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磺基水解酶,其相应的氨基酸序列和核苷酸序列,磺基水解酶制备物,方法及其产物

基本信息

  • 申请号 CN00810155.8 
  • 公开号 CN1362995A 
  • 申请日 2000/05/09 
  • 公开日 2002/08/07 
  • 申请人 CP凯尔科药物学科学院  
  • 优先权日期  
  • 发明人 萨比娜·热尼科 格哈德·德勒伊特 伯恩哈德·克洛阿雷 贝亚·彭尼霍夫 菲利普·波坦 奥迪勒·理查德 布赖恩·鲁道夫  
  • 主分类号  
  • 申请人地址 美国特拉华州 
  • 分类号  
  • 专利代理机构 永新专利商标代理有限公司 
  • 当前专利状态 发明专利申请公布 
  • 代理人 林晓红 
  • 有效性 发明公开 
  • 法律状态
  •  

摘要

本发明提供了基于蛋白质总量纯度水平至少为约40wt.%的纯化的磺基水解酶,分离的核酸序列和氨基酸序列,和纯化至少一种磺基水解酶的方法,包括将海藻提取物进行分级分离获得级分;将至少一个级分进行苯基琼脂糖凝胶层析获得含有至少一种磺基水解酶的琼脂糖凝胶级分。
本发明还提供了用基于蛋白质总量纯度水平至少为约40wt.%的分离的磺基水解酶修饰的酶促修饰的化合物,以及一种酶促修饰硫酸化的化合物的方法,所述方法包括将至少一种基于蛋白质总量纯度水平至少为约40wt.%的磺基水解酶与硫酸化的化合物形成反应混合物,温育该反应混合物以从硫酸化的化合物中除去硫酸酯基团,形成酶促修饰的化合物。
本发明还涉及一种酶促修饰硫酸化的化合物的方法,所述方法包括将第一种磺基水解酶与硫酸化的化合物温育,以从硫酸化的化合物中除去硫酸酯基团,形成中间化合物;接着将第二种磺基水解酶与中间化合物温育,以除去硫酸酯基团,形成酶促修饰的化合物。
本发明还提供了一种从海藻中提取nu-和mu-角叉菜聚糖之一的方法,包括:将海藻分散于含有K展开

权利要求书


1.一种基于总蛋白量纯化水平为至少40wt%的磺基水解酶。

2.权利要求1的磺基水解酶,其中基于总蛋白量的纯化水平为 至少70wt%。

3.权利要求1的磺基水解酶,其中基于总蛋白量的纯化水平为 至少90wt%。

4.权利要求1的磺基水解酶,其中基于总蛋白量的纯化水平为 至少95wt%。

5.权利要求1的磺基水解酶,其中磺基水解酶能从水状胶体中 除去硫酸酯。

6.权利要求5的磺基水解酶,其中水状胶体是糖胺聚糖,岩藻 聚糖和半乳聚糖之一。

7.权利要求1的磺基水解酶,其中磺基水解酶能从半乳聚糖中 除去硫酸酯。

8.权利要求7的磺基水解酶,其中半乳聚糖包括角叉菜聚糖。

9.权利要求8的磺基水解酶,其中角叉菜聚糖包括mu-角叉菜 聚糖。

10.权利要求8的磺基水解酶,其中角叉菜聚糖包括至少大约 50mol%的mu-角叉菜聚糖。

11.权利要求8的磺基水解酶,其中角叉菜聚糖包括nu角叉 菜聚糖。

12.权利要求8的磺基水解酶,其中角叉菜聚糖包括至少大约 50mol%的nu-角叉菜聚糖。

13.权利要求7的磺基水解酶,其中半乳聚糖包括琼脂。

14.权利要求1的磺基水解酶,其中磺基水解酶包括6-O- 磺基水解酶。

15.权利要求1的磺基水解酶,其中磺基水解酶能将nu-角 叉菜聚糖转变为iota-角叉菜聚糖。

16.权利要求1的磺基水解酶,其中磺基水解酶能将mu-角 叉菜聚糖转变为kappa-角叉菜聚糖。

17.权利要求1的磺基水解酶,其中磺基水解酶能除去6-O -硫酸酯以诱导脱水桥形成。

18.一种分离的核酸序列,其包含SEQ ID NO:17序列。

19.一种分离的核酸序列,其包含与SEQ ID NO:17序列有 至少大约25%同源性的序列。

20.权利要求19的分离的核酸序列,其包含与SEQ ID NO: 17序列有至少大约50%同源性的序列。

21.权利要求19的分离的核酸序列,其包含与SEQ ID NO: 17序列有至少大约80%同源性的序列。

22.权利要求19的分离的核酸序列,其包含与SEQ ID NO: 17序列有至少大约90%同源性的序列。

23.一种分离的核酸序列,其在杂交条件下与SEQ ID NO:17 核酸杂交。

24.一种分离的核酸序列,其包含SEQ ID NO:18序列。

25.一种分离的核酸序列,其包含SEQ ID NO:19序列。

26.一种分离的核酸序列,其包含SEQ ID NO:20序列。

27.一种分离的核酸序列,其包含SEQ ID NO:21序列。

28.一种分离的核酸序列,其包含与SEQ ID NO:18序列有 至少大约25%同源性的序列。

29.权利要求28的分离的核酸序列,其包含与SEQ ID NO: 18序列有至少大约50%同源性的序列。

30.权利要求28的分离的核酸序列,其包含与SEQ ID NO: 18序列有至少大约80%同源性的序列。

31.权利要求28的分离的核酸序列,其包含与SEQ ID NO: 18序列有至少大约90%同源性的序列。

32.一种分离的核酸序列,其包含与SEQ ID NO:19序列有 至少大约90%同源性的序列。

33.一种分离的核酸序列,其包含与SEQ ID NO:20序列有 至少大约90%同源性的序列。

34.一种分离的核酸序列,其包含与SEQ ID NO:21序列有 至少大约90%同源性的序列。

35.一种分离的核酸序列,其在杂交条件下与SEQ ID NO:18 核酸杂交。

36.一种分离的核酸序列,其编码相当于SEQ ID NO:22的 氨基酸序列。

37.一种分离的蛋白质,其包括包含SEQ ID NO:22的氨基 酸序列。

38.一种分离的蛋白质,其包括与SEQ ID NO:22有至少大 约35%同源性的氨基酸序列。

39.权利要求38的分离的蛋白质,其中氨基酸序列与SEQ ID NO:22有至少大约50%的同源性。

40.权利要求38的分离的蛋白质,其中氨基酸序列与SEQ ID NO:22有至少大约80%的同源性。

41.一种分离的核酸序列,其编码相当于SEQ ID NO:23的 氨基酸序列。

42.一种分离的蛋白质,其包括包含SEQ ID NO:23的氨基 酸序列。

43.一种分离的蛋白质,其包括与SEQ ID NO:23有至少大 约20%同源性的氨基酸序列。

44.权利要求43的分离的蛋白质,其中氨基酸序列与SEQ ID NO:23有至少大约50%同源性
45.权利要求43的分离的蛋白质,其中氨基酸序列与SEQ ID NO:23有至少大约80%同源性
46.一种纯化至少一种磺基水解酶的方法,包括: 将海藻提取物进行分级分离以获得级分;和 将至少一种级分进行苯基琼脂糖凝胶层析,以获得含有至少一 种磺基水解酶的琼脂糖凝胶级分。

47.权利要求46的方法,其中分级分离包括硫酸铵分级分离。

48.权利要求46的方法,还包括将至少一种苯基琼脂糖凝胶 层析级分进行DEAE琼脂糖凝胶层析,以获得DEAE琼脂糖凝胶级 分。

49.权利要求48的方法,还包括将至少一种DEAE琼脂糖凝 胶层析级分进行肝素琼脂糖凝胶层析。

50.一种酶促修饰的化合物,其已通过分离的磺基水解酶修 饰,该磺基水解酶基于总蛋白量的纯化水平为至少大约40wt%。

51.权利要求50的化合物,其中化合物包括半乳聚糖。

52.权利要求50的化合物,其中化合物包括角叉菜聚糖。

53.权利要求50的化合物,其中化合物包括包含mu-角叉菜 聚糖的角叉菜聚糖。

54.权利要求53的化合物,其中角叉菜聚糖包括至少大约50 mol%的mu-角叉菜聚糖。

55.权利要求50的化合物,其中化合物包括琼脂。

56.一种酶促修饰硫酸化的化合物的方法,包括: 将基于总蛋白量的纯化水平为至少大约40wt%的至少一种磺基 水解酶,与硫酸化的化合物组合形成反应混合物; 温育此反应混合物,以从硫酸化的化合物中除去硫酸酯基团, 形成酶促修饰的化合物。

57.权利要求56的方法,其中基于总蛋白的纯化水平为至少 大约70wt%。

58.权利要求56的方法,其中基于总蛋白的纯化水平为至少 大约90wt%。

59.权利要求56的方法,其中基于总蛋白的纯化水平为至少 大约95wt%。

60.权利要求56的方法,其中温育温度为大约0-60℃。

61.权利要求56的方法,其中温育pH为大约5.5-9.5。

62.权利要求56的方法,其中加入反应混合物中的至少一种 磺基水解酶包含于溶液中,浓度为至少大约2-85μg/ml。

63.权利要求56的方法,其中硫酸化的化合物在反应混合物 中的浓度为大约0.012-2%(w/v)。

64.权利要求56的方法,其中硫酸化的化合物包括半乳聚糖。

65.权利要求56的方法,其中硫酸化的化合物包括角叉菜聚 糖。

66.权利要求56的方法,其中磺基水解酶在硫酸化的化合物 中诱导脱水桥形成。

67.权利要求56的方法,其中硫酸化的化合物包括包含nu- 角叉菜聚糖的角叉菜聚糖。

68.权利要求67的方法,其中角叉菜聚糖包括至少大约50mol %的nu-角叉菜聚糖。

69.权利要求56的方法,其中硫酸化的化合物包括包含mu- 角叉菜聚糖的角叉菜聚糖。

70.权利要求56的方法,其中角叉菜聚糖包括至少大约50mol %的mu-角叉菜聚糖。

71.权利要求56的方法,其中修饰的化合物包括iota-角叉 菜聚糖。

72.权利要求56的方法,其中修饰的化合物包括kappa-角 叉菜聚糖。

73.权利要求56的方法,其中酶促修饰的化合物包括富有前 体的kappa-角叉菜聚糖。

74.权利要求56的方法,其中酶促修饰的化合物包括富有前 体的iota-角叉菜聚糖。

75.权利要求56的方法,其中除去硫酸酯包括从半乳聚糖中 除去6-硫酸酯基团。

76.权利要求56的方法,其中半乳聚糖包括琼脂。

77.权利要求56的方法,其中除去硫酸酯基团包括将nu-角 叉菜聚糖转变为iota-角叉菜聚糖,以形成在一定条件下不凝胶的 产物,所述条件为产物在含有0.1M钾的水溶液中浓度为0.7% (w/v),温度为40℃,pH为7。

78.权利要求56的方法,其中磺基水解酶包括6-O-磺基水 解酶。

79.权利要求56的方法,其中至少一种磺基水解酶将nu-角 叉菜聚糖转变为iota-角叉菜聚糖。

80.权利要求56的方法,其中至少一种磺基水解酶将mu-角 叉菜聚糖转变为kappa-角叉菜聚糖。

81.权利要求56的方法,其中磺基水解酶能除去6-O-硫酸 酯,以诱导脱水桥形成。

82.一种通过权利要求56的方法形成的产物。

83.一种酶促修饰硫酸化的化合物的方法,包括: 将第一种磺基水解酶与硫酸化的化合物温育,以从硫酸化的化 合物中除去硫酸酯基团,形成中间化合物; 接着将第二种磺基水解酶与中间化合物温育,以除去硫酸酯基 团,形成酶促修饰的化合物。

84.权利要求83的方法,其中第一种磺基水解酶随机除去硫 酸酯。

85.权利要求83的方法,其中第二种磺基水解酶渐进性除去 硫酸酯。

86.一种产物,其通过用一种溶液温育硫酸化的化合物产生, 所述溶液的蛋白质含量基本由渐进性除去硫酸酯基团的磺基水解酶 组成。

87.一种产物,其通过用一种溶液温育硫酸化的化合物产生, 所述溶液的蛋白质含量基本由随机除去硫酸酯基团的磺基水解酶组 成。

88.一种从海藻中提取nu-和mu-角叉菜聚糖之一的方法, 包括: 将海藻分散于含有K2CO3的盐溶液中,形成分散液; 过滤分散液获得液体; 超滤分散液以除去盐; 浓缩液体; 将液体的pH调节为大约8-8.5; 从液体中沉淀nu-和mu-角叉菜聚糖之一。

89.权利要求88的方法,其中海藻包括Spinosum。

90.权利要求88的方法,其中海藻是冻干的,并在分散于盐 溶液之前研磨。

91.权利要求88的方法,其中盐溶液还包括KCl溶液。

92.权利要求88的方法,其中KCl的浓度为大约1-1.5M。

93.权利要求88的方法,其中将分散液在过滤之前至少静置 大约18小时。

94.权利要求88的方法,其中浓缩大约2-3倍。

95.权利要求88的方法,其中通过加入碱调节液体的pH值。

96.权利要求88的方法,其中沉淀是通过加入异丙醇进行的。

97.权利要求88的方法,其中进行透析直至水的电导率稳定 在大约2μS/cm之下。

98.权利要求88的方法,其中在沉淀经透析的nu-和mu- 角叉菜聚糖之一后,将nu-和mu-角叉菜聚糖之一冻干并研磨。

99.权利要求88的方法,其中沉淀的经透析的nu-和mu- 角叉菜聚糖之一所具有的nu-和mu-之一的含量为大约18-35mol %。

100.权利要求88的方法,其中沉淀的经透析的nu-和mu- 角叉菜聚糖之一的分子量为大约700-800kDa。
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说明书

相关申请交叉参考: 本申请根据35U.S.C.§119(e)要求在1999年5月10日申请的 美国临时专利申请No.60/133376的优先权,其内容全部并入参考。
发明背景 1.发明领域 本发明涉及磺基水解酶,如半乳聚糖磺基水解酶,如nu-和mu -角叉菜聚糖磺基水解酶。
本发明涉及磺基水解酶的氨基酸和核苷 酸序列。
本发明还涉及酶促修饰硫酸化的化合物,如半乳聚糖。
例 如,酶促修饰可包括修饰硫酸化的半乳聚糖性质,如凝胶性,如通 过除去硫酸酯基团及在半乳聚糖的糖结构中的环位置之间形成桥 区。
本发明还涉及从海藻中提取nu-角叉菜聚糖的方法。
本发明还 涉及酶促修饰的化合物。
2.背景阐述 水状胶体,可广泛的限定为是在存在水的情况下产生凝胶的物 质,部分由于其流变学性质而使用,也可对稳定性有益处。
水状胶体有许多类别。
一种分类方法将这些类别分为溢乳物,如 阿拉伯胶,茄替胶,刺梧桐树胶,talha,和黄芪胶;提取物,如从 褐色海藻中提取的海藻酸盐,从红色海藻中提取的琼脂,角叉菜聚 糖,和furcelleran,及从陆地植物中提取的konjak(葡甘露聚糖), 瓜耳胶,果胶和阿拉伯半乳聚糖;生物聚合物,如黄原胶;化学修 饰的水状胶体,如纤维素制品,包括羧甲基纤维素,羟丙基纤维素, 和羧甲基羟甲基纤维素;及中间形式,如微晶纤维素。
红色海藻已知是称为琼脂和角叉菜聚糖的工业凝胶和增稠用细胞 壁硫酸化半乳聚糖的原料。
它们由通过交替α(1-3)或β(1-4)键 连接的半乳糖吡喃糖残基的线性主链组成。
尽管所有β连接的残基 呈D-构型,但是α(1-4)连接的半乳糖单位在琼脂中呈L-构型, 在角叉菜聚糖中呈D-构型。
琼脂是通过或多或少加热的碱性溶液(100-120℃)从干燥的藻 类中提取的。
在过滤后,使琼脂溶液成为凝胶,加压脱水,干燥及 磨碎,如ARMISEN等,“琼脂的生产和使用”,商业海藻产物的生 产和利用,FAO渔业技术文献,288,pp1-57(1987)所述,该文 献全文并入参考。
提取琼脂的海藻原料包括石花菜属,鸡毛菜属, Gelidiella,和江篱属,如STANLEY,“角叉菜聚糖的生产,性质和 使用”,商业海藻产物的生产和利用,FAO渔业技术文献,288,pp116 -146(1987)所述,该文献全文并入参考。
角叉菜聚糖是分离自红色海藻的天然水溶的硫酸化半乳聚糖家族 的通称。
角叉菜聚糖的增稠和凝胶性用于食品和化妆品配方中,如 THERKELSEN,“角叉菜聚糖”,工业用凝胶:多糖及其衍生物,3rd ed,pp145-180,(1993),和DeRUITER等,“角叉菜聚糖生物技 术”,食品科学及技术趋势,第8卷,pp389-395(1997)所述,这 两个文献均全文并入参考。
角叉菜聚糖的海藻原料包括麒麟菜属(如刺麒麟菜 (E.spinosum),耳突麒麟菜(E.cottonii)(=Kappaphycus alvarezii), 和E.denticulatum),Chondrus(如C.crispus),Calliblepharis(如 C.jubata),和Gigartina(如G.radula和G.stellata)。
角叉菜聚糖是线性的,部分硫酸化的半乳聚糖,主要由α(1-4) 连接的D-半乳糖吡喃糖或3,6-脱水-D-半乳糖吡喃糖残基和β (1-3)连接的半乳糖吡喃糖残基的重复二聚体组成。
如上所述,琼 脂类似地也是线性的,部分硫酸化的半乳聚糖的相似结构,除了α (1-4)连接的D-半乳糖吡喃糖残基是L-形式的。
角叉菜聚糖发生 的一些结构主要不同之处在于二聚体主链上硫酸酯基团的数目和位 置,及二聚体的各个残基是以左手(4C1)或右手(C4)“椅型”构 象存在。
这些结构包括kappa(κ),iota(ι),lambda(λ),theta (θ),mu(μ),和nu(v),如下所示。
iota-,lambda和theta -角叉菜聚糖含有3,6-脱水桥,而nu-,mu-,和lambda-角 叉菜聚糖不含有此桥。
另外,nu-,mu-,和lambda-角叉菜聚糖 的α连接的单位的构象,不同于含有脱水桥的角叉菜聚糖,阻止足 够的螺旋聚集。
螺旋聚集是重要的,因为螺旋促进凝胶形成。
在这 点上,kappa角叉菜聚糖形成坚硬的脆性凝胶,而iota角叉菜聚糖形 成弹性的柔软的凝胶,lambda角叉菜聚糖是非凝胶化的增稠剂。
角叉菜聚糖中SO3-的数量相当多,并在0-40%之间(w/w)变 化,产生高负电荷的聚合物。
理想的kappa,iota和lambda角叉菜 聚糖二聚体分别具有1,2和3个硫酸酯基团,产生典型的硫酸酯含 量分别为22%,32%和38%(w/w)。
然而,因为海藻物种或批次 不同硫酸酯在商业提取物中可发生较大变化。
硫酸酯键在化学上是 非常稳定的,且没有明显或实用的化学方法修饰硫酸酯水平或分布 的同时不降低聚合物的分子量,除了在碱处理期间从前体角叉菜聚 糖中除去6-O-硫酸酯。
角叉菜聚糖是从红色海藻中,通过在水溶液中煮沸,有时在碱性 条件下煮沸,随后经过滤,浓缩,沉淀和干燥而商业性提取的。
沉 淀可通过另加入乙醇,或通过用盐凝胶化随后加压此凝胶而进行, 如STANLEY,“角叉菜聚糖的生产,性质和使用”,商业海藻产物 的生产和利用,FAO渔业技术文献,288,pp116-146(1987)所述, 该文献全文并入参考。
半精制角叉菜聚糖也是通过用碱处理海藻, 随后用水彻底清洗而产生的。
这些处理改良了角叉菜聚糖的凝胶化 性质,并除去了大部分蛋白质,色素和小代谢产物;这种制备物还 含有其它聚合物如纤维素物质,如HOFFMANN等,“分离步骤对 Eucheuma Cottonii角叉菜聚糖的分子组合物和物理性质的作用”, 水状胶体食品,9,pp281-289(1995),所述文献全文并入参考。
非凝胶化的mu-和nu-角叉菜聚糖是分别存在于海藻中的kappa -,iota-角叉菜聚糖的天然前体,并在二聚体单位的α-(1-4) 连接的D-半乳糖吡喃糖残基C-6位具有硫酸酯基团。
通常认为在强 碱处理期间,相伴发生从前体的C-6硫酸酯中消除硫酸酯,及形成 3,6-脱水桥。
不同角叉菜聚糖的功能性质(包括螺旋形成,流变学性质及应用) 是通过(1)聚合物的分子量,(2)硫酸酯基团的数目及其在碳主链 的取代位置,和(3)3,6-脱水半乳糖残基的数目而确定的,如 THERKELSEN,“角叉菜聚糖”,工业树脂:多糖及其衍生物,第三 版,pp145-180(1993);VIEBKE等,“通过MALLS/GPC定性kappa -,iota-角叉菜聚糖卷曲和螺旋”,碳水聚合物,第27卷,pp145 -154(1995);和Le QUESTEL等,“硫酸化的碳水化合物应用于 角叉菜聚糖的计算机模式”,Int.J.Biol.Macromol,第17卷,pp161- 174(1995),所述文献以其全文并入参考。
碱处理可对终产物中角叉菜聚糖形式的比率加以某些控制。
然 而,通常难以推断及获得所需终产物。
已有报道红色海藻脐形紫菜含有磺基水解酶,该酶催化硫酸酯从 紫菜聚糖中释放,紫菜聚糖是与琼脂相关的紫菜属中的主要多糖, 其含有大约10%(w/w)的3,6-脱水-L-半乳糖。
其还含有L -半乳糖-6-硫酸酯。
这些L-半乳糖-6-硫酸酯单位可通过部 分纯化自亲代海藻提取物的酶的作用,转化成3,6-脱水-L-半 乳糖,如REES,“在紫菜聚糖中由L-半乳糖6-硫酸酯单位酶促 合成3,6-脱水-L-半乳糖”,生物化学I,81,pp347-352(1961); 和REES,“紫菜聚糖的酶促脱硫化”,生物化学I,80,pp449-453 (1961),以上文献均全文并入参考。
另外还有报道生产角叉菜聚糖的红色海藻含有“磺基水解酶”, 该酶催化硫酸酯从角叉菜聚糖前体中释放。
皱波角叉菜中的磺基水 解酶见于WONG等,“皱波角叉菜(红藻纲)中磺基水解酶活性和 角叉菜聚糖生物合成”,植物生理学,第61卷,pp663-666(1978), 所述文献以其全文并入参考。
Calliblepharis jubata中的磺基水解酶见 于ZINOUN等,“在红藻Calliblepharis jubata中磺基水解酶活性迹 象”,Botanica Marina,第40卷,pp49-53(1997),所述文献以其 全文并入参考。
Gigartina stellata中磺基水解酶见于LAWSON等,“酶 对多糖构象和功能的代谢控制”,自然,第227卷,pp392-93(1970 年7月25日),及WONG等,“皱波角叉菜(红藻纲)中磺基水解 酶活性和角叉菜聚糖生物合成”,植物生理学,第61卷pp663-666 (1978),所述文献以其全文并入参考。
这种些酶目前未纯化为均一 性,并未有报道提供电泳数据。
半乳聚糖磺基水解酶的作用模式和特异性程度只在文献中以一般 术语加以阐述。
如CRAIGIE等,“角叉菜聚糖生物合成”, Proc.Int.Seaweed.Symp.pp369-377(1978),所述文献以其全文并入 参考,还不清楚有多少不同特异性的磺基水解酶存在于皱波角叉菜 中。
一般文献中少有关于磺基水解酶底物的化学结构,酶促作用的 终产物,和磺基水解酶对半乳聚糖前体作用程度的阐述。
因此,需要各种具有不同特异性的磺基水解酶,以可用于修饰硫 酸化的化合物,如半乳聚糖。
发明概述 本发明在于提供具有各种特异性的纯化的磺基水解酶。
本发明还涉及磺基水解酶的氨基酸和核苷酸序列。
本发明涉及酶促修饰硫酸化的化合物的方法。
本发明还涉及从海藻中提取角叉菜聚糖的方法。
本发明还涉及硫酸化的化合物,如半乳聚糖,其已经磺基水解酶 修饰,如修饰凝胶化性质。
根据一方面,本发明涉及基于总蛋白量纯化水平至少为40wt% 的磺基水解酶。
纯化水平还可至少为70wt%,90wt%,或95wt%。
根据另一方面,本发明涉及包含SEQ ID NO:17序列的分离的 核酸序列。
根据又一方面,本发明涉及包含与SEQ ID NO:17序列有至少25 %同源性的序列的分离的核酸序列。
与SEQ ID NO:17序列的同源 性还可至少为50%,80%,或90%。
根据另一方面,本发明涉及一种分离的核酸序列,其在杂交条件 下与SEQ ID NO:17核酸杂交。
根据另一方面,本发明涉及包含SEQ ID NO:18序列的分离的 核酸序列。
根据另一方面,本发明涉及包含SEQ ID NO:19序列的分离的 核酸序列。
根据另一方面,本发明涉及包含SEQ ID NO:20序列的分离的 核酸序列。
根据另一方面,本发明涉及包含SEQ ID NO:21序列的分离的 核酸序列。
根据又一方面,本发明涉及包含与SEQ ID NO:18序列有至少25 %同源性的序列的分离的核酸序列。
与SEQ ID NO:18序列的同源 性还可至少为50%,80%,或90%。
根据又一方面,本发明涉及包含与SEQ ID NO:19序列有至少90 %同源性的序列的分离的核酸序列。
根据又一方面,本发明涉及包含与SEQ ID NO:20序列有至少90 %同源性的序列的分离的核酸序列。
根据又一方面,本发明涉及包含与SEQ ID NO:21序列有至少90 %同源性的序列的分离的核酸序列。
根据另一方面,本发明涉及一种分离的核酸序列,其在杂交条件 下与SEQ ID NO:18核酸杂交。
根据另一方面,本发明涉及编码相应于SEQ ID NO:22的氨基 酸序列的分离的核酸序列。
根据另一方面,本发明涉及包含SEQ ID NO:22的氨基酸序列 的分离的蛋白质。
根据另一方面,本发明涉及包含与SEQ ID NO:22有至少35% 同源性的氨基酸序列的分离的蛋白质。
与SEQ ID NO:22的同源性 还可至少为50%或80%。
根据另一方面,本发明涉及编码相当于SEQ ID NO:23的氨基 酸序列的分离的核酸序列。
根据另一方面,本发明涉及包含SEQ ID NO:23的氨基酸序列 的分离的蛋白质。
根据另一方面,本发明涉及包含与SEQ ID NO:23有至少20% 同源性的氨基酸序列的分离的蛋白质。
与SEQ ID NO:22的同源性 还可至少为50%或80%。
根据另一方面,本发明涉及纯化至少一种磺基水解酶的方法,包 括:将海藻提取物进行分级分离以获得级分;并将至少一种级分进 行苯基琼脂糖凝胶层析,以获得含有至少一种磺基水解酶的琼脂糖 凝胶级分。
根据又一方面,本发明涉及一种酶促修饰的化合物,其已通过纯 化水平为至少大约40wt%总蛋白量的分离的磺基水解酶修饰。
分离 的磺基水解酶的纯化水平还可至少为70wt%,90wt%或95wt%。
根据另一方面,本发明涉及一种酶促修饰硫酸化的化合物的方 法,包括:将纯化水平为至少大约40wt%总蛋白量的分离的磺基水 解酶,与硫酸化的化合物组合,形成反应混合物;温育此反应混合 物以从硫酸化的化合物中除去硫酸酯基团,形成酶促修饰的化合物。
根据另一方面,本发明涉及一种酶促修饰硫酸化的化合物的方 法,包括:将硫酸化的化合物与第一种磺基水解酶温育,以从硫酸 化的化合物中除去硫酸酯基团,形成中间化合物;随后用第二种磺 基水解酶温育此中间化合物,以除去硫酸酯基团,形成酶促修饰的 化合物。
根据另一方面,本发明涉及一种产物,其是通过用蛋白质含量基 本由磺基水解酶组成的溶液温育硫酸化的化合物而产生的,所述磺 基水解酶进行性除去硫酸酯基团。
根据另一方面,本发明涉及一种产物,其是通过用蛋白质含量基 本由磺基水解酶组成的溶液温育硫酸化的化合物而产生的,所述磺 基水解酶随机除去硫酸酯基团。
根据另一方面,本发明涉及一种从海藻中提取nu-或mu-角叉 菜聚糖的方法,包括:将海藻分散于含有K2CO3的盐溶液中形成分 散系;过滤此分散系获得一种液体;超滤此分散系以除去盐;浓缩 此液体;将此液体的pH调节为8-8.5;并从此液体中沉淀nu-或 mu-角叉菜聚糖。
一方面,磺基水解酶能从水状胶体中除去硫酸酯。
水状胶体可以 是糖胺聚糖,岩藻聚糖和半乳聚糖之一。
另一方面,磺基水解酶能从半乳聚糖中除去硫酸酯。
另一方面,半乳聚糖包含角叉菜聚糖。
角叉菜聚糖可包括mu- 角叉菜聚糖,如包含至少大约50mol%的mu-角叉菜聚糖。
角叉菜 聚糖可包括nu-角叉菜聚糖,如包含至少大约50mol%的nu-角叉 菜聚糖。
另一方面,半乳聚糖包括琼脂。
另一方面,磺基水解酶包括6-O-磺基水解酶。
另一方面,磺基水解酶能将nu-角叉菜聚糖转变为iota-角叉菜 聚糖。
另一方面,磺基水解酶能将mu-角叉菜聚糖转变为kappa-角叉 菜聚糖。
另一方面,磺基水解酶能除去6-O-硫酸酯以诱导脱水桥形成。
另一方面,级分包含硫酸铵级分。
另一方面,此方法还包括对至少一种苯基琼脂糖凝胶级分进行 DEAE琼脂糖凝胶层析,以获得DEAE琼脂糖凝胶级分。
至少一种 DEAE琼脂糖凝胶级分可进行肝素琼脂糖凝胶层析。
另一方面,温育是在大约0-60℃的温度下进行。
另一方面,温育是在pH大约为5.5-9.5的情况下进行。
另一方面,加入反应混合物中的至少一种磺基水解酶是包含于溶 液中的,浓度为至少一种磺基水解酶至少为2-85μg/ml。
另一方面,反应混合物中硫酸化的化合物的浓度为大约0.012-2 %(w/v)。
另一方面,修饰的化合物包括iota-角叉菜聚糖。
另一方面,修饰的化合物包括kappa-角叉菜聚糖。
另一方面,酶促修饰的化合物包括富含前体的iota-角叉菜聚糖。
另一方面,酶促修饰的化合物包括富含前体的kappa-角叉菜聚 糖。
另一方面,除去硫酸酯包括从半乳聚糖中除去6-硫酸酯基团。
另一方面,除去硫酸酯包括将nu-角叉菜聚糖转变为iota-角叉 菜聚糖,形成在一定条件下不发生凝胶的产物,所述条件为产物在 含有0.1M钾的水溶液中浓度为大约0.7%(w/v),温度为40℃,pH 为7。
另一方面,第一种磺基水解酶随机除去硫酸酯。
另一方面,第二种磺基水解酶进行性除去硫酸酯。
另一方面,海藻包括Spinosum。
另一方面,海藻在分散于盐溶液之前是冻干并磨碎的。
另一方面,盐溶液还包含KCl。
KCl的浓度为大约1-1.5M。
另一方面,在过滤前将分散系静置至少18小时。
另一方面,浓缩约2-3倍。
另一方面,通过加入碱调节液体的pH。
另一方面,通过加入异丙醇进行沉淀。
另一方面,进行透析直至水的电导率稳定在大约2μS/cm以下。
另一方面,在沉淀经透析的nu-或mu-角叉菜聚糖之后,将nu -或mu-角叉菜聚糖冻干并磨碎。
另一方面,沉淀的透析的nu-或mu-角叉菜聚糖中nu-或mu -含量为大约18-35mol%。
另一方面,沉淀的透析的nu-或mu-角叉菜聚糖的分子量为大 约700-800kDa。
发明详述 本文所阐述的是举例说明本发明的各种实施方案,并提供据信是 本发明的最实用和最易理解的原理和概念。
在这点上,未尝试示出 比基本理解本发明所必需的更详细的内容,结合附图本领域技术人 员可明白有几种形式可实际应用。
本申请中所有百分率,除非特别说明,均通过基于重量(g)/体 积(ml)测定的。
因此,例如30%代表30g/100ml样品。
除非特别说明,提及的化合物或组分,包括化合物或组分自身, 以及与其它化合物或组分的组合,如化合物的混合物。
在进一步阐述之前,对以下术语进行解释将有助于理解本发明。
“半乳聚糖”:一种由半乳糖单位和其它的单位组成的多糖;如 琼脂和角叉菜聚糖。
半乳聚糖具有至少50mol%的半乳糖单位。
“水状胶体”:一种亲水性多糖或衍生物,例如植物多糖,当将 其加入水中时,其膨胀产生黏性分散系或溶液。
“杂交条件”:将相应核酸移至得自Amersham Pharmacia Biotech AB的尼龙膜上,如SAMBROOK等,分子克隆实验手册,第二版, CSH实验室出版社,冷泉港,NY(1989),所述文献全文并入参考。
将此膜在6×SSC,5×Denhart,0.1%SDS和100μg/ml鲑精DNA 中,在42℃杂交过夜。
SSC是3M NaCl和0.3M柠檬酸钠的水溶液, 根据SAMBROOK等,分子克隆实验手册,第二版,CSH实验室出 版社,冷泉港,NY(1989)所述程序制备,所述文献全文并入参考。
在杂交后,将滤膜在42℃用以下溶液洗15分钟:2×SSC,0.1%SDS; 1×SSC,0.1%SDS,并曝光于得自Molecular Dynamics,Uppsala, Sweden光刺激屏,用也得自于Molecular Dynamics,Uppsala,Sweden 的Storm扫描。
为确定两个氨基酸序列或两个核酸序列之间的相同性百分比或同 源性百分率,对序列进行最佳对比(例如可将缺口导入第一个氨基 酸或核酸序列中,以与第二个氨基酸或核酸序列最佳排列对比)。
然 后将在相应氨基酸位置或核苷酸位置的氨基酸残基或核苷酸进行对 比。
当第一个序列中的一个位置由与第二个序列中相应位置的相同 氨基酸残基或核苷酸占据时,则分子在这个位置是相同的。
两个序 列之间的相同性百分比通过序列呈现的相同性位置的数目(即相同 性百分比=相同性位置数/位置总数(如重叠位)×100)。
优选地, 这两个序列是等长的。
确定两个序列之间的同源性百分比可通过用数学公式进行。
优选 地,用于对比两个序列的公式非限制性的例如是KARLIN等,美国 科学院院报,87,pp2264-2268(1990)所述公式,所述文献以其 全文并入参考,KARLIN等,美国科学院院报,90,pp5873-5877 (1993)对此公式加以修改,所述内容全文并入参考。
这个公式被 掺入ALTSCHUL等,分子生物学杂志,215,pp403-410(1990) 所述的NBLAST和XBLAST程序中,所述文献以其全文并入参考。
可用NBLAST程序,分值=100,字长=12进行BLAST核苷酸检 索,以获得同源于本发明磺基水解酶核酸分子的核苷酸序列。
可用 XBLAST程序,分值=50,字长=3进行BLAST蛋白质检索,以获 得同源于本发明磺基水解酶蛋白质分子的氨基酸序列。
为进行缺口 的序列对比,可利用ALTSCHUL等,核酸研究,25,pp3389-3402 (1997)所述的缺口BLAST,所述文献以其全文并入参考。
或者, 可使用PSI-Blast进行重复检索,其检测分子间的远缘关系。
当利用 BLAST,缺口的BLAST,和PSI-Blast程序时,可使用各自程序(如 XBLAST和NBLAST)的缺省参数。
见http://www.ncbi.nlm.nih.gov。
另外优选地的用于对比两个序列的公式非限制性的例如是MYERS 等,CABIOS,4,pp11-17(1988)所述的公式,所述文献以其全 文并入参考。
这个公式掺入ALIGN程序(2.0版本)中,该程序是 GCG序列对比软件程序包的一部分。
当利用ALIGN程序对比氨基 酸序列时,可使用PAM120权重残基表,缺口长度罚分12,和缺口 罚分4。
总而言之,本发明涉及磺基水解酶的分离和纯化。
例如,磺基水 解酶可纯化自海藻。
磺基水解酶优选能从硫酸化的化合物如角叉菜 聚糖中除去硫酸酯。
磺基水解酶还可在硫酸化的化合物如角叉菜聚 糖上形成3,6-脱水桥。
本发明还涉及酶促修饰硫酸化的化合物的 方法。
本发明还涉及修饰的硫酸化的化合物,如修饰的角叉菜聚糖, 如已被修饰为至少具有相应于iota-角叉菜聚糖的部分的nu-角叉菜 聚糖,或如已被修饰为至少具有相应于kappa-角叉菜聚糖的部分的 mu-角叉菜聚糖。
本发明还涉及从海藻中提取角叉菜聚糖的方法。
本申请和现有技术领域所提供的指导是:(1)蛋白质纯化和(2) 部分氨基酸序列确定;(3)构建和使用探针以确定相应DNA序列 位置;和(4)克隆和测序,如下的讨论将能够:(1)分离磺基水解 酶;(2)鉴别其氨基酸序列;(3)构建相应DNA序列的探针;和(4) 鉴别,分离,纯化和确定编码此酶的DNA序列。
见例如SAMBROOK 等,分子克隆实验手册,第二版,CSH实验室出版社,冷泉港,NY (1989),所述文献以其全文并入参考。
本发明酶促修饰的化合物包括硫酸化的化合物。
硫酸化的化合物 包括半乳聚糖,糖胺聚糖,和岩藻聚糖。
岩藻聚糖是高度不均一的硫酸化多糖,由不同糖残基组成,如岩 藻糖,半乳糖,甘露糖和糖醛酸。
岩藻聚糖基团数目及其组成模式 相当不同。
岩藻聚糖是在褐色海藻和棘皮类动物中产生的。
在这点 上,岩藻聚糖可来自褐色海藻细胞壁的基质相,其主要含有L-岩藻 糖。
L-岩藻糖残基通常通过α(1-3)键连接,并在C4位硫酸化。
对岩藻聚糖酶促修饰可影响其抗凝聚性质。
糖胺聚糖(GAGs)是来自动物胞外基质的硫酸化多糖家族,其 包括肝素,硫酸肝素,硫酸软骨素,硫酸皮肤素,和硫酸角质素。
GAGs由含有己糖醛酸和己糖胺的二糖重复单位组成。
肝素和硫酸 肝素是可变的硫酸化糖胺聚糖,其主要由α(1-4)连接的D-艾杜 糖醛酸-2-硫酸酯残基或D-葡糖醛酸-2-硫酸酯残基和N-磺基- D-葡糖胺-6-硫酸酯残基组成。
对肝素酶促修饰可影响其抗凝血性 质。
硫酸软骨素和硫酸皮肤素主要由α(1-4)连接的D-艾杜糖醛 酸或D-葡糖醛酸和N-磺基-D-葡糖胺-6-硫酸酯残基组成。
通常 N-乙酰半乳糖胺的C2或C4位是硫酸化的,且硫酸皮肤素中艾杜 糖醛酸的C2位也通常是硫酸化的。
硫酸角质素多糖由半乳糖和N- 乙酰半乳糖胺组成。
半乳糖或N-乙酰半乳糖胺的C6位可以是硫酸 化的。
半乳聚糖可得自许多不同原料。
例如,半乳聚糖可得自海藻。
半 乳聚糖例如包括角叉菜聚糖和琼脂。
例如,从海藻中提取琼脂是已知的。
例如从海藻中提取琼脂见于 SELBY等,“琼脂”,工业树脂:多糖及其衍生物,第三版,(1993), 所述文献以其全文并入参考。
从海藻中提取角叉菜聚糖是已知的。
例如,从海藻中提取角叉菜 聚糖见于THERKELSEN,“角叉菜聚糖”,工业用树胶:多糖及其 衍生物,第三版,(1993),所述文献以其全文并入参考。
本发明还涉及提取高于天然水平的高分子量即分子量在大约 500kDa以上的nu-和mn-角叉菜聚糖的方法。
基于待提取的角叉 菜聚糖,角叉菜聚糖的原料可以是海藻,如Spinosum,Cottonii,和 Gigartina radula。
海藻可以是冻干,磨碎并分散于浓度优选为大约0.05-0.3M,更 优选为0.1-0.15M,最优选为大约0.125M的KCl水溶液中。
此分 散系还含有浓度优选为0.0005-0.003M,更优选为0.001-0.0015M, 最优选为大约0.00125M的K2CO3,以保持碱性环境,即pH优选为 大约7-9,更优选为7.5-8.5,最优选为大约7.8-8.3。
也可使用 相应钙盐,如氯化钙和碳酸钙,但由于这些钙盐溶解性相对低,因 此优选钾盐。
将此分散系静置一段时间,优选大约1-72小时,更优选大约16 -32小时,最优选大约24小时,温度为大约5-55℃,优选大约22 -50℃,更优选大约在室温。
在此阶段后,将此分散系过滤。
例如,可用加压硅藻土滤膜过滤。
在过滤之后,优选将此液体例如用30kDa的MWCO-膜超滤或 渗滤,以除去过量的盐。
在超滤后,通过加入自来水在室温清洗提 取物。
持续清洗直至电导率低于2mS/cm并且稳定。
将此液体优选 通过超滤浓缩25-30%。
优选用0.1M的NaCl将pH调节为8-8.5。
然后将此液体优选蒸发至大约10-90%,更优选大约30-70%, 最优选大约50%。
例如,此液体可在真空蒸发器中蒸发。
在蒸发后,将pH优选调节为大约7-9,更优选大约7.5-8.5, 最优选大约为8。
例如,可通过加入1M NaOH将pH调节为8。
然 后用异丙醇(IPA)沉淀并冻干,如用得自英国BP化学制品公司的 100%(v/v)IPA沉淀。
所得提取物具有富集的nu-或mu-含量,优选大约为15-40mol %,更优选为大约17-30mol%,最优选为大约19-24mol%。
所得 提取物还具有高分子量,优选大约为500-1100kDa,更优选为600 -900kDa,最优选为大约700-800kDa。
本发明的磺基水解酶可分离自产生硫酸化半乳聚糖的海藻,如 Solieriaceae科(如麒麟菜属,Kappaphycus),杉藻科(如角叉菜属, 杉藻属),Furcellariaceae,沙菜科,育叶藻科,Cystocloniaceae(如 Calliblepharis),和红毛菜科(如紫菜属)。
例如,磺基水解酶的非详 尽海藻原料和潜在海藻原料包括刺麒麟菜,耳突麒麟菜(= Kappaphycus alvarezii),Eucheuma denticulatum,皱波角叉菜, Calliblepharis jubata,Gigartina radula,星芒杉藻,和脐形紫菜。
以下段落阐述了分离磺基水解酶的方法。
从本发明所述的纯化方 法的指导和实施例中,本领域技术人员可开发另外的分离磺基水解 酶的方法。
根据本发明为分离磺基水解酶,通常优选对潜在的酶原料如海藻 进行筛选酶活性,以保证相应的酶存在于潜在的酶原料中。
如以下 更详细的阐述,筛选包括从潜在酶原料中获得粗提物。
然后,将此 粗提物在各种条件下用于处理各种底物,以一般性地确定粗提物中 存在的所有酶活性。
通过此信息,本领域技术人员可一般性地确定 是否值得对潜在酶原料进行如下所述的进一步纯化,及一般性地确 定酶是保持稳定且活性的条件。
一种粗提方法例如是从C.crispus中分离酶,可将C.crispus的配 子体植物在液氮中冷冻,并研磨成粉末。
虽然此粉末可立即使用, 以保持粉末中酶的完整性,但此粉末仍可在低温保持直至进一步使 用,如在-20℃至-80℃保持。
然后,此粉末可用缓冲液提取,如含有10mM 2-巯基乙醇和 500mM KCl的4体积的50mM Tris-HCl缓冲液(pH9.5)。
在离心之 后,可将上清用冻(如-20℃)丙酮分级分离,例如以两步方法:(1) 从0-30%丙酮饱和液中分级分离;(2)从30-60%丙酮饱和液中 分级分离。
在每个分级步骤之后,优选例如在4℃,以10000×g离 心30分钟。
将粒状沉淀溶解于缓冲液中,如含有10mM 2-巯基乙 醇的2ml的50mM Tris-HCl缓冲液(pH7.1)。
然后,将粒状沉淀以 及上清等分透析,如在4℃,用得自美国Spectrum实验室公司,Rancho Dominguez,CA的MWCO 6-8000或3500 Spectra/por膜,经含有 10mM的2-巯基乙醇的3×3升50mM Tris-HCl缓冲液(pH7.1)透 析过夜。
粒状沉淀和上清可用于寻找磺基水解酶的活性。
另一种粗提方法例如是从耳突麒麟菜(=Kappaphycus alvarezii) 中分离酶,可将耳突麒麟菜在液氮中冷冻。
此耳突麒麟菜可立即使 用或在低温下保持直至进一步使用,如在-80℃保持。
在提取之前, 可将耳突麒麟菜研磨为细末。
除非特别指出,以下所有步骤均可在4℃进行。
将粉末用缓冲液 提取,例如用50mM Tris-HCl(pH9.5)加上500mM KCl和10mM 2 -巯基乙醇提取。
将所得悬浮液搅拌过夜,然后离心,如用得自美 国Beckman Instruments公司,Fullerton,CA的Beckman J2-21,Rotor JA20,以10000×g离心75分钟。
将上清如前所述用冻丙酮分级分 离。
在离心之后,收集上清和粒状沉淀。
然后,将粒状沉淀以及上 清等分进行透析,例如用得自美国Spectrum实验室公司,Rancho Dominguez,CA的MWCO 6-8000或3500透析膜,经含有10mM 的2-巯基乙醇的4×1升50mM Tris-HCl缓冲液(pH7.1)加上10mM 2-巯基乙醇透析20小时。
在透析之后,将上清和再溶解的粒状沉 淀用于寻找磺基水解酶。
一旦获得粗提物,为确定粗提物是否具有磺基水解酶活性,可进 行一些分析。
例如,磺基水解酶可从角叉菜聚糖中除去硫酸酯基团, 因此测定的游离硫酸根游离硫酸根基团可表示磺基水解酶活性。
能 除去6-O-硫酸酯的6-O-磺基水解酶,也趋于导致3,6-脱水 半乳糖桥形成,并因此诱导黏性增加。
因此,测定3,6-脱水半乳 糖桥的水平是另一种测定磺基水解酶活性的方法。
另外,6-O-磺 基水解酶活性与黏性增加相关,因此可测定黏性以表示磺基水解酶 活性。
就测定游离硫酸根游离硫酸根而言,磺基水解酶对角叉菜聚糖的 活性在本申请书中是通过一种新的测定游离硫酸根游离硫酸根的方 法测定的。
一些确定游离硫酸根游离硫酸根的分析已由一些文献阐 述,但这些分析费时或费钱。
见WONG等,“在皱波角叉菜(红藻 纲)中,磺基水解酶活性和角叉菜聚糖生物合成”,植物生理学,第 6全,pp663-666(1978);REES,“紫菜聚糖的酶促脱硫化”,生 物化学杂志,80,pp449-453(1961);和ZINOUN等,“在红色海 藻Calliblepharis jubata中磺基水解酶活性迹象”,Botanica Marina, 第40卷,pp49-53(1997),所述文献以其全文并入参考。
确定游离硫酸根游离硫酸根水平的新方法,是基于通过高效阴离 子交换色谱在8分钟内用自动抑制的电导率检测而确定游离硫酸根 游离硫酸根水平。
除了快速和完全自动化,此方法还因为可易于检 测少如10ppm的游离硫酸根游离硫酸根而具有再现性和敏感性的优 点。
例如,磺基水解酶活性可通过测定温育角叉菜聚糖的酶提取物所 释放的硫酸根数量而分析。
此反应化合物可含有100μl酶样品, 50mM Tris-HCl(pH7.1)/10mM 2-巯基乙醇和100μl的1.4%(w/v) 角叉菜聚糖。
其中,角叉菜聚糖存在于相同缓冲液中,或在得自美 国Millipore Corporation,Bedford,MA的MilliQ水中。
应指出的是, 酶样品可通过任何适当方法获得,如上述粗提方法。
然而样品可以 是任何其它测定活性所需的样品。
除非特别指出,在使用前将酶提 取物煮沸10分钟而制备参照混合物。
在48℃温育6-15小时之后, 通过在得自美国Amicon Bioseparations,Millipore Corporation, Bedford,MA的Microcon-10装置中,在30℃以3320×g离心1 小时,从反应混合物中除去角叉菜聚糖。
存在于Microcon-10装置过滤物中的游离硫酸根游离硫酸根的 数量,然后通过HPAEC(高效阴离子层析)分析,使用装备GP40 梯度泵,和ED40电化学检测仪的Dionex DX 500层析系统进行分 析,所述设备均得自美国Dionex公司,Sunnyvale,CA。
将IonPac AS12 阴离子层析柱(4×200mm,也得自Dionex公司)安放在AG12 Guard 层析柱(4×50mm,也得自Dionex公司)上。
洗脱液是9.5mM Na2CO3/0.5mM NaHCO3,在流速为1.5ml/分洗脱。
通过ASRS电导 率检测阴离子,使用具有电流为50mA的SRS(自动再生抑制器) 的阴离子自动再生抑制器ASRS-1(4mm,也得自Dionex公司)进 行。
就测定3,6-脱水半乳糖桥而言,可使用另一种方法。
在脱硫 反应期间产生的3,6-脱水半乳糖桥数量,在本申请中是用JOL等, “分析含有3,6-脱水半乳糖的角叉菜聚糖和琼脂的一种新的高效 阴离子交换层析法”,268,pp213-222(1999)所述的方法测定的, 所述文献以其全文并入参考。
就测定黏性水平而言,可在反应混合物中进行粘度测定。
反应混 合物的粘度是用得自美国Brookfield Engineering实验室,Stoughton, MA的可编程的Brookfield流变仪DV III,自动调温在48℃而直接 测定的。
用CP52轴以120rpm剪切速率处理10分钟而测定。
一旦例如通过上述筛选鉴别了酶的潜在原料,可根据本发明将磺 基水解酶纯化为均一性。
通过本发明所述的指导和纯化方法,本领 域技术人员可开发出另外的纯化方法。
下文示出并阐述了从皱波角叉菜中纯化酶的一典型例子;除非特 别指出,所有步骤均在4℃进行: 如上所述,除非特别指出在上述纯化过程中所有分级分离和纯化 步骤,均在4℃进行。
可将皱波角叉菜配子体植物在液氮中冷冻并磨碎。
例如,可将冷 冻的皱波角叉菜用得自法国Forplex工厂,Billancourt生产的Forplex 研磨器自动研磨为小于1mm长的碎片。
此“粉末”可立即使用或 可在低温保持直至进一步使用,如在-20℃至-80℃保持。
然后可将研磨的皱波角叉菜进行提取。
例如,将650g的此冷冻 的皱波角叉菜在4℃,在1.5体积(v/w)的提取液(50mM Tris-HCl, pH9.5/500mM KCl/10mM 2-巯基乙醇)中解冻过夜。
换而言之, 将650g的皱波角叉菜在975ml的缓冲液中解冻。
将上清搅拌过夜, 然后如以10000×g离心75分钟。
然后将提取液上清进行分级分离。
例如,将上清通过加入硫酸铵 调节为30%(NH4)2SO4饱和度(16.4g硫酸铵/100ml样品)。
在这 点上,此百分率指硫酸铵的百分数,硫酸铵溶液在0℃在3.9M是饱 和的。
当所有硫酸铵都溶解时,将此混合物静置大约30分钟,然后 以24700×g离心60分钟。
磺基水解酶的活性在粗提物中通常不能检测,有时在硫酸铵上清 中也不能检测。
这可以是由于在下述苯基琼脂糖凝胶层析期间除去 的多糖或蛋白质的干扰所致。
苯基琼脂糖凝胶层析的一重要目的是 除去藻红蛋白,藻红蛋白是组成角叉菜提取物的主要成分的一种亲 水性蛋白质。
在对硫酸铵混合物离心后,收集上清并加样于苯基琼脂糖凝胶层 析柱中,如得自瑞典Amersham Pharmacia Biotech AB,Uppsala的苯 基琼脂糖凝胶6快速流动(2.0×24cm)层析柱,该层析柱预先用50mM Tris-HCl缓冲液(pH8.7),30%饱和度的(NH4)2SO4,500mM KCl和10mM 2-巯基乙醇(缓冲液D)平衡。
将此层析柱用此缓冲液清 洗,直至流出物在280nm的吸光度可忽略不计。
然后将结合的蛋白 质用线性降低梯度的(NH4)2SO4洗脱,线性降低梯度的(NH4)2SO4由360ml缓冲液D和360ml无(NH4)2SO4的相同缓冲液(缓冲液 C)制备。
在梯度末,藻红蛋白以及一些其它蛋白质通常只用缓冲液 C洗脱。
例如,洗脱可在以下条件下进行: 缓冲液D:50mM Tris-HCl缓冲液,pH8.7,含有30%饱和度的 (NH4)2SO4,500mM KCl,和10mM 2-巯基乙醇。
缓冲液C:50mM Tris-HCl缓冲液,pH8.7,含有500mM KCl, 和10mM 2-巯基乙醇。
流速:1ml/分钟 级分规格:8ml 时间(分钟)
%缓冲液D
%缓冲液C
    0
    100
    0
    720
    0
    100
上述提取和苯基琼脂糖凝胶层析优选至少进行两次,以具有足够 的物质进行接下来的步骤。
苯基琼脂糖凝胶层析中相应的级分,即后来发现具有磺基水解酶 活性的级分,然后可进行透析。
例如,可集合活性级分并用得自美 国Spectrum Laboratories,Inc.,Rancho Dominguez,CA的MWCO 6-8000或3500 Spectra/por膜,经5×10升的含有10mM 2-巯基乙 醇的50mM Tris-HCl缓冲液(pH7.1)(缓冲液A)透析36小时。
在 透析后,检测样品的pH和电导率,并如果需要用缓冲液A调节(即 pH7.1及电导率为大约1.7mS/cm)。
在透析后,将样品进行DEAE琼脂糖凝胶层析。
例如,将样品以 1ml/分钟的流速应用于预先用缓冲液A平衡的DEAE琼脂糖凝胶层 析柱(2.0×22cm)中,该层析柱得自瑞典Amersham Pharmacia Biotech AB,Uppsala。
此层析柱可用缓冲液A清洗,直至在280nm的吸光 度可忽略不计。
然后,可洗脱吸附的蛋白质,如以1ml/分钟流速, 用在缓冲液A中的线性NaCl梯度(0-1M)洗脱。
例如,可如下 进行洗脱: 缓冲液A:50mM Tris-HCl缓冲液,pH7.1,和10mM 2-巯基乙 醇 缓冲液B:50mM Tris-HCl缓冲液,pH7.1,和10mM 2-巯基乙 醇+1 MNaCl级分规格:7.5ml 流速:1ml/分钟 时间(分钟)
%缓冲液A
%缓冲液B
    0
    100
    0
    390
    35
    65
    450
    35
    65
    630
    0
    100
对在650-800mM NaCl梯度洗脱的DEAE琼脂糖凝胶层析级分 进行的SDS PAGE分析,通常示出存在一个34.9kDa的单一条带。
此条带相当于磺基水解酶II,其在下文加以详细阐述。
除了磺基水解酶II之外,磺基水解酶I在DEAE层析期间在300 -600mM NaCl之间洗脱。
然而,这些级分通常包含杂质。
为分离 磺基水解酶I,需要进一步纯化,如透析和半亲和性及阳离子交换层 析,例如肝素层析。
例如肝素层析,用580mM NaCl洗脱的级分的一半可用得自美国 的Spectrum Laboratories,Inc.,Rancho Dominguez,CA的MWCO 6-8000或3500 Spectra/por膜,经缓冲液A透析。
然后,可将此级分 加样于(流速为1.5ml/分钟)预先用缓冲液A平衡的HiTrap肝素层 析柱顶部,该层析柱得自瑞典Amersham Pharmacia Biotech AB, Uppsala。
然后将此层析柱可用缓冲液A以流速为1.5ml/分钟清洗, 直至在280nm的吸光度可忽略不计。
接着将结合的蛋白质用三步增 加梯度的NaCl(0-1200mM)洗脱。
尤其地,可用如下梯度进行洗 脱: 缓冲液A:50mM Tris-HCl缓冲液,pH7.1,和10mM 2-巯基乙 醇 缓冲液B:50mM Tris-HCl缓冲液,pH7.1,和10mM 2-巯基乙 醇+1M NaCl级分规格:1.5ml 流速:1.5ml/分钟 时间(分钟)
%缓冲液A
%缓冲液B
    0
    100
    0
    10
    71
    29
    15
    71
    29
    25
    34
    66
    30
    34
    66
    35
    0
    100
    45
    0
    100
对用1200mM NaCl洗脱的级分进行SDS-PAGE分析显示一个单 一的模糊条带,其特征在于分子量为62.1kDa。
此条带相当于磺基水 解酶I。
上述纯化步骤优选用2×600-700g新鲜海藻开始,如上述的650 g。
用此数量的物质,在DEAE层析后这两种酶均充分分离,但磺基 水解酶I仍是未纯化的。
上述半亲和性和阳离子交换层析是必需的, 以将此酶纯化为均一性。
Cottonii磺基水解酶也可经类似于上述纯化皱波角叉菜磺基水解 酶I和II的步骤进行纯化。
例如,可将cottonii在液氮中冷冻,并在-80℃保持直至进一步 使用。
在提取之前,将冷冻的cottonii研磨,如在研钵中手工研磨为 细末,将液氮用烘炉注入研钵中以使cottonii在研磨期间保持冷冻状 态。
为部分纯化cottonii磺基水解酶,以下步骤可在4℃进行。
将磨 碎的cottonii在缓冲液中提取,如25g的磨碎cottonii在40ml的50mM Tris-HCl(pH9.5)+500mM KCl和10mM 2-巯基乙醇中提取。
将 所得上清用磁性搅拌棒搅拌过夜,然后以10000×g离心75分钟, 使用得自美国Beckman Instruments公司,Fullerton,CA的Beckman J2-21,Rotor JA20离心。
将上清用得自美国Spectrum Laboratories, Inc.,Rancho Dominguez,CA的NWCO6-8000或3500透析膜, 经4×1升50mM Tris-HCl(pH8.5)+10mM 2-巯基乙醇透析20小 时。
在透析之后,将上清以1ml/分钟的流速加样于预先用相同缓冲 液平衡的肝素琼脂糖II-S型层析柱(27.5×1cm层析柱,10×0.5cm 凝胶规格)的顶部,该层析柱得自英国Millipore,Stonehouse,肝素 II-S型琼脂糖凝胶得自美国Sigma Chemical,St.Louis,MO。
将此层 析柱用此缓冲液清洗直至在280nm的吸光度可忽略不计。
然后,吸 附的蛋白质可例如用线性NaCl梯度(0-1M)洗脱40分钟。
尤其 洗脱可用以下梯度进行: 缓冲液A:50mM Tris-HCl缓冲液(pH8.5)+10mM 2-巯基乙 醇 缓冲液B:50mM Tris-HCl缓冲液(pH8.5)+10mM 2-巯基乙 醇+1M NaCl级分规格:2ml 流速:1ml/分钟 时间(分钟)
%缓冲液A
  %缓冲液B
    0
    100
    0
    40
    0
    100
尽管大多数蛋白质在提取中不与肝素琼脂糖结合,但磺基水解酶 结合凝胶因为在硫酸根释放和/或粘度提高方面的大部分活性,在后 面级分中发现。
可将从肝素层析所得级分浓缩13倍,例如通过在得 自美国Amicon Bioseparations,Millpore公司,Bedford,MA的 Microcon-10装置中,在4℃中以3320×g离心1小时,之后进行 SDS-PAGE分析和硝酸银染色,如MERRIL等,“在聚丙烯酰胺凝 胶上对蛋白质进行超敏感染色,以示出脑脊液蛋白质中区域性变 化”,科学,211,pp1437-1438(1981)所述,所述文献以其全文 并入参考。
不同活性的级分特征均在于存在两个共同的蛋白质,其中一个分 子量为大约65kDa,另一个分子量大约为55kDa。
根据本发明,基于样品中蛋白质的总量,磺基水解酶可具有高纯 度。
基于蛋白质总量磺基水解酶优选纯化为至少大约40wt%,更优 选为至少大约50wt%,更优选为至少大约60wt%,更优选为至少大 约70wt%,更优选为至少大约80wt%,更优选为至少大约90wt%, 更优选为至少大约95wt%,更优选为至少大约99wt%,最优选为 100wt%。
如下更详细的阐述,此高纯度水平使待修饰的硫酸化的化 合物的性质被修饰。
一旦已经纯化磺基水解酶,则可确定其氨基酸序列。
这些蛋白质 的肽序列可通过常规方法确定,如Edman’s降解法。
为确定这两种磺基水解酶的N-末端氨基酸序列,将磺基水解酶 根据上述纯化方法一般性纯化,包括提取,硫酸铵分级分离,苯基 琼脂糖凝胶层析,DEAE琼脂糖凝胶层析等。
尤其将DEAE琼脂糖 凝胶层析的60和61级分浓缩20倍,通过用得自美国Amicon Bioseparations,Millpore公司,Bedford,MA的Microcon-10装置, 在4℃中以3320×g离心1小时进行浓缩,之后进行SDS PAGE。
集 合DEAE琼脂糖凝胶层析的38-47级分,并用得自美国Spectrum Laboratories,Inc.,Rancho Dominguez,CA的NWCO6-8000或3500 透析膜,经3×3升50mM Tris-HCl(pH7.1)+10mM 2-巯基乙醇 在4℃透析6小时。
在透析后,将样品的电导率通过用MilliQ水稀 释而调节为缓冲液的电导率,MilliQ水得自美国Millipore公司, Bedford,MA。
然后将一半样品(57ml)加样于(流速1.5ml/分钟) 预先用50mM Tris-HCl(pH7.1)+10mM 2-巯基乙醇平衡的HiTrap 肝素层析柱的顶部,该层析柱得自瑞典Pharmacia Biotech AB, Uppsala。
将此层析柱用此缓冲液清洗,直至在280nm的吸光度可 忽略不计。
然后,用增加梯度的NaCl(0-1.2M)洗脱蛋白质。
将 构成在280nm吸光度洗脱峰值的24,25,26和28级分浓缩13倍, 通过用得自美国Amicon Bioseparations,Millpore公司,Bedford,MA 的Microcon-10装置,在4℃中以3320×g离心1小时进行浓缩,之 后加样于SDS凝胶上进行SDS PAGE。
由此,将DEAE层析的两个级分(60和61)以及HiTrap肝素层 析的四个级分(24,25,26和28),进行SDS PAGE(12%总单体 (丙烯酰胺+N,N’-亚甲双丙烯酰胺)克数/100ml凝胶)以分离 酶,根据LAEMMLI,自然,227,pp680-685(1970)所述方法进 行,所述文献以其全文并入参考。
在SDS PAGE之后,将蛋白质移至得自瑞典Pharmacia Biotech AB,Uppsala的“Hybond-P”膜(聚偏二氟乙烯(PVDF)膜)上。
此转移在含有50mM硼酸盐的50mM Tris-HCl(pH8.25)缓冲液中, 在250mA进行2小时。
在转移之后,将蛋白质在100%(w/v)甲 醇中固定几秒,然后将此膜在50%(v/v)甲醇和10%(v/v)乙酸 中,用0.1%(w/v)的Coomassie Blue R250溶液染色1分钟,Coomassie Blue R250得自美国Bio-Rad实验室,Hercules,CA。
将此膜在50% (v/v)甲醇和10%(v/v)乙酸溶液中浸泡4-5分钟而脱色。
在用 得自美国Millipore公司,Bedford,MA的MilliQ水清洗1-2分钟 之后,切下相当于磺基水解酶I和II的条带,并送至法国巴黎Pasteur 研究所,以通过Edman’s降解法确定N-末端氨基酸序列。
从此 试验中,示出磺基水解酶II具有封闭的氨基端,因此其氨基端序列 不能确定。
对磺基水解酶I进行Edman0’s降解确定N-末端具有SEQ ID NO:1所示序列。
用一些相似方法确定一些内部肽的氨基酸序列。
然而在这种情况 中,在进行SDS PAGE(12%总单体(丙烯酰胺+N,N’-亚甲双 丙烯酰胺)克数/100ml凝胶)之后,不进行分离,SDS PAGE根据 LAEMMLI,自然,227,pp680-685(1970)所述方法进行,所述 文献以其全文并入参考。
尤其在电泳之后,立即将凝胶用在50% (v/v)甲醇和10%(v/v)乙酸中的0.0033%(w/v)酰胺黑溶液染 色过夜。
然后将此凝胶简单用得自美国Millipore公司,Bedford,MA 的MilliQ水清洗(4×10分钟),以除去甲醇和乙酸。
然后,将相当 于磺基水解酶I和II的条带切下,并在30℃,在装备冷阱RCT90(法 国,Jouan)的离心脱水器RC 10.10(法国,Jouan)中脱水大约30 分钟,之后送至法国巴黎Pasteur研究所,以进行蛋白酶消化和微量 测序,如下所述。
将含有大约15-30μg磺基水解酶I的丙烯酰胺片段,用在350μl 的0.05Tris-HCl(pH8.6)/0.03%(w/v)SDS中的0.4μg内切蛋白 酶-LysC,在37℃进行蛋白酶酶切18小时。
然后将所得肽在250mm ×2.1mm的DEAE C18层析柱上进行反相HPLC,DEAE C18层析 柱得自法国巴黎CIL CLUZEAU。
用在0.1%(v/v)三氟乙酸中2- 45%(v/v)梯度的乙腈,以0.2ml/分钟的流速进行洗脱,使许多肽 被分离。
其中,肽11,12,18,22和25是明显的,收集它们进行 测序。
这些肽在法国巴黎Pasteur研究所,通过Edman’s降解,用 应用生物系统473A自动气相氨基酸测序仪,根据标准方法进行分 析,应用生物系统473A自动气相氨基酸测序仪得自美国PE应用生 物系统,Foster City,CA。
分析结果确定磺基水解酶I包括SEQ ID NO:2-5所述序列。
将含有大约10μg经SDS PAGE纯化的磺基水解酶II的丙烯酰 胺片段,在600μl的0.05M Tris-HCl(pH8.6)/0.01%(v/v)“Tween 20”聚氧化乙烯山梨聚糖单月桂酸脂,和4%(w/v)牛胰蛋白酶中 进行蛋白酶酶解,“Tween 20”聚氧化乙烯山梨聚糖单月桂酸酯得自 美国USB,Cleveland,OH。
在37℃进行18小时蛋白酶消化。
将所 得胰蛋白酶消化的肽在250mm×2.1mm的DEAE C18层析柱中,通 过反相HPLC纯化,DEAE C18层析柱得自法国巴黎CIL CLUZEAU。
用2-45%(v/v)梯度的乙腈,以0.2ml/分钟的流速在0.1%(v/v) 三氟乙酸中进行洗脱。
在分离的肽中,收集肽13,14,24和25, 因为它们是最明显的,并在法国巴黎Pasteur研究所通过使用应用生 物系统473A自动气相氨基酸测序仪,根据标准方法经Edman’s降 解进行分析,所用测序仪得自美国PE应用生物系统,Foster City, CA。
分析结果确定磺基水解酶I包括SEQ ID NOS:6-11。
基于以上所示氨基酸序列,对相应的cDNA进行序列探查,以确 定磺基水解酶I和II的核苷酸序列。
如以下更详细的阐述,mRNA 分离自皱波角叉菜,从该mRNA中合成cDNA文库,用基于上述磺 基水解酶I和II的氨基酸序列的寡核苷酸获得的PCR片段探查此 cDNA文库,并对阳性的cDNAs进行测序。
从皱波角叉菜的配子体中制备总RNA,如APT等,“编码褐色 海藻巨藻属pyrifera的岩藻黄质叶绿素蛋白的基因家族”,Mol.Gen. Genet.,246,pp455-464(1995)所述,以其全文并入参考。
然后, 用PolyA T tract mRNA分离系统IV试剂盒纯化mRNA,所用试剂 盒得自美国Promega,Madison,WI,根据说明书使用。
一旦分离mRNA,构建皱波角叉菜的cDNA文库。
用λZAPII 载体cDNA合成试剂盒合成cDNA,所用试剂盒得自美国Stratagene, La Jolla,CA,根据说明书使用。
双链cDNA通过琼脂糖凝胶CL-2B 层析柱分级分离,所用层析柱得自瑞典Amersham Pharmacia Biotech AB,Uppsala。
选择经在丙烯酰胺凝胶(5%)上估计平均大小为600 -1500bp的级分,以制备文库。
根据生产商说明将cDNA连接于λ ZAPII载体中,以及转化宿主菌株XL1-Blue MRF’(美国 Stratagene,La Jolla,CA)。
探针设计及筛选cDNA文库的方法如下。
分别从SEQ ID NO:2 和10中设计磺基水解酶I和II的简并的寡核苷酸,对磺基水解酶I 而言,其相当于SEQ ID NO:12,对磺基水解酶II而言,相当于SEQ ID NO:13-14。
简并的寡核苷酸SEQ ID NO:12与载体引物SEQ ID NO:16(5’AATACGACTCACTATAG3’)一起使用,通过PCR 扩增皱波角叉菜cDNA文库中相当于磺基水解酶I的DNA片段。
简并的寡核苷酸SEQ ID NO:13和14与载体引物SEQ ID NO: 15(5’ATTAACCCTCACTAAAG3’)一起使用,通过PCR扩增皱 波角叉菜cDNA文库中相当于磺基水解酶II的DNA片段。
使用寡 核苷酸SEQ ID NO:14和15的第一个PCR提供DNA片段。
使用 此第一个PCR产物和寡核苷酸SEQ ID NO:15和13,扩增相当于 磺基水解酶II的DNA片段。
将相当于磺基水解酶I基因和磺基水解酶II基因的克隆的DNA 片段,用Megaprime试剂盒及1850kBq的32P dCTP,通过随机引发 进行标记,Megaprime试剂盒和32P dCTP得自瑞典Amersham Pharmacia Biotech AB,Uppsala。
所得探针用Sephacryl SR 200纯化 并用于筛选皱波角叉菜配子体cDNA文库,Sephacryl SR 200得自瑞 典Amersham Pharmacia Biotech AB,Uppsala。
为筛选磺基水解酶I和II,将噬斑移至尼龙膜上,所用尼龙膜得 自瑞典Amersham Pharmacia Biotech AB,Uppsala,如SAMBROOK 等,分子克隆实验手册,第二版,CSH实验室出版社,冷泉港, NY(1989),所述内容以其全文并入参考。
将此膜在65℃,在6×SSC, 5×Dehar’t,0.1%SDS和100μg/ml的鲑精DNA中杂交过夜。
SSC 是3M NaCl和0.3M柠檬酸钠的水溶液,如SAMBROOK等,分子 克隆实验手册,第二版,CSH实验室出版社,冷泉港,NY(1989), 所述内容以其全文并入参考。
在杂交之后,将滤膜用以下溶液清洗 15分钟,2×SSC,0.1%SDS;1×SSC,0.1%SDS和0.4×SSC,0.1 %SDS,并曝光于光刺激屏,用Storm扫描,光刺激屏得自瑞典 Molecular Dynamics,Uppsala,Storm也得自Molecular Dynamics。
就磺基水解酶I而言,使用上述筛选条件,将磺基水解酶I的上 述标记的探针用于3次筛选循环中,以从含有磺基水解酶I cDNA 的cDNA文库中筛选300000个噬菌体。
共有408个阳性噬菌体(1.4 %),从中选择30个。
在第二循环中,对10个这些噬菌体进行筛选, 其中7个是阳性的。
这7个阳性噬菌体在第三循环中发现有6个是 阳性的。
就磺基水解酶II而言,使用上述筛选条件,将磺基水解酶II的 上述标记的探针用于3次筛选循环中,以从含有磺基水解酶II cDNA 的cDNA文库中筛选600000个噬菌体。
发现有12个阳性噬菌体 (1/50000),从中选择10个。
在第二循环中,对这些阳性噬菌体进 行筛选,其中9个是阳性的。
这9个阳性噬菌体在第三循环中发现 9个均是阳性的。
将这9个阳性cDNA的5’和3’末端进行测序, 结果表明这9个阳性cDNA中只有4个相当于磺基水解酶II cDNA。
因此,磺基水解酶II基因似乎在角叉菜配子体中弱表达(1/150000 cDNAs)。
就磺基水解酶I和II而言,根据产品说明书进行体内切除 (packaging试剂盒,得自美国Stratagene,La Jolla,CA),对每个cDNA 的5’和3’末端进行测序,以能够鉴别它们。
特别地,使用具有7 -脱氮-dGTP的Thermo-Sequenase核心测序试剂盒测序。
测序反 应在Vistra DNA自动测序仪725中进行,所用测序仪得自瑞典 Molecular Dynamics,Uppsala。
使用上述方法,确定磺基水解酶I cDNA的序列为SEQ ID NO: 17。
特别地,对一个cDNA充分测序并确定其它cDNA的序列末端。
测序结果表明它们是相同的cDNA,5个是全长cDNA,一个是部分 长度的cDNA。
磺基水解酶I的序列包括ATG起始密码子,信号肽(可能用于 从ER分泌至细胞壁),很可能氨基酸在丙氨酸20与赖氨酸21之间 断裂,终止密码子和3’UTR(未翻译区)。
由上述方法推测磺基水解酶II cDNA的核苷酸序列是SEQ ID NO:18,19,20和21。
很明显这4个cDNA是不同的。
其中3个 cDNA是全长的(SEQ ID NO:19,20和21),1个可以是部分长度 的cDNA(SEQ ID NO:18)。
从磺基水解酶I和II的核苷酸序列中,可推导相应的氨基酸序列。
特别地,发现磺基水解酶I的氨基酸序列是SEQ ID NO:22。
磺基 水解酶II的氨基酸序列是SEQ ID NO:23。
关于磺基水解酶I的氨基酸序列,在此序列中发现通过Edman’s 降解确定的所有蛋白质微序列。
磺基水解酶I的氨基酸序列有长度 为20个氨基酸的信号肽。
切割位点位于Ala20和Lys21之间。
因此, 成熟的酶包含594个氨基酸,及含有一个潜在的N-糖基化位点 (NFTI;AA 72-75),并与FAD结合结构域有一些相似性。
磺基水解酶I的C末端有300个氨基酸以上与衣滴虫reinhardtii 的L-氨基酸氧化酶呈22%序列相同性,衣滴虫reinhardtii的L-氨 基酸氧化酶由VALLON等,“M(α)的cDNA序列,衣滴虫reinhardtii 的L-氨基酸氧化酶的催化亚基(登记号No.U78797):由黄色蛋白 的各种变种呈现的一种新序列基序”,植物生理学,115,pp1729-1731 (1997)阐述,所述内容以其全文并入参考。
在这点上,在许多有 机体中发现L-氨基酸氧化酶。
它们催化以下反应:
在衣滴虫reinhardtii中, 已示出此65kDa酶位于外周质,是配子特异性的,并由除去铵诱导 的。
磺基水解酶II长度为279个氨基酸,并含有一个糖基化位点。
对 磺基水解酶II的序列分析表明,用BLAST软件未发现与NCBI数 据库(http://www.ncbi.nlm.nih.gov/BLAST/)中已知序列有明显相 似性。
确定磺基水解酶I和II的氨基酸序列还可精确确定这些酶的分子 量。
在这点上,通过SDS PAGE估计,磺基水解酶I和II的分子量 分别为62.1和34.9kDa。
在磺基水解酶I的情况中,此MW略低于 从氨基酸序列推导的分子量,后者为66.8kDa。
相反,磺基水解酶II 的分子量从氨基酸序列计算时,为30.9kDa,略低于由SDS PAGE 估计的分子量。
从这两个序列中,用Mac Molly翻译程序计算理论等电点(pI)。
磺基水解酶I和II的pI分别为8.4和9.3。
从磺基水解酶I和II的氨基酸和核苷酸序列中,基于与本文所述 磺基水解酶的序列同源性,用已知方法可检测这些磺基水解酶的类 似物或同源物,并分离。
因此,所有或部分已知酶编码序列可用于 构建探针,该探针将选择性地与特定来源的基因组或cDNA文库中 存在的相同或高度相似的酶编码序列杂交。
特别地,与本发明特异 鉴别的序列有至少25%,优选至少50%,更优选至少80%同源性 的核苷酸序列属于本发明。
相似地,与本发明特异鉴别的序列有至 少25%,优选至少50%,更优选至少80%同源性氨基酸序列属于 本发明。
杂交方法包括杂交筛选铺板的cDNA文库,和用相当于保守的序 列结构域的寡核苷酸引物经聚合酶链反应(PCR)扩增。
见INNIS 等,PCR方法及应用指导,科学出版社(1990),所述内容以其全文 并入参考。
另外,关于上述方法的参考文献包括AUSUBEL等,分子生物学 通用方法,格林出版公司协会和John Wiley Interscience,(1992); 和BERGER等,分子克隆方法指导,科学出版社(1987),所述内 容以其全文并入参考。
例如通过从相应来源中提取DNA和RNA,并用已知磺基水解酶 之一的完全或部分序列进行Southern杂交,基因组和cDNA文库筛 选可发现同源性磺基水解酶。
例如,根据APT所述方法提取总DNA,“编码褐色海藻巨藻属 pyrifera中岩藻黄质叶绿素蛋白的基因家族”,Mol.Gen.Genet.,246, pp455-464(1995),所述内容以其全文并入参考。
在这点上应指出 的是通常非必需用APT所述方式除去多糖。
Southern杂交例如可通过在37℃,将7μg的皱波角叉菜,耳突 麒麟菜,刺麒麟菜和Gracilaria gracilis的总DNA用60 U的HindIII 和80U的EcoRI消化4小时而进行,HindIII得自瑞典Amersham Pharmacia Biotech AB,Uppsala;EcoRI得自美国Biolabs,Beverly, MA。
在沉淀后,可将消化的DNA再溶解于40μl的100mM Tris(pH7.5) +10mM EDTA中。
然后将此片段在0.8%琼脂糖凝胶上分级分离(在 35V迁移过夜),之后用“Trans DNA表达真空印迹仪”在真空下移 至Hybond-N+膜上,Hybond-N+膜得自瑞典Amersham Pharmacia Biotech AB,Uppsala;Trans DNA表达真空印迹仪得自美国 Appligene,Gaithersburg,MD,在生产者所给定的条件下使用。
预杂交和杂交就皱波角叉菜而言在60℃,就其它海藻而言在42 ℃进行,条件如SAMBROOK等,分子克隆实验手册,第二版,CSH 实验室出版社,冷泉港,NY(1989),所述内容以其全文并入参考。
在杂交后,将此膜如下清洗: 对除皱波角叉菜之外所有海藻而言, 2×SSC+0.1%SDS,2×20分钟;和 1×SSC+0.1%SDS,2×15分钟。
对皱波角叉菜而言,如上清洗并另用0.5×SSC+0.1%SDS清洗 15分钟。
Southern杂交是用编码磺基水解酶I的部分长度cDNA进行的。
在用HindIII和XhoI消化cDNA后,产生二个片段:一个为400bp, 另一个为1600bp,HindIII和XhoI均得自瑞典Amersham Pharmacia Biotech AB,Uppsala。
然后收集后一个片段,并用ECF随机引发标 记和检测系统标记,ECF随机引发标记和检测系统得自瑞典 Amersham Pharmacia Biotech AB,Uppsala。
标记,杂交和检测根据 生产者推荐方法进行。
Southern杂交还可用编码磺基水解酶II的全长cDNA进行。
此 Southern杂交揭示皱波角叉菜中一条大约2.5kB的主要条带以及3 个其它条带(4-1.2kB)。
然而,即使在曝光60小时后,在刺麒麟 菜和耳突麒麟菜中仍能检测到3条微弱可见的条带,但在 Gracilariagracilis中不能检测到。
用编码磺基水解酶I的全长cDNA 作探针可获得相似结果。
结果概况如下: 海藻
磺基水解酶I cDNA
磺基水解酶II cDNA
皱波角叉菜

1条主要条带+2-3条
微弱条带
1条主要条带+3条微
弱条带
Gigartina
skottsbergii
1个条带+3-4条微弱
条带
未测定

Gracilaria gracilis
NA
无条带
麒麟菜
1个条带+微弱条带
3个微弱条带
麒麟菜
微弱条带
3个微弱条带
所有这些结果表明,在刺麒麟菜,耳突麒麟菜,和Gigartina skottsbergii中存在同源性磺基水解酶I,在刺麒麟菜,耳突麒麟菜中 存在同源性磺基水解酶II,但与各自角叉菜的酶的同源性较低。
几乎纯化的磺基水解酶II与iota-前体温育形成凝胶,而煮沸的 酶不形成凝胶,所述几乎纯化的酶是基于样品中总蛋白量已纯化为 80-90%(w/w)均一性。
将此酶还与4种不同浓度的iota-前体温 育。
酶量低产生柔软的凝胶,而较多数量的酶产生较硬的凝胶。
在用磺基水解酶I温育nu-角叉菜聚糖之后,检测到硫酸根释 放,但角叉菜聚糖样品的粘度未增加。
相反,用磺基水解酶II温育 导致硫酸根释放及粘度增加。
NMR分析示出所有分离的酶级分将nu -角叉菜聚糖转变为iota-角叉菜聚糖。
由于所观测的修饰作用,美国临时申请No.60/133376中的磺基 水解酶和脱水酶的先前理论已经废弃。
先前理论阐述这两种酶有两 种不同功能:(1)一种酶除去nu前体上的C-6硫酸酯,和(2)一 种酶形成3,6-脱水半乳糖桥,从而将结构转变为iota-角叉菜聚 糖。
应指出的是,尽管美国临时申请No.60/133376未能准确阐述此 酶的作用模式,但此临时申请揭示了怎样纯化和使用这些酶。
尽管不希望受理论的限制,但现据信磺基水解酶I是随机除去硫 酸酯基团的。
相反,磺基水解酶II可通过沿分子滑动从而产生iota 段而渐进性地起作用,其可与其它相似分子凝聚产生凝胶。
当先用随机酶温育iota-前体,随后灭活及之后用渐进酶温育时, 与只用渐进酶所得结果相比粘度较高。
似乎是随机酶制备聚合物, 以此方式易于渐进酶沿分子滑动。
通过以上所述,本发明高纯度的磺基水解酶可修饰硫酸化的化合 物的性质。
使用酶的一优点是其能在相对低的温度下工作,如0-60℃,优 选20-55℃,更优选37-48℃。
因此,酶不需高热以生产角叉菜聚 糖凝胶。
优选在pH为5.5-9.5,更优选为6-9.5,最优选为7-9进行温 育。
在这点上,用皱波角叉菜磺基水解酶温育优选在pH为6.5-7.5 进行。
用cottonii磺基水解酶温育优选在pH为8-9.5进行。
含有磺基水解酶的样品的总蛋白浓度优选至少为2-85μg/ml, 更优选为10-80μg/ml,最优选为25-70μg/ml。
在几乎纯化的磺 基水解酶II的情况下,此浓度优选为1-10μg/ml,更优选为2.5- 10μg/ml,最优选为2.5-5μg/ml。
反应混合物中底物如角叉菜聚糖的浓度优选为0.012-2% (w/v),更优选为0.12-2%(w/v),最优选为0.7-1.75%(w/v)。
就用cottonii提取物温育而言,其中进行脱硫反应的最佳条件如 下: —底物:终浓度为大约1.5%(w/v)的mu-角叉菜聚糖 —作为温度函数的活性/稳定性:在48℃温育9小时与在37℃温 育16小时或在20℃温育48小时释放同样多的游离硫酸根。
—作为pH函数的活性/稳定性:Tris-HCl 100mM(pH9.0)+2- 巯基乙醇10mM或Bis-tris 100mM(pH8.5)+10mM 2-巯基乙醇 似乎是cottonii的磺基水解酶的最适当的缓冲液。
—蛋白质量:5μg的总蛋白是在Dionex上获得明显信号所需的 最小量。
本发明纯化的磺基水解酶在修饰硫酸化的化合物如角叉菜聚糖中 是有效的,例如,根据本发明的1mg酶提取物(在此情况中0-30 %丙酮级分)每小时能释放400nmol的硫酸根。
磺基水解酶I和II可分别使用,或组合使用,以修饰底物,尤其 特异修饰角叉菜聚糖中硫酸酯基团和/或脱水桥的数目和分布。
本发 明高纯度的磺基水解酶尤其用于修饰性质。
此发现的最直接应用可能是取代现有的化学修饰方法的酶促修饰 方法,其中用酶促修饰可使功能性相当(或更好),如食物的凝胶性, 粘度,质地更好。
例如,含有前体且因此不发生胶凝的角叉菜聚糖可经酶促诱导而 凝胶化。
另外例如,nu-角叉菜聚糖可转变为iota-角叉菜聚糖,以形成 在一定条件下不发生胶凝的产物,所述条件是在65℃,在pH7,产 物的浓度是在含有0.1M钾的水溶液中为大约0.7%(w/v)。
另外,这些酶例如非限制性地具有以下应用:选择性控制3,6 -脱水半乳糖残基的诱导;修饰角叉菜聚糖的与硫酸酯基团和3,6 -脱水半乳糖残基的数目和分布相关的性质;诱导iota-前体在水 溶液系统中的修饰和凝胶化(包括冷却下可溶的角叉菜聚糖溶液和 粘膏的冻结,代表性用途包括食品,制药,纺织业,和人体卫生制 品,还包括特别的用途如奶制品,尤其奶粉配方,牙膏和其它膏状 或浆状制品);控制生产iota-角叉菜聚糖以替代明胶(因为期望此 酶提供与当前的碱化方法相比不完全的修饰,这将更好的控制依赖 于这种不完全修饰的类明胶性质);只修饰kappa-iota-前体混合物 中iota-前体,例如冷水海藻的中性提取物,由此可提供较低的凝 胶强度,但提高水结合性以及带来其它新特性;与具有6硫酸酯基 团的其它半乳聚糖结构,包括类琼胶一起使用,以及与角叉菜聚糖 和琼脂中同源核酸和蛋白质一起使用。
含有前体的角叉菜聚糖可通过注射使用或包被于未烹调的肉类如 鸡肉,鲑鱼。
如果这种酶包含于混合物中,它们将产生角叉菜聚糖 凝胶,因此当烹调肉类时,可防止汁液从肉类中漏出。
其它可能用途包括如下: —通过使用温和条件提取角叉菜聚糖,随后使用酶修饰角叉菜聚 糖制备具有高粘度和高凝胶强度的高分子量的角叉菜聚糖; —在或接近周围环境温度凝胶化(冷凝),减少或消除需要加热 和/或冷却的步骤,如生产酸奶需要产生凝胶。
本发明通过以下实施例将得以进一步例证。
这些实施例非限制本 发明的范围。
除非特别指出,实施例中所有百分率,份数等均是以重量为单位。
实施例1-4 这些实施例涉及皱波角叉菜磺基水解酶提取物对不同类型角叉菜 聚糖的特异性研究。
为研究皱波角叉菜磺基水解酶的特异性,将nu-,mu-,iota-, 和kappa-角叉菜聚糖用作底物。
Iota-和kappa-角叉菜聚糖通过 碱提取形成完全3,6-脱水半乳糖而分离自其海藻原料。
含有mu -,nu-或lambda-角叉菜聚糖的富含前体的角叉菜聚糖,是通过 用水中性提取而分离的。
lambda-角叉菜聚糖分离自经人工拣选的 四分孢子体。
所有角叉菜聚糖通过在异丙醇中沉淀而回收。
下表1 中所列的这些角叉菜聚糖是由丹麦Lille Skensved,Hercules公司提 供的。
表1 角叉菜聚
    糖
    海藻原料植物学名称

  海藻商品名

  硫酸酯含量(%
    (w/w))
    Nu
    Eucheuma denticulatum
    Spinosum
    33
    Mu
    Kappaphycus alvarezii
    Cottonii
    23
    Iota
    Eucheuma denticulatum
    Spinosum
    33
    Kappa
    Kappaphycus alvarezii
    Cottonii
    20
在使用之前,将角叉菜聚糖用10升含有10mM 2-巯基乙醇的 50mM Tris-HC(pH7.1)缓冲液,经得自美国Spectrum Laboratories, Inc.,Rancho Dominguez,CA的MWCO 6-8000或3500 Spectra/por 膜透析过夜。
在透析后,角叉菜聚糖的终浓度为大约1.25%(w/v)。
将皱波角叉菜的配子体植物在液氮中冷冻,并用Forplex研磨仪 自动研磨为长度小于1mm的碎片,Forplex研磨仪得自法国Forplex Industrie,Boulogne Billancourt。
将此“粉末”立即使用或在-20℃ 或-80℃保存直至进一步使用。
以如下方式制备皱波角叉菜提取物。
将15g研磨的皱波角叉菜 用含有10mM 2-巯基乙醇和500mM KCl的4体积(即60ml)的50mM Tris-HCl缓冲液(pH9.5)提取。
然后将上清用冷冻的(-20℃)丙 酮分级分离:进行两步分离:从0-30%饱和度和从30-60%饱和 度的丙酮中分离。
在这点上,当冷丙酮的饱和度从A%-B%时,加 入zml样品中的丙酮体积如下确定:z(B-A)/(100-B)。
在每个分级分离步骤之后,在4℃以10000×g离心30分钟。
将 粒状沉淀溶解于2ml的含有10mM 2-巯基乙醇的50mM Tris-HCl(pH7.1)中。
然后将粒状沉淀以及每个上清等分在4℃,用3×3 升含有10mM 2-巯基乙醇的50mM Tris-HC(pH7.1)缓冲液,经得 自美国Spectrum Laboratories,Inc.,Rancho Dominguez,CA的MWCO 6-8000或3500 Spectra/por膜透析过夜。
从这些提取物中制备用于筛选活性的反应混合物,其组分如下表 2所示。
表2 组成成分
对照组
样品
表3所列的角叉菜聚糖(在50mM
Tris-HCl(pH7.1)+10mM 2-巯基
乙醇中浓度为1.25%(w/v))
500μl


500μl


50mM Tris-HCl(pH7.1)+10mM 2
-巯基乙醇
500μl

250μl

角叉菜提取物
0μl
250μl
如下表3所示,将上述各种角叉菜聚糖在室温在pH7.1与经上述 方式获得的角叉菜提取物温育40小时。
每个样品的游离硫酸根数量 用本申请所述游离硫酸根分析方法测定。
相似地,通过相同方法对 每个相应对照组的游离硫酸根数量进行测定,对照组包括相同角叉 菜聚糖但不包括角叉菜提取物,如表2所示。
每个样品与其对照组 之间游离硫酸根的差异是释放的游离硫酸根的相对水平,如下表3 所示。
表3  实施例

        提取物

          释放的硫酸根的相对水平
                   (ppm)
  Nu
  Mu
  Iota
  Kappa
    1
上清(0-30%丙酮)
  101.0
  15.3
  6.4
  6.7
    2
粒状沉淀(0-30%丙酮)
  48.1
  7.1
  2.4
  3.2
    3
上清(30-60%丙酮)
  72.8
  16.5
  4.3
  6.2
    4
粒状沉淀(30-60%丙酮)
  40.6
  8.7
  2.6
  2.0
如表3所示,角叉菜提取物对nu-角叉菜聚糖是活性的。
第一 个上清(0-30%丙酮饱和度)和第二个上清(30-60%丙酮饱和度) 对mu-角叉菜聚糖也有一些活性,但对该底物的活性与对nu-角 叉菜聚糖的活性相比相对较低。
实施例5-38 如以下实施例所示,为确定皱波角叉菜磺基水解酶的最佳条件, 对分级分离的皱波角叉菜提取物进行部分定性,包括不同pH,温度, 酶和底物浓度下的活性。
从这些实施例中,显示nu-角叉菜聚糖的 脱硫化应在48℃,用终浓度为0.7%(w/v)的底物最少进行6-15 小时。
这些实施例还示出角叉菜提取物特征在于最佳pH为7,用 Tris-HCl(50mM,pH7.1+10mM 2-巯基乙醇)作缓冲液。
除非特别指出,将表1所列的nu-角叉菜聚糖溶解于含有10mM 2 -巯基乙醇的Tris-HCl(50mM,pH7.1)缓冲液中,并用得自美国 Spectrum Laboratories,Inc.,Rancho Dominguez,CA的MWCO 6-8000 或3500 Spectra/por膜,用6×2升相同缓冲液透析24小时。
用于反 应混合物中的底物终浓度为0.6%(w/v)。
为获得磺基水解酶提取物,将如实施例1-4所述方式研磨为粉 末的皱波角叉菜,在-20℃用0-30%或30-60%饱和度的冷丙酮 分级分离。
将级分用4×2.5升的50mM Tris-HCl(pH7.1)+10mM 2-巯基 乙醇缓冲液透析16小时。
从0-30%丙酮饱和度所得皱波角叉菜提 取物的蛋白质浓度为大约170μg/ml,这是用牛血清白蛋白作标准, 经德国Bio-Rad Laboratories GmbH,Munich的Bio-Rad蛋白质分析 测定的。
实施例5-13 这些实施例涉及在不同pH皱波角叉菜提取物对nu-角叉菜聚糖 的活性。
在这些实施例中,将300mg的nu-角叉菜聚糖用6×2升MilliQ 水,用MwCO 6-8000或3500Spectra/por膜,透析24小时,MilliQ 水得自美国Millipore Corporation,Bedford,MA,MWCO 6-8000或 3500 Spectra/por膜得自美国Spectrum Laboratories,Inc.,Rancho Dominguez,CA。
在透析后角叉菜聚糖的终浓度为1.1%(w/v)。
样品和对照组反应混合物如下表4所示制备。
表4 组成成分
 对照组
 样品
Nu-角叉菜聚糖(在水中浓度为1.1%(w/v))
 500μl
 500μl
缓冲液(100mM Tris,Pipes或Mes,如下所述)
 250μl
 250μl
50mM Tris-HCl pH7.1
 250μl
 0μl
角叉菜提取物(在50mM Tris-HCl pH7.1中)
(0-30%丙酮饱和度)
 0μl

 250μl

根据所需的pH,如下表5所示,反应混合物中所用缓冲液如下: -pH5.5-6.5:100mM MES(2-(N-吗啉代)乙磺酸)+10mM 2-巯基乙醇 -pH6.5和7.0:100mM Pipes(哌嗪-N,N’(2-乙磺酸)) +10mM 2-巯基乙醇 -pH7.0-9.0:100mM Tris-HCl+10mM 2-巯基乙醇 缓冲液的pH在Tris-HCl的情况下通过加入HCl或在MES和Pipes 的情况下加入NaOH而改变。
将反应混合物在29℃温育26小时。
在温育后,释放的硫酸根数 量根据本申请所述游离硫酸根分析方法测定。
通过对样品及其相应 对照组中游离硫酸根的数量进行对比,计算下表5所示游离硫酸根 的相对数量。
表5  实施例
    PH
   释放的硫酸根的相对水平(ppm)
 %相对水平
    MES
  Pipes
 Tris-HCl
    5
    5.5
    2.7
    6.6
    6
    6
    20.0
    48.7
    7
    6.5
    31.2
    75.9
    8
    6.5
    29.8
    72.5
    9
    7
    32.6
    79.3
    10
    7
    41.1
    100
    11
    8
    32.1
    78.1
    12
    8.5
    23.0
    56.0
    13
    9
    23.5
    57.2
表5示出皱波角叉菜提取物的最佳pH为大约7。
实施例14-21 这些实施例涉及确定作为提取物的蛋白质包括磺基水解酶的数量 的函数的皱波角叉菜提取物对nu-角叉菜聚糖的活性。
样品和对照组反应混合物以下表6所示比例制备。
表6 实施例



  Nu-角叉菜聚糖(在50mM
  Tris-HCl(pH7.1)+10mM 2-
  巯基乙醇中浓度为1.25%
    (w/v))
    角叉菜提取物
 (170μg/ml蛋白质)
 (0-30%丙酮饱和度)

50mM Tris-HCl
(pH7.1)+10mM
2-巯基乙醇

对照组
    500μl
    0μl
    500μl
    14
    500μl
    50μl
    450μl
    15
    500μl
    100μl
    400μl
    16
    500μl
    150μl
    350μl
    17
    500μl
    200μl
    300μl
    18
    500μl
    250μl
    250μl
    19
    500μl
    300μl
    200μl
    20
    500μl
    400μl
    100μl
    21
    500μl
    500μl
    0μl
将含有不同浓度磺基水解酶提取物的对照组和样品混合物,在30 ℃在pH7.1温育30小时。
在温育之后,释放的硫酸根数量根据本申 请所述游离硫酸根分析方法测定。
通过对样品及其相应对照组中游 离硫酸根的数量进行对比,计算下表7所示游离硫酸根的相对量。
表7 实施例

 蛋白质量
   (μg)
 在30小时内释放的硫
 酸根的相对水平(ppm)
    14
    8.5
    14.1
    15
    17
    24.5
    16
    25.5
    34.2
    17
    34
    40.2
    18
    42.5
    54.6
    19
    51
    53.1
    20
    68
    74.7
    21
    85
    65.2
正如所期望的,酶量增加提高了释放的硫酸根量。
实施例22-32 这些实施例涉及确定对于不同nu-角叉菜聚糖浓度,皱波角叉 菜提取物的活性。
如上表1所述相同方式制备对照组和样品反应混合物,除了反应 混合物的体积降至500μl,即所有成分的体积减少50%,并使用30 -60%丙酮饱和度的角叉菜提取物。
为确定在脱硫反应期间使用的nu-角叉菜聚糖的最佳浓度,对0 -2.5%(w/v)(终浓度)范围内的12种不同浓度的nu-角叉菜聚 糖进行测试,如下表8所示。
在37℃温育15小时后,释放的硫酸根数量根据本申请所述游离 硫酸根分析方法测定。
通过对样品及其相应对照组中游离硫酸根的 数量进行对比,计算下表8所示游离硫酸根的相对量。
表8 实施例


反应混合物中nu-角叉
菜聚糖的终浓度(%
    (w/v))
释放的硫酸根的相
对水平(ppm)

 %相对活性


    22
    0.37
    40.0
    81.3
    23
    0.54
    47.3
    96.0
    24
    0.7
    49.2
    100
    25
    0.85
    43.8
    88.9
    26
    1.03
    44.6
    90.5
    27
    1.12
    43.0
    87.3
    28
    1.27
    19.0
    38.6
    29
    1.45
    9.0
    18.3
    30
    1.76
    39.8
    80.8
    31
    2.07
    29.1
    59.1
    32
    2.49
    33.1
    67.2
表8示出0.7%(w/v)的nu-角叉菜聚糖(反应混合物中的终 浓度)是用于通过nu磺基水解酶进行脱硫反应的最佳底物浓度。
实施例33-38 这些实施例涉及确定在不同温度皱波角叉菜提取物对nu角叉菜 聚糖的活性。
如以上实施例1-4所述相同方式制备对照组和样品反 应混合物,只是使用30-60%丙酮饱和度的角叉菜提取物。
将反应混合物在0,13,20,30,37和48℃,在pH7.1进行温 育。
为测定在不同时间释放的硫酸根量,在上述温度温育0,2,8, 26,46和72小时后,取反应混合物的少量等分(大约0.2ml)。
表9 实施例
 温度(℃)
释放的硫酸根的相对水平(ppm)
  0小时
  2小时
   8小时
  26小时
  46小时
  72小时
    33
    0
  0.2
  1.8
   2.0
  0
  7.2
  11.6
    34
    13
  0
  2.7
   9.0
  15.2
  29.2
  27.0
    35
    20
  0.2
  4.9
   13.6
  26.1
  44.7
  47.5
    36
    30
  0.25
  7.1
   13.2
  39.7
  61.8
  51.6
    37
    37
  0.3
  9.0
   22.9
  44.6
  77.8
  58.6
    38
    48
  0.3
  14.6
   34.8
  -
  -
  -
表9示出从nu-角叉菜聚糖释放的硫酸根量随着温度提高而增 加。
尤其地,48℃似乎是粗提物的最佳温度。
事实上,在48℃温育 8小时与在室温温育40小时释放的硫酸根量相同。
实施例39-46 这些实施例涉及研究基于总蛋白含量纯化的皱波角叉菜磺基水解 酶II对不同类型角叉菜聚糖的特异性。
基于总蛋白含量纯化的皱波角叉菜磺基水解酶II是通过本申请书 术方法分离的。
尤其地,用650-850mM浓度的NaCl从DEAE层 析柱洗脱纯化的皱波角叉菜的级分。
对纯化的磺基水解酶II对不同 类型角叉菜聚糖的特异性进行测试。
尤其地,下表10所示对照组和 样品反应混合物是通过用表11所示的角叉菜聚糖产生的。
因此,在 富含nu的iota-角叉菜聚糖(如表11中“E”制备法所示)上测试 纯化的磺基水解酶II。
另外在用iotase温育的nu富集的iota-和iota -角叉菜聚糖的酶抗性级分上测试纯化的磺基水解酶II,如以下所 述(如表11中“ER”制备法所示)。
另外还在中性提取的iota-和 kappa-角叉菜聚糖上测试纯化的磺基水解酶II,如以下所述制备(如 表11中“N”制备法所示)。
另外在nu富集的iota-和mu-富集的 kappa-角叉菜聚糖上测试纯化的磺基水解酶II,如以下所述制备 (如表11中“C”制备法所示)。
表11中制备nu富集的iota-角叉菜聚糖的“E”制备法如下。
将15kgEucheuma denticulatum用80%(w/v)异丙醇清洗3次,在 60℃在干燥室内干燥直至恒重,并研磨为直径为0.5mm的颗粒。
将 研磨的海藻在50℃在1000升的0.125M KCl/K2CO3(9.15kg KCl和 0.17kg)中提取4小时。
在提取期间,测定pH值,以保证在8-9 之间。
如果pH低于8,加入适量的K2CO3
将提取液在kiselgur-滤膜上过滤,并将提取液用自来水UF(超 滤)清洗,直至电导率为2mS/cm(<2000μS/cm)或更低,及稳 定。
然后,将提取液浓缩为总体积为大约65-70升。
将pH用0.1M NaOH调节为大约8.5。
在这点上,用吸液管加入1-10dl的0.1M NaOH,同时搅拌,并密切监视pH值。
在100%(w/v)异丙醇中进 行沉淀实验,如果形成沉淀,全部都沉淀。
如果沉淀较少,将提取 液在以下真空和pH及温度下通过蒸发浓缩。
提取液的pH必须不超 过9.2。
在一些情况中,必须使角叉菜聚糖沉淀过夜。
将沉淀的角叉 菜聚糖用100%(w/v)异丙醇清洗两次。
所有步骤均在室温下进行。
将角叉菜聚糖冻干。
NMR结果表明前体水平富集为总重量的32% 左右。
如上表1所示制备iota-角叉菜聚糖的同样方式制备iota-角叉 菜聚糖。
制备nu富集的iota-角叉菜聚糖和iota-角叉菜聚糖的酶抗性级 分(表11的ER方法)如下进行。
起始物是通过上述E方法获得的 nu富集的iota-角叉菜聚糖,或表1所列的iota-角叉菜聚糖。
在这些起始物中,将1g产生酶抗性的角叉菜聚糖溶解于50mM Tris-HCl(pH7.0)+100mM NaCl和5mM CaCl2中。
将所得消化混 合物在37℃,间隔2小时通过每mg角叉菜聚糖加入0.2U的iota- 角叉菜聚糖酶温育4小时,iota-角叉菜聚糖酶已根据POTIN等,“从 海产类噬细胞菌属细菌中纯化和定性新的κ-角叉菜聚糖酶”,欧洲 生物化学杂志,201,pp241-247(1991)所述纯化,所述内容以其 期望并入参考。
1单位(U)的酶活性是指在还原糖分析中,每分钟 在237nm吸光度增加0.1单位的酶数量,如KIDBY等,“在nm范 围内还原糖的常规铁氰化物评估”,分析生物化学,55,pp321-325 (1973)所述,所述内容以其全文并入参考。
第一种酶抗性级分 (ERF1)是在用2体积的50%(v/v)乙醇沉淀后获得的。
在4℃以 10000×g离心20分钟后,收集粒状沉淀并认为是ERF1。
然后将2 体积的95%(v/v)乙醇加入上清中。
在如前相同条件下离心后,收 集粒状沉淀并称为ERF2。
将ERF1和ERF2分别再溶解于水中,并 用NWCO 6-8000或3500 Spectra/por膜,经5×2升的20mM(NH4) HCO3透析,NWCO 6-8000或3500 Spectra/por膜得自美国Spectrum Laboratories公司,Rancho Dominguez,CA。
然后将ERF1和ERF2 冻干。
中性提取方法(即表11中N方法)如下。
将表11所列的200g 海藻,在10升自来水中在110℃提取35分钟,随后过滤,浓缩及 在异丙醇中沉淀,如THERKELSEN,“角叉菜聚糖”,工业树脂: 多糖及其衍生物,第三版,pp145-180,(1993),所述内容以其全 文并入参考。
C制备方法如上述E制备方法,除了起始物是Cottonii(= Kappaphycus alvarezii)。
谈及表11,将反应混合物在pH7.1在48℃温育14小时。
释放的 硫酸根数量根据本申请书所述游离硫酸根分析方法测定。
通过对比 样品及其相应对照组中游离硫酸根的数量,计算下表11所示游离硫 酸根的相对数量。
表10 组成成分
 对照组
 样品
表5所列角叉菜聚糖(在MilliQ
水中浓度为1.4%(w/v))
 200μl

 200μl

沸腾10分钟的纯化磺基水解酶II
 200μl
 0μl
纯化的磺基水解酶II
 0μl
 200μl
表11 实施例

 角叉菜聚糖

 制备方法

 角叉菜聚糖原料

 释放的硫酸根的
 相对水平(ppm)
39
 Nu富集的iota
 E
 E.spinosum
 87.7
40
 ERF1
 ER
 E.spinosum
 4.9
41
 ERF2
 ER
 E.spinosum
 77.3
42
 中性提取的iota
 N
 E.spinosum
 43.8
43
 Nu富集的iota
 C
 G.skottsbergii
 9.0
44
 中性提取的iota
 N
 G.skottsbergii
 7.4
45
 Mu富集的kappa
 C
 K.alvarezii
 1.4
46
 中性提取的kappa
 N
 K.alvarezii
 1.6
如筛选研究所期望的,表11示出皱波角叉菜磺基水解酶II对kappa -角叉菜聚糖或其前体即mu-角叉菜聚糖无活性。
皱波角叉菜磺基 水解酶II只对从spinosum中经中性提取的iota-角叉菜聚糖或其富 集nu的配体有活性。
令人惊奇的是,此nu-角叉菜聚糖的ERF1不 是磺基水解酶II的良好底物。
不期望受理论限制,ERF1据信含有 相对高分子量的nu-角叉菜聚糖。
所观测的对ERF2有活性及对ERF1 无活性还不完全清楚。
实施例47-53 这些实施例涉及研究温度对基于蛋白质含量纯化的皱波角叉菜磺 基水解酶II对不同类型角叉菜聚糖的活性/稳定性的影响。
基于蛋白质含量纯化的皱波角叉菜磺基水解酶II是通过本申请书 所述的方法分离的。
尤其地,集合DEAE琼脂糖凝胶层析的59-61 级分,并用作磺基水解酶II的原料。
将1体积的DEAE琼脂糖凝胶层析的59-61级分集合,用1体 积的在50mM Tris-HCl+10mM 2-巯基乙醇(pH7.1)中的1.4% (w/v)的nu-角叉菜聚糖温育,nu-角叉菜聚糖是根据实施例5- 12的方法产生的。
以相同方式制备参考混合物,除了酶(纯化的磺 基水解酶II)在用nu-角叉菜聚糖温育之前在大气压下煮沸10分钟。
如表12所示,将反应混合物以及参考混合物在不同温度下温育, 从0℃-60℃。
在上述温度下温育3,8,15,24,32和40小时后 取等分。
结果以通过用本说明书所述的方法测定的释放的硫酸根相 对数量表示,作为温育期间的作用结果。
表12  实施例
 温度℃
 在不同时间(小时)释放的硫酸根相对水平
 3
 8
 15
 24
 32
 40
 47
 0
 0
 0
 1.7
 2.1
 3.9
 3.2
 48
 12
 0
 0
 6.0
 6.1
 10.3
 12.9
 49
 20
 2.4
 4.7
 13.6
 14.0
 25.3
 30.5
 50
 30
 4.7
 -
 21.4
 29.0
 32.3
 27.0
 51
 37
 9.0
 15.7
 34.3
 41.2
 53.5
 35.4
 52
 48
 -
 26.6
 55.7
 73.0
 97.2
 97.7
 53
 60
 15.2
 16.3
 14.6
 33.3
 35.3
 -
如表12所示,磺基水解酶的活性在48℃活性最大。
高于这个温 度,由于酶变性而丧失活性。
实施例54-59  这些实施例涉及对Kappaphycus alvarezii(Cottonii)提取物的磺 基水解酶活性进行定性。
Cottonii是由菲律宾宿雾岛Genu Philippines提供的活产品。
将 Cottonii在液氮中冷冻运输,并保持在-80℃直至进一步使用。
在提 取之前,将Cottonii在研磨器中人工研磨为细末,在研磨期间用烘 炉导入液氮以保持Cottonii处于冷冻状态。
实施例54-57 这些实施例涉及用各种Cottonii磺基水解酶提取物处理角叉菜聚 糖以筛选活性。
如实施例1-4制备皱波角叉菜所述制备Cottonii的 提取物。
然而在此情况中,进行额外的分级分离步骤,因为上清在 冷丙酮中也配成60-85%饱和度。
加入的丙酮量如实施例1-4所 述计算。
在每个分级分离步骤之后,进行如实施例1-4所述的离心。
然后将粒状沉淀再溶解于50mM Tris-HCl(pH7.1)+10mM 2-巯基 乙醇中,之后在4℃用3×3升的上述缓冲液透析过夜。
在透析后样 品的体积为大约1.5ml。
根据实施例1-4所述产生对照组和样品,除了是从Cottonii而 非皱波角叉菜中提取。
因此,如下表13所述,在一些情况中,将Cottonii 的原始提取物用丙酮分级分离。
如表13所示,在25℃用各种提取物与角叉菜聚糖温育40小时。
释放的硫酸根量用本申请书中所述方法测定。
表13  实施例
 Cottonii提取物
各种底物中释放的硫酸根(ppm)
Nu
 Mu
 Iota
 Kappa
 54
 原始
0
 18.9
 3.5
 7.2
 55
 0-30%丙酮(粒状沉淀)
0
 85.9
 2.2
 24.1
 56
 30-60%丙酮(粒状沉淀)
58.9
 37.1
 0
 1.6
 57
 60-85%丙酮(粒状沉淀)
0
 1
 0
 17
如表13所示,即使不进行分级分离Cottonii的提取物对mu-角 叉菜聚糖也是活性的。
从0-30%或从30-60%丙酮中分级分离的 相同提取物示出相同底物的较高活性。
一个提取物还示出对nu-角 叉菜聚糖的活性。
实施例58-75 这些实施例涉及确定Cottonii磺基水解酶在不同mu-角叉菜聚 糖浓度的活性。
将Cottonii提取物的30-60%丙酮级分(粒状沉淀),在4℃用 NWCO 6-8000或3500 Spectra/por膜,经3×3升的50mM Tris-HCl(pH7.1)+10mM 2-巯基乙醇透析,NWCO 6-8000或3500 Spectra/por膜得自美国Spectrum Laboratories公司,Rancho Dominguez,CA。
制备具有表14所列组分的对照组和样品反应混合物。
为制备这 些反应混合物,制备两种母液。
母液1是1.25%(w/v)的mu-角 叉菜聚糖,母液2是5%(w/v)的mu-角叉菜聚糖,均在50mM Tris-HCl(pH7.1)+10mM 2-巯基乙醇中。
在表14中,缓冲液是 50mM Tris-HCl(pH7.1)+10mM 2-巯基乙醇。
提取物中蛋白质的 浓度估计为大约105μg/ml,这是用牛血清白蛋白作标准,经得自德 国Bio-Rad Laboratories GmbH,Munich的Bio-Rad蛋白质分析测定 的。
表14  实施例

 提取物
 (μl)
 母液1
 (μl)
 母液2
 (μl)
 缓冲液
 (μl)
 Mu的终浓度
 (%(w/v))
 对照组
 125
 0
 0
 375
 0
 58
 125
 5
 0
 370
 0.012
 59
 125
 10
 0
 365
 0.025
 60
 125
 20
 0
 355
 0.05
 61
 125
 50
 0
 325
 0.125
 62
 125
 75
 0
 300
 0.187
 63
 125
 100
 0
 275
 0.25
 64
 125
 150
 0
 225
 0.375
 65
 125
 200
 0
 175
 0.5
 66
 125
 250
 0
 125
 0.625
 67
 250
 0
 74
 676
 0.37
 68
 250
 0
 110
 640
 0.55
 69
 250
 0
 140
 610
 0.7
 70
 250
 0
 170
 580
 0.85
 71
 250
 0
 200
 550
 1
 72
 250
 0
 220
 530
 1.1
 73
 250
 0
 300
 450
 1.5
 74
 250
 0
 350
 400
 1.75
 75
 250
 0
 400
 350
 2
将对照组和样品反应混合物在25℃在pH7.1,与下表15所示的 不同浓度的mu-角叉菜聚糖温育40小时。
释放的硫酸根的相对量 用本说明书所述方法测定。
表15 实施例

 Mu的终浓度
 (%(w/v))
 释放的硫酸根的相
 对水平(ppm)
58
 0.012
 3.8
59
 0.025
 5.1
60
 0.05
 5.8
61
 0.125
 11.9
62
 0.187
 17.9
63
 0.25
 19.7
64
 0.37
 22.2
65
 0.375
 23.2
66
 0.5
 31.2
67
 0.5
 26.7
68
 0.625
 32.8
69
 0.7
 32.6
70
 0.85
 36.9
71
 1
 29.2
72
 1.1
 29.6
73
 1.5
 66.1
74
 1.75
 65.4
75
 2
 55.9
如表15所示,1.75%(w/v)左右的mu-角叉菜聚糖是用于对 Cottonii提取物进行脱硫反应的最佳底物浓度。
事实上,在此浓度释 放的硫酸根量是0.5-1%(w/v)mu-角叉菜聚糖浓度释放的硫酸 根量的两倍。
实施例76-81 这些实施例涉及确定在不同温度Cottonii磺基水解酶对mu-角 叉菜聚糖的活性。
将Cottonii提取物的0-30%丙酮级分(粒状沉淀),在4℃用 NWCO 6-8000或3500 Spectra/por膜,经3×3升的50mM Tris-HCl(pH7.1)+10mM 2-巯基乙醇透析,NWCO 6-8000或3500 Spectra/por膜得自美国Spectrum Laboratories公司,Rancho Dominguez,CA。
对照组和样品反应混合物如实施例54-57所述相同方式产生。
这样,Cottonii提取物的量为250μl。
另外,在样品反应混合物中mu -角叉菜聚糖溶液(在50mM Tris-HCl(pH7.1)+10mM 2-巯基乙 醇中浓度为1.25%(w/v))的量为500μl。
在pH7.1,在下表16所列不同温度进行温育。
在下表所列不同 时间取反应混合物的等分,并用本申请书所述方法测定释放的硫酸 根的相对量。
表16  实施例
 温度
 (℃)
 释放的硫酸根的相对量(ppm)
 3小时
 9小时
 27小时
 48小时
 70小时
 76
 4
 2.4
 2.6
 25.5
 15.9
 42.1
 77
 12
 10.2
 6.4
 29.5
 38.8
 79.4
 78
 20
 11
 18.4
 53.5
 59.4
 79.8
 79
 30
 17.8
 34.8
 -
 61.7
 90.4
 80
 37
 24
 49.7
 74.4
 73.2
 90.4
 81
 48
 11.9
 61.8
 81.2
 77.2
 105
表16示出尽管提取物在低温度(4℃)有活性,但Cottonii的mu 磺基水解酶提取物在48℃呈现最大活性。
在这点上,应指出48℃是 测试的最高温度,由此提取物在更高温度可能有更高活性。
在任何 情况下,在48℃,在用酶温育mu-角叉菜聚糖9小时后,明显释 放硫酸根。
实施例82-95 这些实施例涉及测定在不同pH Cottonii磺基水解酶对mu-角叉 菜聚糖的活性。
用于这些实施例中的Cottonii提取物,用牛血清白蛋白作标准, 通过Bio-Rad蛋白质分析测定其蛋白质浓度为大约105μg/ml,Bio- Rad蛋白质分析得自德国慕尼黑Bio-Rad Laboratories GmbH。
样品 和对照组反应混合物如下表17所示制备。
表17 组成成分
对照组
 样品
Mu-角叉菜聚糖(在水中1.2%
(w/v))
250μl

 250μl

缓冲液(100mM Tris,Pipes,Mes,
或Bis-Tris,如下所述)
125μl

 125μl

50mM Tris-HCl pH7.1+10mM 2-
巯基乙醇
125μl

 0μl

Cottonii提取物(在50mM Tris-HCl
pH7.1+10mM 2-巯基乙醇中)
0μl

 125μl

在这些实施例中,pH根据实施例5-13的方法变化,实施例5 -13涉及确定皱波角叉菜磺基水解酶的活性。
除了关于皱波角叉菜 所述的缓冲液之外,为确定最佳pH值,使用bis-tris缓冲液(100mM bis tris+2-巯基乙醇10mM),pH8.0-9.5。
bis tris是(双〔2-羟 乙基〕亚氨基tris〔羟甲基〕甲烷;2-双〔2-羟乙基〕氨基-2- 〔羟甲基〕-1,3-丙二醇),其得自美国圣路易斯Sigma Chemical, MO。
将反应混合物在48℃温育18小时。
在温育后,释放的硫酸根量 根据本申请书所述游离硫酸根分析方法测定。
通过对比样品和对照 组中游离硫酸根的量,计算下表18所示游离硫酸根的相对量。
表18  实施例
 PH
 释放的硫酸根(ppm)
 MES
 Pipes
 Tris-HCl
 Bis-Tris
 82
 5.5
 1.94
 83
 6
 19.8
 84
 6.5
 49.8
 85
 6.5
 58.0
 86
 7
 58.1
 87
 7
 47.4
 88
 7.5
 54.4
 89
 8.2
 56.5
 90
 8.2
 73.2
 91
 8.5
 69.0
 92
 8.5
 71.6
 93
 9
 85.6
 94
 9
 18.8
 95
 9.5
 41.0
表18示出根据反应混合物中所用的缓冲液,mu-磺基水解酶的 最佳pH值在8.2-9.0之间。
因此,Cottonii提取物的最佳pH比皱 波角叉菜提取物的最佳pH值更碱化。
实施例96-104和对比例1 这些实施例和对比例涉及确定在不同蛋白质量,Cottonii磺基水 解酶对mu-角叉菜聚糖的活性。
在实施例和对比例中,Cottonii提取物中蛋白质的浓度测定为 105μg/ml。
反应混合物中蛋白质的量根据下表19变化。
将反应混 合物在48℃,在pH7.1温育18小时。
在表19中,缓冲液是50mM Tris-HCl pH7.1+10mM 2-巯基乙 醇。
根据本说明书所述方法测定的释放的硫酸根量,在下表19中示 出。
表19 实施例


Cottonii提
取物(μl)

缓冲液
(μl)

在水中1.2%(w/v)
mu-角叉菜聚糖(μ
l)
蛋白质量
  (μg)

释放的硫酸
根(ppm)

对比例1
0
250
250
0
1.9
96
5
245
250
0.52
5.7
97
10
240
250
1.05
7.2
98
20
230
250
2.10
10.4
99
50
200
250
5.20
17.9
100
75
175
250
7.90
26.2
101
100
150
250
10.50
30.8
102
150
100
250
15.70
50.2
103
200
50
250
21.00
66.8
104
250
0
250
26.20
84.5
表19示出mu磺基水解酶是一种活性酶,因为少如5μg的总蛋 白就足以释放显著量的硫酸酯。
实施例105 此实施例涉及从Cottonii中分离和部分纯化mu磺基水解酶。
将50g新鲜Cottonii在液氮中冷冻,并用Grinomix GM200研磨 仪研磨,新鲜Cottonii由菲律宾宿务岛Genu提供,Grinomix GM200 研磨仪得自德国Retsch BV。
然后将此粉末在4℃,在1.5体积,即 75ml的50mM Tris-HCl(pH9.5)+10Mm 2-巯基乙醇+500mM KCl中解冻大约60小时。
将提取物在4℃以24000×g离心90分钟。
然后用在50mM Tris-HCl(pH7.1)+10Mm 2-巯基乙醇中1.5% (w/v)的nu或mu-角叉菜聚糖,测试上清的磺基水解酶活性。
在 48℃用Cottonii提取物温育20小时。
此温育混合物含有250μl 50mM Tris-HCl(pH7.1)+10Mm 2-巯基乙醇,pH7.1,500μl提取物, 和在50mM Tris-HCl(pH7.1)+10mM 2-巯基乙醇中的500μl底 物(1.5%(w/v))。
释放的硫酸根量通过本申请书所述方法测定。
iota-前体释放的硫酸根最高(在20小时后80ppm),kappa-前 体最低(在20小时后10-30ppm),尤其地,当底物是表1所述的 mu-角叉菜聚糖时,释放的硫酸根是11ppm,而当底物是根据实施 例39-46所述“C”方法产生的mu-角叉菜聚糖时,释放的游离 硫酸根是29ppm。
为进一步纯化磺基水解酶,通过加入16.4g硫酸铵/100ml样品将 提取物调节为30%硫酸铵饱和度。
在4℃在16小时后,将样品在4 ℃以24000×g离心90分钟。
将上清(40ml)以3ml/分钟流速加样 于苯基琼脂糖凝胶6快速流动层析柱(高sub)中,所用层析柱得自 瑞典Amersham Pharmacia Biotech AB,Uppsala,并预先用50mM Tris-HCl(pH8.7)+10mM 2-巯基乙醇+500mM KCl+30%饱和度 的硫酸铵平衡。
将此层析柱用此缓冲液清洗,直至在280nm的吸光 度可忽略不计。
然后,将蛋白质用降低梯度的硫酸铵洗脱,如以下 及表20所述。
缓冲液A:50mM Tris-HCl(pH8.7)+10mM 2-巯基乙醇+500mM KCl+30%饱和度的硫酸铵 缓冲液B:50mM Tris-HCl(pH8.7)+10mM 2-巯基乙醇+500mM KCl级分规格:5ml 流速:3ml/分钟 表20  时间(分钟)
 %缓冲液A
 %缓冲液B
 0
 100
 0
 120
 0
 100
实施例106-109和对比例2 这些实施例涉及从皱波角叉菜中纯化磺基水解酶I和II。
从皱波角叉菜中将磺基水解酶I和II均纯化为均一性。
酶的提取 是用两批0.6-0.7kg的新鲜海藻开始,随后进行两次苯基琼脂糖凝 胶层析。
集合活性级分(根据释放的硫酸根),利用MWCO 6-8000 或3500 Spectra/por膜,用5×10升含有10mM 2-巯基乙醇的50mM Tris-HCl缓冲液(pH7.1)(缓冲液A)透析,MWCO 6-8000或3500 Spectra/por膜得自美国Spectrum Laboratories,Inc.,Rancho Dominguez,CA。
然后将透析的级分加样于DEAE琼脂糖凝胶层析 柱,产生纯化的磺基水解酶II,DEAE琼脂糖凝胶层析柱得自瑞典 Amersham Pharmacia Biotech AB,Uppsala。
将含有磺基水解酶I以 及一些其它蛋白的一种级分的一半,加样于HiTrap肝素层析柱,产 生纯化的磺基水解酶I,HiTrap肝素层析柱得自瑞典Amersham Pharmacia Biotech AB,Uppsala。
级分中纯化的磺基水解酶I和II的浓度是非常低的,且用牛血清 白蛋白作标准,经Bio-Rad蛋白质分析不能确定,因为溶液中磺基 水解酶I和II的数量低于检测限。
将下表21所示的反应混合物在48℃温育14小时。
在这些反应 混合物中,将不同量的几乎纯化的(基于蛋白质总量大约80%(w/v) 纯化的)磺基水解酶II,与根据以上实施例39-46所述的“E”方 法所得的iota-前体温育,产生凝胶,所用磺基水解酶II的浓度经 得自德国慕尼黑Bio-Rad实验室的Bio-Rad蛋白质分析测定为 30μg/ml。
相反,当将酶在100℃煮沸10分钟后温育时,在相同条 件下的温育不能产生凝胶。
在温育后,将所有反应混合物在100℃ 煮沸10分钟,以终止反应。
对比例2用作对照,并在反应混合物中不加入磺基水解酶而制 备。
表21  实施例

 磺基水解酶II,
 30μg/ml(μl)
 水(μl)

 Nu角叉菜聚糖(1.4%(w/v)
 在水中)(μl)
 对比例2
 0
 1500
 1500
 106
 100
 1400
 1500
 107
 250
 1250
 1500
 108
 500
 1000
 1500
 109
 1000
 500
 1500
温育的样品的凝胶强度和复数粘度如表22所示测定。
表22中的 测定法是基于温度变化,其中温度从80℃降至10℃,然后依次从10 ℃升至80℃。
在温度变化期间将样品进行各种变形,并测定所得力。
此测试在具有杯状-振动系统(C14)的Bohlin VOR流变仪上进行, Bohlin VOR流变仪得自瑞典Bohlin Reologi AB,Sjobo。
扭矩元件 为0.24gcm,频率为0.5Hz,振幅为10+80%。
将力转变为弹粘性模量(分别为G’和G”)和复数粘度(η°)。
凝胶温度是当温度降低变化时,其中G’和G”温度交叉,且高 于G”时的温度。
熔解温度是当温度升高变化时G”高于G’ 的温度。
凝胶强度是指G’凝胶或G’熔解,和在10℃所得的G’。
复数粘度(η°)是在10℃的粘度。
表22  实施例


 凝胶温
 度(℃)

 熔解
 温度
 (℃)
 在10℃的
 G′凝胶
 (Pa)
 在10℃的
 G’熔解
 (Pa)
 在10℃的
 η°凝胶
 (Pa.s)
 在10℃的
 η°熔解
 (Pa.s)
 对比例2
 -
 -
 -
 -
 0.0041
 0.0346
 106
 -
 -
 4
 0.124
 0.097
 0.135
 107
 25.3
 35.5
 38
 46
 11.65
 17.38
 108
 51.4
 58.4
 76
 69
 24.54
 21.868
 109
 64.4
 68.1
 39
 39
 12.19
 12.16
表22示出凝胶强度和复数粘度随着酶浓度提高而增加,并呈现 在大约5μg/ml达到最大值,之后凝胶强度和复数粘度降低,并变 得类似于碱处理的iota-角叉菜聚糖。
需要一定量的磺基水解酶产 生可测定的凝胶,大约为1μg/ml。
少量的酶(2.5μg/ml)产生柔软 的凝胶,而较多量的酶(5和10μg/ml)产生较硬的凝胶。
实施例110和对比例3-5 这些实施例涉及用部分纯化的皱波角叉菜提取物温育iota-和nu -角叉菜聚糖。
表24中的iota-和nu-角叉菜聚糖均提取自Eucheuma denticulatum(Spinosum),如下所述。
对比例3用作对照,并含有iota-角叉菜聚糖,其是商业提取物, 并已用氢氧化钙处理,以充分除去6-O-硫酸酯基团,并用作对照。
以如下方式提取用于对比例4-5和实施例的nu-角叉菜聚糖。
将25g冻干并研磨的Spinosum分散于2.5升的0.125M KCl中。
在 室温提取24小时。
用614-200mm的Frisenette滤纸进行过滤,所 用滤纸得自丹麦A.G.Frisenette & snner APS,Ebeltoft。
由于容易粘 结,因此需要更换滤纸,共需更换3次。
将液体在冰箱中冷藏(5℃) 过夜。
然后将液体在Roto-蒸发器RE 120上,在40℃用水浴以2- 3rpm蒸发至50%体积,Roto-蒸发器RE120得自瑞士 Laboratoriums Technik AG,Flawil。
将pH通过加入6滴1M NaOH调节为大约8.0。
将角叉菜聚糖用100%(v/v)异丙醇(IPA)沉淀 并冻干,异丙醇得自英国BP化学制品有限公司。
将nu-角叉菜聚 糖人工修整为最大为1cm2的薄片,并以1%(w/v)nu-角叉菜聚糖 水平分散于蒸馏水中。
将nu-角叉菜聚糖用自来水经Spectra/por膜 MWCO 6-8000或3500透析,直至在水中的电导率为1.5μS/cm, Spectra/por膜MWCO 6-8000或3500得自美国Spectrum Laboratories,Inc.,Rancho Dominguez,CA。
将nu-角叉菜聚糖的 pH调节为9.3,然后将此溶液沉淀并冻干。
将冻干的组分在研磨器 中研磨。
此提取物具有丰富的nu-含量和高分子量。
还示出用来自皱波角叉菜的含有磺基水解酶部分纯化的级分温育 nu-角叉菜聚糖的结果。
纯化方法一般如本说明书所示方法,即硫 酸铵分级分离,苯基琼脂糖凝胶层析,除了用Poros HQ层析代替 DEAE琼脂糖凝胶层析。
Poros HQ层析柱(4.6×100mm)得自美 国Foster市,PerSeptive Biosystems,CA。
Poros HQ层析法包括DEAE 琼脂糖凝胶层析中所用的相同缓冲液,但洗脱如下及如表23所示进 行: 缓冲液A:50mM Tris-HCl+10mM 2-巯基乙醇pH7.1 缓冲液B:50mM Tris-HCl+10mM 2-巯基乙醇+1M NaCl pH7.1 流速;2ml/分钟 级分规格:2ml 表23  时间(分钟)
 %缓冲液A
 %缓冲液B
 0
 100
 0
 60
 0
 100
集合含有磺基水解酶活性的级分28-37,并如下所述用作酶级 分。
将nu-角叉菜聚糖与含有以下成分的混合物温育:1.5ml的1.4 %(w/v,在50mM Tris-HCl(pH7.1)+10mM 2-巯基乙醇中)nu -角叉菜聚糖,和1.5ml在50mM Tris-HCl(pH7.1)/10mM 2-巯 基乙醇中的酶级分。
对比例5的参照混合物是用苯基琼脂糖凝胶层析的级分产生的, 该级分没有磺基水解酶活性,即不从nu-角叉菜聚糖中释放硫酸根。
对比例5涉及确定凝胶化是否是与蛋白质相互作用所致,或凝胶化 是否是与磺基水解酶相互作用所致。
在48℃温育20小时后,将角叉菜聚糖通过在30℃在Microcon -10装置上,以3320×g离心1小时而从反应混合物中除去,以如 本说明书所述测定释放的游离硫酸根数量,Microcon-10装置购自 美国Amicon Bioseparations,Millipore Corporation,Bedford,MA。
相反,其它测定法(即半乳糖,3,6AG,和粘度测定)直接在反 应混合物中进行。
提取自E.denticulatum(Spinosum)的nu-角叉菜聚糖,和与一 些蛋白质或含有皱波角叉菜的两种磺基水解酶的部分纯化的酶级分 温育的相同nu-角叉菜聚糖的主要结构特点,在表24中概括。
表24的粘度测定是在上述反应混合物中进行的,只是在48℃温 育后反应混合物的粘度是用可程序化的DV III型Brookfield流变 仪,自动调温在48℃直接测定的,DV III型Brookfield流变仪得自 美国Brookfield Engineering Laboratories,Stoughton,MA。
用CP52 杆以120rpm剪切速率测定10分钟。
在表24中,磺基水解酶活性是在温育nu角叉菜聚糖的酶提取物 基础上,通过测定释放的硫酸根量分析的。
过滤物中存在的游离硫 酸根量根据本说明书所述方法测定。
表24 实施例

含量

半乳糖
(mol%)
 3,6-脱水
 Gal(mol%)
 游离硫酸根
 (%w/w)
Brookfield
粘度(cP)
对比例3

Iota-角叉菜
聚糖
50

 50

 0.6

太高(凝
胶)
对比例4

Nu-角叉菜聚

68

 32

 NA

<5

对比例5

Nu-角叉菜聚
糖+蛋白质
71

 29

 0.4

<5

110



Nu-角叉菜聚
糖+部分纯化
的磺基水解酶
I和II
59



 41



 2.3



40



表24示出存在磺基水解酶时释放硫酸根,及3,6 AG水平增加 导致凝胶形成。
实施例111-116和对比例6-11 这些实施例涉及用来自皱波角叉菜的磺基水解酶I和II的分离的 级分温育nu-角叉菜聚糖,以测定对粘度的作用。
为获得磺基水解酶I和II,纯化方法一般包括本说明书所述的方 案。
在此唯一不同之处是起始物为2kg。
级分21和40得自相同纯化实验,而级分23和48得自用相同方 法分别进行的层析。
通常当使用0.6-0.7kg海藻时,在DEAE琼脂 糖凝胶层析后首先洗脱磺基水解酶I,而后洗脱磺基水解酶II,这与 级分23和48的情况一样。
然而,在用2kg海藻进行的纯化中,级 分的顺序是相反的,这样磺基水解酶II在级分21中,而磺基水解酶 I在级分40中。
在表25中,“21+nu”,“23+nu”,“40+nu”,和“48+nu”分 别表示1ml的级分21,23,40和48(在50mM Tris-HCl+10mM 2 -巯基乙醇pH7.1中),2ml MilliQ水,和3ml 1.4%(w/v,在MilliQ 水中)nu-角叉菜聚糖的混合物,将此混合物在48℃温育15小时, 然后在100℃灭活15分钟,混合物中nu-角叉菜聚糖是通过实施例 39-46的“E”方法获得的。
对照组包括的混合物进行相同处理, 除了使用煮沸的酶,即表25所示“@100”酶。
“40+nu+21”,和 “23+nu+48”分别表示1ml级分40或23(在50mM Tris-HCl+10mM 2-巯基乙醇pH7.1中),2ml MilliQ水,和3ml 1.4%(w/v,在MilliQ 水中)nu-角叉菜聚糖的混合物,将此混合物在48℃温育15小时, 然后在100℃灭活15分钟,然后向其中分别加入1ml级分21或48 (在50mM Tris-HCl+10mM 2-巯基乙醇pH7.1中),接着在48℃ 温育6小时,混合物中nu-角叉菜聚糖是通过实施例39-46的“E” 方法获得的。
结果如下表25所示。
表25 实施例
级分
平均    MW
(kDa)

   硫酸酯释放
         粘度增加
 Iota
 mol%


Y/N

ppm

 Y/N

 cP

 T(℃)
111

21+nu

35(磺基水解
酶II)
Y

139

 Y

 12

 40

 92

对比例
6
21@100+
nu
35(磺基水解
酶II)
7

 N

 0.0

 40

 77

112

23+nu

62(磺基水解
酶I)
Y

194

 N

 0.3

 55

 87

对比例
7
23@100+
nu
62(磺基水解
酶I)
18

 N

 0.0

 55

 77

113

40+nu

62(磺基水解
酶I)
Y

69

 N

 0.0

 40

 83

对比例
8
40@100+
nu
62(磺基水解
酶I)
16

 N

 0.0

 40

 76

114

48+nu

35(磺基水解
酶II)
Y

93

 Y

 5.6

 55

 83

对比例
9
48@100+
nu
35(磺基水解
酶II)
12

 Y

 0.8

 55

 76

115

40+nu+
21
62/35(磺基水
解酶I和II)
Y

105

 Y

 29

 40

 95

116


23+nu+

48
62/35(磺基水

解酶I和II)
Y





 Y


 12


 55


 89


表25示出在用酶温育nu-角叉菜聚糖后,磺基水解酶I不增加 样品粘度,而磺基水解酶II增加样品粘度。
将实施例113和115进行对比示出先用随机酶(磺基水解酶I) 温育iota-前体,即nu-角叉菜聚糖,随后灭活并用渐进酶(磺基 水解酶II)温育,所得结果与只用渐进酶的结果相比粘度更高。
将酶促修饰的样品经NMR分析,以确定这两种酶的作用模式。
数据表明这两种酶是磺基水解酶,从iota-前体(nu)的C-6位释 放硫酸根,并随后诱导3,6-脱水桥形成。
测定的温育样品的凝胶强度和复数粘度如表28所示。
在表28中, 对比例10的样品是通过将表1所列的0.7%(w/v)的iota-角叉菜 聚糖,分散于含有2ml的0.5%(w/v)KC和2ml的0.25%(w/v) CaCl2的离子交换水中产生的。
将此溶液加热至80℃并蒸发至5ml。
对比例11的样品是未用酶处理的nu-角叉菜聚糖。
表28中的测定基于表26和27所述的方法。
表26示出确定凝胶 分布图的方法,起始温度为80℃。
表27示出确定熔解分布图的方 法,起始温度为10℃。
除非表26-27中特别指出,用Bohlin VOR Rheometer进行测定,如实施例106-109和对比例2所述。
表26 模式

蔓延/保持

温度
(℃)
 时间(s)

 样品Int.
 (s)
 频率
 (Hz)
 Amp.
 (%)
振荡
蔓延
61
 1140
 20
 0.5
 80
振荡
蔓延
10
 3060
 20
 0.5
 10
表27 模式

斜面/保

温度
(℃)
 时间(s)

 样品Int.
 (s)
 频率
 (Hz)
 Amp.
 (%)
振荡
蔓延
58
 2280
 20
 0.5
 10
振荡
蔓延
80
 1320
 20
 0.5
 80
表28 实施例


 成分


 胶凝温度
 (℃)

 熔解温度
 (℃)

 在40℃
 的η°
 (cP)
 在10℃
 的η°
 (cP)
 G’
 (Pa)

对比例
10
 Iota

 60.8

 65.3

 8372

 12287

 38.4

111
 21+nu
 37.1
 39.2
 42
 15120
 47.3
113
 40+nu
 22.5
 28.8
 4.3
 6557
 20.6
115

 40+nu+
 21
 49.4

 56.8

 3979

 13560

 42.4

对比例
11
 Nu

 -

 -

-

 -

 -

如表28所示,酶制品能影响聚合物的胶凝和熔解温度。
酶促修 饰的聚合物的粘度低于传统的iota角叉菜聚糖。
粘度和胶凝点的不 同可以是由于离子和粘度作用所致,并可以针对酶促制备样品而优 化。
本发明结合一些优选的实施方案进行了阐述,因此可更充分理解 和应用本发明的各方面,这些实施方案无限制本发明之意。
相反, 在所附权利要求范围内可对本发明进行修改。
序列 磺基水解酶I NH2-末端        KEGCETAIVGAGIGGAYSAFRLASP         (SEQ ID NO:1) 内部肽        GLIGLNNLVTPMEK                    (SEQ ID NO:2)        MSGVEQVYFDDLHAQLK                 (SEQ ID NO:3)        EIRDRVEELEKEEDYAK                 (SEQ ID NO:4)        GRTNVYELYAK                       (SEQ ID NO:5) 磺基水解酶II 内部肽        WVVNIVINGVR                       (SEQ ID NO:6)        QVLELEFTVVR                       (SEQ ID NO:7)        LSPLTFQR                          (SEQ ID NO:8)        INDNLVYQXGNLPAGK                  (SEQ ID NO:9)        NYNIQNTDGSVFR                     (SEQ ID NO:10) 额外的内部肽        MTVEFQ                            (SEQ ID NO:11) 磺基水解酶I简并寡核苷酸 AAR GAR GGR TGY GAR AC                   (SEQ ID NO:12) 磺基水解酶II简并寡核苷酸 GTRTTYTGDATRTTRTAGTT                     (SEQ ID NO:13) AANACNYWNCCRTCIGTGTT                     (SEQ ID NO:14) 载体引物     ATTAACCCTCACTAAAG                (SEQ ID NO:15)     AATACGACTCACTATAG                (SEQ ID NO:16) 磺基水解酶I核苷酸序列 (SEQ ID NO:17)  GACAGCCCTCCCCAACATGGGGCTCACCTACGTTCTTTTGTCTGTTCTTGTCTT  ACAAGCAACCCACGCACTTGCCAAAGAGGGATGCGAGACCGCTATAGTTGGA  GCCGGAATTGGTGGCGCTTATTCTGCCTTCCGTTTGGCAAGCCCATCAGTCTGTA  TCTTTGAAGCCAACCGTCGCCCAGGAGGGCGCATCTTGACCGTTCGGGATCCA  AGCGCCTCGTTTCTGAACTTCACTATTGACCTTGGTGCGTATCGCTACCATCGT  GCACACCATCGTCTTGTCCGCCTCGTTGCTGAAGACCTACTCAACCTTCCTGTG  GCTTGCTATACGGACTTGCTCAACAACCGAAAAGATTGTCCGGACGCGACGATT  CGTCTCTTTTCAACTCGAGGGAACGTGCTTGGAGCTCTTGGAGGCCGGATTGC  TCAAGACTTAATAAAGAAGTACGGACCGTTCCTGCCATATGTGATTCAGAGGA  GCTTTCGGTGGGGACAAGGAAAGCCCTTGAAGGAAAGACGGACAATGTCTGG  GTTGCTAATCGGGCCAAACTCAGTAATCAAAGAGATCCGAGATCGCGTTGAG  GAGCTTGAGAAAGAGGAAGACTATGCGAAAGCGATGCAGATTGCGGACGAA  ATCATTGCGGCAATGCAAGATGGCTCGTACAGAGGGCATCCCGTATTCAGAGA  TCAGTTTGATGCAAGTCGCGATCCGTGAAGGCTTTACGACAGAGGAGATGCA  ACTGGAAACGGACTTCTCATTTCTCAGCAGTGTGGAAAGGCGGCAGACGCTA  GAATACAACGGGCAGCTTTCAATCAGGCAAATGGCACTAGAAAAGGGACTTA  TAGGGCTTAACAATCTAGTGACGCCGATGGAGAAGCGGCGTGGAGTGCTACG  TAGAGCGGGCATGATCACGCTCGTGGACGGCCTGCTTGAGCGGGCGATGAAGGG  CGGTGTGCAGGTACAATATGGGAAGAAGGTCGTGAGAATTACGCGCACCGGA  AATGAGAAGAGGCCTATAAGACTCAAGTTCGAGGACGGCGGGATGGTAGAAG  TGAAGAACGTGATTCTCAACATTGGCAAGCCGGGGCTGATTGCTCTTGGGCTG  GACTCGGAGCCGATGATGAGCACCAAGGAGCCTTTCCGGCGAGCGGTCGAGC  GAAACTTTGTGCTGAGCTTATCCAAGACGTATTGTTTCTGGGAAGACGCGTGGT GGTTGACAAAGTTGGGGCAACGGGATGGGCGTATTCAGGTTCCTTCAGATTC GATGCAGTCAATGCGATACCACGATGGACACGTCGTGTGCAAGGACGAGAGA AGGCTTAAAAGTTGCCGTGGCGGATTGCTCGCGTCGTACTCGGGGGGCGATC AGATGGGGCTTGGGGCTGCTTTGCATGCGCACGTGCATAATGCTAAACCGTACA CACCGCTGACAAGCAGTGACAACGTAGTGAAATTGATTCCAGGGAAGATGTC TGGAGTAGAGCAAGTATACTTTGATGACCTGCACGCACAAATCAAGCGTGTGCA CAAGAGGTCGGTGGAGCGGAAGGGGCTTGACGTGGACAAGGTGATTTCCAAG CCGGCTATGTGCCTATTTGCGGATTGGCGGGAGGTGGGTACTCATGCGGCCA TGGGGCCGGGAAAAGGAAGAACGAATGTGTACGAGTTGTACGCTAAACCGG TTAGTGATTTGAGAATCGCACTGGTAAACGAAGCGTGGAGTGGGGACCAAG GGTGGGCGGAGGGGAGCTTGAGAAGCGCAGAGCGGGCGCTGTTCCACCAAT TCGGAATGGAGAAGCCAGAGTGGATGGATAAGGAGTATCACCGGTCGGTGAT TGAGAGGTACAACCAGGGGTGATTTCGGCGCGGGCATACAGTATGCGTGTCG TTCGTGAAGTTGTAGCAAAGGGCTAATCCTTCCACCTGTCGTCTCGGCGCAAA GAATAAAAGCTCGAAGATTAGTGGTGACGTTAGAAGTAGGCATACAGAACCA 磺基水解酶II核苷酸序列     (SEQ ID NO:18) AAATTTAAAGGAATTTTNAAAAAATTTTAAAGCTTAAATTTGCCATTTGCCAT TAAGGTGGGCAATTGTTGGAAAGCGATCGGTTGGGCCTTTTTGTTTTTACGCA AGCTGGAAAAGGGGATTGTGCTCCAAGGCGATTAAGTTGGGTAACGCAAGGG TTTTCCCAGTCAGACGTTGTAAAACGACGGCCAGTGAATTGTAATACGACTC ACTATAGGGCGAATTGGGTACCGGGCCCCCCCTCGAGTTTTTTTTTTTTTTTTT TTTTCAGAGGCGAAAGGTGTCGTTTACTGAAATCTCAAGTACGGGAGCAACT CCGCCCATCTCTACTCATCGTTCACTACAAGTTGCAGACACTATTTCACGCTC ATCACGAGGTAAGGGAAACGGTACTCGATACCTTTACTCACTCCTCTTAGAC AGTGAACTCGAGCTCAAGAACCTGCCTGCCGTCCACGTTCGAGCGGCCCAAC CTGCGTTCAACCCTGACTCCGTTGATCACAATGTTGACTACCCACCTTGTGCG GTTATTGAAGCAGTTGTTGAAATGGAACAGCTTGACAGTGTACTTCCCTGGAA CCATGTTCGTGAACGACACAGCTTCCTTGCCGGCCGGCAAGTTGCCGCACTG GTACACCAAGTTGTCATTGATACGTCCTCCCTGGGAGCCCGGCGGCCCATCA ACGGAAAGGTCGAAATCATCGGACGAATCCCACGCCACGTCCACCACGATCG GCCGCACAACCGTCTGGAATGAGACGCAGTCCCTGGCGTCGGACGTCGCGAT CGTGCGGAACACGGACCCATCGGTGTTCTGAATGTTGTAGTTGCGGATCGGA AGACGGATGCAGAGGTCGTCGAGGAAGTCCTCCTGGTTACCCACAGGGCTAC GGCGGGAGACACCCCTGAGTTCGCGCTGGAACGTGAGAGGGGAAAGACGGA AGTAGTTTGGCGGGAACGGGTGGCTCAGTCCGTTTGGCCTGTACCTGTTGATG GGGGTGGTGCGTGAGCCCGATTCAACGAGGGCAACGCCAGTTTTGCGGATGC TGCCGAGCGTCCGGCCGCCCGGGAAGTTACGGCAGACGGATGCCTGCAGCCC GGGGGATCCACTAGTTCTAGAGCGGCCGCCACCGCGGTGGAGCTCCAGCTTT TGTTCCCTTTAGTGAGGGTTAATTTCGAGCTTGGCGTAATCATGGTCATAGCT GTTTTCTGTGTGAAATTGGTATCCGCTCACAATTCACACAACATACCAGCCCC GAAACATAAATGTTAAAGCCTGGGTGGCTAATGAGTGAGCTTACTTACATTA ATTGGNTTGGCNNTACTTGCCCCTTTTTAAATCGGGGAAACCTTTCNGCCNAC TNTNTTAAANAATCGGCCAACCCCCCGGGGANAGGGG (SEQ ID NO:19) TTTTTGCCCATTGCCCATCAAGGTGGGCAATTTTTGGAAAGGCGATCGGGTGG GGCCTTTTGGTAATTACGCAAGCTGCAAAAGGGGAATGTGCTGCAAGCCGAT TAAGTTGGGTAACGCCAGGGTTTTCCCAGTCAGAACGTTGTAAACGCGGGCA GTGAATTGTAATACGACTCACTATAGGGCGAATTGGGTACCGGGCCCCCCCT CGAGTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTGGAGATGAAAGG TGTCGTTTACTGATACCAAGTACGGCGCAACTCCGCCCATCTCTACTCATCGT CACTACAGGTTGCAAACACTATTCCACGACCATGACGATTTAAGGGAACGCT ACTTGGGACCTTCCACTCATTCCTCTTAGACGGTGAACTCGAGCTCGAGAACC CTCCTGCCGTCCACATTCGACCGCCCCAACCTGCGTTGAATTCTTACCCCGTT GACCACAACGTTCACCACCCACTTCGTACGCTTATTGAAGCAGTTGTTGAAGT GGAACAGCGTGACCGTGTACTTCCCTCGAACCATGTTTTCGAAGGACACAGC TTCCTTGCCGGCCGGAGAGTCGCCGCACGCGGCCACCAAGTTGTCATTGATA CGGCCTCCTACAGATCCAGGGGGACCAACAACGGAAAGGTCGAAGTCATCG GACGAATCCCACGCCACGTCCACCACGATCGGCCGCACAACCGTCCGGAATG AAAGGCAGTCCCTGGCGTCCGACGTCGAGATCGTCCGGAACACAGTCCCATC CGTGTTCTGAATGTTGTAGTTGCGGATCGGAAGACGGATGCAGAGGTCGTCG AGGAACTCCTCCTGGTTACCCATGGCGCCACGACGAGCGACGCCCTTGCGGT CGCGCTGGAATGTCAGAGGCGTCAGACGGAAGTAGTTTCTCGGGAACGCGGG TCTCAGTCCATTAGGCCGGTACCTGTTGATCGGCGTGGTGCCTGAGCCTGATT CAATGAGCGCCGCGCCAGTGGTGCGAACGTTGCCGAGCGTTCTCCCGCCGGG GAAGTTACGGCAGATGAATGCTGAGCGGGAGTAGTCTGGCCCGCGGAGAAG GATCTTCGCACCCTTGGGACGCATGGAGCCATCAGCGCGGCAGAAGCGGAAC CGGCATGAGCGGCCGCATTGCGCGTTCGCTGTGAAGGCGATAGCGGCC AGGAGAAGGACGAACAGGAATGAAGCGTTCATTGTTGGTATGTGAAGACTGC CGCACCGAAATGAAGGCTGCTGGTGCCGAATTCCTGCAGCCCGGGGGATCCA CTAGTTCTAGAGCGGCCGCCACCGCGGTGGAGCTCCAGCTTTTGTTCCCTTTA GTGAGGGTTAATTTCGAGCTTGGCGTAATG (SEQ ID NO:20) ATCTCGAAATTAACCCTCACTAAAGGGAACAAAAGCTGGAGCTCCACCGCGG TGGCGGCCGCTCTAGAACTAGTGGATCCCCCGGGCTGCAGGAATTCGGCACC AGCAGCCTTCATTTCGGTGCGGCAGTCTTCACATACCAACAATGAACGCTTCA TTCCTGTTCGTCCTTCTCCTGGCCGCTATCGCCTTCACAGCGAACGCCCAATG CGGCCGCTCATGCCGGTTCCGCTTCTGCCGCGCTGATGGCTCCATGCGTCCCA AGGGTGCGAAGGTCCTTCTCCGCGGGCCAGACTACTCCCGCTCAGCATTCATC TGCCGTAACTTCCCTGGCGGGAGAACGCTCGGCAACGTTCGCACCACTGGCG CGGCGCTCATTGAATCAGGCTCAGGCACCACGCCGATCAACAGGTACCGGCC CAATGGACTGAGACCCGCGTTCCCGAGAAACTACTTCCGTCTGACGCCTCTG ACATTCCAGCGCGACCGCAAGGGCGTCGCTCGTCGTGGCGCCATGGGTAACC AGGAGGAGTTCCTCGACGACCTCTGCATCCGTCTTCCGATCCGCAACTACAAC ATTCAGAACAAGGATGGGTCTGTGTTCCGGACGATCTCGACGTCGGACGCCA GGGACTGCCTTTCATTCCGGACGGTTGTGCGGCCGATCGTGGTGGACGTGGC GTGGGATTCGTCCGATGACTTCGACCTTTCCGTTGTTGGTCCCCCTGGATCTG TAGGAGGCCGTATCAATGACAACTTGGTGGCCGCGTGCGGCGACTCTCCGGC CGGCAAGGAAGCTGTGTCCTTCGAAAACATGGTTCGAGGGAAGTACACGGTC ACGCTGTTCCACTTCAACAACTGCTTCAATAAGCGTACGAAGTGGGTGGTGA ACGTTGTGGTCAACGGGGTAAGGATTCAACGCAGGTTGGGGCGGTCGAATGT GGACGGCAGGAGGGTTCTCGAGCTCGAGTTCACCGTCTAAGAGGAATGAGTG GAAGGTCCCAAGTAGCGTTCCCTTACATCGTCATGGTCGTGGAATAGTGTTTG CAACCTGTAGTGACGATGAGTAGAGATGGGCGGAGTTGCGCCGCACTTGGTA TCAGTAAACGACACCTTTCATCTCTGTTCGAAAAAAAAAAAAAAAAAAACTC GAGGGGGGGCCCGGTACCCAATTCGCCCTATAGTGAGTCGAATTACAATTCA CTGGCCGCGTTTTACAACGTCGTGACTGGGAAAACCCTGCGTTACCCAACTTA ATCGCTTTGAAGACAATCCCTTTTTCCAACTTGGGGTAAAAACCAAAAGGGC CCGCACCATTCGCCTTTCCAAAAATTTGCCCACCCTTAATGGCAAAATGGCAA ATTTTAAGCCTTAAATTTTTTTTAAAAATTCCCGTTAAATTTTTTTAAAATAAC TTATTTTTTTAACCAATAGGCCCAAATCGGGAAAATCCCTTTTAA (SEQ ID NO:21) GAATTCGGCACGAGCAGCCTTCATTTCGGTGCGGCAGTCTTCACATACCAAC AATGAACGCTTCATTCCTGTTCGTCCTTCTCCTGGCCGCTATCGCCTTCACAG CGAACGCCCAATGCGGCCGCTCATGCCGGTTCCGCTTCTGCCGCGCTGATGG CTCCATGCGTCCCAAGGGTGCGAAGATCCTTCTCCGCGGGCCAGACTACTCC CGCTCAGCATTCATCTGCCGTAACTTCCCCGGCGGGAGAACGCTCGGCAACG TTCGCACCACTGGCGCGGCGGCTCATTGAATCAGGCTCAGGCACCACGCCGAT CAACAGGTACCGGCCCAATGGACTGAGACCCGCGTTCCCGAGAAACTTCTTC CGTCTGACGCCTCTGACATTCCAGCGCGACCGCAAGGGCGTCGCTCGTCGTG GCGCCATGGGTAACCAGGAGGAGTTCCTCGACGACCTCTGCATCCGTCTTCC GATCCGCAACTACAACATTCAGAACAAGGATGGGTCTGTGTTCCGGACGATC TCGACGTCGGACGCCAGGGACTGCCTTTCATTCCGGACGGTTGTGCGGCCGA TCGTGGTGGACGTGGCGTGGGATTCGTCCGATGACTTCGACCTTTCCGTTGTT GGTCCCCCTGGATCTGTAGGAGGCCGTATCAATGACAACTTGGTGGCCGCGT GCGGCGACTCTCCGGCCGGCAAGGAAGCTGTGTCCTTCGAAAACATGGTTCG AGGGAAGTACACGGTCACGCTGTTCCACTTCAACAACTGCTTCAATAAGCGT ACGAAGTGGGTGGTGAACGTTGTGGTCAACGGGGTAAGGATTCAACGCAGGT TGGGGCGGTCGAATGTGGACGGCAGGAGGGTTCTCGAGCTCGAGTTCACCGT CTAAGAGGAATGAGTGGAAGGTCCCAAGTAGCGTTCCCTTACATCGTCATGG TCGTGGAATAGTGTTTGCAACCTGTAGTGACGATGAGTAGAGATGGGCGGAG TTGCGCCGCACTTGGTATCAGTAAACGACACCTTTCATCTCTGTTCGAAAAAA AAAAAAAAAAAAAAAAAAAACTCGAG 磺基水解酶I氰基酸序列(SEQ ID NO:22) MGLTYVLLSVLVLQATHALAKEGCETAIVGAGIGGAY SAFRLASPSVCIFEANRRPGGRILTVRDPSASFLNFTID LGAYRYHRAHHRLVRLVAEDLLNLPVACYTDLLNNR KDCPDATIRLFSTRGNVLGALGGRIAQDLIKKYGPFLP YVIQRSFRWGQGKPLKERRTMSGLLIGPNSVIKEIRDR VEELEKEEDYAKAMQIADEIIAAMQDGSYRGIPYSEIS LMQVAIREGFTTEEMQLETDFSFLSSVERRQTLEYNG QLSIRQMALEKGLIGLNNLVTPMEKRRGVLRRAGMIT LVDGLLERAMKGGVQVQYGKKVVRITRTGNEKRPIR LKFEDGGMVEVKNVILNIGKPGLIALGLDSEPMMSTK EPFRRAVERNFVLSLSKTYCFWEDAWWLTKLGQRDG RIQVPSDSMQSMRYHDGHVVCKDERRLKSCRGGLLA SYSGGDQMGLGAALHAHVHNAKPYTPLTSSDNVVKL IPGKMSGVEQVYFDDLHAQIKRVHKRSVERKGLDVD KVISKPAMCLFADWREVGTHAAMGPGKGRTNVYELY AKPVSDLRIALVNEAWSGDQGWAEGSLRSAERALFH QFGMEKPEWMDKEYHRSVIERYNQG 磺基水解酶II核苷酸序列(SEQ ID NO:23) MNASFLFVLNLAAIAFTANAQCGRSCRFRFCRADGSMRPKGAKILLRGPD YSRSAFICRNFPGGRTLGNVRTTGAALIESGSGTTPINRYRPNGLRPAFPRN FFRLTPLTFQRDRKGVARRGANGNQEEFLDDLCIRLPIRNYNIQNKDGSVF RTISTSDARDCLSFRTVVRPIVVDVAWDSSDDFDLSVVGPPGSVGGRINDN LVAACGDSPAGKEAVSFENMVRGKYTVTLFHFNNCFNKRTKWVVNVVV NGVRIQRRLGRSNVDGRRVLELEFTV                   序列表 <110>萨比娜·热尼科 伯恩哈德·克洛阿雷 菲利普·波坦 布伯恩·鲁道夫 格哈德·德勒伊特 贝亚·彭尼霍夫 奥迪勒·理查德 <120>磺基水解酶,其相应的氨基酸序列和核苷酸序列,磺基水解酶制备物,方法及其产物 <130>P18666的序列公开 <140> <141> <150>60/133,376 <151>1999-05-10 <160>23 <170>PatentIn Ver.2.0 <210>1 <211>25 <212>PRT <213>皱波角叉菜 <400>1 Lys Glu Gly Cys Glu Thr Ala Ile Val Gly Ala Gly Ile Gly Gly Ala   1               5                  10                  15 Tyr Ser Ala Phe Arg Leu Ala Ser Pro          20                  25 <210>2 <211>14 <212>PRT <213>皱波角叉菜 <400>2 Gly Leu Ile Gly Leu Asn Asn Leu Val Thr Pro Met Glu Lys   1               5                  10 <210>3 <211>17 <212>PRT <213>皱波角叉菜 <400>3 Met Ser Gly Val Glu Gln Val Tyr Phe Asp Asp Leu His Ala Gln Ile   1               5                  10                  15 Lys <210>4 <211>17 <212>PRT <213>皱波角叉菜 <400>4 Glu Ile Arg Asp Arg Val Glu Glu Leu Glu Lys Glu Glu Asp Tyr Ala   1               5                  10                  15 Lys <210>5 <211>11 <212>PRT <213>皱波角叉菜 <400>5 Gly Arg Thr Asn Val Tyr Glu Leu Tyr Ala Lys   1               5                  10 <210>6 <211>11 <212>PRT <213>皱波角叉菜 <400>6 Trp Val Val Asn Ile Val Ile Asn Gly Val Arg   1               5                  10 <210>7 <211>11 <212>PRT <213>皱波角叉菜 <400>7 Gln Val Leu Glu Leu Glu Phe Thr Val Val Arg   1               5                  10 <210>8 <211>8 <212>PRT <213>皱波角叉菜 <400>8 Leu Ser Pro Leu Thr Phe Gln Arg   1               5 <210>9 <211>16 <212>PRT <213>皱波角叉菜 <400>9 Ile Asn Asp Asn Leu Val Tyr Gln Xaa Gly Asn Leu Pro Ala Gly Lys   1               5                  10                  15 <210>10 <211>13 <212>PRT <213>皱波角叉菜 <400>10 Asn Tyr Asn Ile Gln Asn Thr Asp Gly Ser Val Phe Arg   1               5                  10 <210>11 <211>6 <212>PRT <213>皱波角叉菜 <400>11 Met Thr Val Glu Phe Gln   1               5 <210>12 <211>17 <212>PRT <213>皱波角叉菜 <400>12 Ala Ala Arg Gly Ala Arg Gly Gly Arg Thr Gly Tyr Gly Ala Arg Ala   1               5                  10                  15 Cys <210>13 <211>20 <212>PRT <213>皱波角叉菜 <400>13 Gly Thr Arg Thr Thr Tyr Thr Gly Asp Ala Thr Arg Thr Thr Arg Thr   1               5                  10                  15 Ala Gly Thr Thr          20 <210>14 <211>20 <212>PRT <213>皱波角叉菜 <400>l4 Ala Ala Asn Ala Cys Asn Tyr Trp Asn Cys Cys Arg Thr Cys Ile Gly   1               5                  10                  15 Thr Gly Thr Thr          20 <210>15 <211>17 <212>DNA <213>皱波角叉菜 <400>15 attaaccctc actaaag                                              17 <210>16 <211>17 <212>DNA <213>皱波角叉菜 <400>16 aatacgactc actatag                                            17 <210>17 <211>2020 <212>DNA <213>皱波角叉菜 <400>17 gacagccctc cccaacatgg ggctcaccta cgttcttttg tctgttcttg tcttacaagc 60 aacccacgca cttgccaaag agggatgcga gaccgctata gttggagccg gaattggtgg 120 cgcttattct gccttccgtt tggcaagccc atcagtctgt atctttgaag ccaaccgtcg 180 cccaggaggg cgcatcttga ccgttcggga tccaagcgcc tcgtttctga acttcactat 240 tgaccttggt gcgtatcgct accatcgtgc acaccatcgt cttgtccgcc tcgttgctga 300 agacctactc aaccttcctg tggcttgcta tacggacttg ctcaacaacc gaaaagattg 360 tccggacgcg acgattcgtc tcttttcaac tcgagggaac gtgcttggag ctcttggagg 420 ccggattgct caagacttaa taaagaagta cggaccgttc ctgccatatg tgattcagag 480 gagctttcgg tggggacaag gaaagccctt gaaggaaaga cggacaatgt ctgggttgct 540 aatcgggcca aactcagtaa tcaaagagat ccgagatcgc gttgaggagc ttgagaaaga 600 ggaagactat gcgaaagcga tgcagattgc ggacgaaatc attgcggcaa tgcaagatgg 660 ctcgtacaga ggcatcccgt attcagagat cagtttgatg caagtcgcga tccgtgaagg 720 ctttacgaca gaggagatgc aactggaaac ggacttctca tttctcagca gtgtggaaag 780 gcggcagacg ctagaataca acgggcagct ttcaatcagg caaatggcac tagaaaaggg 840 acttataggg cttaacaatc tagtgacgcc gatggagaag cggcgtggag tgctacgtag 900 agcgggcatg atcacgctcg tggacggcct gcttgagcgg gcgatgaagg gcggtgtgca 960 ggtacaatat gggaagaagg tcgtgagaat tacgcgcacc ggaaatgaga agaggcctat 1020 aagactcaag ttcgaggacg gcgggatggt agaagtgaag aacgtgattc tcaacattgg 1080 caagccgggg ctgattgctc ttgggctgga ctcggagccg atgatgagca ccaaggagcc 1140 tttccggcga gcggtcgagc gaaactttgt gctgagctta tccaagacgt attgtttctg 1200 ggaagacgcg tggtggttga caaagttggg gcaacgggat gggcgtattc aggttccttc 1260 agattcgatg cagtcaatgc gataccacga tggacacgtc gtgtgcaagg acgagagaag 1320 gcttaaaagt tgccgtggcg gattgctcgc gtcgtactcg gggggcgatc agatggggct 1380 tggggctgct ttgcatgcgc acgtgcataa tgctaaaccg tacacaccgc tgacaagcag 1440 tgacaacgta gtgaaattga ttccagggaa gatgtctgga gtagagcaag tatactttga 1500 tgacctgcac gcacaaatca agcgtgtgca caagaggtcg gtggagcgga aggggcttga 1560 cgtggacaag gtgatttcca agccggctat gtgcctattt gcggattggc gggaggtggg 1620 tactcatgcg gccatggggc cgggaaaagg aagaacgaat gtgtacgagt tgtacgctaa 1680 accggttagt gatttgagaa tcgcactggt aaacgaagcg tggagtgggg accaagggtg 1740 ggcggagggg agcttgagaa gcgcagagcg ggcgctgttc caccaattcg gaatggagaa 1800 gccagagtgg atggataagg agtatcaccg gtcggtgatt gagaggtaca accaggggtg 1860 atttcggcgc gggcatacag tatgcgtgtc gttcgtgaag ttgtagcaaa gggctaatcc 1920 ttccacctgt cgtctcggcg caaagaataa aagctcgaag attagtggtg acgttagaag 1980 taggcataca gaaccaaaaa aaaaaaaaaa aaaaaaaaaa                       2020 <210>18 <211>1399 <212>DNA <213>皱波角叉菜 <400>18 aaatttaaag gaattttnaa aaaattttaa agcttaaatt tgccatttgc cattaaggtg 60 ggcaattgtt ggaaagcgat cggttgggcc tttttgtttt tacgcaagct ggaaaagggg 120 attgtgctcc aaggcgatta agttgggtaa cgcaagggtt ttcccagtca gacgttgtaa 180 aacgacggcc agtgaattgt aatacgactc actatagggc gaattgggta ccgggccccc 240 cctcgagttt tttttttttt ttttttttca gaggcgaaag gtgtcgttta ctgaaatctc 300 aagtacggga gcaactccgc ccatctctac tcatcgttca ctacaagttg cagacactat 360 ttcacgctca tcacgaggta agggaaacgg tactcgatac ctttactcac tcctcttaga 420 cagtgaactc gagctcaaga acctgcctgc cgtccacgtt cgagcggccc aacctgcgtt 480 caaccctgac tccgttgatc acaatgttga ctacccacct tgtgcggtta ttgaagcagt 540 tgttgaaatg gaacagcttg acagtgtact tccctggaac catgttcgtg aacgacacag 600 cttccttgcc ggccggcaag ttgccgcact ggtacaccaa gttgtcattg atacgtcctc 660 cctgggagcc cggcggccca tcaacggaaa ggtcgaaatc atcggacgaa tcccacgcca 720 cgtccaccac gatcggccgc acaaccgtct ggaatgagac gcagtccctg gcgtcggacg 780 tcgcgatcgt gcggaacacg gacccatcgg tgttctgaat gttgtagttg cggatcggaa 840 gacggatgca gaggtcgtcg aggaagtcct cctggttacc cacagggcta cggcgggaga 900 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tttttttttt tttggagatg aaaggtgtcg tttactgata ccaagtacgg cgcaactccg 300 cccatctcta ctcatcgtca ctacaggttg caaacactat tccacgacca tgacgattta 360 agggaacgct acttgggacc ttccactcat tcctcttaga cggtgaactc gagctcgaga 420 accctcctgc cgtccacatt cgaccgcccc aacctgcgtt gaattcttac cccgttgacc 480 acaacgttca ccacccactt cgtacgctta ttgaagcagt tgttgaagtg gaacagcgtg 540 accgtgtact tccctcgaac catgttttcg aaggacacag cttccttgcc ggccggagag 600 tcgccgcacg cggccaccaa gttgtcattg atacggcctc ctacagatcc agggggacca 660 acaacggaaa ggtcgaagtc atcggacgaa tcccacgcca cgtccaccac gatcggccgc 720 acaaccgtcc ggaatgaaag gcagtccctg gcgtccgacg tcgagatcgt ccggaacaca 780 gtcccatccg tgttctgaat gttgtagttg cggatcggaa gacggatgca gaggtcgtcg 840 aggaactcct cctggttacc catggcgcca cgacgagcga cgcccttgcg gtcgcgctgg 900 aatgtcagag gcgtcagacg gaagtagttt ctcgggaacg cgggtctcag tccattaggc 960 cggtacctgt tgatcggcgt ggtgcctgag cccgattcaa tgagcgccgc gccagtggtg 1020 cgaacgttgc cgagcgttct cccgccgggg aagttacggc agatgaatgc tgagcgggag 1080 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     35                  40                  45 Ile Phe Glu Ala Asn Arg Arg Pro Gly Gly Arg Ile Leu Thr Val Arg  50                  55                  60 Asp Pro Ser Ala Ser Phe Leu Asn Phe Thr Ile Asp Leu Gly Ala Tyr  65                  70                  75                  80 Arg Tyr His Arg Ala His His Arg Leu Val Arg Leu Val Ala Glu Asp              85                  90                  95 Leu Leu Asn Leu Pro Val Ala Cys Tyr Thr Asp Leu Leu Asn Asn Arg         100                 105                 110 Lys Asp Cys Pro Asp Ala Thr Ile Arg Leu Phe Ser Thr Arg Gly Asn     115                 120                 125 Val Leu Gly Ala Leu Gly Gly Arg Ile Ala Gln Asp Leu Ile Lys Lys 130                 135                 140 Tyr Gly Pro Phe Leu Pro Tyr Val Ile Gln Arg Ser Phe Arg Trp Gly 145                 150                 155                 160 Gln Gly Lys Pro Leu Lys Glu Arg Arg Thr Met Ser Gly Leu Leu Ile             165                 170                 175 Gly Pro Asn Ser Val Ile Lys Glu Ile Arg Asp Arg Val Glu Glu Leu         180                 185                 190 Glu Lys Glu Glu Asp Tyr Ala Lys Ala Met Gln Ile Ala Asp Glu Ile     195                 200                 205 Ile Ala Ala Met Gln Asp Gly Ser Tyr Arg Gly Ile Pro Tyr Ser Glu 210                 215                 220 Ile Ser Leu Met Gln Val Ala Ile Arg Glu Gly Phe Thr Thr Glu Glu 225                 230                 235                 240 Met Gln Leu Glu Thr Asp Phe Ser Phe Leu Sar Ser Val Glu Arg Arg             245                 250                 255 Gln Thr Leu Glu Tyr Asn Gly Gln Leu Ser Ile Arg Gln Met Ala Leu         260                 265                 270 Glu Lys Gly Leu Ile Gly Leu Asn Asn Leu Val Thr Pro Met Glu Lys     275                 280                 285 Arg Arg Gly Val Leu Arg Arg Ala Gly Met Ile Thr Leu Val Asp Gly 290                 295                 300 Leu Leu Glu Arg Ala Met Lys Gly Gly Val Gln Val Gln Tyr Gly Lys 305                 310                 315                 320 Lys Val Val Arg Ile Thr Arg Thr Gly Asn Glu Lys Arg Pro Ile Arg             325                 330                 335 Leu Lys Phe Glu Asp Gly Gly Met Val Glu Val Lys Asn Val Ile Leu         340                 345                 350 Asn Ile Gly Lys Pro Gly Leu Ile Ala Leu Gly Leu Asp Ser Glu Pro     355                 360                 365 Met Met Ser Thr Lys Glu Pro Phe Arg Arg Ala Val Glu Arg Asn Phe 370                 375                 380 Val Leu Ser Leu Ser Lys Thr Tyr Cys Phe Trp Glu Asp Ala Trp Trp 385                 390                 395                 400 Leu Thr Lys Leu Gly Gln Arg Asp Gly Arg Ile Gln Val Pro Ser Asp             405                 410                 415 Ser Met Gln Ser Met Arg Tyr His Asp Gly His Val Val Cys Lys Asp         420                 425                 430 Glu Arg Arg Leu Lys Ser Cys Arg Gly Gly Leu Leu Ala Ser Tyr Ser     435                 440                 445 Gly Gly Asp Gln Met Gly Leu Gly Ala Ala Leu His Ala His Val His 450                 455                 460 Asn Ala Lys Pro Tyr Thr Pro Leu Thr Ser Ser Asp Asn Val Val Lys 465                 470                 475                 480 Leu Ile Pro Gly Lys Met Ser Gly Val Glu Gln Val Tyr Phe Asp Asp             485                 490                 495 Leu His Ala Gln Ile Lys Arg Val His Lys Arg Ser Val Glu Arg Lys         500                 505                 510 Gly Leu Asp Val Asp Lys Val Ile Ser Lys Pro Ala Met Cys Leu Phe     515                 520                 525 Ala Asp Trp Arg Glu Val Gly Thr His Ala Ala Met Gly Pro Gly Lys 530                 535                 540 Gly Arg Thr Asn Val Tyr Glu Leu Tyr Ala Lys Pro Val Ser Asp Leu 545                 550                 555                 560 Arg Ile Ala Leu Val Asn Glu Ala Trp Ser Gly Asp Gln Gly Trp Ala             565                 570                 575 Glu Gly Ser Leu Arg Ser Ala Glu Arg Ala Leu Phe His Gln Phe Gly         580                 585                 590 Met Glu Lys Pro Glu Trp Met Asp Lys Glu Tyr His Arg Ser Val Ile     595                 600                 605 Glu Arg Tyr Asn Gln Gly 610 <210>23 <211>278 <212>PRT <213>皱波角叉菜 <400>23 Met Asn Ala Ser Phe Leu Phe Val Leu Asn Leu Ala Ala Ile Ala Phe   1               5                  10                  15 Thr Ala Asn Ala Gln Cys Gly Arg Ser Cys Arg Phe Arg Phe Cys Arg          20                  25                  30 Ala Asp Gly Ser Met Arg Pro Lys Gly Ala Lys Ile Leu Leu Arg Gly      35                  40                  45 Pro Asp Tyr Ser Arg Ser Ala Phe Ile Cys Arg Asn Phe Pro Gly Gly  50                  55                  60 Arg Thr Leu Gly Asn Val Arg Thr Thr Gly Ala Ala Leu Ile Glu Ser  65                  70                  75                  80 Gly Ser Gly Thr Thr Pro Ile Asn Arg Tyr Arg Pro Asn Gly Leu Arg              85                  90                  95 Pro Ala Phe Pro Arg Asn Phe Phe Arg Leu Thr Pro Leu Thr Phe Gln         100                 105                 110 Arg Asp Arg Lys Gly Val Ala Arg Arg Gly Ala Asn Gly Asn Gln Glu     115                 120                 125 Glu Phe Leu Asp Asp Leu Cys Ile Arg Leu Pro Ile Arg Asn Tyr Asn 130                 135                 140 Ile Gln Asn Lys Asp Gly Ser Val Phe Arg Thr Ile Ser Thr Ser Asp 145                 150                 155                 160 Ala Arg Asp Cys Leu Ser Phe Arg Thr Val Val Arg Pro Ile Val Val             165                 170                 175 Asp Val Ala Trp Asp Ser Ser Asp Asp Phe Asp Leu Ser Val Val Gly         180                 185                 190 Pro Pro Gly Ser Val Gly Gly Arg Ile Asn Asp Asn Leu Val Ala Ala     195                 200                 205 Cys Gly Asp Ser Pro Ala Gly Lys Glu Ala Val Ser Phe Glu Asn Met 210                 215                 220 Val Arg Gly Lys Tyr Thr Val Thr Leu Phe His Phe Asn Asn Cys Phe 225                 230                 235                 240 Asn Lys Arg Thr Lys Trp Val Val Asn Val Val Val Asn Gly Val Arg             245                 250                 255 Ile Gln Arg Arg Leu Gly Arg Ser Asn Val Asp Gly Arg Arg Val Leu         260                 265                 270 Glu Leu Glu Phe Thr Val     275 展开

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