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FVIIa或组织因子拮抗剂在调节基因表达和细胞迁移或趋化中的应用

基本信息

  • 申请号 CN00810228.7 
  • 公开号 CN100411684C 
  • 申请日 2000/07/14 
  • 公开日 2008/08/20 
  • 申请人 诺沃挪第克健康护理股份公司  
  • 优先权日期  
  • 发明人 米里拉·伊兹班 拉斯·C·彼得森 阿格尼塔·西格巴恩  
  • 主分类号 A61K38/36 
  • 申请人地址 瑞士苏黎世 
  • 分类号 A61K38/36;A61P43/00 
  • 专利代理机构 北京市柳沈律师事务所 
  • 当前专利状态 发明专利权部分无效宣告的公告 
  • 代理人 巫肖南 
  • 有效性 授权 
  • 法律状态 失效
  •  

摘要

本发明涉及FVII和/或FVIIa和/或另一种TF激动剂和/或FVIIai和/或另一种TF拮抗剂在与细胞迁移有关的或可通过细胞迁移或趋化的特异性调节而治疗的病理学症状的治疗中的应用。
本发明还涉及FVII和/或FVIIa和/或另一种TF激动剂和/或FVIIai和/或另一种TF拮抗剂在与至少一种基因,例如,Cyr61基因在细胞中的表达调节有关的病理学症状的治疗中的应用。
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权利要求书


1. FVIIa在制备用于诱导或增强细胞迁移的药物中的用途。
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说明书

发明领域凝血因子VII(FVII)或诸如表达组织因子(TF)的细胞中失活的凝血因子VIIa(FVIIai)等组织因子拮抗剂的新型细胞调节活性已有描述。
本发明涉及经过将细胞与FVIIa或另一TF激动剂,或FVIIai或另一TF拮抗剂接触并测定所述细胞的迁移来调节细胞迁移或趋化的方法。
本发明还涉及FVIIa或另一TF激动剂,或FVIIai或另一TF拮抗剂在制备调节患者细胞迁移的药物中的应用。
而且本发明涉及治疗方法和检测化合物,特别是与细胞迁移相互作用的药物候选物的活性的方法。
发明背景当血浆中循环的FVIIa与整合膜蛋白,组织因子(TF)结合时启动凝血的外源途径。
TF在凝血中的作用已被广泛研究。
据信FVIIa作为蛋白裂解酶参与凝血级联反应时局限于TF表达细胞的胞外小叶。
当TF的序列表现出与细胞因子/干扰素-或造血受体超家族具有同源性时首先暗示了FVIIa的胞内活性。
造血受体家族的亚类I包括生长激素,促乳素,白细胞介素1至7,粒细胞-巨噬细胞集落刺激因子,促红细胞生成素和血小板生成素的受体。
亚类II包括TF和针对干扰素a和b的受体。
表观晶体结构进一步证实了TF与这类受体的相似性。
包括干扰素b和g和IL-10的受体的这类细胞因子受体的特征在于其激活导致受体自身以及胞内蛋白亚型的迅速酪氨酸磷酸化。
在开始酪氨酸磷酸化后几分钟内,激活一批促分裂原激活的(Ser/Thr)激酶(MAPK)。
这些激酶被分配至几组平行的信号传递途径。
通过对FVIIa的推断的胞内信号传递能力的研究表明,在组成型表达TF的人膀胱癌细胞系J82中和在用白细胞介素-1预处理而表达TF的脐静脉内皮细胞中诱导胞内游离钙(Ca2+)的流动,但不能表现出胞内酪氨酸激酶的任何细胞因子样激活。
因此,相信FVIIa以TF依赖的方式通过激活磷脂酶C而诱导胞内Ca2+的流动。
FVIIa激活磷脂酶C的机制尚不清楚,但已特别排除了酪氨酸激酶激活的可能性。
多个实验室最近的报道表明TF可能影响除凝血外的一批重要的生物学功能,例如血管发生,胚胎血管形成和肿瘤转移。
然而,目前还不清楚TF是如何负责这些生物学过程的。
TF的胞外结构域由两个纤连蛋白III型样组件组成,与典型的II类细胞因子受体胞外结构域相似,从而产生这样的可能性,即TF可能在信号传递这种细胞因子受体的主要功能中起作用。
然而,TF具有极短胞质结构域(仅21个氨基酸残基长)且缺乏介导与细胞因子受体信号传递必需的非受体Janus激酶(Jaks)结合的膜近侧基序。
然而,一些生化发现表明TF具有信号传递功能。
人TF蛋白序列分析揭示在胞质结构域中推断的磷酸化位点,它在小鼠,大鼠和兔TF中保守。
用蛋白激酶C激活剂刺激后TF胞质尾部的特异性丝氨酸残基在细胞中被磷酸化。
用U87-MG细胞的溶胞产物温育时人TF的胞质尾部在多个位点被体外磷酸化。
在显示TF的转移前(prometastatic)功能主要依赖于TF胞质结构域的研究中也显示了信号传递中TF胞质结构域的潜在作用。
而且,TF胞质结构域显示出与肌动蛋白结合蛋白280(ABP-280)相互作用且通过募集ABP-280进行TF介导的粘附接触而支持细胞粘附和迁移。
然而,TF也显示出通过在胞外信号传递中作为其生理学配体FVIIa的辅因子以蛋白裂解机制参与某些类型的细胞信号传递。
例如,FVIIa与细胞表面TF的结合显示能诱导多种TF表达细胞中的胞内Ca2+振动(oscillation),单核细胞中的酪氨酸瞬时磷酸化,MAP激酶的激活,成纤维细胞中基因表达的改变和肿瘤细胞中尿激酶受体的增强表达。
催化失活的FVIIa(FVIIai)不能诱导从Ca2+振动到MAP激酶激活和基因下降的多种上述信号传递反应,且FVIIa的催化活性似乎至少需要一些TF-FVIIa介导的信号传递。
目前,对于由蛋白裂解活性FVIIa诱导的信号传递途径和FVIIa产生的信号如何导致血管发生和肿瘤转移所知不多。
为了研究FVIIa诱导反应中的转录时间程序,在本研究中,我们使用cDNA微列阵(microarray)检查了人成纤维细胞对FVIIa的反应。
这些数据揭示与FVIIa接触时在成纤维细胞中一些基因的细胞表达可检测到改变。
一个这类基因是Cyr61,它是一种生长因子可诱导型即早期基因,其产物在成纤维细胞和内皮细胞中显示能促进细胞粘附,增强生长因子诱导的DNA合成并刺激细胞迁移。
发明简述本发明涉及FVII和/或FVIIa和/或另一TF激动剂和/或FVIIai和/或另一TF拮抗剂在与细胞迁移有关的或可用细胞迁移或趋化的特异性调节治疗的病理学症状的治疗中的应用。
本发明的另一方面涉及FVII和/或FVIIa和/或另一TF激动剂和/或FVIIai和/或另一TF拮抗剂在与至少一种基因,例如,Cyr61基因在细胞中的表达调节有关的病理学症状的治疗中的应用。
本发明的另一方面涉及诱导或增强细胞迁移的方法,包括将所述细胞与组织因子激动剂接触的步骤。
在一个实施方案中,组织因子激动剂是FVII或FVIIa。
本发明的另一方面涉及降低或抑制细胞迁移的方法,包括将细胞与组织因子拮抗剂接触的步骤。
在一个实施方案中,组织因子拮抗剂是修饰的FVII。
在一个实施方案中,细胞是表达组织因子的人类细胞,包括成纤维细胞,平滑肌细胞,肿瘤细胞,造血细胞和上皮细胞。
在一个实施方案中,修饰的因子VII选自用丹酰-Phe-Pro-Arg氯甲基酮,丹酰-Glu-Gly-Arg氯甲基酮,丹酰-Phe-Phe-Arg氯甲基酮,Phe-Phe-Arg氯甲基酮,丹酰-D-Phe-Pro-Arg氯甲基酮,丹酰-D-Glu-Gly-Arg氯甲基酮,丹酰-D-Phe-Phe-Arg氯甲基酮和D-Phe-Phe-Arg氯甲基酮修饰的因子VII。
本发明的另一方面涉及诱导或增强患者伤口愈合的方法,包括给所述患者施用有效量的含有因子VIIa或因子VII或另一组织因子激动剂或其组合的药用组合物。
本发明的另一方面涉及在具有与不希望的细胞迁移,侵入,迁移诱导的细胞增生或血管发生相关的疾病或症状的患者中抑制或降低细胞迁移,侵入,迁移诱导的细胞增生或血管发生的方法,包括给所述患者施用有效量的含有组织因子拮抗剂的药用组合物。
在一个实施方案中,所述疾病或症状是原发性肿瘤生长,肿瘤侵入或转移。
本发明的另一方面涉及组织因子激动剂在用于诱导或增强细胞迁移的药物的生产中的应用。
本发明的另一方面涉及组织因子拮抗剂在用于降低或抑制细胞迁移的药物的生产中的应用。
本发明的另一方面涉及调节细胞中至少一种基因表达的方法,包括将所述细胞与组织因子激动剂接触或将所述细胞与组织因子拮抗剂接触的步骤。
在一个实施方案中,该基因是属于CCN基因家族的基因。
在另一实施方案中,该基因选自Cyr61,CTFG,多巴胺D2受体,ESTIncyte PD 395 116或P2U核苷酸受体。
在一个实施方案中,该基因是Cyr61基因。
在一个实施方案中,调节是诱导或增强表达。
在另一实施方案中,调节是降低或抑制表达。
在一个实施方案中,FVII或FVIIa或另一组织因子激动剂诱导或增强基因表达,而修饰的FVII或另一组织因子拮抗剂降低或抑制基因表达,例如,当该基因是属于CCN基因家族的基因,或该基因选自Cyr61,CTFG,多巴胺D2受体,EST Incyte PD 395116或P2U核苷酸受体时。
在另一实施方案中,FVII或FVIIa或另一组织因子激动剂降低或抑制基因表达,而修饰的FVII或另一组织因子拮抗剂诱导或增强基因表达,例如,当该基因是ESTPD674714时。
可治疗的疾病症状是诸如动脉粥样硬化,肿瘤沉积,肿瘤生长,肿瘤侵入,转移或血管发生等病理学症状。
可治疗的其它症状是例如,包括血管壁再生和烧伤治疗的伤口愈合,或炎症,或细胞迁移的体外调节,例如,组织生长。
附图描述(fra 6011)图1A和1B:成纤维细胞中TF表达的流式细胞术分析(1A)。
以用作阴性对照的鼠单克隆异硫氰酸荧光素(FITC)-偶联的的小鼠抗IgG-抗体(空白区)或单克隆FITC-偶联的的抗组织因子(TF)抗体(填充区)染色细胞。
图1B显示了成纤维细胞的前凝血活性。
与不表达TF的单核细胞相比,表达TF的成纤维细胞的PCA增强10倍。
图2A:FVIIa和FFR-FVIIa对PDGF-BB诱导的人成纤维细胞趋化的影响。
■显示了成纤维细胞对不同浓度的PDGF-BB的趋化应答。
与100nMFVIIa(●)或100nM FFR-FVIIa(○)一起保温的成纤维细胞向不同浓度的PDGF-BB迁移。
结果为3个不同实验的平均值和SEM。
P值小于0.05,*被认为统计学上显著(Student’s t检验)。
图3A-D:不同浓度的FVIIa或FFR-FVIIa对成纤维细胞中PDGF-BB诱导的趋化的影响。
■显示了成纤维细胞对不同浓度的PDGF-BB的迁移。
细胞与12.5(A),25(B),50(C)和100(D)nM FVIIa(●)或FFR-FVIIa(○)一起保温细胞并在Boyden室中对不同浓度的PDGF-BB进行测定。
结果为3个不同实验的平均值和SEM。
*=P<0.05,**=P<0.01且***=P<0.001Student’s t检验。
图4A:TF的3种单克隆抗体的混合物阻断FVIIa和FFR-FVIIa对成纤维细胞中PDGF-BB诱导的趋化的影响。
■显示无TF抗体时成纤维细胞对PDGF-BB的迁移。
●为用TF抗体和100nM FVIIa预保温的成纤维细胞,○为用TF抗体和100nM FFR-FVIIa预保温的成纤维细胞。
结果为3个不同实验的平均值和SEM。
图5A和5B:FXa对FVIIa诱导的针对PDGF-BB的趋化应答的影响。
用200nM TAP(图5A)(■)或用0.2-2μM TAP(图5B)(■)并随后用100nMFVIIa(●)预保温成纤维细胞。
TAP在整个实验期间均存在。
以不同浓度的PDGF-BB(5A)或以0.1ng/mlPDGF-BB(5B)诱导趋化。
结果为2个不同实验的平均值和SD。
图6A:凝血酶对FVIIa诱导的针对PDGF-BB的趋化应答的影响。
用5U/ml(终浓度)水蛭素并随后用100nM FVIIa预保温成纤维细胞。
水蛭素在整个实验期间均存在。
以不同浓度的PDGF-BB诱导趋化。
■表示仅与水蛭素保温的细胞,●表示与水蛭素和FVIIa保温的细胞。
结果为2个不同实验的平均值和SD。
图7A:PI3’-激酶对用FVIIa培养的成纤维细胞中趋化的抑制效应。
用不同浓度的LY294002在37℃下预培养细胞30分钟,然后在有100nM FVIIa(●)或没有FVIIa(■)的条件下预培养细胞。
抑制剂在整个趋化试验期间均存在。
以0.1ng/ml PDGF-BB诱导趋化。
结果为2个不同实验的平均值和SD。
图8 A和8B:PLC对用FVIIa培养的成纤维细胞中趋化的抑制效应。
用不同浓度的U73122(活性PLC抑制剂)(8A)或U73343(无活性对照)(8B)在37℃下预培养细胞30分钟,然后在有或无100nM FVIIa的条件下预培养细胞,并随后在Boyden室中对0.1ng/ml PDGF-BB的浓度梯度进行测定。
试剂在整个实验期间均存在。
■表示仅用U73122或U73343培养的细胞,●表示用U73122或U73343以及FVIIa培养的细胞。
结果为2个不同实验的平均值和SD。
图9:单独用FVIIa,FFR-FVIIa或与PDGF-BB联合刺激的成纤维细胞中肌醇三磷酸(IP3)的释放。
用myo[3H]肌醇标记细胞过夜,在不含或含有10ng/ml或100ng/ml PDGF-BB的条件下用或不用100nM FVIIa或FFR-FVIIa培养。
然后分析细胞中IP3的释放。
空心柱表示未用FVIIa或FFR-FVIIa培养的细胞(对照),影线柱表示用FFR-FVIIa培养的细胞,黑心柱表示用FVIIa培养的细胞。
图10:PLC-γ1在应答单独的PDGF-BB(对照),FVIIa或FFR-FVIIa与PDGF-BB的组合时的酪氨酸磷酸化。
用100nM FVIIa或FFR-FVIIa培养细胞1小时,然后在有或没有所示浓度的PDGF-BB条件下培养。
裂解细胞并按方法中所述检测PLC-γ1的酪氨酸磷酸化。
图1,Northern印迹分析证实用cDNA微列阵试验获得的数据。
对10g总RNA(与用于分离产生cDNA微列阵杂交探针的poly(A)RNA来自相同的RNA样品)进行Northern印迹分析并用32P-标记的Cyr61(部分长度的cDNA,从Genomic Systems获得)进行探测。
B组,用PhosphorImager(Molecular Dynamics)定量杂交信号。
图2和2B,因子VIIa诱导的时间依赖型Cyr61表达。
用因子VIIa(5g/ml)(2A)或PDGF-BB(10ng/ml)(2B)对WI-38细胞的休眠单层处理不同时间。
对总RNA(10g)进行Northern印迹分析并用放射性标记的Cyr61探测。
28S核糖体RNA相应印迹的溴化乙锭染色示于图中下半部分,作为RNA上样物对照。
图3,因子VIIa诱导的剂量依赖型Cyr61表达。
用不同剂量的因子VIIa,0,0.1,0.5,2.0和5.0g/ml处理WI-38细胞的休眠单层45分钟。
对总RNA(10g)进行Northern印迹分析并用放射性标记的Cyr61探测。
28S核糖体RNA相应印迹的溴化乙锭染色示于图中下半部分,作为RNA上样物对照。
图4,因子VIIa的催化活性是诱导Cyr61表达所必需的。
用对照无血清培养基或含因子VIIa(5g/ml)或活性位点失活的因子VIIa(VIIai,5g/ml)的无血清培养基处理WI-38细胞的休眠单层45分钟。
对总RNA(10g)进行Northern印迹分析并用放射性标记的Cyr61探测。
28S核糖体RNA相应印迹的溴化乙锭染色示于图中下半部分,作为RNA上样物对照。
图5,因子VIIa诱导的Cyr61表达不能被因子Xa和凝血酶的特异性抑制剂所取消。
用对照培养基或含因子VIIa(5g/ml;100nM)的培养基处理WI-38细胞的休眠单层45分钟。
细胞用200nM重组TAP(泳道3)或水蛭素(泳道4)预培养30分钟再与因子VIIa接触45分钟。
对总RNA(10g)进行Northern印迹分析并用放射性标记的Cyr61探测。
28S核糖体RNA相应印迹的溴化乙锭染色示于图中下半部分,作为RNA上样物对照。
图6,放线菌素-D和环己酰亚胺对因子VIIa诱导的Cyr61 mRNA稳态水平的影响。
在WI-38细胞的休眠单层与因子VIIa(5g/ml)接触45分钟前用对照载体,放线菌素-D(10g/ml)或环己酰亚胺(10g/ml)预培养细胞30分钟。
对总RNA(10g)进行Northern印迹分析并用放射性标记的Cyr61探测。
28S核糖体RNA相应印迹的溴化乙锭染色示于图中下半部分,作为RNA上样物对照。
图7,因子VIIa诱导CTGF的表达。
用因子VIIa(5g/ml)将WI-38细胞的休眠单层处理不同时间。
对总RNA(10g)进行Northern印迹分析并用放射性标记的CTGF探测。
28S核糖体RNA相应印迹的溴化乙锭染色示于图中下半部分,作为RNA上样物对照。
发明详述本发明涉及FVII或FVIIa或另一TF激动剂在制备用于诱导或增强细胞迁移的药用组合物中的应用。
本发明的另一方面涉及FVII,FVIIa或另一TF激动剂在制备用于诱导或增强伤口愈合或血管发生的药用组合物中的应用。
本发明还有一个方面涉及FVIIai或另一TF拮抗剂在制备用于抑制或防止细胞迁移的药用组合物中的应用。
在一个实施方案中,细胞迁移存在于受试者中。
本发明另一方面涉及FVIIai或另一TF拮抗剂在制备用于抑制或防止血管发生,转移,肿瘤生长或肿瘤侵入的药用组合物中的应用。
本发明的另一方面涉及诱导或增强患者中细胞迁移的方法,包括给所述患者施用有效量的FVII或FVIIa或另一TF激动剂。
本发明还有一个方面涉及抑制或防止患者中细胞迁移的方法,包括给所述患者施用有效量的FVIIai或另一TF拮抗剂。
在一个具体实施方案中,有效量是从约5μg/kg/天到约500μg/kg/天的日剂量。
在另一实施方案中,TF拮抗剂包括修饰的FVIIa,例如,FFR-FVIIa。
本发明提供了FVII和/或FVIIa涉及刺激细胞迁移的活性的机制。
该机制为建立FVII和/或FVIIa对有诸如内皮细胞,上皮细胞,成纤维细胞,平滑肌细胞和单核细胞/巨噬细胞等TF表达细胞参与的病理学症状的介入提供了基础。
本发明还提供了鉴定用于治疗性干扰的特异性药物学靶的基础。
因此,本发明涉及FVII和/或FVIIa和/或FVIIai在治疗涉及细胞迁移或可经过特异性调节细胞迁移来治疗的病理学症状中的应用。
在另一方面,本发明涉及检测调节细胞迁移的药物候选物的方法,该方法包括:a)培养TF表达细胞;b)测量细胞的迁移;c)用药物候选物培养细胞,和d)测量所培养的细胞的迁移并测定迁移水平与步骤b测量的迁移相比的任何变化,该变化是药物候选物在所述细胞中有生物学活性的指标。
一般来说,参与所谓凝血级联反应的血液组分是前酶或酶原,酶促失活的蛋白质,经过本身是一种已激活的凝血因子的激活剂的作用它们可转变为蛋白裂解酶。
进行了该转变的凝血因子一般称为“活性因子”,且经过在该凝血因子名称后加上字母“a”来命名(例如,因子VIIa)。
术语“锌-螯合剂”意指包括与因子VIIa结合且诱导在因子VFIIa内用锌离子取代钙离子,从而抑制因子VIIa或组织因子-因子VIIa复合物(TF-FVIIa)的活性的化合物。
根据本发明合适的TF拮抗剂可以是锌螯合化合物,例如,二异羟肟酸盐或二酰肼,其中的异羟肟酸基或酰肼基彼此间的位置使得能螯合锌离子。
锌螯合化合物与FVIIa联合发挥作用。
Zn2+离子发挥其抑制作用与Ca2+离子的刺激效应竞争。
预期Zn2+离子从FVIIa内的一个或多个钙结合位点取代Ca2+离子。
锌螯合化合物,例如异羟肟酸盐和酰肼都能作为锌离子结合的有力支持而与钙离子竞争。
因此特异性化合物可加强对因子VIIa/组织因子复合物的锌抑制活性。
与组织因子复合的因子VIIa的活性可受这样的机制抑制,即其中锌螯合剂与因子VIIa结合,促进用Zn2+取代Ca2+
通过这种作用螯合剂在血液中正常浓度的游离Zn2+和Ca2+离子下对TF发挥调节效应。
术语“FVII”或“因子VII”指“单链”(酶原性)凝血因子VII。
术语“因子VIIa”,或“FVIIa”指在Arg152-Ile153肽键处被特异性裂解的“双链”激活的凝血因子VII。
FVII和FVIIa可从血液中纯化或以重组方法生产。
很明显实现本文所述方法不依赖于纯化的因子VIIa来源如何,因此,本发明预期覆盖适用于本文的任何因子VII或FVIIa制品的应用。
优选人FVIIa。
FVII或FVIIa也试图包括一个或多个氨基酸残基已被取代的FVII变异体。
术语“修饰的因子VII”,“失活的FVII”或“FVIIai”意指在其催化中心至少有一个修饰的FVIIa,该修饰基本上抑制了修饰的FVIIa激活FX和FIX的能力。
这些术语可互换使用。
该修饰包括催化三联体残基Ser344,Asp142和His193的一个或多个氨基酸替换(或取代),也包括用诸如有机磷化合物,磺胺酰氟(sulfanylfluoride),肽卤甲基酮或氮杂肽(azapeptide)等丝氨酸蛋白酶抑制剂修饰催化三联体残基。
FFR-FVIIa是用不可逆抑制剂,D-苯丙氨酸-L-苯丙氨酸-L-精氨酸氯甲基酮(FFR cmk)封闭FVIIa的活性中心获得的FVIIai衍生物的一个例子。
其它合适的FVIIai衍生物是用L-苯丙氨酸-L-苯丙氨酸-L-精氨酸氯甲基酮,丹酰-L-苯丙氨酸-L-苯丙氨酸-L-精氨酸氯甲基酮,或丹酰D-苯丙氨酸-L-苯丙氨酸-L-精氨酸氯甲基酮封闭活性中心获得或可获得的失活FVIIa,优选FFR-FVIIa(被FFRcmk灭活的FVIIa)。
术语“蛋白激酶”意指能使肽和/或蛋白质中的丝氨酸和/或苏氨酸和/或酪氨酸磷酸化的酶。
术语“药物候选物”意指在细胞系统中具有生物学功能或发挥生物学效应的任何样品。
该样品可以是诸如微生物或植物提取物等生物材料样品,或者可以是含有化合物或经有机合成或遗传技术制备的化合物的混合物的样品。
术语“TF激动剂”包括能诱导下述反应的化合物a)经过直接结合TF而进行信号传递(例如,FVIIa),b)刺激MAPK级联反应,c)取消MAPK抑制(例如,PTPase抑制剂),该激动剂是上文定义的药物候选物。
术语“TF拮抗剂”包括a)与FVIIa竞争结合TF而不传递的试剂,例如,FVIIai,b)与FVIIa结合且阻止与TF结合的试剂,例如,Zn异羟肟酸盐,c)通过干扰MAPK级联反应的成员而抑制信号传递的试剂,d)与FVIIa/TF结合且阻止传递的试剂,e)与FVIIa/TF/FX结合且阻止传递的试剂,f)抑制人组织因子/因子VIIa复合物催化的人因子X活化的试剂,该拮抗剂是上文定义的药物候选物。
术语“药物学靶”意指可改变TF表达细胞的迁移的蛋白质。
术语“报道基因”意指一种DNA构建体,其转录时产生可检测的蛋白质。
术语“SRE启动子元件”指结合血清中存在的组分所诱导的转录因子的DNA序列。
术语“TF表达细胞”指表达TF的任意哺乳动物细胞。
术语“蛋白质磷酸化”意指肽和/或蛋白质中丝氨酸和/或苏氨酸和/或酪氨酸的磷酸化。
细胞迁移的调节或调控定义为FVIIa或另一TF激动剂,或FVIIai或另一TF拮抗剂,1)增强或降低正在进行的,正常或异常的细胞迁移,2)启动正常细胞迁移,和3)启动异常细胞迁移的能力。
基因表达的调节或调控定义为FVIIa或另一TF激动剂,或FVIIai或另一TF拮抗剂,1)增强或降低正在进行的,正常或异常的细胞迁移,2)启动正常细胞迁移,和3)启动异常细胞迁移的能力。
在本文中,术语“治疗”指包括预防有害症状和调节已经出现的症状以达到抑制或最小化该症状的目的。
因此在术语“治疗”中包括预防性施用FVIIa或另一TF激动剂,或FVIIai或另一TF拮抗剂。
在本文中,术语“一个单位”定义为在1ml正常血浆中存在的因子VII的量,其对应于约0.5μg蛋白质。
激活后,50单位相当于约1μg蛋白质。
在本文中,术语“患者”定义为任何动物,特别是哺乳动物,例如,人类。
术语“受试者”与“患者”可互换使用。
缩写TF          组织因子FVII        因子FVII的单链,无活性形式FVIIa       因子VII的活性形式RFVIIa      重组因子VII的活性形式FVIIai      修饰的(失活的)因子VIIFFR-FVIIai  与D-Phe-L-Phe-L-Arg氯甲基酮反应而被灭活的因子VII组织因子(TF)是因子FVIIa(FVIIa)的细胞受体且该复合物是凝血的主要起动剂。
我们研究了FVIIa与TF结合对大量表达TF的人成纤维细胞的细胞迁移和信号传递的影响。
用FVIIa培养的成纤维细胞在比未与FVIIa接触的成纤维细胞低约100倍的浓度下向PDGF-BB的浓度梯度迁移。
抗TF抗体抑制由FVIIa/TF诱导的趋化的增强。
而且,用活性位点被抑制的FVIIa(FFR-FVIIa)观察到PDGF-BB诱导的趋化的显著抑制。
排除了过度趋化由FXa和凝血酶活性的推断性生成来诱导的可能性。
FVIIa诱导肌醇-1,4,5-三磷酸的产生且与PDGF-BB程度相同;FVIIa和PDGF-BB的效应是相加的。
FFR-FVIIa不能诱导肌醇-1,4,5-三磷酸的任何释放。
应答PDGF-BB和FVIIa的细胞迁移被PLC-抑制剂完全抑制,表明PLC的激活对该应答很重要。
因此,FVIIa与TF的结合可独立于凝血而调节细胞性应答,如趋化,且FVIIa的催化活性是必需的。
据信TF在肿瘤细胞转移中发挥功能,但该机制尚不清楚。
然而,Ott等最近鉴定了作为TF胞质结构域配体的肌动蛋白结合蛋白280(ABP-280),这提供了TF可支持肿瘤细胞转移的分子途径。
然而,对于由FVIIa/TF转导的分子信号和生物学功能仍然所知甚少。
人成纤维细胞能组成型表达TF。
这些细胞也表达血小板衍生的生长因子(PDGF)的受体。
PDGF在其靶细胞中诱导细胞分裂,肌动蛋白重排并介导细胞迁移(趋化)。
我们以前曾指出PDGF-BB是人成纤维细胞的有效趋化因子且趋化应答由β-受体类型介导。
因此,选择这些细胞以研究推断的由FVIIa与TF结合诱导的信号传递和细胞迁移。
下面我们首次指明在由FVIIa与TF结合所诱导的信号传递与对生长因子的细胞应答之间的清楚联系。
我们提供了以下数据:在人成纤维细胞中,FVIIa/TF复合物导致对PDGF-BB的过度趋化应答。
而且,活性位点受抑制的FVIIa(FFR-FVIIa)以剂量依赖的方式抑制向PDGF-BB的定向迁移。
使用PLC和磷脂酰肌醇3’-激酶(PI3’-激酶)的特异性抑制剂,我们也证实了由FVIIa/TF信号传递所诱导的对PDGF-BB的过度趋化应答依赖于磷脂酶C(PLC)活性但不依赖于PI3’-激酶。
FVIIa和PDGF-BB以相加方式诱导肌醇-1,4,5-三磷酸(IP3)的产生,此IP3是PLC激活后释放的一个第二信使。
在许多血管外细胞,例如,血管外膜中和肝,脾及肾的纤维囊中基质成纤维细胞的胞质膜上组成型表达TF。
因此,在与循环血液物理相隔并提供止血外膜的位置发现有TF的表达。
受损伤时认为这一屏障可防止机体流血。
然而,在单核细胞/巨噬细胞,血管平滑肌细胞,内皮细胞中和在许多肿瘤细胞中用包括细胞因子和生长因子的各种试剂可诱导TF。
刺激后在转录水平上迅速出现诱导,因此将TF鉴定为与生长相关的即早期基因。
在该研究中我们考察了TF作为信号传递受体的作用。
我们显示了组成型表达TF的人成纤维细胞通过FVIIa的配体结合向极低浓度的PDGF-BB迁移。
TF/FVIIa单独不能诱导增强的自发迁移,即随机迁移。
因此,FVIIa/TF和生长因子PDGF-BB的细胞内信号传递的组合对于实现移动应答是必需的。
不仅与TF的结合是强制性的,而且TF/FVIIa的催化活性也是强制性的,因为活性位点已被抑制的FVIIa不能激发增强的迁移应答。
而且,抑制型单克隆抗体防止由FVIIa引起的趋化应答的增强。
我们也排除了由FXa或凝血酶引起的间接信号传递,因为TAP和水蛭素对FVIIa/TF诱导的趋化没有影响。
相反我们发现FFR-FVIIa的浓度增加有效地抑制PDGF-BB诱导的趋化。
用FFR-FVIIa培养的成纤维细胞表现出完全正常的随机迁移。
在抗-TF抗体联合存在的条件下观察不到FFR-FVIIa对PDGF-BB诱导的趋化的抑制效应,从而排除了FFR-FVIIa有毒的可能性。
结果表明在表达PDGFβ-受体和TF的细胞中,FVIIa/TF复合物对于针对PDGF-BB的趋化应答很重要。
我们发现的FVIIa增加IP3的产生,以前报道的特别是在MDCK细胞中FVIIa/TF诱导型Ca2+振动的数据有力地支持了在许多细胞中PLC由FVIIa/TF信号传递来激活的观点。
另外,FVIIa/TF诱导的人成纤维细胞对PDGF-BB的过度趋化应答被PLC-抑制剂以剂量依赖的方式抑制。
我们以前在PDGFβ-受体Y934F突变型细胞中发现了相似的对PDGF-BB的过度趋化应答,它显示出增强的磷酸化和PLC-γ1激活。
在这些细胞中,PLC-γ1的磷酸化增强与比表达野生型PDGFβ的细胞的IP3生产高三倍相关。
FVIIa/TF和PDGF-BB的组合在人成纤维细胞中诱导IP3生产增加约2倍。
然而,FVIIa/TF诱导的IP3生产与PLC-γ1的磷酸化不相关。
不能排除FVIIa/TF诱导的PLC-γ2发生酪氨酸磷酸化,但这似乎是不可能的,因为在人成纤维细胞中PLC-γ2的表达极低。
而且,TF的细胞内部分不具有内在蛋白酪氨酸激酶活性。
这些结果表明FVIIa/TF诱导β和/或δPLC同工酶的激活。
在IP3释放试验中,向细胞培养基中补充仅含约0.1nM FXa的0.1%FBS。
我们发现超过20nM FXa的浓度对于诱导IP3生产是必需的。
激活β或δPLC同工酶的机制仍然有待于解释。
据信激活涉及TF和膜相关蛋白之间的协作。
最近,鉴定了TF与细胞骨架之间的联系。
显示了TF的胞质结构域与肌动蛋白纤丝结合蛋白ABP280之间的分子相互作用。
而且,发现TF与肌动蛋白和肌动蛋白纤丝结合蛋白,例如在伸展的上皮细胞中层形足板和皱褶膜区的α-肌动蛋白和ABP280密切接触。
ABP 280是丝蛋白亚家族的一个成员,为层形足板的正常功能所必需,因此对于细胞移动是极其重要的。
PI3’激酶和PLC同工酶与诸如肌动蛋白结合的移动等趋化应答有关。
在以前的研究中,我们观察到PDGF-β受体诱导的趋化中的PI3’-激酶途径在PLC-γ1过度表达和活性增强的细胞中似乎并不重要。
对于FVIIa与TF结合的细胞也是如此。
这表明PI3’-激酶和PLC同工酶的激活作用的大小将确定何种途径占支配地位。
综合起来,我们的数据显示细胞迁移是FVIIa/TF信号传递所诱导的重要形态发生功能。
趋化在伤口愈合,血管发生和转移中起着关键作用。
趋化也是动脉粥样斑块形成中的重要成份。
在这些过程中多种细胞表达TF和PDGF以及PDGF受体。
再狭窄是阻塞的动脉在介入治疗后的一种主要并发症。
PDGF通过介导平滑肌细胞和成纤维细胞的迁移和增生而参与针对机械损伤的血管壁应答(新内膜形成)。
现在我们首次显示了FVIIa与TF表达细胞的结合对PDGF具有增强的趋化应答,它不依赖于凝血。
目前,对于由蛋白裂解活性VIIa诱导的信号传递途径和由VIIa产生的信号如何负责细胞过程所知不多。
一种可能性是FVIIa可诱导生长调节剂的表达,该调节剂在下游发挥作用以诱导细胞过程。
为了考察该可能性,在本实验中,我们使用含有超过8000个人基因的cDNA微列阵检查了人成纤维细胞应答VIIa接触引起的转录程序的改变。
我们选择成纤维细胞是因为这些细胞在正常情况下接触血清,在因物理(例如,手术)和病理学症状引起血管损伤的情况下,血清中含有生长因子和激活的凝血因子。
在与血清反应中观察到的基因表达的短时过程表明成纤维细胞的编程反映了与血清的突然接触,其不是作为一般的细胞分裂刺激,而是作为特异性的生理学信号。
对于应答血清和生长因子的转录激活作用的鉴定也表明在联合控制炎症,血管发生和伤口愈合的各种细胞之间的交流中成纤维细胞是积极参与者。
用从接触VIIa90分钟的成纤维细胞分离的mRNA进行的cDNA微列阵分析显示Cyr61上调。
Northern印迹分析证实在成纤维细胞中VIIa诱导Cyr61的表达。
尽管不如在成纤维细胞中显著,在血管平滑肌细胞中VIIa也增强Cyr61的表达。
Cyr61表达的诱导依赖于FVIIa的催化活性,因为FVIIai不能诱导Cyr61的表达。
尽管因子Xa和凝血酶也能诱导Cyr61的表达(数据未显示),但这些化合物与FVIIa诱导的Cyr61表达无关。
在我们的实验系统中,我们没有发现痕量的因子Xa和凝血酶产生的证据。
而且,因子Xa和凝血酶的特异性抑制剂对FVIIa诱导的Cyr61表达无明显影响。
Cyr61基因是成纤维细胞中被血清生长因子转录激活的一种即早期基因。
它编码一种分泌型40kDa,富含半胱氨酸且结合肝素的蛋白质,该蛋白质与胞外基质和细胞表面相联系。
Cyr61是保守的模块蛋白应急基因家族的一个成员,其特征在于存在一个N-末端分泌信号,接着是在该家族的成员中高度保守的4个模块结构域和38个半胱氨酸残基。
现在该蛋白质家族由6个不同的成员组成,包括Cyr61,结缔组织生长因子(CTGF)和鸟类原癌蛋白,Nov(因此命名为CCN家族)(CCN家族在Lau等,实验细胞研究,248:44-57,1999中也有描述)。
Cyr61蛋白显示出(i)以相似于纤连蛋白的方式促进上皮细胞的附着和伸展,(ii)增强bFGF和PDGF对成纤维细胞和血管内皮细胞的DNA合成速率的影响,(iii)促进成纤维细胞和内皮细胞的细胞迁移。
最近的研究表明Cyr61可作为整合蛋白αγβ3的配体,αγβ3是一种粘附受体,已知它与调节包括血管发生和肿瘤转移在内的许多细胞过程的信号传递有关。
纯化的Cyr61蛋白显示出通过αγβ3-依赖型途径刺激培养中的人微血管内皮细胞的定向迁移并诱导大鼠角膜中的新血管形成。
而且,在肿瘤细胞中Cyr61的表达促进肿瘤生长和血管形成。
现有资料表明FVIIa在成纤维细胞中诱导Cyr61表达,据信FVIIa诱导的Cyr61通过整合蛋白αγβ3而作用于FVIIa介导的细胞迁移和肿瘤转移。
因此,Cyr61将FVIIa-TF蛋白裂解信号与整合蛋白信号传递途径相连。
平滑肌细胞和肿瘤细胞的迁移及肿瘤转移需要VIIa催化活性,该发现与Cyr61的诱导需要FVIIa催化活性的其它发现一致。
除了Cyr61外,VIIa也能诱导其它调节物,所述调节物可介导FVIIa诱导的生物学应答。
在胰腺癌细胞中FVIIa与细胞表面TF的结合显示出选择性地过度表达uPAR基因。
以前我们使用不同的展示技术显示了在与FVIIa接触的成纤维细胞中poly(A)聚合酶基因的转录被上调。
尽管对cDNA微列阵是否也显示PAP的差异表达感兴趣,但滤膜不含PAP cDNA。
除了Cyr61外,我们的cDNA微列阵也显示了4种其它基因的差异表达(见结果),但差异表达比率与显著性界限十分接近。
由于在预备实验中我们用Northern印迹分析不能证实其差别表达而且也缺乏有关这些基因产物介导FVIIa诱导型生物学应答的能力的任何建议性相关数据,因此我们没有进一步分析其表述。
然而,由于CTGF是与Cyr61结构上相关的分子且激发与Cyr61相同的生物学应答,因此我们检查了CTGF的表达,尽管在cDNA微列阵中FVIIa处理的样品与对照样品中CTGF表达的相对比率为1.8(试验中对实际数值的保守估计为2)。
该数据揭示,FVIIa也诱导CTGF表达,且VIIa诱导的CTGF的表达动力学相似于Cyr61的表达动力学。
尽管CTGF的行为非常类似于Cyr61,但它们之间存在细微的差别。
例如,(a)CTGF显示出本身具有促细胞分裂活性,而Cyr61无内在的促细胞分裂活性但增强生长因子诱导的DNA合成,(b)Cyr61刺激趋化而CTGF刺激趋化性和化动性,(c)尽管Cyr61和CTGF都是ECM相关的信号传递分子,但CTGF显示出分泌进培养基。
因此,可能FVIIa通过Cyr61调节局部的细胞功能而通过分泌CTGF在其远处发挥作用。
用本文所述FVIIa或另一TF激动剂或FVIIai或另一TF拮抗剂治疗任何患者的方案可由本领域的技术人员来确定。
治疗中施用的每日剂量可由医生确定且依赖于所用的具体化合物,用药途径和患者的体重和状态。
有效量是从约5μg/kg/天到约500μg/kg/天的合适日剂量,优选从约10μg/kg/天到300μg/kg/天,更优选从约15μg/kg/天到200μg/kg/天,最优选从约20μg/kg/天到100μg/kg/天。
FVIIa或另一TF激动剂或FVIIai或另一TF拮抗剂可按单次剂量的形式用药,但也可按多次剂量给药,优选根据所给剂量和病人的状态以4-6-12小时的间隔给药。
FVIIa或另一TF激动剂或FVIIai或另一TF拮抗剂可通过静脉内用药或通过连续或脉冲式输注用药或直接对相关位点用药,例如,直接注射进肿瘤。
FVIIa或另一TF激动剂或FVIIai或另一TF拮抗剂优选经过静脉内注射并以每千克体重约100-100,000单位的量用药,且优选以每千克体重约250-25,000单位的量用药,该剂量相应于约5-500μg/kg且每24小时重复2-4次的剂量。
根据本发明可使用的制备药用组合物的常规技术在例如,Remington’s药物科学,1985中描述。
以技术人员已知的方法不加改变就可制备根据本发明使用的组合物。
简单地说,适用于本发明所述应用的药用制品可通过将FVII,FVIIa或另一TF激动剂或FVIIai或另一TF拮抗剂(优选纯化形式)与合适的佐剂和合适的载体或稀释剂混合来制备。
合适的生理学上可接受的载体或稀释剂包括无菌水或生理盐水。
在这种情况下,合适的佐剂包括钙,蛋白质(例如,清蛋白),或其它惰性肽(例如,甘氨酰甘氨酸)或氨基酸(例如,甘氨酸或组氨酸)以稳定纯化的因子VIIa。
其它生理学上可接受的佐剂是非还原糖,多元醇(例如,山梨糖醇,甘露糖醇或甘油),多糖如低分子量糊精,去污剂(例如,多乙氧基醚(polysorbate))和抗氧化剂(例如,硫酸氢盐和抗坏血酸)。
佐剂一般为0.001到4%w/v的浓度。
该药用制品也可含有蛋白酶抑制剂如抑酶肽和防腐剂。
可对该制品进行灭菌,例如,用截留细菌的滤膜进行过滤,向组合物中掺入灭菌剂,对该组合物进行辐射或加热该组合物。
也可以将它们制备为无菌固体组合物的形式,然后在使用前或使用时溶于无菌水或其它一些适于注射的无菌介质中。
本发明的不同方面涉及:调节细胞中至少一种基因的表达的方法,包括步骤:a)将所述细胞与因子VII(a)或组织因子拮抗剂接触b)测定所述细胞中所述基因的表达。
上述方法,其中所述细胞是表达组织因子的人类血管细胞,包括成纤维细胞和平滑肌细胞。
上述方法,其中所述基因选自Cyr61,CTFG,多巴胺D2受体,EST IncytePD 395116或P2U核苷酸受体。
上述方法,其中所述组织因子拮抗剂是修饰的因子VII(a),其称为因子VIIai。
一种增强所述基因的表达的方法。
一种抑制或最小化所述基因的表达的方法。
一种增强所述基因的表达的方法,包括将该细胞与因子VIIa接触。
一种抑制所述基因的表达的方法,包括将该细胞与称为FVIIai的修饰的因子VII接触。
上述方法,其中所述基因是EST PD674714。
调节细胞迁移的方法,包括步骤:a)将所述细胞与因子VIIa或组织因子拮抗剂接触b)测定所述细胞的迁移。
上述方法,其中所述细胞是表达组织因子的人类细胞,包括成纤维细胞,平滑肌细胞,肿瘤细胞,造血细胞和上皮细胞。
上述方法,其中所述组织因子拮抗剂是称为因子VIIai的修饰的因子VIIa。
上述方法,其中修饰的因子VII选自丹酰-Phe-Pro-Arg氯甲基酮,丹酰-Glu-Gly-Arg氯甲基酮,丹酰-Phe-Phe-Arg氯甲基酮和Phe-Phe-Arg氯甲基酮。
一种增强细胞迁移的方法,包括将细胞与FVIIa或组织因子激动剂接触。
一种减小或抑制细胞迁移的方法,包括将细胞与组织因子拮抗剂接触。
一种诱导或增强患者伤口愈合的方法,包括给所述患者施用有效量的含有因子VIIa或组织因子激动剂的药用组合物。
一种抑制肿瘤细胞的侵袭的方法,包括将所述细胞与有效量的组织因子拮抗剂接触。
一种在具有与不希望的细胞迁移,侵入,迁移诱导的细胞增生或血管发生相关的疾病或症状的患者中抑制细胞迁移,侵入,迁移诱导的细胞增生或血管发生的方法,包括给所述患者施用有效量的含有组织因子拮抗剂的药用组合物。
上述方法,其中的疾病或症状是原发性肿瘤生长,肿瘤侵入或转移。
上述方法,其中的组织因子拮抗剂是称为FVIIai的修饰的因子VII。
因子VIIa或组织因子拮抗剂在用于调节细胞迁移的药物生产中的应用。
上述应用,其中因子VIIa用于生产增强细胞迁移的药物。
上述应用,其中组织因子拮抗剂用于生产减小或抑制细胞迁移的药物。
上述方法,其中的组织因子拮抗剂是称为因子VIIai的修饰的因子VIIa。
上述应用,其中修饰的因子VII选自丹酰-Phe-Pro-Arg氯甲基酮,丹酰-Glu-Gly-Arg氯甲基酮,丹酰-Phe-Phe-Arg氯甲基酮和Phe-Phe-Arg氯甲基酮。
用下面的实施例进一步说明本发明,然而,这些实施例不构成对保护范围的限制。
在下面的描述和下面的实施例中公开的特征单独或以其任意组合对于实现本发明的各种形式是有重要意义的。
实施例实施例1FVII的制备适用于本发明的纯化的人VIIa因子优选通过,如Hagen等,美国国家科学院学报,83:2412-2416,1986或欧洲专利200.421(ZymoGenetics)所述的DNA重组技术来制备。
经重组技术制备的VIIa因子可以是真正的VIIa因子或者是经过一定程度的修饰的VIIa因子,只要这些VIIa因子相对于真正的VIIa因子具有实质上相同的针对凝血作用的生物学活性。
这些修饰的VIIa因子可通过修饰编码VII因子的核酸序列而产生,如在编码天然FVII的核酸中,通过已知方法,如定点诱变,改变氨基酸密码子或去掉部分氨基酸密码子。
VII因子还可通过Broze和Majerus,生物学化学杂志,255(4):1242-1247,1980以及Hedner和Kisiel,临床研究杂志,71:1836-1841,1983所述的方法来制备。
这些方法产生的VII因子中检测不到其它凝血因子。
通过进一步的凝胶过滤作为最终纯化步骤可得到纯度更高的VII因子制剂。
然后将VII因子通过已知方式,如通过多种不同的血浆蛋白,如XIIa因子、IXa因子或Xa因子转化成活化的FVIIa。
或者,如Bjoern等(Research Disclosure,269,1986年9月,第564-565页)所述,VII因子可通过流经离子交换层析柱,如Mono Q(Pharmacia fine Chemicals)等来活化。
实施例2FVIIai的制备适用于本发明的修饰型VII因子可如国际专利申请92/15686,94/27631,96/12800和/97/47651(ZymoGenetics/Novo Nordisk)所述来制备。
实施例3FVIIa和FFR-FVIIa在成纤维细胞对PDGF-BB的趋化应答中的影响将表达活性TF的成纤维细胞(图1A和1B)与100nM FVIIa一起保温,然后接种至改良型Boyden小室的上部;而将含有10%FBS及不同浓度的PDGF-BB的培养基添加至150μm微孔膜以下。
当在所述膜以下添加的是含10%FBS但不含PDGF-BB的培养基时,将这种情况下细胞的迁移作为随机迁移的测量依据,定为100%迁移。
在0.01ng/ml PDGF-BB时,受FVIIa刺激的细胞有显著的迁移应答,其相当于未与FVIIa接触的细胞在1ng/mlPDGF-BB时的应答,即,有100倍的浓度差异(图2A)。
在0.01-0.1ng/mlPDGF-BB下,针对FVIIa的迁移应答以剂量依赖的方式递增,其始于25nMFVIIa时,当达到50-100nM FVIIa时具有最大效应(图3A-D)。
经FVIIa活化之后,未观察到随机迁移的增加。
为检验在针对PDGF-BB的过度趋化应答中,具有蛋白水解活性的FVIIa是否强制性的,将成纤维细胞也与100nMFFR-FVIIa一起保温并以相同方式在Boyden小室中进行分析(图2A)。
在0.01-1ng/ml的低浓度PDGF-BB下,未发现FFR-FVIIa使趋化作用增加。
相反,100nM FFR-FVIIa可显著抑制由10-50ng/ml PDGF-BB诱导的趋化作用(图2A和3A-D)。
当成纤维细胞先与三种不同TF抗体预保温,再与FVIIa或FFR-FVIIa一起保温时,针对PDGF-BB的迁移应答等同于成纤维细胞在没有与TF结合的配体时的应答(图4A)。
一种非相关单克隆IgG抗体既未阻止由FVIIa诱导的过度趋化作用,也未抑制由FFR-FVIIa诱导的迁移应答(数据未显示)。
IgG抗体或三种TF抗体的存在未改变成纤维细胞的随机迁移(数据未显示)。
实施例4过度趋化应答并非由FXa或凝血酶介导由于经FVIIa诱导的、能导致针对PDGF-BB的过度趋化应答的信号传递取决于FVIIa的催化活性,确定信号传递是直接发生还是经由FVIIa/TF复合物所产生的FXa或凝血酶而发生将十分重要。
0.2-10μM蜱抗凝肽(TAP)不能阻断由FVIIa/TF传递的增强型迁移应答,但可特异性封闭FXa的活性位点并阻止能导致形成凝血酶之凝血级联反应的进一步活化(图5A,5B)。
添加5U/ml水蛭素(一种特异性凝血酶抑制剂)对FVIIa/TF诱导的过度趋化作用也无任何影响(图6A)。
TAP和水蛭素在没有配体FVIIa时不影响成纤维细胞应答PDGF而发生的迁移(图5A,5B,6A)。
因此,FVIIa对趋化作用的影响不太可能是通过FX或凝血酶的活化来介导。
实施例5针对PDGF-BB的过度趋化应答受PLC-依赖性途径的影响,但与PI3′-激酶无关最近报道,PI3′-激酶的活化对PDGFβ-受体诱导的趋化作用很重要。
因此,我们研究了LY 294002(一种特异性PI3′-激酶抑制剂)是否能阻断由FVIIa/TF信号传递而诱导的趋化应答。
将成纤维细胞用指定浓度的LY294002于37℃预处理30分钟,然后添加100nM FVIIa,如上述在Boyden小室中进行分析。
在整个试验期间将PDGF-BB浓度保持在0.1ng/ml,即一种非常低但能使FVIIa诱导显著的趋化应答的浓度。
整个实验里一直有LY294002。
图7A显示,由FVIIa/TF信号传递所介导的针对PDGF-BB的迁移应答不受PI3′-激酶抑制作用的影响。
为研究FVIIa/TF诱导的趋化应答是否涉及磷脂酰肌醇特异性磷脂酶C(PLC)的活化,我们先将成纤维细胞与不同浓度的U73122(一种特异性PLC抑制剂)于37℃预保温30分钟,然后添加100nM FVIIa;接着在有所述抑制剂存在的条件下,对所述细胞进行趋化试验。
用另一种对PLC无影响的高度类似物U73343作为阴性对照。
在这些实验中也将PDGF-BB浓度保持在0.1ng/ml。
用活性PLC-抑制剂U73122预处理的细胞以剂量依赖性方式抑制了针对0.1ng/ml PDGF-BB的过度趋化应答,彻底抑制发生在1μM时(图8A和8B)。
当使用无活性类似物U73343时,未发现对趋化作用的影响。
实施例6FVIIa/TF诱导PLC的活化为了进一步研究PLC活性对过度趋化应答的重要性,我们还分析了FVIIa/TF对成纤维细胞中PLC活性的直接影响。
PLC的活化导致产生两种第二信使:肌醇-1,4,5-三磷酸(IP3)和二乙酰甘油。
将成纤维细胞与myp[3H]肌醇一起保温过夜,再与100nM FVIIa或FFR-FVIIa一起保温60分钟,然后在有或无指定浓度的PDGF-BB的条件下保温。
用100nM FVIIa单独处理60分钟,这能以等同于10ng/ml和100ng/ml PDGF-BB单独使用时的水平诱导成纤维细胞释放IP3(图9)。
此外,100nM FVIIa与10ng/ml或100ng/mlPDGF-BB的组合使IP3的释放加倍。
活性位点受抑制的FVIIa不能诱导IP3的释放。
这些结果清楚表明,PLC通过FVIIa与TF的结合而活化。
实施例7成纤维细胞中PLC-γ1的磷酸化不因TF/FVIIa的信号传递而增强为确定由特定的酪氨酸激酶受体活化的PLC-γ1同工型是否负责由FVIIa/TF诱导的PLC活性的增加,我们研究了PLC-γ1的酪氨酸磷酸化作用。
在有或没有100nM FVIIa或FFR-FVIIa的条件下将成纤维细胞保温1小时,然后用0,2,10或100ng/ml PDGF-BB刺激。
保温5分钟后,使细胞裂解并使PLC-γ1免疫沉淀,经SDS-PAGE分离并用抗磷酸酪氨酸抗体进行免疫印迹。
当随着PDGF-BB浓度的增加,PLC-γ1的酪氨酸磷酸化显著增加时,成纤维细胞中单独添加FVIIa未诱导PLC-γ1的任何酪氨酸磷酸化效应(图10)。
此外,FVIIa与PDGF-BB在不同浓度的组合与PDGF-BB的单独作用相比,未诱导任何进一步的磷酸化作用(图10)。
FFR-FVIIa对PLC-γ1的酪氨酸磷酸化作用没有影响(图10)。
因此,除了PLC-γ1以外,其它PLC同工型也负责FVIIa刺激后PLC活性的增加。
实施例8方法细胞培养将人的包皮成纤维细胞AG1518和AG1523在添加了10%胎牛血清(FBS)的Eagle′s MEM中培养至铺满。
于使用前,使细胞经胰酶处理(2.5mg/ml,37℃,10分钟)而脱壁,在Hank′s平衡的盐溶液中洗涤,然后悬浮于含10%FBS的Eagle′s MEM或添加了0.1%FBS的Ham′s培养基中。
蛋白质如所述29表达并纯化人的FVIIa(Novo Nordisk A/S,Gentofte,丹麦)。
FFR-FVIIa(Novo Nordisk)通过用D-phe-L-Phe-L-Arg氯甲基酮封闭FVIIa中的活性位点而获得。
重组蜱抗凝肽(TAP)由Dr.P.Vlasuk,Corvas (SanDiego,CA)馈赠。
水蛭素购自Sigma。
LY294002,U73122和U73343来自Biomol(Plymouth Meeting,PA)。
抗TF单克隆抗体TF8-5G9,TF9-5B7和MTFH-1(Morrissey,J.H.,Fair,D.S.,Edgington,T.S.,纯化的细胞相关型组织因子的单克隆抗体分析,Thromb.Res.52,247-261(1988))由Dr.JamesH.Morrissey,Oklahoma Medical Research Foundation馈赠。
磷酸酪氨酸抗体PY99来自Santa Cruz,California。
流式细胞仪分析用流式细胞仪(Coulter Epics XL-MCL,BeckmanCoulter,Fullerton,CA,Coulter Electronics,USA)经免疫荧光法分析TF的表面表达。
所述仪器每日用Immuno-CheckTM或Flow CheckTM校准珠(Coulter)校准。
在间接免疫荧光实验中,将AG1518或AG1523成纤维细胞用含0.1%牛血清白蛋白(BSA)的PBS洗两次,在冰上与异硫氰酸荧光素(FITC)-标记的抗人TF单克隆抗体(4508CJ,American Diagnostica,Greenwicb,Ct.USA)一起保温30分钟。
用抗黑曲霉葡萄糖氧化酶单克隆IgG1(Dakopatts)作阴性对照。
测定每份样品的平均通道荧光强度(MFI)以及阳性细胞百分率。
测定TF活性如Lindmark等(Lindmark,E.,Tenno,T.,Chen,J.,Siegbahn,A,IL-10抑制LPS诱导型人单核细胞组织因子在全血中的表达,Br.J.Haematol.102,597-604(1998))所述测定TF的促凝血活性。
简短说,含0.2×105AG1518或AG1523成纤维细胞的等分试样用PBS洗两次,加在96孔微滴板(Nunc,Roskilde,丹麦)的孔中。
在一种两阶段酰胺分解试验中测定促凝血活性,其中显色底物S-2222(Chromogenix,Molndal,瑞典)被FXa裂解,而此FXa正是FX被TF/FVIIa复合物活化后的形式。
各孔加入一种反应混合物,使得该混合物中含有终浓度为0.6mM的S-2222,2mM CaCl2,以及来自凝血因子浓缩物Prothromplex-TTM TIM4(Baxter,Vienna,奥地利)的终浓度为1U/ml的凝血因子FVII和终浓度1.2U/ml的凝血因子FX,于37℃保温30分钟后,测定405nm的光吸收值的改变。
做三份平行测量。
趋化试验如前述(Siegbahn,A.,Hanimacher,A.,Westermark,B.,Heldin,C-H。
血小板衍生生长因子的各种同工型对成纤维细胞、单核细胞、和粒细胞趋化作用的不同影响,J.Clin.Invest.85,916-920(1990);Nister,M.,Hammacher,A.,Mellstrom,K.,Siegbahn,A.,Ronnstrand,L.,Westermark,B.,Heldin,C-H。
神经胶质瘤衍生的PDGF A链同型二聚体具有不同于从人血小板纯化的PDGFAB异型二聚体的功能活性,细胞,52,791-799(1988)),在改良型Boyden小室中利用前沿(leading front)技术分析成纤维细胞的迁移应答。
微孔滤膜(孔径8μm)用I型胶原的溶液室温包被过夜。
于使用前将滤膜风干30分钟。
使人的包皮成纤维细胞AG1523在含10%FBS的Eagle′s MEM中生长至铺满。
经胰酶(2.5mg/ml,37℃,10分钟)消化使细胞脱壁,然后悬浮于含10%FBS的Eagle′s MEM中。
试验前,使成纤维细胞在有或没有FVIIa或FFR-FVIIa的条件下保温。
将100μl该细胞悬液(2×105个细胞/ml)添加至Boyden小室中的滤膜以上。
使PDGF-BB在试验培养基(含10%FBS的Eagle′s MEM)中稀释,添加至小室中滤膜以下。
将细胞在含95%空气/5℃CO2的潮湿小室中37℃保温6小时。
实验全程均有FVIIa或FFR-FVIIa。
然后取出滤膜,用乙醇固定,用Mayer′s苏木精明矾染色,然后封片。
将迁移测定为:一个高倍镜视野(12.5×24)中相距最远的两个成纤维细胞核迁移的间距。
将每张滤膜中的迁移距离计算为:该滤膜上至少三个不同部分的读数的均值。
趋化物的每种浓度用2-4张滤膜进行实验。
在每组实验中,将成纤维细胞向试验培养基的迁移当作对照。
在使用了抗TF单克隆抗体或针对凝血因子TAP和水蛭素的抑制剂的情况下,细胞先与这些试剂预保温10分钟,再在有或没有FVIIa或FFR-FVIIa时保温,然后进行趋化试验。
在整个趋化实验全程也都存在抗体,TAP或水蛭素。
在检验针对不同抑制剂LY294002,U73122或U73343之迁移应答的影响的实验中,细胞先与指定浓度的所述抑制剂预保温30分钟,且所述抑制剂也出现在这些实验的全程中。
肌醇三磷酸(IP3)释放试验将含有人成纤维细胞AG1518的半铺满培养物的6孔板与2μCi myo(3H)肌醇(Amersham)在2ml Ham′s F12(含0.1%FBS)中的溶液一起保温过夜(约20小时)。
将培养基换成含0.1%FBS(含2mMCaCl2)及20mM LiCl的Ham′s F12,将细胞在37℃保温15分钟。
然后在有或无100nM FVIIa或100nM FFR-FVIIa的条件下将细胞保温1小时。
添加PDGF-BB(0,10或100ng/ml),继续在37℃保温10分钟。
如Eriksson等(Eriksson,A.,Nanberg,E.,Ronnstrand,L,Engstrom,U.,Hellman,U.,Rupp,E.,Carpenter,G.,Heldin,C-H.,Claesson-Welsh,L。
证实磷脂酶C-γ与两种血小板衍生生长因子受体之间相互作用的功能性差异,生物学化学杂志270,7773-7781(1995))进行IP3试验。
激动剂诱导型PLC-γ1磷酸化试验AG1518的半铺满培养物在含0.1%FBS的培养基中经血清饥饿培养过夜(约20hr),然后在有或无100nMFVIIa或FFR-FVIIa的条件下保温1小时,接着与0,2,10或100ng/mlPDGF-BB于37℃保温5分钟。
裂解细胞,基本如前所述(Hansen,K.,Johnell,M.,Siegbahn,A.,Rorsman,C.,Engstrom,U.,Wernstedt,C.,Heldin,C-H.,Ronnstrand,L.PDGF β-受体中Src磷酸化位点的突变导致PDGF-刺激型趋化作用增强而细胞分裂减少,EMBO J.,15,5299-5313(1996))用抗-PLC-γ1抗血清使PLC-γ1沉淀,所述抗血清是通过用对应于牛PLC-γ1羧基末端的肽免疫家兔而产生的(Artega,C.L.,Johnson,M.D.,Todderud,G.,Coffey,R.J.,Carpenter,G.,Page,D.L.在原发性人类乳腺癌中酪氨酸激酶底物磷脂酶C-γ1的含量增加,美国国家科学院学报88,10435-10439(1991)。
样品经SDS-PAGE分离,用磷酸酪氨酸抗体PY99进行免疫印迹。
统计学分析用适于Windows软件包的Statistica TM(StatSoft,Tulsa,Okla.美国)分析数据。
用适于相关(dependent)样品的Student′s t-检验确定不同数据组之间的显著性差异。
P值<0.05被认为具有统计学显著性。
蛋白质由Novo Nordisk(Gentofte,丹麦)馈赠的重组人VIIa在无菌水中重建为1-1.3mg/ml浓度的溶液。
用鲎阿米巴样细胞裂解物(Bio Whittaker)检查VIIa原液是否有痕量内毒素污染,未检测出污染(检测水平30pg)。
重组蜱抗凝蛋白(TAP)由George Vlasuk(Corvas,San Diego,CA)馈赠,重组水蛭素来自Sigma(St.Louis,MO)或Colbiochem(San Diego,CA)。
纯化的人的Xa因子和凝血酶均来自Enzyme Research Laboratories(Southbend,IN)。
cDNA微阵列将WI-38细胞培养至80%铺满,血清消耗(deprive)24小时,以便进入上述休眠。
将培养基更换为新鲜无血清的DMEM(添加了5mM CaCl2),在培养箱中稳定2小时。
然后,细胞用纯化的重组VIIa(5μg/ml)处理90分钟。
在90分钟的处理结束时,从未处理的细胞(对照)和VIIa处理的细胞中用Trizol(GIBCO BRL)分离总RNA。
通过按说明书在Oligo TexmRNA分离柱(Qiagen)上两次过柱而纯化poly(A)RNA。
将来自对照以及来自VIIa处理的细胞的800ng高纯度poly(A)RNA送到cDNA微阵列分析中心(cDNA microarray analysis service,Human UniGEM V microarray,GenomeSystems Inc.,St.Lois,MO)。
Northern印迹分析用TRIZOL试剂从与VIIa接触的WI-38细胞的休眠单层培养物以及“结果”部分所述的其它材料中制备总RNA。
用标准方法进行Northern印迹分析。
简短说,取10μg总RNA在1%琼脂糖/6%甲醛的凝胶上电泳以便根据分子大小进行分离,然后用毛细印迹法转移至硝酸纤维素膜上。
将Northern印迹膜与含有50%甲酰胺,5×SSC,50mM TrisHCl,pH7.5,0.1%焦磷酸钠,1%SDS,1%聚乙烯吡咯烷酮,1%Ficoll,25mMEDTA,100μg/ml变性的鲑精DNA和1%BSA的溶液于42℃预杂交,与32P标记的Cyr61cDNA探针(106cpm/ml)杂交。
将杂交膜用Dupont NEF或FujiRX X-线胶片曝光。
为了定量,使这些膜暴露于磷筛选屏1-4h,在PhosphorImger(Molecular Dynamics)中用“Image-quant”软件分析已曝光的屏。
为获得平均值,将不同实验所得单位(计数)用内部对照(出现在用对照处理的样品中的计数)标准化。
显色试验将WI-38细胞培养在96孔板上,如上述使之休眠。
洗涤细胞后,在含有细胞的培养孔以及用缓冲液包被的孔(无细胞)中添加FVIIa(5μg/ml)的含1.00μg钙的缓冲液。
保温30分钟后,各孔加入25μg针对Xa因子和凝血酶的显色底物,即Chromozym X和Chromozym TH。
显色3h后,在微滴板读取仪上读板。
作为对照,是将细胞与痕量浓度的Xa因子(50-0.1ng/ml)或凝血酶(0.1-0.002U/ml)一起保温。
将VIIa添加至细胞,或将VIIa添加至不含细胞的孔中,这两种情况在450nm处的光吸收值未见差异。
所述读数低于用最低浓度的Xa因子或凝血酶所得读数,且所述读数表示VIIa的显色活性。
实施例9cDNA微阵列使休眠的成纤维细胞与无血清的培养基对照或添加了VIIa(5μg/ml)的无血清培养基混合90分钟(每种处理有3个T-75的烧瓶)。
该处理后,收获总RNA,分离poly(A)RNA。
将600ng mRNA用Cy3或Cy5荧光标记,然后与含有8,000个已验序的EST(代表多达5,000个已知的人类基因)的UniGem Human V芯片杂交(由Genome System Inc.提供收费服务)。
在对照板上,将已知浓度的参照cDNA插入探针生成反应中,以测量敏感性并监控逆转录反应和纯化过程,该对照板可确定能指示成功杂交的杂交效率和该试验的总体质量和效果。
对实验数据的全面(global)分析表明,对照样品与VII处理的样品之间的杂交信号差异很小。
只有少数基因显示出中等差异的表达。
我们发现,通过VIIa处理可上调5种基因(在VIIa处理组中高3.5-2倍)而下调1种基因(低2.4倍)(+/-2是确定真实比例的最小数量级时的保守估计)。
被上调3.5倍的基因的身份不明,因为其归属不明。
其它被VIIa上调的基因有Cyr61(2.5倍),多巴胺D2受体(2.2倍),EST Incyte PD395116(2倍)及P2U核苷酸受体(2倍)。
有趣的是,CTGF(一种属于Cyr61家族的基因)在VIIa处理的细胞中比在对照细胞中高1.8倍。
在VIIa处理的细胞中下调的转录子是EST PD674714。
我们选择Cyr61进行进一步分析。
实施例10证实Cyr61的差异表达为证实在微阵列中获得的数据,我们对来自对照细胞和来自经VIIa处理的细胞的RNA样品(与在微阵列中制备用于探针生成的poly(A)RNA时相同的RNA样品)进行Northern印迹分析,并用放射性标记的Cyr61cDNA探测。
数据显示,Cyr61 cDNA探针与分离自对照细胞及经VIIa处理的细胞的RNA的单一转录子(约2.0kb)杂交。
但杂交信号的强度远远高于在分离自VIIa处理细胞的RNA中的强度(图1)。
对杂交信号的定量表明,Cyr61的表达在与VIIa接触的细胞中比在对照细胞中高2.8倍。
实施例11VIIa诱导的Cyr61表达的动力学为测定Cyr61表达的动力学,将休眠的成纤维细胞用5μg/ml VIIa处理不同时间。
提取总RNA,进行Northern印迹分析。
如图2所示,Cyr61的表达在VIIa处理细胞中以时间依赖的方式增加。
在约45分钟时达到表达峰值,然后在2-3h内下降至基线水平。
由于已报道小鼠成纤维细胞受血清和生长因子刺激后Cyr61的表达可持续数小时(最多8-10h),然后才出现抑制,我们检查了血清和PDGF对休眠的人成纤维细胞WI-38中Cyr61表达动力学的影响。
如图2B所示,用PDGF刺激仅使Cyr61短暂表达,加刺激的2h后便被完全抑制。
血清诱导的Cyr61表达的结果与此类似(数据未显示)。
实施例12VIIa因子剂量依赖型诱导的Cyr61表达为确定VIIa的剂量依赖性,用各种剂量的FVIIa(0.1-5μg/ml)将休眠的成纤维细胞处理45分钟,然后对来自这些细胞的总RNA进行Northern印迹分析。
如图3所示。
用低至0.1μg/ml的FVIIa处理成纤维细胞足以诱导Cyr61表达,血浆浓度的FVIIa(0.5μg/ml,10nM)导致显著应答,其接近最大值。
实施例13VIIa因子催化活性是Cyr61诱导所必需的为检验对Cyr61的诱导是否需要VIIa催化活性,用VIIa、活性位点已灭活的FVIIa(FVIIai)将WI-38细胞处理45分钟,通过Northern印迹分析来评估Cyr61的表达。
如图4所示,FVIIai不能诱导Cyr61表达,说明需要FVIIa的蛋白水解活性。
在这一内容中,重要的是应指出,FVIIai显示出以相同或高于FVIIa的亲和力与细胞表面TF结合。
在我们的试验中,VIIa诱导的Cyr61表达不太可能是下游凝血因子(FXa和凝血酶)的产生所致。
通过敏感的显色试验,我们未发现在我们的实验体系中有Xa因子及凝血酶产生的迹象(检测的敏感性为10pg)。
而且,特异性针对Xa因子和凝血酶的抑制剂(分别为蜱抗凝蛋白和水蛭素)不能破坏VIIa诱导的Cyr61表达(图5)。
实施例14VIIa对Cyr61 mRNA稳态水平的诱导涉及转录机制为研究在VIIa介导的Cyr61 mRNA稳态水平的升高中是否涉及转录,将休眠的WI-38细胞先与放线菌素D(10μg/ml)一起保温30分钟,再加入VIIa作用45分钟。
如图6所示,放线菌素D抑制了VIIa的刺激效应。
这一发现表明对Cyr61的诱导涉及转录机制。
为研究VIIa诱导Cyr61mRNA时是否需要蛋白质的从头合成,将WI-38细胞先用蛋白合成抑制剂环己酰亚胺预处理,再与VIIa接触45分钟。
如图6所示,VIIa的刺激效应未被环己酰亚胺阻断。
事实上,环己酰亚胺显著提高了VIIa所诱导的Cyr61 mRNA的稳态水平。
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