫的小鼠细胞(实验显示p=0.046,重复 实验为.004)。
用I类与II类限制肽的混合物免疫且用100μg B7-2Ig处 理导致平均特异性溶胞率显著大于不接受B7-2Ig的肽免疫小鼠(四次重 复实验中p=0.003、p=0.0001、p=0.045和p=0.0012)。
当B7-2Ig的剂量 增加一倍至200μg/小鼠时,并不增加这种应答,说明100μg剂量诱导最 大的B7-2Ig依赖性增强作用。
肽混合物免疫与B7-2Ig处理的结合导致肽特异性CTL应答在幅度 上类似于活病毒免疫作用所引起的应答。
将9项独立实验中18只活病 毒免疫小鼠所得数值取平均后,得到平均特异性溶胞值为52±12,证明 了少量外周血样CTL测定法的可再现性和在T细胞的帮助与B7-2Ig的 存在下的肽的免疫作用所引起的应答相当于有效活病毒免疫法所引起 的应答这一结论的有效性。
从外周血细胞检测的CTL应答在2至3周达 到峰值,在第五周淡化,用活病毒免疫的小鼠和用肽免疫且用B7-2Ig 处理的小鼠都是如此,再次说明应答的相似性。
不过正如下文所讨论 的,用肽混合物免疫且用B7-2Ig处理的小鼠不被保护免受致死病毒的攻 击。
图3和4数据是由配制在0.1%明矾中的B7-2Ig所产生的,前者本 身是一种经过临床批准的免疫佐剂(Aprile,M.A.等1966《加拿大公共 卫生杂志》57:343)。
单独的明矾或对照Ig的明矾溶液给药不影响抗肽 应答,明矾制剂也不是B7-2Ig依赖性免疫增强作用所需的。
不过,明矾 制剂的确强化B7-2Ig的作用。
若直接比较B7-2Ig的明矾溶液的作用与 B7-2Ig的PBS溶液的作用,在将B7-2Ig的明矾溶液给药时观察到更大 的CTL应答增强作用(平均溶胞率含有明矾为72±13,不含明矾为 38±12,p=0.007)。
T细胞的最佳抗原特异性活化作用和调节作用需要共同刺激信号从 APC表面上的B7分子释放到T细胞表面上的CD28与CTLA-4 (Boussiotis,V.A.等1996《免疫学评论》153:5;Lenschow,D.J.等1996 《免疫学年评》14:233;Green,J.M.等1994《免疫》1:501;Tivol,E.A. 等1995《免疫》3:541和Waterhouse,P.1995《科学》270:985)。
多种 小鼠模型研究显示,通过增加B7的细胞表面表达能够增强免疫应答。
在这些研究中,B7表达的增加是如下诱导的:肿瘤细胞转导(Baskar,S. 等1993《美国国家科学院院报》90:5687;Cavallo,F.等1995《欧洲免疫 学杂志》25:1154;Coughlin,C.M.等1995《癌症研究》55:4980;Chen,L. 等1992《细胞》71:1093;Chen,L.等1994《实验医学杂志》179:523; Gajewski,T.F.等1996《免疫学杂志》8:2909;Yang,G.等1995《免疫学 杂志》154:279和Dunussi-Joannopoulos K.等1996《血液》87:2938)、 cDNA注入(Kim,J.J.等1997《天然生物工程》15:641;Kim,J.J.等1998 《新疫苗》16:1828和Horspool,J.H.等1998《免疫学杂志》160:2706) 或用病毒载体感染(Chamberlain,R.S.等1996《癌症研究》56:2832; Emtage,P.C.等1998《免疫学杂志》160:2531;Hodge,J.W.等1994《癌 症研究》54:5552和Putzer,B.M.等1997《美国国家科学院院报》94: 10889)。
利用增加体内B7水平的不同策略,已经开发了B7-2的可溶 性蛋白形式B7-2Ig,由小鼠IgG2a的Fc组成,该Fc与B7-2的细胞外 部分融合,该部分与每条Ig链连接。
B7-2Ig的体内给药增强抗原特异 性Th细胞与CTL应答。
因而,B7-2Ig的体内给药是肿瘤细胞的来自体 外B7转导或者使用病毒或DNA载体优化B7-2介导共同刺激的简单的 替代选择。
因为传染病和自体免疫疾病的后果大大受到应答性Th细胞产生细 胞因子的模式的影响,所以人们有兴趣确定B7途径是否能够用来向Th1 或Th2型细胞因子应答偏斜(Kuchroo,V.K.等1995《细胞》80:10; Lenschow,D.J.等1995《实验医学杂志》181:1145;Corry,D.B.等1994 《免疫学杂志》153:4142;Freeman,G.J.等1995《免疫》2:523;Schweitzer, A.N.等1997《免疫学杂志》158:713;Rulifson,I.C.等1997《免疫学杂 志》158:658和McAdam,A.J.等1998《免疫学评论》165:231)。
大量 实验系统表明,Th2分化比Th1分化更依赖于B7的共同刺激作用 (Lenschow,D.J.等1995《实验医学杂志》181:1145;Corry,D.B.等1994 《免疫学杂志》153:4142;Freeman,G.J.等1995《免疫》2:523和Rulifson, I.C.等1997《免疫学杂志》158:658)。
抗-B7 mAb已经成功地用于体 内操纵T细胞分化。
B7-1被mAb阻断据报道有助于Th2分化,而B7- 2的阻断有助于Th1分化(Kuchroo,V.K.等1995《细胞》80:Mar 10(5); Lenschow,D.J.等1995《实验医学杂志》181:1145;Corry,D.B.等1994 《免疫学杂志》153:4142;Freeman,G.J.等1995《免疫》2:523和Rulifson, I.C.等1997《免疫学杂志》158:658)。
相反,Schweitzer等利用B7失 效小鼠APC发现,B7-1或B7-2体外似乎都不选择性调节Th1或Th2 的分化(Schweitzer,A.N.等1997《免疫学杂志》158:713)。
该例数据 显示,B7-2Ig的体内给药增强Th1和Th2型的抗原特异性细胞因子应 答。
因此,治疗潜在性B7-2Ig很可能在以升高而非偏斜应答为目标的情 况下是最好的。
为了试验B7-2Ig对CTL应答的作用,比较用来自流感病毒 A/PR/8/34的NP的肽所引起的肽特异性CTL应答和用来自活病毒免疫 小鼠的相同的肽所引起的应答。
B7-2Ig处理诱导对I类限制肽IFA乳剂 的应答的小而显著的增强作用。
这些数据是一致的,证明在没有外来帮 助的存在下,用B7转染的肿瘤细胞足以产生体外CTL应答(Harding,F. A.等1993《实验医学杂志》177:1791)。
不过,被B7-2Ig增强的应答显著低于对活病毒免疫小鼠的相同的肽 的CTL应答。
这些数据显示,小鼠能够比通过I类限制肽免疫且B7-2Ig 共同给药所引起的小鼠应答产生大得多的抗肽应答。
在进一步增强对I类限制肽的应答的努力中,研究了向含有I类限 制CTL肽抗原的IFA乳剂中加入Th细胞、II类限制肽抗原的作用。
前 人报道最佳的CTL应答取决于Th细胞(Fayolle,C.等1991《免疫学杂 志》147:4069;Keene,J.A.等1982《实验医学杂志》155:768;von Herrath, M.G.等1996《病毒学杂志》70:1072和Ossendorp,F.等1998《实验医 学杂志》187:693)。
在用I类与II类限制肽免疫的小鼠中,CTL应答 显著升高。
这些数据表明,Th细胞抗原的共同免疫能够提供对抗肽抗原 的CTL应答的帮助。
CTL与Th肽表位之间的共价连接并不是所需要 的,提示任何免疫原性蛋白质都可以用作共同免疫原,以提供对CTL 应答的帮助。
我们的发现进一步支持了该结论,也就是向含有I类限制 肽的IFA乳剂中加入KLH,导致肽特异性CTL应答的显著增强作用。
尽管得到增强,用I类与II类限制肽免疫的小鼠的肽特异性CTL应 答也小于用活病毒免疫的小鼠。
向方案中加入B7-2Ig增加用肽混合物免 疫的小鼠的CTL应答至用活病毒免疫的小鼠的水平。
这两组的应答是相 当的,但是前者不被保护免受致死病毒的攻击。
该结果与Lawson等的 结果是一致的(Lawson,C.M.等1994《病毒学杂志》68:3505),他们 通过将表达肽的重组疫苗病毒给药,引起对用在该项研究中的相同的肽 的剧烈CTL应答。
目前,对单独这种肽的剧烈CTL应答不足以赋予 BALB/c小鼠以保护性免疫。
尽管不是B7-2Ig的免疫增强作用所需要的,明矾制剂仍然导致比 PBS制剂更大的增强作用。
对照Ig的明矾溶液给药不影响应答,说明单 独的明矾不增强应答。
用活病毒感染是I类限制应答活化作用的天然和有效的途径 (Zinkernagel,R.M.等1979《免疫学进展》27:51)。
因此,这里列出 的、表明从用活病毒免疫的小鼠和用I类与II类限制肽的混合乳剂免疫 且用B7-2Ig处理的小鼠得到相当的抗肽应答的数据确立了后者免疫方 案的有效性。
目前,引起对I类限制肽的CTL应答是很令人感兴趣的。
近些年来关于人CTL象小鼠CTL一样能够识别与肿瘤有关的I类限制 肽的证明提示,针对这些肽的CTL应答可以证实对人肿瘤有效(van der Bruggen,P.等1991《科学》254:1643;Wolfel,T.等1993《国际癌症杂志》 55:237;Maeurer,M.J.1996《黑色素瘤研究》6:11;Cormier,J.N.等1997 《科学美国人癌症杂志》3:37;Apostolopoulos,V.等1997《免疫学杂志》 159:5211;Rosenberg,S.A.1998《天然医药》4:321和Nestle,F.O.等1998 《天然医药》4:328)。
这种可能性刺激了人们更大的热情,设计优化 对I类限制肽疫苗的应答的免疫方案。
据报道,多种不同的策略都已取 得了成功,包括向重组病毒和细菌中插入小基因、肽的寡聚化、脂质的 修饰、cDNA的免疫、使用毒素和细胞因子作为佐剂和抗原脉冲刺激树 状细胞(Allsopp,C.E.等1996《欧洲免疫学杂志》26:1951;Rotzschke,O. 等1997《美国国家科学院院报》94:14642;Alving,C.A.等1995《免疫 学评论》145:1;Ciernik,I.F.等1996《免疫学杂志》156:2369;Porgador, A.等1997《免疫学杂志》158:834;Noguchi,Y.等1995《美国国家科学 院院报》92:2219和Takahashi,H.等1992《国际免疫学》5:849)。
这 里所报道的方法的优点是,它可一贯地应用于任何肽,无需进一步修 改,对I类和II类限制应答都有效。
B7-2Ig与肽免疫的共同给药升高相对弱的I类限制肽应答至相当于 由活病毒免疫所引起的水平,提示了B7-2蛋白的可溶形式也能够增强 对其他弱免疫原的应答。
这些发现显示,B7-2的可溶性蛋白形式可以在 免疫系统应答无效的癌症或传染病疗法中增强抗原特异性免疫应答。
表I:Th细胞因子应答的B7-2Ig依赖性增强作用a细胞因子在体外重新刺激后的表达 体内处理               IFNγ                           IL-5            IL-13                    (pg/ml±SD)      (pg/ml±SD)     (pg/ml±SD) 肽的免疫               b.db            54±44          136±125 肽免疫加B7-2Ig         1720±986        2479±1104      5365±1795 IFA加B7-2Ig            b.db            b.db           b.dba将每组五只小鼠在两个皮下部位用IFA乳剂免疫,每次注射的乳剂 含有100μg两种II类限制肽或PBS。
在邻近免疫部位的部位将100μg B7-2IgG2a的0.1%明矾溶液或单独的0.1%明矾给药。
九天后,收获淋巴 结细胞,在培养基中用5μg/ml各种肽重新刺激三天。
从一式三份的小 孔所得结果取平均,得到关于每只小鼠的数值。
数据以组内小鼠细胞因 子的平均浓度±SD表示。
结果类似于使用IgG2a mAb作为对照的对照小 鼠所得结果。
所示数据是三次重复实验之一。
b低于测定法的检测限度。
实施例2:B7-IgG融合蛋白增强抗肿瘤免疫应答,诱导已建立肿瘤 的消退 评价了B7-1或B7-2的细胞外区与IgG2a之间的融合蛋白关于它 们在四种不同的鼠肿瘤模型中增强抗肿瘤应答的能力,包括弱免疫原 性黑色素瘤B16/F10。
当与B7-1或B7-2 IgG混合时,用辐射处理肿 瘤细胞进行单次疫苗接种,保护小鼠免受活肿瘤的攻击。
更显著地, 在用与B7-IgG混合的辐射处理肿瘤细胞进行疫苗接种后,已经生长7 天的肿瘤消退了。
甚至单独的B7-IgG的治疗性给药也类似地减少了 肿瘤的负担。
已经排斥已建立肿瘤的动物对重新攻击是耐受性的,强 烈提示了B7-IgG的抗肿瘤作用是由肿瘤特异性免疫机理介导的。
另 外,用与B7-1或B7-2 IgG混合的辐射处理肿瘤细胞进行单次疫苗接 种,产生抗与肿瘤有关的抗原的CD8应答。
因而,B7-IgG与外源性 释放的和内源性抗原结合表现有力的佐剂活性。
这些发现提示了B7-Ig 增强抗肿瘤与抗病毒应答的临床价值。
实施例2所用材料和方法 鼠B7-1-IgGIgG和B7-2-IgG2a融合蛋白的表达质粒是这样构建 的,连接编码鼠B7-1或B7-2的信号和细胞外结构域的DNA与编码 从鼠IgG2a抗体衍生的铰链区-CH2-CH3结构域的DNA。
抗体铰合区 内的半胱氨酸残基保持保守,以便所产生的mB7-1-IgGIgG2a或mB7- 2-IgG2a是二聚体和二价的。
在所生成的融合蛋白中,为了防止被高 亲和性Fc受体结合和防止补充活化,突变IgG2a区(称为B7- IgG2mut)。
下列CH2结构域中的氨基酸残基被丙氨酸代替:#235位 亮氨酸、#318位谷氨酸、#320位赖氨酸和#322位赖氨酸。
关于B7-IgG 蛋白的产生,在CHO细胞系中表达质粒,分离蛋白质。
P815是从肥大细胞瘤衍生的肿瘤细胞系,在向DBA/2小鼠(Jackson Laboratories)真皮内(i.d.)注射5×104细胞后生长成为固体肿瘤。
用在 这些实验中的克隆在i.d.注射后自发转移,25-35天后引起小鼠死亡。
MethA是从Balb/C小鼠肉瘤衍生的肿瘤细胞系,在i.d.注射5×105细 胞后生长成为固体肿瘤(来自Taconic的Balb/C小鼠)。
B16/F10是从 C57BL/6小鼠(Taconic)黑色素瘤衍生的非免疫原性肿瘤系,在i.d.注射 1×105细胞后生长成为固体肿瘤,因在25-35天后转移导致死亡。
膀 胱癌MB49也是从C57BL/6小鼠衍生的,i.d.注射1×105细胞,100% 小鼠在5-7天后长出固体肿瘤。
体外共同刺激测定法 将2×105幼鼠脾细胞一式三份平板接种在96孔平板上,平板涂有 低浓度的抗-CD3 mAb(0-500ng-ml-2C11,Pharmingen)。
为了提供共同刺 激所必要的信号,平板同时涂有抗-CD28 mAb(0-1μg/ml)作为阳性对 照,或者涂有B7-1-IgG或B7-2-IgG(0-9μg/m1)。
还加入B7-IgG的可溶 形式或与次生抗-小鼠IgG2a Ab交联的形式。
将脾细胞刺激72小时。
取 上清液试样用于IFN-γ分析,将细胞用H3-胸苷脉冲处理8小时。
在标准 ELISA中进行IFN-γ分析,用捕获Ab R46A4和生物素基化XGM1.2作 为检测Ab。
疫苗接种方案 在预防性肿瘤疫苗模型中,在第0天,在小鼠被肿瘤细胞攻击的同 时进行疫苗接种。
将小鼠用辐射处理肿瘤细胞(1×107细胞)的PBS溶 液免疫,其中混合有75-100μg mB7-1-IgG、B7-2-IgG、鼠IgG或者什么 也没有。
对两条后肢给以爪垫内(i.fp.)注射。
在第3或5天重复一次 B7-IgG的注射。
在第7天,用限定剂量的活肿瘤细胞攻击动物,在右胁 i.d.注射50μl。
监测40-60天内的原发性肿瘤的生长和动物的存活率。
在治疗性肿瘤疫苗模型中,原发性肿瘤是通过i.d.接种限定数量的 肿瘤细胞而建立的。
在第5-7天(此时肿瘤可明显触知),用1×107辐 射处理肿瘤细胞i.fp.接种小鼠,其中混合有100μg B7-1-IgG、B7-2-IgG 或者什么也没有。
三天后再次i.fp.注射100μg B7-IgG。
这种疫苗接种方 案重复两或三周。
监测第7天至第40-70天内的原发肿瘤的生长和小鼠 的存活率。
在治疗模型中,将携带肿瘤的小鼠B7-IgG用单独的融合蛋白处理。
i.fp.注射50-100μg单独的B7-1-IgG或B7-2-IgG三周,一周两次。
监测 40天内的肿瘤生长和存活率。
P1A特异性CTL应答的检测 用混合有或者没有混合B7-1-IgG或B7-2-IgG的辐射处理P815细胞 单次免疫后10-14天,从DBA/2小鼠中收集脾。
红细胞溶解后,在T25 烧瓶内将20×106脾细胞用0.1ng/ml P1A肽和5U/ml IL-2(Pharmingen) 重新刺激6天。
然后,进行标准的5h Cr51-释放测定,用A20细胞作为 靶,用10μg/ml P1A进行肽脉冲处理或者不进行脉冲处理。
P1A-肽特异 性溶胞百分率以肽-脉冲处理的靶溶胞百分率与未脉冲处理的靶溶胞百 分率之间的差异表示。
结果: 固定化或交联的B7-IgG体外为次优刺激的鼠脾细胞提供共同刺激 信号 FACS或Biocore分析测定了B7-1-IgG和B7-2-IgG融合蛋白与鼠 CD28和CTLA-4结合。
为了测定B7-IgG融合蛋白增强还是抑制T细胞 活化作用,通过联合培养与平板结合的抗-CD3 mAb和固定在平板上的 B7-IgG,体外刺激鼠脾细胞。
与平板结合的抗-CD28 mAb的共同刺激作 用充当阳性对照。
B7-1-IgG和B7-2-IgG相似地诱导增殖和IFN-γ分泌的 剂量依赖性增加(图5)。
将2×105幼脾细胞一式三份用50ng/ml抗-CD3 单克隆抗体和递增数量的固定化抗-CD28抗体或B7-1或B7-2 IgG刺激 72小时。
6小时脉冲后加入3H-胸苷,测量增殖应答。
B和C栏分别显 示IFNγ或IL2的数量,它们在用50ng/ml抗-CD3抗体和指定数量的固 定化B7-2-IgG刺激72小时后释放。
用标准ELISA测量细胞因子。
在没 有抗-CD3刺激的存在下,B7-IgG不诱导增殖作用。
B7-IgG分子与次生 抗-鼠IgG mAb的固定化或交联是有效共同刺激所必需的,因为可溶性 B7-IgG蛋白不增强增殖作用或IFN-γ的产生。
在其Fc结合区突变的 B7-IgG蛋白(B7-1-IgG与B7-2-IgG2mut)当被固定在平板上时有效共同 刺激脾细胞。
B7-1-IgG或B7-2-IgG都增强辐射处理肿瘤细胞疫苗的保护功效 在预防性肿瘤疫苗模型中评价了作为佐剂的B7-IgG融合蛋白。
接 种5×104活P815肿瘤细胞,100%幼DBA/2小鼠在5-7天后生成固体肿 瘤。
将每组10只DBA/2小鼠用1×107辐射处理P815肿瘤细胞i.fp.免 疫一次。
细胞疫苗是单独给药的,或者与100μg的B7-1-IgG、B7-2-IgG 或它们的突变蛋白混合给药。
在第5天将B7-IgG再次给药。
作为对照, 在第0和5天将100μg单独的B7-1-IgG或B7-2-IgG i.fp.给药。
在第7 天用5×104活P815肿瘤细胞攻击小鼠。
24天后没有可触知的肿瘤,确 定对攻击具有保护作用。
图6显示五次代表性实验之一的结果。
活肿瘤 攻击前一周将小鼠用P815肿瘤细胞免疫不导致对肿瘤生长的保护作 用。
不过,用混合有B7-1-IgG或B7-2-IgG的辐射处理肿瘤细胞单次免 疫,诱导60-70%保护作用(图6,表2)。
相反,用单独的B7-1-IgG或 B7-2-IgG免疫不提供保护作用(图6)。
14-24天后没有固体肿瘤和/或 存活至少60天都确认了保护作用。
后者说明不存在转移性疾病。
为了评价IgG结构域在融合蛋白功能中的角色,将小鼠用混合有突 变融合蛋白B7-IgGmut的辐射处理P815肿瘤细胞免疫,该突变的融合 蛋白不结合Fc受体,不活化补体。
突变的分子不如野生型有效(图6, 表2),提示了在B7-IgG分子的Fc结合中的角色。
还比较了与B7-IgG混合的辐射处理肿瘤细胞与被B7-1或B7-2转染 的肿瘤细胞的功效。
用B7-转染体进行疫苗接种,诱导显著更低的抗肿 瘤免疫性,仅保护了30%的小鼠,而用混合有B7-IgG的辐射处理野生 型P815细胞免疫后保护了65%(表2)。
这些发现说明,B7-IgG可能 是有效生成抗肿瘤保护作用的佐剂,可以比B7-转染的肿瘤细胞更有 效。
用混合有B7-1-IgG或B7-2-IgG的辐射处理P815肿瘤细胞进行疫苗 接种,治愈小鼠的已建立P815肿瘤 为了试验B7-IgG在治疗性肿瘤疫苗模型中的佐剂活性,用P815肿 瘤细胞i.d.注射DBA/2小鼠,剂量为在五至七天后生成可触知的固体肿 瘤。
在第0天通过i.d.注射5×104P815细胞建立固体P815肿瘤。
在已 经形成可触知的肿瘤之后,在第7天开始疫苗接种。
图7显示如下i.fp. 注射小鼠的结果:PBS对照(A,E),单独的辐射处理P815肿瘤细胞(B), 与无关小鼠IgG2a Ab混合的辐射处理P815肿瘤细胞(F),与B7-1-IgG(C) 或B7-2-IgG(G)混合的辐射处理P815肿瘤细胞。
在第7、14、21天重复 免疫。
三天后分别将PBS、无关Ab或B7-IgG再次给药。
监测40天内 的肿瘤生长。
25-30天后,对照组动物开始死于自发性转移瘤。
D和H 栏显示不同治疗组的存活时间。
数据是四次独立实验的代表。
肿瘤生长 的动力学和疫苗接种后的存活如图7所示,是四次独立实验的代表。
从 第一次免疫后约一周开始,观察到混合有B7-IgG的肿瘤细胞免疫组小 鼠肿瘤生长减少,也就是肿瘤消退。
单独的辐射处理肿瘤细胞或混合有 无关小鼠IgG2a Ab的辐射处理肿瘤细胞处理组肿瘤生长不减少。
混合 有B7-IgG的辐射处理P815肿瘤细胞免疫的三个周期之后,60-80%的小 鼠原发性肿瘤已经消失。
原发性肿瘤的消退与小鼠的长期存活有相互关 系。
混合有B7-1-IgG或B7-2-IgG的辐射处理P815细胞免疫增加长期存 活大约80%(图7D,H)。
未治疗组或辐射处理肿瘤疫苗对照组的大部 分小鼠一般在25与35天之间死亡,显然是由肝、脾和淋巴结内形成的 自发性转移瘤所引起的。
在不同肿瘤模型中作为治疗性肿瘤疫苗佐剂的B7-IgG 为了确定B7-IgG结果是否与P815肿瘤或DBA/2小鼠株一致,利用 两种不同的小鼠株试验了B7-IgG作为佐剂在三种另外的肿瘤模型中的 功效。
在所有四种模型中都得到了相似的阳性结果。
将携带7日已建立MethA肉瘤的Balb/c小鼠用PBS、单独的辐射处 理MethA细胞或混合有B7-1-IgG或B7-2-IgG的辐射处理MethA细胞免 疫。
分别在Balb/c或C57BL/6小鼠中建立固体MethA或B16/F10肿瘤。
图8显示将每组十只小鼠分别用单独的辐射处理肿瘤细胞(B,E)或混合 有25μg(C,D)或100μg(F,G)B7-1-IgG或B7-2-IgG的辐射处理肿瘤细 胞i.fp.免疫。
3-4天后再一次给以PBS、B7-1-IgG或B7-2-IgG注射。
一 组用单独的PBS处理(A,关于B16/F10没有显示)。
监测35天肿瘤 生长。
一旦肿瘤达到400mm2,使MethA肿瘤小鼠安乐死,或者动物死 于自发性转移瘤。
存活动物的百分率如H栏所示。
实验重复至少三次。
用混合有B7-IgG的辐射处理MethA细胞免疫两次治愈100%小鼠,而对 照组10-15%小鼠自发地痊愈(图8)。
在携带膀胱癌MB49的C57BL/6 小鼠中观察到相似的结果。
在C57BL/6小鼠中,还研究了高转移性与弱 免疫原性黑色素瘤B16/F10的应答。
用混合有两种B7-IgG蛋白之一的 辐射处理B16肿瘤细胞免疫三次,相对对照而言减少肿瘤生长,提高长 期存活率(图8)。
对照组动物在35-40天内全部死亡,而用B7-IgG疫 苗处理过的小鼠至少有40-80%存活超过60天(图8)。
这些发现支持 了P815肿瘤模型中的观察结果,证明了B7-IgG作为治疗性肿瘤疫苗佐 剂的有力活性。
单独的B7-IgG的治疗性给药诱导抗肿瘤应答 如上所述,在没有辐射处理肿瘤细胞的存在下将幼鼠用B7-IgG进 行预防性免疫,不保护小鼠免受肿瘤攻击。
不过,在所有四种治疗性肿 瘤模型中,将携带肿瘤的小鼠用单独的B7-1-IgG或B7-2-IgG处理,减 少肿瘤生长,增加存活率(图9)。
在第0天用活P815(A)、MethA(B)、 MB49(C)或C57BL/6(D)肿瘤细胞接种小鼠。
如上所述在第6-8天开始 免疫。
将小鼠用PBS(□)、单独的辐射处理肿瘤细胞(◇)、混合有B7-1- IgG(△)或B7-2-IgG(○)的辐射处理肿瘤细胞或者单独的B7-1-IgG(*)或 B7-2-IgG(+)处理。
每组7-10只小鼠肿瘤大小的平均值绘图。
一旦肿瘤 达到400mm2大小,使小鼠安乐死,或者如果它们死于转移性疾病就赋 予该值。
在所有所试验的模型中,用单独的B7-IgG对携带肿瘤的小鼠 进行治疗性处理,延缓肿瘤生长,诱导肿瘤消退,增加存活率。
不过, B16/F10肿瘤模型数据提示,用辐射处理肿瘤细胞加B7-IgG进行疫苗接 种的抗肿瘤疗效强于单独的B7-IgG,至少对弱免疫原性肿瘤来说如此。
这些可溶性B7-IgG的结果惊人地给出利用呈递在细胞表面上的共 同刺激分子所得结果(固相共同刺激)。
在全部三种这些模型中评价了 用B7-转染的肿瘤细胞进行治疗性疫苗接种,显示对肿瘤生长和存活率 没有作用至具有适度作用。
这里利用混合有可溶性B7-Ig的辐射处理肿 瘤细胞疫苗所示作用惊人地强大得多。
混合100μg B7-IgG与疫苗可提供 大约1016B7分子,而在107转染肿瘤细胞表面上仅有大约总计1010-1011B7分子。
这样一种数量上的差异可以解释为什么用辐射处理B7-转染体 进行疫苗接种的效率大大低于活B7-转染体,其中活细胞能够增加和增 大可利用的B7分子数量。
其他解释可能涉及B7-IgG分子比表达在辐射 处理肿瘤细胞表面上的B7分子延长了存在的时间。
而且,可溶性分子 在体内可以不同地分布,到达更适当的免疫刺激部位。
B7-IgG介导的肿瘤痊愈是CD8 T细胞依赖性的和IFN-γ独立性的 为了进一步描绘适应性免疫应答参与B7-IgG介导的免疫刺激作用 的特征,评价了缺乏成熟T与B细胞的SCID小鼠中的B7-IgG。
在SCID 小鼠中建立固体肿瘤,然后将它们用单独的B7-IgG活辐射处理细胞疫 苗加B7-IgG处理。
没有一种处理措施对肿瘤生长起作用,证明了B7-IgG 介导的肿瘤应答对T或B细胞的依赖性(图10)。
另在使CD8或CD4 T细胞衰竭之后处理携带肿瘤的小鼠。
在B7-IgG疗法开始前一天,注射 抗体,使CD8或CD4 T细胞衰竭。
在第28天通过PBL的FACS分析验 证衰竭成功。
在CD4衰竭的小鼠中,B7-IgG诱导肿瘤消退和痊愈,与 正常小鼠没有区别(图11),而CD8衰竭废除了B7-IgG介导的抗肿瘤 活性。
肿瘤生长比CD8衰竭的未治疗小鼠缓慢,但是观察到没有肿瘤痊 愈(图11)。
尽管IFN-γ在抗肿瘤免疫监视和抗肿瘤应答中扮演重要角色,也可 确定B7-IgG治愈已建立肿瘤而与IFN-γ无关。
在IFN-γ失效小鼠中建立 固体肿瘤,用B7-IgG或混合有B7-IgG的辐射处理肿瘤细胞疫苗处理。
两种处理均诱导肿瘤消退和在第28天左右痊愈,相当于野生型小鼠, 证明了B7-IgG肿瘤疗法的IFN-γ独立性(图12)。
而且,因其IFN-γ受 体突变而对IFN-γ不是应答性的肿瘤用B7-IgG处理后仍然痊愈。
还测定了B7-IgG在抗肿瘤疗法中或者作为疫苗佐剂比阻断CTLA4 抗体更有力。
在三种不同的肿瘤模型中,B7-IgG处理治愈肿瘤或者保护 免受肿瘤攻击,其中抗-CTLA4抗体没有作用,尽管它对CTLA4具有高 得多的亲和性,前人也报道了它的阻断活性。
这些数据证明,B7-IgG增 强免疫应答的机理不仅限于和依赖于阻断由CTLA4介导的负信号。
表2:与辐射处理肿瘤细胞混合的B7-IgG2a提供保护性免疫 免疫作用                    保护百分率       动物数(受攻击动物的被    实验数                         (平均+/-SD)      保护数/总数) 幼鼠                         8%(11)         3/42                      5 辐射处理P815                 2%(4)          1/43                      5 辐射处理P815-B7-1转染体      23%(4)         3/13                      2 辐射处理P815+B7-1IgG         65%(18)        29/45                     4 辐射处理P815+B7-2IgG         60%(24)        23/37                     4 辐射处理P815+突变的B7-1IgG   28%(4)         5/18                      2 辐射处理P815+突变的B7-2IgG   20%            2/10                      1 辐射处理P815+抗-CD28         0%             0/10                      1 辐射处理P815+抗-CTLA-4       40%            4/10                      1 辐射处理L1210-P1A            0%(0)          0/19                      2 辐射处理L1210-P1A+           10%(14)        2/20                      2 B7-1-IgGIgG 等价方式 本领域技术人员只需利用常规的实验方法将认识或者能够确定很多 本文所述发明的具体实施方式的等价方式。
这样的等价方法打算为下列 权利要求所涵盖。
                                 序列表 <110>遗传研究所有限公司(Genetics Institute,Inc) <120>可溶性共同刺激分子增强免疫应答的用途 <130>GNN-003 <140>09/565,316 <141>2000-05-05 <150>60/132,944 <151>1999-05-06 <160>7 <170>PatentIn Ver.2.0 <210>1 <211>1491 <212>DNA <213>人(Homo sapiens) <220> <221>CDS <222>(318)..(1181) <220> <221>成熟肽 <222>(420) <220> <223>318到1181bp位置的开放读框 <220> <223>来自1474到1479bp位置的交替聚腺苷酸化信号 <400>1 ccaaagaaaa agtgatttgt cattgcttta tagactgtaa gaagagaaca tctcagaagt 60 ggagtcttac cctgaaatca aaggatttaa agaaaaagtg gaatttttct tcagcaagct 120 gtgaaactaa atccacaacc tttggagacc caggaacacc ctccaatctc tgtgtgtttt 180 gtaaacatca ctggagggtc ttctacgtga gcaattggat tgtcatcagc cctgcctgtt 240 ttgcacctgg gaagtgccct ggtcttactt gggtccaaat tgttggcttt cacttttgac 300 cctaagcatc tgaagcc atg ggc cac aca cgg agg cag gga aca tca cca    350                Met Gly His Thr Arg Arg Gln Gly Thr Ser Pro                                -30                 -25 tcc aag tgt cca tac ctg aat ttc ttt cag ctc ttg gtg ctg gct ggt   398 Ser Lys Cys Pro Tyr Leu Asn Phe Phe Gln Leu Leu Val Leu Ala Gly         -20                 -15                 -10 ctt tct cac ttc tgt tca ggt gtt atc cac gtg acc aag gaa gtg aaa    446 Leu Ser His Phe Cys Ser Gly Val Ile His Val Thr Lys Glu Val Lys      -5              -1   1               5 gaa gtg gca acg ctg tcc tgt ggt cac aat gtt tct gtt gaa gag ctg    494 Glu Val Ala Thr Leu Ser Cys Gly His Asn Val Ser Val Glu Glu Leu  10                  15                  20                  25 gca caa act cgc atc tac tgg caa aag gag aag aaa atg gtg ctg act    542 Ala Gln Thr Arg Ile Tyr Trp Gln Lys Glu Lys Lys Met Val Leu Thr              30                  35                  40 atg atg tct ggg gac atg aat ata tgg ccc gag tac aag aac cgg acc    590 Met Met Ser Gly Asp Met Asn Ile Trp Pro Glu Tyr Lys Asn Arg Thr          45                  50                  55 atc ttt gat atc act aat aac ctc tcc att gtg atc ctg gct ctg cgc    638 Ile Phe Asp Ile Thr Asn Asn Leu Ser Ile Val Ile Leu Ala Leu Arg     60                   65                  70 cca tct gac gag ggc aca tac gag tgt gtt gtt ctg aag tat gaa aaa    686 Pro Ser Asp Glu Gly Thr Tyr Glu Cys Val Val Leu Lys Tyr Glu Lys  75                  80                  85 gac gct ttc aag cgg gaa cac ctg gct gaa gtg acg tta tca gtc aaa    734 Asp Ala Phe Lys Arg Glu His Leu Ala Glu Val Thr Leu Ser Val Lys  90                  95                 100                 105 gct gac ttc cct aca cct agt ata tct gac ttt gaa att cca act tct    782 Ala Asp Phe Pro Thr Pro Ser Ile Ser Asp Phe Glu Ile Pro Thr Ser             110                 115                 120 aat att aga agg ata att tgc tca acc tct gga ggt ttt cca gag cct    830 Asn Ile Arg Arg Ile Ile Cys Ser Thr Ser Gly Gly Phe Pro Glu Pro         125                 130                 135 cac ctc tcc tgg ttg gaa aat gga gaa gaa tta aat gcc atc aac aca    878 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Ile Ser Val Asn Gly Ile Phe Val Ile Cys Cys Leu Thr Tyr Cys Phe     220                 225                 230 gcc cca aga tgc aga gag aga agg agg aat gag aga ttg aga agg gaa    1166 Ala Pro Arg Cys Arg Glu Arg Arg Arg Asn Glu Arg Leu Arg Arg Glu 235                 240                 245 agt gta cgc cct gta taacagtgtc cgcagaagca aggggctgaa aagatctgaa    1221 Ser Val Arg Pro Val 250 ggtagcctcc gtcatctctt ctgggataca tggatcgtgg ggatcatgag gcattcttcc  1281 cttaacaaat ttaagctgtt ttacccacta cctcaccttc ttaaaaacct ctttcagatt  1341 aagctgaaca gttacaagat ggctggcatc cctctccttt ctccccatat gcaatttgct  1401 taatgtaacc tcttcttttg ccatgtttcc attctgccat cttgaattgt cttgtcagcc  1461 aattcattat ctattaaaca ctaatttgag                                   1491 <210>2 <211>288 <212>PRT <213>人(Homo sapiens) <220> <223>-34到-12位的信号序列:可溶性蛋白的氨基末端测序 <220> <223>1到208位的细胞外结构域;  与已知序列的类似性 <220> <223>209到235位的跨膜结构域;  与已知序列的类似性 <220> <223>236到254位的细胞内结构域;  与已知序列的类似性 <220> <223>19-21,55-57,64-66,152-154,173-175,177-179,192-194,  198-200位的N连接的糖基化,与已知序列的类似性 <220> <223>1到104位的Ig V-set结构域;  与已知序列的类似性 <220> <223>105到202位的Ig C-set结构域;  与已知序列的类似性 <400>2 Met Gly His Thr Arg Arg Gln Gly Thr Ser Pro Ser Lys Cys Pro Tyr             -30                 -25                 -20 Leu Asn Phe Phe Gln Leu Leu Val Leu Ala Gly Leu Ser His Phe Cys         -15                 -10                  -5 Ser Gly Val Ile His Val Thr Lys Glu Val Lys Glu Val Ala Thr Leu  -1   1               5                  10 Ser Cys Gly His Asn Val Ser Val Glu Glu Leu Ala Gln Thr Arg Ile  15                  20                  25                  30 Tyr Trp Gln Lys Glu Lys Lys Met Val Leu Thr Met Met Ser Gly Asp              35                  40                  45 Met Asn Ile Trp Pro Glu Tyr Lys Asn Arg Thr Ile Phe Asp Ile Thr          50                  55                  60 Asn Asn Leu Ser Ile Val Ile Leu Ala Leu Arg Pro Ser Asp Glu Gly      65                  70                  75 Thr Tyr Glu Cys Val Val Leu Lys Tyr Glu Lys Asp Ala Phe Lys Arg  80                  85                  90 Glu His Leu Ala Glu Val Thr Leu Ser Val Lys Ala Asp Phe Pro Thr  95                 100                 105                 110 Pro Ser Ile Ser Asp Phe Glu Ile Pro Thr Ser Asn Ile Arg Arg Ile             115                 120                 125 Ile Cys Ser Thr Ser Gly Gly Phe Pro Glu Pro His Leu Ser Trp Leu         130                 135                 140 Glu Asn Gly Glu Glu Leu Asn Ala Ile Asn Thr Thr Val Ser Gln Asp     145                 150                 155 Pro Glu Thr Glu Leu Tyr Ala Val Ser Ser Lys Leu Asp Phe Asn Met 160                 165                 170 Thr Thr Asn His Ser Phe Met Cys Leu Ile Lys Tyr Gly His Leu Arg 175                 180                 185                 190 Val Asn Gln Thr Phe Asn Trp Asn Thr Thr Lys Gln Glu His Phe Pro             195                 200                 205 Asp Asn Leu Leu Pro Ser Trp Ala Ile Thr Leu Ile Ser Val Asn Gly         210                 215                 220 Ile Phe Val Ile Cys Cys Leu Thr Tyr Cys Phe Ala Pro Arg Cys Arg     225                 230                 235 Glu Arg Arg Arg Asn Glu Arg Leu Arg Arg Glu Ser Val Arg Pro Val 240                 245                 250 <210>3 <211>1120 <212>DNA <213>人(Homo sapiens) <220> <221>CDS <222>(107)..(1093) <400>3 cacagggtga aagctttgct tctctgctgc tgtaacaggg actagcacag acacacggat  60 gagtggggtc atttccagat attaggtcac agcagaagca gccaaa atg gat ccc     115                                                Met Asp Pro                                                  1 cag tgc act atg gga ctg agt aac att ctc ttt gtg atg gcc ttc ctg    163 Gln Cys Thr Met Gly Leu Ser Asn Ile Leu Phe Val Met Ala Phe Leu   5                  10                  15 ctc tct ggt gct gct cct ctg aag att caa gct tat ttc aat gag act    211 Leu Ser Gly Ala Ala Pro Leu Lys Ile Gln Ala Tyr Phe Asn Glu Thr  20                  25                  30                  35 gca gac ctg cca tgc caa ttt gca aac tct caa aac caa agc ctg agt    259 Ala Asp Leu Pro Cys Gln Phe Ala Asn Ser Gln Asn Gln Ser Leu Ser              40                  45                  50 gag cta gta gta ttt tgg cag gac cag gaa aac ttg gtt ctg aat gag    307 Glu Leu Val Val Phe Trp Gln Asp Gln Glu Asn Leu Val Leu Asn Glu          55                  60                  65 gta tac tta ggc aaa gag aaa ttt gac agt gtt cat tcc aag tat atg    355 Val Tyr Leu Gly Lys Glu Lys Phe Asp Ser Val His Ser Lys Tyr Met      70                  75                  80 ggc cgc aca agt ttt gat tcg gac agt tgg acc ctg aga ctt cac aat    403 Gly Arg Thr Ser Phe Asp Ser Asp Ser Trp Thr Leu Arg Leu His Asn  85                  90                  95 ctt cag atc aag gac aag ggc ttg tat caa tgt atc atc cat cac aaa    451 Leu Gln Ile Lys Asp Lys Gly Leu Tyr Gln Cys Ile Ile His His Lys 100                 105                 110                 115 aag ccc aca gga atg att cgc atc cac cag atg aat tct gaa ctg tca    499 Lys Pro Thr Gly Met Ile Arg Ile His Gln Met Asn Ser Glu Leu Ser             120                 125                 130 gtg ctt gct aac ttc agt caa cct gaa ata gta cca att tct aat ata    547 Val Leu Ala Asn Phe Ser Gln Pro Glu Ile Val Pro Ile Ser Asn Ile         135                 140                 145 aca gaa aat gtg tac ata aat ttg acc tgc tca tct ata cac ggt tac    595 Thr Glu Asn Val Tyr Ile Asn Leu Thr Cys Ser Ser Ile His Gly Tyr     150                 155                 160 cca gaa cct aag aag atg agt gtt ttg cta aga acc aag aat tca act    643 Pro Glu Pro Lys Lys Met Ser Val Leu Leu Arg Thr Lys Asn Ser Thr 165                 170                 175 atc gag tat gat ggt att atg cag aaa tct caa gat aat gtc aca gaa    691 Ile Glu Tyr Asp Gly Ile Met Gln Lys Ser Gln Asp Asn Val Thr Glu 180                 185                 190                 195 ctg tac gac gtt tcc atc agc ttg tct gtt tca ttc cct gat gtt acg    739 Leu Tyr Asp Val Ser Ile Ser Leu Ser Val Ser Phe Pro Asp Val Thr             200                 205                 210 agc aat atg acc atc ttc tgt att ctg gaa act gac aag acg cgg ctt    787 Ser Asn Met Thr Ile Phe Cys Ile Leu Glu Thr Asp Lys Thr Arg Leu         215                 220                 225 tta tct tca cct ttc tct ata gag ctt gag gac cct cag cct ccc cca    835 Leu Ser Ser Pro Phe Ser Ile Glu Leu Glu Asp Pro Gln Pro Pro Pro     230                 235                 240 gac cac att cct tgg att aca gct gta ctt cca aca gtt att ata tgt    883 Asp His Ile Pro Trp Ile Thr Ala Val Leu Pro Thr Val Ile Ile Cys 245                 250                 255 gtg atg gtt ttc tgt cta att cta tgg aaa tgg aag aag aag aag cgg    931 Val Met Val Phe Cys Leu Ile Leu Trp Lys Trp Lys Lys Lys Lys Arg 260                 265                 270                 275 cct cgc aac tct tat aaa tgt gga acc aac aca atg gag agg gaa gag    979 Pro Arg Asn Ser Tyr Lys Cys Gly Thr Asn Thr Met Glu Arg Glu Glu             280                 285                 290 agt gaa cag acc aag aaa aga gaa aaa atc cat ata cct gaa aga tct    1027 Ser Glu Gln Thr Lys Lys Arg Glu Lys Ile His Ile Pro Glu Arg Ser         295                 300                 305 gat gaa gcc cag cgt gtt ttt aaa agt tcg aag aca tct tca tgc gac    1075 Asp Glu Ala Gln Arg Val Phe Lys Ser Ser Lys Thr Ser Ser Cys Asp     310                 315                 320 aaa agt gat aca tgt ttt taattaaaga gtaaagccca aaaaaaa              1120 Lys Ser Asp Thr Cys Phe 325 <210>4 <211>329 <212>PRT <213>人(Homo sapiens) <400>4 Met Asp Pro Gln Cys Thr Met Gly Leu Ser Asn Ile Leu Phe Val Met   1               5                  10                  15 Ala Phe Leu Leu Ser Gly Ala Ala Pro Leu Lys Ile Gln Ala Tyr Phe          20                  25                  30 Asn Glu Thr Ala Asp Leu Pro Cys Gln Phe Ala Asn Ser Gln Asn Gln      35                  40                  45 Ser Leu Ser Glu Leu Val Val Phe Trp Gln Asp Gln Glu Asn Leu Val  50                  55                  60 Leu Asn Glu Val Tyr Leu Gly Lys Glu Lys Phe Asp Ser Val His Ser  65                  70                  75                  80 Lys Tyr Met Gly Arg Thr Ser Phe Asp Ser Asp Ser Trp Thr Leu Arg              85                  90                  95 Leu His Asn Leu Gln Ile Lys Asp Lys Gly Leu Tyr Gln Cys Ile Ile         100                 105                 110 His His Lys Lys Pro Thr Gly Met Ile Arg Ile His Gln Met Asn Ser     115                 120                 125 Glu Leu Ser Val Leu Ala Asn Phe Ser Gln Pro Glu Ile Val Pro Ile 130                 135                 140 Ser Asn Ile Thr Glu Asn Val Tyr Ile Asn Leu Thr Cys Ser Ser Ile 145                 150                 155                 160 His Gly Tyr Pro Glu Pro Lys Lys Met Ser Val Leu Leu Arg Thr Lys             165                 170                 175 Asn Ser Thr Ile Glu Tyr Asp Gly Ile Met Gln Lys Ser Gln Asp Asn         180                 185                 190 Val Thr Glu Leu Tyr Asp Val Ser Ile Ser Leu Ser Val Ser Phe Pro     195                 200                 205 Asp Val Thr Ser Asn Met Thr Ile Phe Cys Ile Leu Glu Thr Asp Lys 210                 215                 220 Thr Arg Leu Leu Ser Ser Pro Phe Ser Ile Glu Leu Glu Asp Pro Gln 225                 230                 235                 240 Pro Pro Pro Asp His Ile Pro Trp Ile Thr Ala Val Leu Pro Thr Val             245                 250                 255 Ile Ile Cys Val Met Val Phe Cys Leu Ile Leu Trp Lys Trp Lys Lys         260                 265                 270 Lys Lys Arg Pro Arg Asn Ser Tyr Lys Cys Gly Thr Asn Thr Met Glu     275                 280                 285 Arg Glu Glu Ser Glu Gln Thr Lys Lys Arg Glu Lys Ile His Ile Pro 290                 295                 300 Glu Arg Ser Asp Glu Ala Gln Arg Val Phe Lys Ser Ser Lys Thr Ser 305                 310                  315                320 Ser Cys Asp Lys Ser Asp Thr Cys Phe             325 <210>5 <211>9 <212>PRT <213>人工序列 <220> <223>人工序列描述:肽 <400>5 Thr Tyr Gln Arg Thr Arg Ala Leu Val   1               5 <210>6 <211>23 <212>PRT <213>人工序列 <220> <223>人工序列描述:肽 <400>6 Arg Leu Ile Gln Asn Ser Leu Thr Ile Glu Arg Met Val Leu Ser Ala   1               5                  10                  15 Phe Asp Glu Arg Arg Asn Lys          20 <210>7 <211>24 <212>PRT <213>人工序列 <220> <223>人工序列描述:肽 <400>7 Phe Trp Arg Gly Glu Asn Gly Arg Lys Thr Arg Ile Ala Tyr Glu Arg   1               5                  10                  15 Met Cys Asn Ile Leu Lys Gly Lys          20 展开

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