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OX2受体的同系物

基本信息

  • 申请号 CN00810289.9 
  • 公开号 CN1372594A 
  • 申请日 2000/05/11 
  • 公开日 2002/10/02 
  • 申请人 医疗研究局 先灵公司  
  • 优先权日期  
  • 发明人 A·N·巴克莱 M·H·布朗 D·M·戈尔曼 L·L·拉尼尔 G·J·赖特 H·切尔温斯基 J·H·菲利普斯 R·M·赫克 J·D·塞德维克  
  • 主分类号  
  • 申请人地址 英国伦敦 
  • 分类号  
  • 专利代理机构 中国专利代理(香港)有限公司 
  • 当前专利状态 发明专利申请公布 
  • 代理人 罗宏 
  • 有效性 失效 
  • 法律状态 审查中-公开
  •  

摘要

编码哺乳动物,例如灵长类动物OX2的受体的核酸,纯化蛋白及其片段。
还提供多克隆和单克隆抗体。
描述了使用组合物用于诊断和治疗用途的方法。
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权利要求书


1.一种组合物,其物质选自: a1)一种基本纯的或重组的多肽,包含与SEQ ID NO:2区段相同 的至少四个氨基酸的至少三个分离的非重叠区段; a2)一种基本纯的或重组的多肽,包含与SEQ ID NO:2区段相同 的至少五个氨基酸的至少两个分离的非重叠区段; a3)一种天然序列的啮齿类动物OX2RH1多肽,包含成熟的SEQ ID NO:2; a4)一种包含大鼠OX2RH1序列的融合多肽; b1)一种基本纯的或重组的多肽,包含与SEQ ID NO:4区段相同 的至少四个氨基酸的至少三个分离的非重叠区段; b2)一种基本纯的或重组的多肽,包含与SEQ ID NO:4区段相同 的至少五个氨基酸的至少两个分离的非重叠区段; b3)一种天然序列的啮齿类动物OX2RH1多肽,包含成熟的SEQ ID NO:4; b4)一种包含人OX2RH1序列的融合多肽; c1)一种基本纯的或重组的多肽,包含与SEQ ID NO:6区段相同 的至少四个氨基酸的至少三个分离的非重叠区段; c2)一种基本纯的或重组的多肽,包含与SEQ ID NO:6区段相同 的至少五个氨基酸的至少两个分离的非重叠区段; c3)一种天然序列的啮齿类动物OX2RH1多肽,包含成熟的SEQ ID NO:6; c4)一种包含小鼠OX2RH1序列的融合多肽; d1)一种基本纯的或重组的多肽,包含与SEQ ID NO:8区段相同 的至少四个氨基酸的至少三个分离的非重叠区段; d2)一种基本纯的或重组的多肽,包含与SEQ ID NO:8区段相同 的至少五个氨基酸的至少两个分离的非重叠区段; d3)一种天然序列的啮齿类动物OX2RH1多肽,包含成熟的SEQ ID NO:8; d4)一种包含人OX2RH2序列的融合多肽; e1)一种基本纯的或重组的多肽,包含与SEQ ID NO:10区段相 同的至少四个氨基酸的至少三个分离的非重叠区段; e2)一种基本纯的或重组的多肽,包含与SEQ ID NO:10区段相 同的至少五个氨基酸的至少两个分离的非重叠区段; e3)一种天然序列的啮齿类动物OX2RH2多肽,包含成熟的SEQ ID NO:10; e4)一种包含小鼠OX2RH2序列的融合多肽; f1)一种基本纯的或重组的多肽,包含与SEQ ID NO:12区段相 同的至少四个氨基酸的至少三个分离的非重叠区段; f2)一种基本纯的或重组的多肽,包含与SEQ ID NO:12区段相 同的至少五个氨基酸的至少两个分离的非重叠区段; f3)一种天然序列的啮齿类动物OX2RH3多肽,包含成熟的SEQ ID NO:12; f4)一种包含小鼠OX2RH3序列的融合多肽; g1)一种基本纯的或重组的多肽,包含与SEQ ID NO:20区段相 同的至少四个氨基酸的至少三个分离的非重叠区段; g2)一种基本纯的或重组的多肽,包含与SEQ ID NO:20区段相 同的至少五个氨基酸的至少两个分离的非重叠区段; g3)一种天然序列的灵长类动物OX2RH1.2多肽,包含成熟的SEQ ID NO:20; g4)一种包含灵长类动物OX2RH1.2序列的融合多肽; h1)一种基本纯的或重组的多肽,包含与SEQ ID NO:23区段相 同的至少四个氨基酸的至少三个分离的非重叠区段; h2)一种基本纯的或重组的多肽,包含与SEQ ID NO:23区段相 同的至少五个氨基酸的至少两个分离的非重叠区段; h3)一种天然序列的啮齿类动物OX2RH4多肽,包含成熟的SEQ ID NO:23; h4)一种包含小鼠OX2RH4序列的融合多肽。

2.一种结合化合物,包含来源于抗体的抗原结合位点,其特异性 地结合权利要求1的天然OX2RH多肽,其中: a)所述结合化合物位于容器中; b)所述OX2RH多肽来源于啮齿类动物或灵长类动物; c)所述结合化合物是Fv,Fab,或Fab2片段; d)所述结合化合物被接合到其它的化学部分上;或 e)所述抗体:   i)是相对于表1-3成熟多肽的肽序列培养的;   ii)相对于成熟的OX2RH培养的;   iii)被培养成纯化的哺乳动物OX2RH;   iv)是免疫选择的; v)是多克隆抗体; vi)结合变性的OX2RH; vii)对抗原显示至少30μM的Kd; viii)附着在固体基质上,包括颗粒或塑料膜; ix)存在于无菌的组合物中;或 x)是可检测标记的,包括荧光标记物。

3.一种分离的或重组的核酸,其编码权利要求1所述的OX2RH多 肽,其中所述: a)OX2RH来源于哺乳动物;或 b)所述核酸:   i)编码表1-3的抗原肽序列;   ii)编码表1-3的大多数抗原肽序列;   iii)显示与编码所述区段的天然cDNA有至少十三个核苷 酸的同一性;   iv)是一种表达载体;   v)进一步包含复制起点;   vi)来源于天然的源;   vii)包含可检测的标记物;   viii)包含合成的核苷酸序列;   ix)少于6kb,优选少于3kb;   x)来源于灵长类动物或啮齿类动物;   xi)包含天然的全长编码序列;   xii)是一种用于编码所述OX2RH的基因的杂交探针;   xiii)进一步编码DAP12或DAP10;或   xiv)是PCR引物,PCR产物,或诱变引物。

4.一种核酸,其中: a)在40℃30分钟,小于2M盐的洗涤条件下,与SEQ ID NO:1, 3,5,7,9,11,19,或22的编码部分杂交;或 b)在至少约30个核苷酸的一段序列的水平上显示与灵长类动 物或啮齿类动物的OX2RH cDNA的同一性。

5.一种调节细胞或组织培养物细胞生理学或发育的方法,包含使 所述细胞与哺乳动物OX2RH的激动剂或拮抗剂相接触。

6.权利要求5的方法,其中所述: a)调节生理学是:   i)提高meloid功能;或   ii)提高免疫性; b)激动剂或拮抗剂减弱OX2介导的信号产生至所述细胞,或 c)所述拮抗剂是:   i)所述OX2RH的抗体;   ii)一种可溶性的OX2RH结构;   iii)一种可溶性的OX2RH-Ig融合体;或   iv)一种OX2R反义核酸。

7.权利要求6的方法,其中: a)所述生理学的调节是体外meloid细胞功能的提高,且所述 拮抗剂是OX2突变蛋白;或 b)所述生理学的调节是用所述拮抗剂系统治疗的动物的免疫 性提高。

8.一种鉴定OX2R的非-OX2配位体的方法,所述方法包含自OX2 剔除小鼠筛选基因文库,用于结合OX2R-Ig融合蛋白,并鉴定结合所 述融合蛋白的基因。
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说明书

                               序列表 SEQ ID NO:1是啮齿类动物OX2R的核苷酸序列。
SEQ ID NO:2是啮齿类动物OX2R的多肽序列。
SEQ ID NO:3是灵长类动物OX2R的同系物1的核苷酸序列。
SEQ ID NO:4是灵长类动物OX2R的同系物1的多肽序列。
SEQ ID NO:5是啮齿类动物OX2R的同系物1的核苷酸序列。
SEQ ID NO:6是啮齿类动物OX2R的同系物1的多肽序列。
SEQ ID NO:7是灵长类动物OX2R的同系物2的核苷酸序列。
SEQ ID NO:8是灵长类动物OX2R的同系物2的多肽序列。
SEQ ID NO:9是啮齿类动物OX2R的同系物2的核苷酸序列。
SEQ ID NO:10是啮齿类动物OX2R的同系物2的多肽序列。
SEQ ID NO:11是啮齿类动物OX2R的同系物3的核苷酸序列。
SEQ ID NO:12是啮齿类动物OX2R的同系物3的多肽序列。
SEQ ID NO:13是啮齿类动物OX2R的多肽编码序列。
SEQ ID NO:14是灵长类动物OX2R的同系物1的多肽编码序列。
SEQ ID NO:15是啮齿类动物OX2R的同系物1的多肽编码序列。
SEQ ID NO:16是灵长类动物OX2R的同系物2的多肽编码序列。
SEQ ID NO:17是啮齿类动物OX2R的同系物2的多肽编码序列。
SEQ ID NO:18是啮齿类动物OX2R的同系物3的多肽编码序列。
SEQ ID NO:19是灵长类动物OX2R同系物1.2的核苷酸序列。
SEQ ID NO:20是灵长类动物OX2R同系物1.2的多肽序列。
SEQ ID NO:21是灵长类动物OX2R的同系物1.2的多肽编码序列。
SEQ ID NO:22是啮齿类动物OX2R的同系物4的核苷酸序列。
SEQ ID NO:23是啮齿类动物OX2R的同系物4的多肽序列。
SEQ ID NO:24是啮齿类动物OX2R的同系物4的多肽编码序列。
<110>Medical Research Council  Schering Corporation <120>哺乳动物蛋白;有关的试剂和方法 <130>DXO1052K1 PCT <140>PCT/US 00/12998 <141>2000-05-11 <150>GB 9911123.9 <151>1999-05-13 <150>GB 9925989.7 <151>1999-11-03 <160>24 <170>PatentIn Ver.2.0 <210>1 <211>1574 <212>DNA <213>未知 <220> <223>未知生物的描述:啮齿类动物;推测的  rattus rattus <220> <221>CDS <222>(91)..(1071) <220> <221>mat肽 <222>(162)..(1071) <400> 1 agcggaggga tcctggtcat ggtcaccgct gctcccctac ctgtgaagag aaagagcacc 60 gagtgagccg ctgaaaacca gaaaaccgaa atg ctc tgc ttt tgg aga act tct  114                              Met Leu Cys Phe Trp Arg Thr Ser                                              -20 cac gta gca gta ctc ttg atc tgg ggg gtc ttc gcg gct gag tca agt   162 His Val Ala Val Leu Leu Ile Trp Gly Val Phe Ala Ala Glu Ser Ser -15                 -10                  -5              -1 tgt cct gat aag aat caa aca atg cag aac aat tca tca act atg aca   210 Cys Pro Asp Lys Asn Gln Thr Met Gln Asn Asn Ser Ser Thr Met Thr 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tca tgg cct gta aag atg gct aca aat gct gtg ctt tgt tgc cct cct   474 Ser Trp Pro Val Lys Met Ala Thr Asn Ala Val Leu Cys Cys Pro Pro 45                   50                  55                  60 atc gca tta aga aat ttg atc ata ata aca tgg gaa ata atc ctg aga   522 Ile Ala Leu Arg Asn Leu Ile Ile Ile Thr Trp Glu Ile Ile Leu Arg              65                  70                  75 ggc cag cct tcc tgc aca aaa gcc tac aag aaa gaa aca aat gag acc   570 Gly Gln Pro Ser Cys Thr Lys Ala Tyr Lys Lys Glu Thr Asn Glu Thr          80                  85                  90 aag gaa acc aac tgt act gat gag aga ata acc tgg gtc tcc aga cct   618 Lys Glu Thr Asn Cys Thr Asp Glu Arg Ile Thr Trp Val Ser Arg Pro      95                 100                 105 gat cag aat tcg gac ctt cag att cgt acc gtg gcc atc act cat gac   666 Asp Gln Asn Ser Asp Leu Gln Ile Arg Thr Val Ala Ile Thr His Asp 110                 115                 120 ggg tat tac aga tgc ata atg gta aca cct gat ggg aat ttc cat cgt   714 Gly Tyr Tyr Arg Cys Ile Met Val Thr Pro Asp Gly Asn Phe His Arg 125                 130                 135                 140 gga tat cac ctc caa gtg tta gtt aca cct gaa gtg acc ctg ttt caa   762 Gly Tyr His Leu Gln Val Leu Val Thr Pro Glu Val Thr Leu Phe Gln             145                 150                 155 aac agg aat aga act gca gta tgc aag gca gtt gca ggg aag cca gct   810 Asn Arg Asn Arg Thr Ala Val Cys Lys Ala Val Ala Gly Lys Pro Ala         160                 165                 170 gcg cat atc tcc tgg atc cca gag ggc gat tgt gcc act aag caa gaa   858 Ala His Ile Ser Trp Ile Pro Glu Gly Asp Cys Ala Thr Lys Gln Glu     175                 180                 185 tac tgg agc aat ggc aca gtg act gtt aag agt aca tgc cac tgg gag   906 Tyr Trp Ser Asn Gly Thr Val Thr Val Lys Ser Thr Cys His Trp Glu 190                 195                 200 gtc cac aat gtg tct acc gtg acc tgc cac gtc tcc cat ttg act ggc   954 Val His Asn Val Ser Thr Val Thr Cys His Val Ser His Leu Thr Gly 205                 210                 215                 220 aac aag agt ctg tac ata gag cta ctt cct gtt cca ggt gcc aaa aaa   1002 Asn Lys Ser Leu Tyr Ile Glu Leu Leu Pro Val Pro Gly Ala Lys Lys             225                 230                 235 atc agc aaa att ata tat tcc ata tat cat cct tac tat tat tat tta   1050 Ile Ser Lys Ile Ile Tyr Ser Ile Tyr His Pro Tyr Tyr Tyr Tyr Leu         240                 245                 250 gac cat cgt ggg att cat ttg gtt gtt gaa agt caa tgg ctg cag aaa   1098 Asp His Arg Gly Ile His Leu Val Val Glu Ser Gln Trp Leu Gln Lys     255                 260                 265 ata taaattgaat aaaacagaat ctactccagt tgttgaggag gatgaaatgc        1151 Ile agccctatgc cagctacaca gagaagaaca atcctctcta tgatactaca aacaaggtga 1211 aggcatctga ggcattacaa agtgaagttg acacagacct ccatacttta taagttgttg 1271 gactctagta ccaagaaaca acaacaaacg agatacatta taattactgt ctgattttct 1331 tacagttcta gaatgaagac ttatattgaa attaggtttt ccaaggttct tagaagacat 1391 tttaatggat tctcattcat acccttgtat aattggaatt tttgattctt agctgctacc 1451 agctagttct ctgaagaact gatgttatta caaagaaaat acatgcccat gaccaaatat 1511 tcaaattgtg caggacagta aataatgaaa accaaatttc ctcaagaaat aactgaagaa 1571 ggagcaagtg tgaacagttt cttgtgtatc ctt                              1604 <210>4 <211>295 <212>PRT <213>未知 <400>4 Met Leu Cys Pro Trp Arg Thr Ala Asn Leu Gly Leu Leu Leu Ile Leu -25                 -20                 -15 Thr Ile Phe Leu Val Ala Glu Ala Glu Gly Ala Ala Gln Pro Asn Asn -10                  -5              -1   1               5 Ser Leu Met Leu Gln Thr Ser Lys Glu Asn His Ala Leu Ala Ser Ser          10                  15                  20 Ser Leu Cys Met Asp Glu Lys Gln Ile Thr Gln Asn Tyr Ser Lys Val      25                  30                  35 Leu Ala Glu Val Asn Thr Ser Trp Pro Val Lys Met Ala Thr Asn Ala  40                  45                  50 Val Leu Cys Cys Pro Pro Ile Ala Leu Arg Asn Leu Ile Ile Ile Thr  55                  60                  65                  70 Trp Glu Ile Ile Leu Arg Gly Gln Pro Ser Cys Thr Lys Ala Tyr Lys              75                  80                  85 Lys Glu Thr Asn Glu Thr Lys Glu Thr Asn Cys Thr Asp Glu Arg Ile          90                  95                 100 Thr Trp Val Ser Arg Pro Asp Gln Asn Ser Asp Leu Gln Ile Arg Thr     105                 110                 115 Val Ala Ile Thr His Asp Gly Tyr Tyr Arg Cys Ile Met Val Thr Pro 120                 125                 130 Asp Gly Asn Phe His Arg Gly Tyr His Leu Gln Val Leu Val Thr Pro 135                 140                 145                 150 Glu Val Thr Leu Phe Gln Asn Arg Asn Arg Thr Ala ValCys Lys Ala             155                 160                165 Val Ala Gly Lys Pro Ala Ala His Ile Ser Trp Ile Pro Glu Gly Asp         170                 175                 180 Cys Ala Thr Lys Gln Glu Tyr Trp Ser Asn Gly Thr Val Thr Val Lys     185                 190                 195 Ser Thr Cys His Trp Glu Val His Asn Val Ser Thr Val Thr Cys His 200                 205                 210 Val Ser His Leu Thr Gly Asn Lys Ser Leu Tyr Ile Glu Leu Leu Pro 215                 220                 225                 230 Val Pro Gly Ala Lys Lys Ile Ser Lys Ile Ile Tyr Ser Ile Tyr His             235                 240                 245 Pro Tyr Tyr Tyr Tyr Leu Asp His Arg Gly Ile His Leu Val Val Glu         250                 255                 260 Ser Gln Trp Leu Gln Lys Ile     265 <210>5 <211>1490 <212>DNA <213>未知 <220> <223>未知生物的描述:啮齿类动物;推测的肌肉 <220> <221>CDS <222>(10)..(987) <220> <221>mat_肽 <222>(85).. (987) <400>5 aaaaccgaa atg ttt tgc ttt tgg aga act tct gcc cta gca gtg ctc tta   51       Met Phe Cys Phe Trp Arg Thr Ser Ala Leu Ala Val Leu Leu       -25                 -20                 -15 ata tgg ggg gtc ttt gtg gct ggg tca agt tgt act gat aag aat caa     99 Ile Trp Gly Val Phe Val Ala Gly Ser Ser Cys Thr Asp Lys Asn Gln -10                  -5              -1   1               5 aca aca cag aac aac agt tca tct cct ctg aca caa gtg aac act aca     147 Thr Thr Gln Asn Asn Ser Ser Ser Pro Leu Thr Gln Val Asn Thr Thr              10                  15                  20 gtg tct gta cag ata ggt aca aag gct ctg ctc tgc tgc ttt tct att   195 Val Ser Val Gln Ile Gly Thr Lys Ala Leu Leu Cys Cys Phe Ser Ile          25                  30                  35 cca ctg aca aaa gca gta tta atc aca tgg ata ata aag ctc aga ggc   243 Pro Leu Thr Lys Ala Val Leu Ile Thr Trp Ile Ile Lys Leu Arg Gly      40                  45                  50 ctg cca tcc tgc aca ata gca tac aaa gta gat aca aag acc aat gaa   291 Leu Pro Ser Cys Thr Ile Ala Tyr Lys Val Asp Thr Lys Thr Asn Glu  55                  60                  65 acc agc tgc ttg ggc agg aac atc acc tgg gcc tcc aca cct gac cac    339 Thr Ser Cys Leu Gly Arg Asn Ile Thr Trp Ala Ser Thr Pro Asp His  70                  75                  80                  85 agt cct gaa ctt cag atc agt gca gtg acc ctc cag cat gag ggg act    387 Ser Pro Glu Leu Gln Ile Ser Ala Val Thr Leu Gln His Glu Gly Thr              90                  95                 100 tac aca tgt gag aca gta aca cct gaa ggg aat ttt gaa aaa aac tat    435 Tyr Thr Cys Glu Thr Val Thr Pro Glu Gly Asn Phe Glu Lys Asn Tyr         105                 110                 115 gac ctc caa gtg ctg gtg ccc cct gaa gta acc tac ttt cca gag aaa    483 Asp Leu Gln Val Leu Val Pro Pro Glu Val Thr Tyr Phe Pro Glu Lys     120                 125                 130 aac aga tct gca gtc tgt gag gca atg gca ggc aag cct gct gca cag    531 Asn Arg Ser Ala Val Cys Glu Ala Met Ala Gly Lys Pro Ala Ala Gln 135                 140                 145 atc tct tgg tct cca gat ggg gac tgt gtc act acg agt gaa tca cac    579 Ile Ser Trp Ser Pro Asp Gly Asp Cys Val Thr Thr Ser Glu Ser His 150                 155                 160                 165 agc aat ggc act gtg act gtc agg agc aca tgc cac tgg gag cag aac     627 Ser Asn Gly Thr Val Thr Val Arg Ser Thr Cys His Trp Glu Gln Asn             170                 175                 180 aat gtg tct gat gtg tcc tgc att gtc tct cat ttg act ggt aac caa     675 Asn Val Ser Asp Val Ser Cys Ile Val Ser His Leu Thr Gly Asn Gln         185                 190                 195 tct ctg tcc ata gaa ctg agt aga ggt ggt aac caa tca tta cga cca     723 Ser Leu Ser Ile Glu Leu Ser Arg Gly Gly Asn Gln Ser Leu Arg Pro     200                 205                 210  tat att cca tac atc ata cca tca att atc att ttg atc atc ata gga   771  Tyr Ile Pro Tyr Ile Ile Pro Ser Ile Ile Ile Leu Ile Ile Ile Gly  215                 220                 225  tgc att tgt ctt ttg aaa atc agt ggc ttc aga aaa tgc aaa ttg cca   819  Cys Ile Cys Leu Leu Lys Ile Ser Gly Phe Arg Lys Cys Lys Leu Pro  230                 235                 240                 245  aaa tta gaa gct act tca gct att gag gag gat gaa atg cag cct tat   867  Lys Leu Glu Ala Thr Ser Ala Ile Glu Glu Asp Glu Met Gln Pro Tyr              250                 255                 260  gct agc tat aca gag aag agc aat cca ctc tat gat act gtg act aag   915  Ala Ser Tyr Thr Glu Lys Ser Asn Pro Leu Tyr Asp Thr Val Thr Lys          265                 270                 275  gtg gag gca ttt cca gta tca caa ggc gaa gtc aat ggc aca gac tgc   963  Val Glu Ala Phe Pro Val Ser Gln Gly Glu Val Asn Gly Thr Asp Cys      280                 285                 290  ctt act ttg tcg gcc att gga atc tagaaccaag aaaaaagaag tcaagagaca  1017  Leu Thr Leu Ser Ala Ile Gly Ile  295                 300  tcataattac tgctttgctt tctttaaaat tcgacaatgg aaggactact tggaaattag 1077  ctcttccaaa gctattaaaa agcacaaatg ttctaatgaa attgcattta aattctatca 1137  ttggaagttt ggaatctctg ctgctacctg ttaattttag gaagaactga tttaattatt 1197  acaaagaaag cacatggtta tggtgaaata tcaagttgtg caataaagta tgatgaaaac 1257  tgagtttcct caagaaataa ctgcaggagg aacaatcatc actaaagaat ttcatgtgag 1317  ttcttacaaa aaaattccta tgtatacatg actatggtat gtgtgtccaa ttacatgttt 1377  atttacaaat gtgtatatat gcacacattt gcttttcagg acatctcctt gtaaaaaaca 1437  cactggagtt ttggatttat aaaagcttat aaagtgagca ttggagatat ttt         1490 <210>6 <211>326 <212>PRT <213>未知 <400>6 Met Phe Cys Phe Trp Arg Thr Ser Ala Leu Ala Val Leu Leu Ile Trp -25                 -20                 -15                 -10 Gly Val Phe Val Ala Gly Ser Ser Cys Thr Asp Lys Asn Gln Thr Thr              -5              -1   1               5 Gln Asn Asn Ser Ser Ser Pro Leu Thr Gln Val Asn Thr Thr Val Ser      10                  15                  20 Val Gln Ile Gly Thr Lys Ala Leu Leu Cys Cys Phe Ser Ile Pro Leu  25                  30                  35 Thr Lys Ala Val Leu Ile Thr Trp Ile Ile Lys Leu Arg Gly Leu Pro  40                  45                  50                  55 Ser Cys Thr Ile Ala Tyr Lys Val Asp Thr Lys Thr Asn Glu Thr Ser              60                  65                  70 Cys Leu Gly Arg Asn Ile Thr Trp Ala Ser Thr Pro Asp His Ser Pro          75                  80                  85 Glu Leu Gln Ile Ser Ala Val Thr Leu Gln His Glu Gly Thr Tyr Thr      90                  95                 100 Cys Glu Thr Val Thr Pro Glu Gly Asn Phe Glu Lys Asn Tyr Asp Leu 105                 110                 115 Gln Val Leu Val Pro Pro Glu Val Thr Tyr Phe Pro Glu Lys Asn Arg 120                 125                 130                 135 Ser Ala Val Cys Glu Ala Met Ala Gly Lys Pro Ala Ala Gln Ile Ser             140                 145                 150 Trp Ser Pro Asp Gly Asp Cys Val Thr Thr Ser Glu Ser His Ser Asn         155                 160                 165 Gly Thr Val Thr Val Arg Ser Thr Cys His Trp Glu Gln Asn Asn Val     170                 175                 180 Ser Asp Val Ser Cys Ile Val Ser His Leu Thr Gly Asn Gln Ser Leu 185                 190                 195 Ser Ile Glu Leu Ser Arg Gly Gly Asn Gln Ser Leu Arg Pro Tyr Ile 200                 205                 210                 215 Pro Tyr Ile Ile Pro Ser Ile Ile Ile Leu Ile Ile Ile Gly Cys Ile             220                 225                 230 Cys Leu Leu Lys Ile Ser Gly Phe Arg Lys Cys Lys Leu Pro Lys Leu         235                 240                 245 Glu Ala Thr Ser Ala Ile Glu Glu Asp Glu Met Gln Pro Tyr Ala Ser     250                 255                 260 Tyr Thr Glu Lys Ser Asn Pro Leu Tyr Asp Thr Val Thr Lys Val Glu 265                 270                 275 Ala Phe Pro Val Ser Gln Gly Glu Val Asn Gly Thr Asp Cys Leu Thr 280                 285                 290                 295 Leu Ser Ala Ile Gly Ile             300 <210>7 <211>1010 <212>DNA <213>未知 <220> <223>未知生物的描述:灵长类动物;推测的人类 <220> <221>CDS <222>(1).. (750) <400> 7 atg ggt gga aag cag atg aca cag aac tat tca aca att ttt gca gaa   48 Met Gly Gly Lys Gln Met Thr Gln Asn Tyr Ser Thr Ile Phe Ala Glu   1               5                  10                  15 ggt aac att tca cag cct gta ctg atg gat ata aat gct gtg ctt tgt   96 Gly Asn Ile Ser Gln Pro Val Leu Met Asp Ile Asn Ala Val Leu Cys          20                  25                  30 tgc cct cct att gca tta aga aat ttg atc ata ata aca tgg gaa ata   144 Cys Pro Pro Ile Ala Leu Arg Asn Leu Ile Ile Ile Thr Trp Glu Ile      35                  40                  45 atc ctg aga ggc cag cct tcc tgc aca aaa gcc tac aag aaa gaa aca   192 Ile Leu Arg Gly Gln Pro Ser Cys Thr Lys Ala Tyr Lys Lys Glu Thr  50                  55                  60 aat gag acc aag gaa acc aac tgt act gtt gag aga ata acc tgg gtc   240 Asn Glu Thr Lys Glu Thr Asn Cys Thr Val Glu Arg Ile Thr Trp Val 65                   70                  75                  80 tct aga cct gat cag aat tcg gac ctt cag att cgt ccg gtg gac acc   288 Ser Arg Pro Asp Gln Asn Ser Asp Leu Gln Ile Arg Pro Val Asp Thr              85                  90                  95 act cat gac ggg tat tac aga ggc ata gtg gta aca cct gat ggg aat   336 Thr His Asp Gly Tyr Tyr Arg Gly Ile Val Val Thr Pro Asp Gly Asn         100                 105                 110 ttc cat cgt gga tat cac ctc caa gtg tta gtt aca ccc gaa gtg aac   384 Phe His Arg Gly Tyr His Leu Gln Val Leu Val Thr Pro Glu Val Asn     115                 120                 125 cta ttt caa agc agg aat ata act gca gta tgc aag gca gtt aca ggg   432 Leu Phe Gln Ser Arg Asn Ile Thr Ala Val Cys Lys Ala Val Thr GIy 130                 135                 140 aag cca gct gcc cag atc tcc tgg atc cca gag gga tct att ctt gcc   480 Lys Pro Ala Ala Gln Ile Ser Trp Ile Pro Glu Gly Ser Ile Leu Ala 145                 150                 155                 160 act aag caa gaa tac tgg ggc aat ggc aca gtg acg gtt aag agt aca   528 Thr Lys Gln Glu Tyr Trp Gly Asn Gly Thr Val Thr Val Lys Ser Thr             165                 170                 175 tgc ccc tgg gag ggc cac aag tct act gtg acc tgc cat gtc tcc cat   576 Cys Pro Trp Glu Gly His Lys Ser Thr Val Thr Cys His Val Ser His         180                 185                 190 ttg act ggc aac aag agt ctg tcc gta aag ttg aat tca ggt ctc aga   624 Leu Thr Gly Asn Lys Ser Leu Ser Val Lys Leu Asn Ser Gly Leu Arg     195                 200                 205 acc tca gga tct cca gcg ttg tcc tta ctg atc att ctt tat gtg aaa   672 Thr Ser Gly Ser Pro Ala Leu Ser Leu Leu Ile Ile Leu Tyr Val Lys 210                 215                 220 ctc tct ctt ttt gtg gtc att ctg gtc acc aca gga ttt gtt ttc ttc   720 Leu Ser Leu Phe Val Val Ile Leu Val Thr Thr Gly Phe Val Phe Phe 225                 230                 235                 240 cag agg ata aat cat gtc aga aaa gtt ctt taaagaagaa ggaagggtct     770 Gln Arg Ile Asn His Val Arg Lys Val Leu             245                 250 tcttttgctt ctcctccttg tctctggact gcaacattgg tgagatgagt gatggtccag 830 cagtgaactt gggccatgga tgatgttaag gatagaagcc actcagtagg atagaagaaa 890 agaaagatgg aagaaggatc ctgggcttga tgaccatgaa gtttccctat aaaccctcaa 950 ccacctattc attgacttct tttgtgttag agtgaataaa attttgttca tgccagtgtt 1010 <210>8 <211>250 <212>PRT <213>未知 <400>8 Met Gly Gly Lys Gln Met Thr Gln Asn Tyr Ser Thr Ile Phe Ala Glu   1               5                  10                  15 Gly Asn Ile Ser Gln Pro Val Leu Met Asp Ile Asn Ala Val Leu Cys          20                  25                  30 Cys Pro Pro Ile Ala Leu Arg Asn Leu Ile Ile Ile Thr Trp Glu Ile      35                  40                  45 Ile Leu Arg Gly Gln Pro Ser Cys Thr Lys Ala Tyr Lys Lys Glu Thr  50                  55                  60 Asn Glu Thr Lys Glu Thr Asn Cys Thr Val Glu Arg Ile Thr Trp Val 65                   70                  75                  80 Ser Arg Pro Asp Gln Asn Ser Asp Leu Gln Ile Arg Pro Val Asp Thr              85                  90                  95 Thr His Asp Gly Tyr Tyr Arg Gly Ile Val Val Thr Pro Asp Gly Asn         100                 105                 110 Phe His Arg Gly Tyr His Leu Gln Val Leu Val Thr Pro Glu Val Asn     115                 120                 125 Leu Phe Gln Ser Arg Asn Ile Thr Ala Val Cys Lys Ala Val Thr Gly 130                 135                 140 Lys Pro Ala Ala Gln Ile Ser Trp Ile Pro Glu Gly Ser Ile Leu Ala 145                 150                 155                 160 Thr Lys Gln Glu Tyr Trp Gly Asn Gly Thr Val Thr Val Lys Ser Thr             165                 170                 175 Cys Pro Trp Glu Gly His Lys Ser Thr Val Thr Cys His Val Ser His         180                 185                 190 Leu Thr Gly Asn Lys Ser Leu Ser Val Lys Leu Asn Ser Gly Leu Arg     195                 200                 205 Thr Ser Gly Ser Pro Ala Leu Ser Leu Leu Ile Ile Leu Tyr Val Lys 210                 215                 220 Leu Ser Leu Phe Val Val Ile Leu Val Thr Thr Gly Phe Val Phe Phe 225                 230                 235                 240 Gln Arg Ile Asn His Val Arg Lys Val Leu             245                 250 <210>9 <211>1085 <212>DNA <213>未知 <220> <223>未知生物的描述:啮齿类动物;推测的肌肉 <220> <221>CDS <222>(1)..(582) <400>9 aga ggc cag cct tcc tgc ata atg gcc tac aaa gta gaa aca aag gag   48 Arg Gly Gln Pro Ser Cys Ile Met Ala Tyr Lys Val Glu Thr Lys Glu   1               5                  10                  15 acc aat gaa acc tgc ttg ggc agg aac atc acc tgg gcc tcc aca cct   96 Thr Asn Glu Thr Cys Leu Gly Arg Asn Ile Thr Trp Ala Ser Thr Pro          20                  25                  30 gac cac att cct gac ctt cag atc agt gcg gtg gcc ctc cag cat gag   144 Asp His Ile Pro Asp Leu Gln Ile Ser Ala Val Ala Leu Gln His Glu      35                  40                  45 ggg aat tac tta tgt gag ata aca aca cct gaa ggg aat ttc cat aaa   192 Gly Asn Tyr Leu Cys Glu Ile Thr Thr Pro Glu Gly Asn Phe His Lys  50                  55                  60 gtc tat gac ctc caa gtg ctg gtg ccc cct gaa gta acc tac ttt ctc   240 Val Tyr Asp Leu Gln Val Leu Val Pro Pro Glu Val Thr Tyr Phe Leu  65                  70                  75                  80 ggg gaa aat aga act gca gtt tgt gag gca atg gca ggc aag cct gct   288 Gly Glu Asn Arg Thr Ala Val Cys Glu Ala Met Ala Gly Lys Pro Ala              85                  90                  95 gca cag atc tct tgg act cca gat ggg gac tgt gtc act aag agt gag   336 Ala Gln Ile Ser Trp Thr Pro Asp Gly Asp Cys Val Thr Lys Ser Glu             100                 105                 110 tca cac agc aat ggc act gtg act gtc agg agc act tgc cac tgg gag   384 Ser His Ser Asn Gly Thr Val Thr Val Arg Ser Thr Cys His Trp Glu         115                 120                 125 cag aac aat gtg tct gct gtg tcc tgc att gtc tct cat tcg act ggt   432 Gln Asn Asn Val Ser Ala Val Ser Cys Ile Val Ser His Ser Thr Gly     130                 135                 140 aat cag tct ctg tcc ata gaa ctg agt aga ggt acc acc agc acc acc   480 Asn Gln Ser Leu Ser Ile Glu Leu Ser Arg Gly Thr Thr Ser Thr Thr 135                 150                 155                 160 cct tcc ttg ctg acc att ctc tac gtg aaa atg gtc ctt ttg ggg att   528 Pro Ser Leu Leu Thr Ile Leu Tyr Val Lys Met Val Leu Leu Gly Ile             165                 170                 175 att ctt ctt aaa gtg gga ttt gct ttc ttc cag aag aga aat gtt acc   576 Ile Leu Leu Lys Val Gly Phe Ala Phe Phe Gln Lys Arg Asn Val Thr         180                 185                 190 aga aca tgaatatcca gatttctgga agctcattag tctgatgaca cataccagaa    632 Arg Thr aacagcattt gtaatcaact ttctcattgg aatccagctt acccgtccct gctgtcttca 692 tgtttgttag acactcacct ccaaattctt aactgagaag ggctcctgtc taaaggaaat 752 atggggacaa attgtggagc atagaccaaa agaaaggcca tccagagact gccccaccta 812 aggacccatc ccatatacag acaccaaacc cagacactac tgaagatgct gcgaagcgtt 872 tgctgacagg agcctgttat agctgtctcc tgagaggctc agccagagcc tgacaaatac 932 ataggtagat gcttgcagcc aacaactgga ctgagcaaaa aatctccatt ggaggagtta 992 gagaaaggac tgaagagggt gaaagggttt gcagccccat aggaagaaca acaatatcaa 1052 ccaaccagat ctcccagagc tcccagggac taa                              1085 <210>10 <211>194 <212>PRT <213>未知 <400>10 Arg Gly Gln Pro Ser Cys Ile Met Ala Tyr Lys Val Glu Thr Lys Glu   1               5                  10                  15 Thr Asn Glu Thr Cys Leu Gly Arg Asn Ile Thr Trp Ala Ser Thr Pro          20                  25                  30 Asp His Ile Pro Asp Leu Gln Ile Ser Ala Val Ala Leu Gln His Glu      35                  40                  45 Gly Asn Tyr Leu Cys Glu Ile Thr Thr Pro Glu Gly Asn Phe His Lys  50                  55                  60 Val Tyr Asp Leu Gln Val Leu Val Pro Pro Glu Val Thr Tyr Phe Leu  65                  70                  75                  80 Gly Glu Asn Arg Thr Ala Val Cys Glu Ala Met Ala Gly Lys Pro Ala              85                  90                  95 Ala Gln Ile Ser Trp Thr Pro Asp Gly Asp Cys Val Thr Lys Ser Glu         100                 105                 110 Ser His Ser Asn Gly Thr Val Thr Val Arg Ser Thr Cys His Trp Glu     115                 120                 125 Gln Asn Asn Val Ser Ala Val Ser Cys Ile Val Ser His Ser Thr Gly 130                 135                 140 Asn Gln Ser Leu Ser Ile Glu Leu Ser Arg Gly Thr Thr Ser Thr Thr 145                 150                 155                 160 Pro Ser Leu Leu Thr Ile Leu Tyr Val Lys Met Val Leu Leu Gly Ile             165                 170                 175 Ile Leu Leu Lys Val Gly Phe Ala Phe Phe Gln Lys Arg Asn Val Thr         180                 185                 190 Arg Thr <210>11 <211>1354 <212>DNA <213>未知 <220> <223>未知生物的描述:啮齿类动物;推测的肌肉 <220> <221>CDS <222>(42)..(875) <220> <221>mat肽 <222>(117)..(875) <400>11 ggcacgagtt acgatttgtg cttaacctga ctccactcca g atg cat gct ttg ggg 56                                           Met His Ala Leu Gly                                           -25 agg act ctg gct ttg atg tta ctc atc ttc atc act att ttg gtg cct   104 Arg Thr Leu Ala Leu Met Leu Leu Ile Phe Ile Thr Ile Leu Val Pro -20                 -15                 -10                  -5 gag tca agt tgt tca gtg aaa gga cgg gag gag atc cca ccg gat gat   152 Glu Ser Ser Cys Ser Val Lys Gly Arg Glu Glu Ile Pro Pro Asp Asp          -1   1               5                  10 tca ttt cct ttt tca gat gat aat atc ttc cct gat gga gtg ggc gtc   200 Ser Phe Pro Phe Ser Asp Asp Asn Ile Phe Pro Asp Gly Val Gly Val      15                  20                  25 acc atg gag att gag att atc act cca gtg tct gta cag ata ggt atc   248 Thr Met Glu Ile Glu Ile Ile Thr Pro Val Ser Val Gln Ile Gly Ile  30                  35                  40 aag gct cag ctt ttc tgt cat cct agt cca tca aaa gaa gca aca ctt   296 Lys Ala Gln Leu Phe Cys His Pro Ser Pro Ser Lys Glu Ala Thr Leu  45                  50                  55                  60 aga ata tgg gaa ata act ccc aga gac tgg cct tcc tgc aga cta ccc   344 Arg Ile Trp Glu Ile Thr Pro Arg Asp Trp Pro Ser Cys Arg Leu Pro              65                  70                  75 tac aga gca gag ttg cag cag atc agt aaa aaa atc tgt act gag aga   392 Tyr Arg Ala Glu Leu Gln Gln Ile Ser Lys Lys Ile Cys Thr Glu Arg          80                  85                  90 gga acc act agg gtc cct gca cat cac cag agt tct gac ctt ccc atc   440 Gly Thr Thr Arg Val Pro Ala His His Gln Ser Ser Asp Leu Pro Ile      95                 100                 105 aaa tca atg gcc ctc aag cat gat ggg cat tac tca tgt cgg ata gaa   488 Lys Ser Met Ala Leu Lys His Asp Gly His Tyr Ser Cys Arg Ile Glu 110                 115                 120 aca aca gat ggg att ttc caa gag aga cat agc atc caa gtg cca ggg   536 Thr Thr Asp Gly Ile Phe Gln Glu Arg His Ser Ile Gln Val Pro Gly 125                 130                 135                 140 gaa aat aga act gta gtt tgt gag gca att gca agc aag cct gct atg   584 Glu Asn Arg Thr Val Val Cys Glu Ala Ile Ala Ser Lys Pro Ala Met             145                 150                 155 cag atc ttg tgg act cca gat gag gac tgt gtc act aag agt aaa tca   632 Gln Ile Leu Trp Thr Pro Asp Glu Asp Cys Val Thr Lys Ser Lys Ser         160                 165                 170 cac aat gac acc atg att gtc agg agc aag tgc cac agg gag aaa aac   680 His Asn Asp Thr Met Ile Val Arg Ser Lys Cys His Arg Glu Lys Asn     175                 180                 185 aat ggc cac agt gtg ttc tgc ttt atc tcc cat ttg act gat aac tgg   728 Asn Gly His Ser Val Phe Cys Phe Ile Ser His Leu Thr Asp Asn Trp 190                 195                 200 att ctc tcc atg gaa cag aat cga ggt aca acc agc atc ctg cct tcc   776 Ile Leu Ser Met Glu Gln Asn Arg Gly Thr Thr Ser Ile Leu Pro Ser 205                 210                 215                 220 ttg ctg agc att ctc tat gtg aaa ctg gct gta act gtt ctc atc gta   824 Leu Leu Ser Ile Leu Tyr Val Lys Leu Ala Val Thr Val Leu Ile Val             225                 230                 235 gga ttt gct ttt ttc cag aag aga aat tat ttc aga gtg cca gaa ggc   872 Gly Phe Ala Phe Phe Gln Lys Arg Asn Tyr Phe Arg Val Pro Glu Gly         240                 245                 250 tcc tgaggagagt ggtctgtggt taagatgaga tttaccacca tctgaaagac        925 Ser atcttgtcta ccgcgcagcg tgctgagatt ccgagaagca gccacagaac ctactaggaa 985 gacaaatctg atgtggttgt caatcctttc aatggacctg agtacttcta taaacccgag 1045 tgaggttgtg ctggacccag gagccaggct aggtcatata tgttgatttt tgctgcaaga 1105 cctcatggtt tatctacaaa tcctaaattc tttcacttcc agttttaaaa cttttggccc 1165 aagcatttta tccacagcat aacaccttta aagaaactct cccacggaaa ctgctggttc 1225 catggaatgg aaaattgcaa catggtttac aagacagtgc aaaccaagca gcattccaag 1285 atatgagctt cagaaagtta caggaactgt cttgggacga gaaagaagga ttaaatagtt 1345 cccagtccc                                                         1354 <210>12 <211>278 <212>PRT <213>未知 <400>12 Met His Ala Leu Gly Arg Thr Leu Ala Leu Met Leu Leu Ile Phe Ile -25                 -20                 -15                 -10 Thr Ile Leu Val Pro Glu Ser Ser Cys Ser Val Lys Gly Arg Glu Glu              -5              -1   1               5 Ile Pro Pro Asp Asp Ser Phe Pro Phe Ser Asp Asp Asn Ile Phe Pro      10                  15                  20 Asp Gly Val Gly Val Thr Met Glu Ile Glu Ile Ile Thr Pro Val Ser  25                  30                  35 Val Gln Ile Gly Ile Lys Ala Gln Leu Phe Cys His Pro Ser Pro Ser  40                  45                  50                  55 Lys Glu Ala Thr Leu Arg Ile Trp Glu Ile Thr Pro Arg Asp Trp Pro              60                  65                  70 Ser Cys Arg Leu Pro Tyr Arg Ala Glu Leu Gln Gln Ile Ser Lys Lys          75                  80                  85 Ile Cys Thr Glu Arg Gly Thr Thr Arg Val Pro Ala His His Gln Ser      90                  95                 100 Ser Asp Leu Pro Ile Lys Ser Met Ala Leu Lys His Asp Gly His Tyr 105                 110                 115 Ser Cys Arg Ile Glu Thr Thr Asp Gly Ile Phe Gln Glu Arg His Ser 120                 125                 130                 135 Ile Gln Val Pro Gly Glu Asn Arg Thr Val Val Cys Glu Ala Ile Ala             140                 145                 150 Ser Lys Pro Ala Met Gln Ile Leu Trp Thr Pro Asp Glu Asp Cys Val         155                 160                 165 Thr Lys Ser Lys Ser His Asn Asp Thr Met Ile Val Arg Ser Lys Cys     170                 175                 180 His Arg Glu Lys Asn Asn Gly His Ser Val Phe Cys Phe Ile Ser His 185                 190                 195 Leu Thr Asp Asn Trp Ile Leu Ser Met Glu Gln Asn Arg Gly Thr Thr 200                 205                 210                 215 Ser Ile Leu Pro Ser Leu Leu Ser Ile Leu Tyr Val Lys Leu Ala Val             220                 225                 230 Thr Val Leu Ile Val Gly Phe Ala Phe Phe Gln Lys Arg Asn Tyr Phe         235                 240                 245 Arg Val Pro Glu Gly Ser     250 <210>13 <211>981 <212>DNA <213>反向翻译 <220> <221>misc_特征 <222>(1)..(981) <223>n可以是a,c,g,或t <400>13 atgytntgyt tytggmgnac nwsncaygtn gcngtnytny tnathtgggg ngtnttygcn 60 gcngarwsnw sntgyccnga yaaraaycar acnatgcara ayaaywsnws nacnatgacn 120 gargtnaaya cnacngtntt ygtncaratg ggnaaraarg cnytnytntg ytgyccnwsn 180 athwsnytna cnaargtnat hytnathacn tggacnatha cnytnmgngg ncarccnwsn 240 tgyathathw sntayaargc ngayacnmgn garacncayg arwsnaaytg ywsngaymgn 300 wsnathacnt gggcnwsnac nccngayytn gcnccngayy tncarathws ngcngtngcn 360 ytncarcayg arggnmgnta ywsntgygay athgcngtnc cngayggnaa yttycaraay 420 athtaygayy tncargtnyt ngtnccnccn gargtnacnc ayttyccngg ngaraaymgn 480 acngcngtnt gygargcnat hgcnggnaar ccngcngcnc arathwsntg gacnccngay 540 ggngaytgyg tngcnaaraa ygarwsncay wsnaayggna cngtnacngt nmgnwsnacn 600 tgycaytggg arcarwsnca ygtnwsngtn gtnttytgyg tngtnwsnca yytnacnacn 660 ggnaaycarw snytnwsnat hgarytnggn mgnggnggng aycarytnyt nggnwsntay 720 athcartaya thathccnws nathathath ytnathatha thggntgyat htgyytnytn 780 aarathwsng gntgymgnaa rtgyaarytn ccnaarwsng gngcnacncc ngayathgar 840 gargaygara tgcarccnta ygcnwsntay acngaraarw snaayccnyt ntaygayacn 900 gtnacnacna cngargcnca yccngcnwsn carggnaarg tnaayggnac ngaytgyytn 960 acnytnwsng cnatgggnat h                                           981 <210>14 <211>885 <212>DNA <213>反向翻译 <220> <221>misc_特征 <222>(1)..(885) <223>n可以是a,c,g,或t <400>14 atgytntgyc cntggmgnac ngcnaayytn ggnytnytny tnathytnac nathttyytn 60 gtngcngarg cngarggngc ngcncarccn aayagywsny tnatgytnca racnwsnaar 120 garaaycayg cnytngcnws nwsnwsnytn tgyatggayg araarcarat hacncaraay 180 taywsnaarg tnytngcnga rgtnaayacn wsntggccng tnaaratggc nacnaaygcn 240 gtnytntgyt gyccnccnat hgcnytnmgn aayytnatha thathacntg ggarathath 300 ytnmgnggnc arccnwsntg yacnaargcn tayaaraarg aracnaayga racnaargar 360 acnaaytgya cngaygarmg nathacntgg gtnwsnmgnc cngaycaraa ywsngayytn 420 carathmgna cngtngcnat hacncaygay ggntaytaym gntgyathat ggtnacnccn 480 gayggnaayt tycaymgngg ntaycayytn cargtnytng tnacnccnga rgtnacnytn 540 ttycaraaym gnaaymgnac ngcngtntgy aargcngtng cnggnaarcc ngcngcncay 600 athwsntgga thccngargg ngaytgygcn gcnaarcarg artaytggws naayggnacn 660 gtnacngtna arwsnacntg ycaytgggar gtncayaayg tnwsnacngt nacntgycay 720 gtnwsncayy tnacnggnaa yaarwsnytn tayathgary tnytnccngt nccnggngcn 780 aaraarathw snaarathat htaywsnath taycayccnt aytaytayta yytngaycay 840 mgnggnathc ayytngtngt ngarwsncar tggytncara arath                 885 <210>15 <211>978 <212>DNA <213>反向翻译 <220> <221>misc_特征 <222>(1)..(978) <223>n可以是a,c,g,或t <400>15 atgttytgyt tytggmgnac nwsngcnytn gcngtnytny tnathtgggg ngtnttygtn 60 gcnggnwsnw sntgyacnga yaaraaycar acnacncara ayaaywsnws nwsnccnytn 120 acncargtna ayacnacngt nwsngtncar athggnacna argcnytnyt ntgytgytty 180 wsnathccny tnacnaargc ngtnytnath acntggatha thaarytnmg nggnytnccn 240 wsntgyacna thgcntayaa rgtngayacn aaracnaayg aracnwsntg yytnggnmgn 300 aayathacnt gggcnwsnac nccngaycay wsnccngary tncarathws ngcngtnacn 360 ytncarcayg arggnacnta yacntgygar acngtnacnc cngarggnaa yttygaraar 420 aaytaygayy tncargtnyt ngtnccnccn gargtnacnt ayttyccnga raaraaymgn 480 wsngcngtnt gygargcnat ggcnggnaar ccngcngcnc arathwsntg gwsnccngay 540 ggngaytgyg tnacnacnws ngarwsncay wsnaayggna cngtnacngt nmgnwsnacn 600 tgycaytggg arcaraayaa ygtnwsngay gtnwsntgya thgtnwsnca yytnacnggn 660 aaycarwsny tnwsnathga rytnwsnmgn ggnggnaayc arwsnytnmg nccntayath 720 ccntayatha thccnwsnat hathathytn athathathg gntgyathtg yytnytnaar 780 athwsnggnt tymgnaartg yaarytnccn aarytngarg cnacnwsngc nathgargar 840 gaygaratgc arccntaygc nwsntayacn garaarwsna ayccnytnta ygayacngtn 900 acnaargtng argcnttycc ngtnwsncar ggngargtna ayggnacnga ytgyytnacn 960 ytnwsngcna thggnath                                               978 <210>16 <211>750 <212>DNA <213>反向翻译 <220> <221>misc_特征 <222>(1)..(750) <223>n可以是a,c,g,或t <400>16 atgggnggna arcaratgac ncaraaytay wsnacnatht tygcngargg naayathwsn 60 carccngtny tnatggayat haaygcngtn ytntgytgyc cnccnathgc nytnmgnaay 120 ytnathatha thacntggga rathathytn mgnggncarc cnwsntgyac naargcntay 180 aaraargara cnaaygarac naargaracn aaytgyacng tngarmgnat hacntgggtn 240 wsnmgnccng aycaraayws ngayytncar athmgnccng tngayacnac ncaygayggn 300 taytaymgng gnathgtngt nacnccngay ggnaayttyc aymgnggnta ycayytncar 360 gtnytngtna cnccngargt naayytntty carwsnmgna ayathacngc ngtntgyaar 420 gcngtnacng gnaarccngc ngcncarath wsntggathc cngarggnws nathytngcn 480 acnaarcarg artaytgggg naayggnacn gtnacngtna arwsnacntg yccntgggar 540 ggncayaarw snacngtnac ntgycaygtn wsncayytna cnggnaayaa rwsnytnwsn 600 gtnaarytna aywsnggnyt nmgnacnwsn ggnwsnccng cnytnwsnyt nytnathath 660 ytntaygtna arytnwsnyt nttygtngtn athytngtna cnacnggntt ygtnttytty 720 carmgnatha aycaygtnmg naargtnytn                                  750 <210>17 <211>582 <212>DNA <213>反向翻译 <220> <221>misc_特征 <222>(1)..(582) <223>n可以是a,c,g,或t <400>17 mgnggncarc cnwsntgyat hatggcntay aargtngara cnaargarac naaygaracn 60 tgyytnggnm gnaayathac ntgggcnwsn acnccngayc ayathccnga yytncarath 120 wsngcngtng cnytncarca ygarggnaay tayytntgyg arathacnac nccngarggn 180 aayttycaya argtntayga yytncargtn ytngtnccnc cngargtnac ntayttyytn 240 ggngaraaym gnacngcngt ntgygargcn atggcnggna arccngcngc ncarathwsn 300 tggacnccng ayggngaytg ygtnacnaar wsngarwsnc aywsnaaygg nacngtnacn 360 gtnmgnwsna cntgycaytg ggarcaraay aaygtnwsng cngtnwsntg yathgtnwsn 420 caywsnacng gnaaycarws nytnwsnath garytnwsnm gnggnacnac nwsnacnacn 480 ccnwsnytny tnacnathyt ntaygtnaar atggtnytny tnggnathat hytnytnaar 540 gtnggnttyg cnttyttyca raarmgnaay gtnacnmgna cn                    582 <210>18 <211>834 <212>DNA <213>反向翻译 <220> <221>misc_特征 <222>(1)..(834) <223>n可以是a,c,g,或t <400>18 atgcaygcny tnggnmgnac nytngcnytn atgytnytna thttyathac nathytngtn 60 ccngarwsnw sntgywsngt naarggnmgn gargarathc cnccngayga ywsnttyccn 120 ttywsngayg ayaayathtt yccngayggn gtnggngtna cnatggarat hgarathath 180 acnccngtnw sngtncarat hggnathaar gcncarytnt tytgycaycc nwsnccnwsn 240 aargargcna cnytnmgnat htgggarath acnccnmgng aytggccnws ntgymgnytn 300 ccntaymgng cngarytnca rcarathwsn aaraaratht gyacngarmg nggnacnacn 360 mgngtnccng cncaycayca rwsnwsngay ytnccnatha arwsnatggc nytnaarcay 420 gayggncayt aywsntgymg nathgaracn acngayggna thttycarga rmgncaywsn 480 athcargtnc cnggngaraa ymgnacngtn gtntgygarg cnathgcnws naarccngcn 540 atgcarathy tntggacncc ngaygargay tgygtnacna arwsnaarws ncayaaygay 600 acnatgathg tnmgnwsnaa rtgycaymgn garaaraaya ayggncayws ngtnttytgy 660 ttyathwsnc ayytnacnga yaaytggath ytnwsnatgg arcaraaymg nggnacnacn 720 wsnathytnc cnwsnytnyt nwsnathytn taygtnaary tngcngtnac ngtnytnath 780 gtnggnttyg cnttyttyca raarmgnaay tayttymgng tnccngargg nwsn       834 <210>19 <211>1047 <212>DNA <213>未知 <220> <223>未知生物的描述:灵长类动物,推测的人类 <220> <221>CDS <222>(1)..(1044) <220> <221>mat_肽 <222>(79)..(1044) <400>19 atg ctc tgc cct tgg aga act gct aac cta ggg cta ctg ttg att ttg   48 Met Leu Cys Pro Trp Arg Thr Ala Asn Leu Gly Leu Leu Leu Ile Leu -25                 -20                 -15 act atc ttc tta gtg gcc gaa gcg gag ggt gct gct caa cca aac aac   96 Thr Ile Phe Leu Val Ala Glu Ala Glu Gly Ala Ala Gln Pro Asn Asn -10                  -5              -1   1               5 tca tta atg ctg caa act agc aag gag aat cat gct tta gct tca agc   144 Ser Leu Met Leu Gln Thr Ser Lys Glu Asn His Ala Leu Ala Ser Ser          10                  15                  20 agt tta tgt atg gat gaa aaa cag att aca cag aac tac tcg aaa gta   192 Ser Leu Cys Met Asp Glu Lys Gln Ile Thr Gln Asn Tyr Ser Lys Val      25                  30                  35 ctc gca gaa gtt aac act tca tgg cct gta aag atg gct aca aat gct   240 Leu Ala Glu Val Asn Thr Ser Trp Pro Val Lys Met Ala Thr Asn Ala  40                  45                  50 gtg ctt tgt tgc cct cct atc gca tta aga aat ttg atc ata ata aca   288 Val Leu Cys Cys Pro Pro Ile Ala Leu Arg Asn Leu Ile Ile Ile Thr  55                  60                  65                  70 tgg gaa ata atc ctg aga ggc cag cct tcc tgc aca aaa gcc tac agg   336 Trp Glu Ile Ile Leu Arg Gly Gln Pro Ser Cys Thr Lys Ala Tyr Arg              75                  80                  85 aaa gaa aca aat gag acc aag gaa acc aac tgt act gat gag aga ata   384 Lys Glu Thr Asn Glu Thr Lys Glu Thr Asn Cys Thr Asp Glu Arg Ile          90                  95                 100 acc tgg gtc tcc aga cct gat cag aat tcg gac ctt cag att cgt cca   432 Thr Trp Val Ser Arg Pro Asp Gln Asn Ser Asp Leu Gln Ile Arg Pro     105                 110                 115 gtg gcc atc act cat gac ggg tat tac aga tgc ata atg gta aca cct   480 Val Ala Ile Thr His Asp Gly Tyr Tyr Arg Cys Ile Met Val Thr Pro 120                 125                 130 gat ggg aat ttc cat cgt gga tat cac ctc caa gtg tta gtt aca cct   528 Asp Gly Asn Phe His Arg Gly Tyr His Leu Gln Val Leu Val Thr Pro 135                 140                 145                 150 gaa gtg acc ctg ttt caa aac agg aat aga act gca gta tgc aag gca   576 Glu Val Thr Leu Phe Gln Asn Arg Asn Arg Thr Ala Val Cys Lys Ala             155                 160                 165 gtt gca ggg aag cca gct gcg cag atc tcc tgg atc cca gag ggc gat   624 Val Ala Gly Lys Pro Ala Ala Gln Ile Ser Trp Ile Pro Glu Gly Asp         170                 175                 180 tgt gcc act aag caa gaa tac tgg agc aat ggc aca gtg act gtt aag   672 Cys Ala Thr Lys Gln Glu Tyr Trp Ser Asn Gly Thr Val Thr Val Lys     185                 190                 195 agt aca tgc cac tgg gag gtc cac aat gtg tct acc gtg acc tgc cac   720 Ser Thr Cys His Trp Glu Val His Asn Val Ser Thr Val Thr Cys His 200                 205                 210 gtc tcc cat ttg act ggc aac aag agt ctg tac ata gag cta ctt cct   768 Val Ser His Leu Thr Gly Asn Lys Ser Leu Tyr Ile Glu Leu Leu Pro 215                 220                 225                 230 gtt cca ggt gcc aaa aaa tca gca aaa tta tat att cca tat atc atc   816 Val Pro Gly Ala Lys Lys Ser Ala Lys Leu Tyr Ile Pro Tyr Ile Ile             235                 240                 245 ctt act att att att ttg acc atc gtg gga ttc att tgg ttg ttg aaa   864 Leu Thr Ile Ile Ile Leu Thr Ile Val Gly Phe Ile Trp Leu Leu Lys         250                 255                 260 gtc aat ggc tgc aga aaa tat aaa ttg aat aaa aca gaa tct act cca   912 Val Asn Gly Cys Arg Lys Tyr Lys Leu Asn Lys Thr Glu Ser Thr Pro     265                 270                 275 gtt gtt gag gag gat gaa atg cag ccc tat gcc agc tac aca gag aag   960 Val Val Glu Glu Asp Glu Met Gln Pro Tyr Ala Ser Tyr Thr Glu Lys 280                 285                 290 aac aat cct ctc tat gat act aca aac aag gtg aag gca tct cag gca   1008 Asn Asn Pro Leu Tyr Asp Thr Thr Asn Lys Val Lys Ala Ser Gln Ala 295                 300                 305                 310 tta caa agt gaa gtt gac aca gac ctc cat act tta taa               1047 Leu Gln Ser Glu Val Asp Thr Asp Leu His Thr Leu             315                 320 <210>20 <211>348 <212>PRT <213>未知 <400>20 Met Leu Cys Pro Trp Arg Thr Ala Asn Leu Gly Leu Leu Leu Ile Leu -25                 -20                 -15 Thr Ile Phe Leu Val Ala Glu Ala Glu Gly Ala Ala Gln Pro Asn Asn -10                 -5               -1   1               5 Ser Leu Met Leu Gln Thr Ser Lys Glu Asn His Ala Leu Ala Ser Ser          10                  15                  20 Ser Leu Cys Met Asp Glu Lys Gln Ile Thr Gln Asn Tyr Ser Lys Val      25                  30                  35 Leu Ala Glu Val Asn Thr Ser Trp Pro Val Lys Met Ala Thr Asn Ala  40                  45                  50 Val Leu Cys Cys Pro Pro Ile Ala Leu Arg Asn Leu Ile Ile Ile Thr  55                  60                  65                  70 Trp Glu Ile Ile Leu Arg Gly Gln Pro Ser Cys Thr Lys Ala Tyr Arg              75                  80                  85 Lys Glu Thr Asn Glu Thr Lys Glu Thr Asn Cys Thr Asp Glu Arg Ile          90                  95                 100 Thr Trp Val Ser Arg Pro Asp Gln Asn Ser Asp Leu Gln Ile Arg Pro     105                 110                 115 Val Ala Ile Thr His Asp Gly Tyr Tyr Arg Cys Ile Met Val Thr Pro 120                 125                 130 Asp Gly Asn Phe His Arg Gly Tyr His Leu Gln Val Leu Val Thr Pro 135                 140                 145                 150 Glu Val Thr Leu Phe Gln Asn Arg Asn Arg Thr Ala Val Cys Lys Ala             155                 160                 165 Val Ala Gly Lys Pro Ala Ala Gln Ile Ser Trp Ile Pro Glu Gly Asp         170                 175                 180 Cys Ala Thr Lys Gln Glu Tyr Trp Ser Asn Gly Thr Val Thr Val Lys     185                 190                 195 Ser Thr Cys His Trp Glu Val His Asn Val Ser Thr Val Thr Cys His 200                 205                 210 Val Ser His Leu Thr Gly Asn Lys Ser Leu Tyr Ile Glu Leu Leu Pro 215                 220                 225                 230 Val Pro Gly Ala Lys Lys Ser Ala Lys Leu Tyr Ile Pro Tyr Ile Ile             235                 240                 245 Leu Thr Ile Ile Ile Leu Thr Ile Val Gly Phe Ile Trp Leu Leu Lys         250                 255                 260 Val Asn Gly Cys Arg Lys Tyr Lys Leu Asn Lys Thr Glu Ser Thr Pro     265                 270                 275 Val Val Glu Glu Asp Glu Met Gln Pro Tyr Ala Ser Tyr Thr Glu Lys 280                 285                 290 Asn Asn Pro Leu Tyr Asp Thr Thr Asn Lys Val Lys Ala Ser Gln Ala 295                 300                 305                 310 Leu Gln Ser Glu Val Asp Thr Asp Leu His Thr Leu             315                 320 <210>21 <211>1044 <212>DNA <213>反向翻译 <220> <221>misc_特征 <222>(1)..(1044) <223>n可以是a,c,g,或t <400>21 atgytntgyc cntggmgnac ngcnaayytn ggnytnytny tnathytnac nathttyytn 60 gtngcngarg cngarggngc ngcncarccn aayaaywsny tnatgytnca racnwsnaar 120 garaaycayg cnytngcnws nwsnwsnytn tgyatggayg araarcarat hacncaraay 180 taywsnaarg tnytngcnga rgtnaayacn wsntggccng tnaaratggc nacnaaygcn 240 gtnytntgyt gyccnccnat hgcnytnmgn aayytnatha thathacntg ggarathath 300 ytnmgnggnc arccnwsntg yacnaargcn taymgnaarg aracnaayga racnaargar 360 acnaaytgya cngaygarmg nathacntgg gtnwsnmgnc cngaycaraa ywsngayytn 420 carathmgnc cngtngcnat hacncaygay ggntaytaym gntgyathat ggtnacnccn 480 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特别是,它提供可以调节发育和/或免疫系统的试剂或方法。
还描述了这些材料的诊断和治疗用途。
                      发明背景 OX2抗原(OX2)是一种在各种细胞,包括胸腺细胞,B淋巴细胞, 活化的T淋巴细胞,神经元,内皮细胞,和滤泡树突细胞上鉴定的细 胞表面蛋白。
Barclay(1981)Immunology 44:727-736。
序列分析表 明,它是一种包含两种胞外免疫球蛋白-样(Ig-样)区和短胞质区的 跨膜蛋白。
Clark等,(1985)EMBO J.4:113-118。
此区的构成较 普通且可以在多种不同的白细胞表面蛋白中找到。
Barclay等, (1997)Leucocyte Antigens Factsbook(2d.ed.)Academic Press, 伦敦。
这些类型的蛋白常常与其它也具有Ig-样区的细胞表面上的其 它蛋白相互作用。
OX2抗原的分布与一种假说相一致,即OX2通过结合配偶体,例 如OX2受体(OX2R),交换信号至白细胞谱系内的细胞内,其中该白 细胞谱系包括巨嗜细胞,其表达受体(Preston等,(1997) Eur.J.Immunol.27:1911-1918),和单核细胞-巨嗜细胞谱系的其 它细胞。
且,OX2还可能参与在巨嗜细胞各种功能的调节。
在此情况 中,例如,OX2在神经元上的表达可以建立了一种可以表达OX2R的, 被称作小胶质细胞的脑停留巨嗜细胞的直接通讯方法,因为它们来源 于单核细胞-巨嗜细胞谱系。
Perry和Gordon(1988)Trends Neurosci. 11:273-277。
通常,巨嗜细胞的缺损或过度活化造成免疫疾病和其它疾病的广 范围发病。
见,例如,McGee等,(eds.1992)Oxford Textbook of Pathology Oxford University Press,Oxford;Lewis 和 McGee(eds.1992)The Macrophage IRL Press,Oxford;和Bock和 Goode(eds.1997)The Molecular Basis of Cellular Defence Mechanisms Wilev & Sons。
且,OX2的相互作用蛋白,例如,OX2抗原的OX2R的鉴定较困难, 这是因为相互作用的亲和力通常非常低。
这意味着细胞表面蛋白的重 组形式,例如,OX2,与其结合配偶体,相互作用的蛋白,例如,OX2R 的结合不够稳定,以致不能用普通方法检测。
因而,CD48和CD2间的 相互作用,它们的配偶体在其胞外区均含两个Ig-样区,具有第二部 分的半衰期。
见,Van der Merwe等,(1993)Biochem.Soc.Trahs. 21:340S;和Van der Merwe和Barclay(1994)Trends Biochem.Sci. 19:354-358。
细胞表面蛋白,如OX2的重组形式可以通过很多方法制成多价 体,并用于检测新的蛋白。
已经用基因工程方法改造了OX2,以包括 来源于CD4的两个Ig-样区的标记物。
重组可溶性蛋白是通过常规表 达方法在真核细胞中表达的。
在早期的研究中,相互作用是在荧光颗 粒和小鼠巨嗜细胞上的多价重组OX2蛋白间观察的。
Preston等, (1997)Eur.J.Immunol.27:1911-1918。
尽管如此,通过阻断抗体OX89,在小鼠巨嗜细胞上鉴定OX2R还 未成功。
Preston等,(1997)Eur.J.Immunol.27:1911-1918。
如前所述,新的OX2-样分子受体的发现,鉴定,和理解是非常有 利的。
本发明提供OX2配位体新的受体同系物,和相关的化合物,及 它们的使用方法。
                      发明概述 本发明涉及被称作OX2的配位体的新受体同系物,例如,啮齿类 动物和灵长类动物的实施方案。
这些通常被称作OX2的受体同系物 (OX2RH),有来源于各种啮齿类动物和灵长类动物物种的实施方案。
已经建立了两种确实结合各物种OX2的受体同系物。
特别是,提供被 称作OX2RH1,OX2RH2,OX2RH3,和OX2RH4的同系物的描述。
它包括编 码多肽自身的核酸,和它们的生产和使用方法。
本发明核酸的特征部 分在于,它与本发明所包括的克隆互补DNA(cDNA)序列的同源性。
本发明人已经生产出了一种新的,大鼠巨嗜细胞上OX2R的单克 隆抗体(mAb),称作OX102,其阻断OX2和OX2R之间的相互作用。
它们已经被分离并表征大鼠OX2R的基因和多肽。
其中提供大鼠OX2R 的核酸分子和多肽(预测的氨基酸序列)的序列。
从相似蛋白类推, 本发明人教导人类OX2R的核苷酸和氨基酸序列与相应大鼠的OX2R序 列至少50%同源。
大鼠OX2R cDNA和预测的OX2R多肽序列的有效性 能够鉴定等价的人类OX2R序列,或者通过筛选已知的人类序列,或 通过细胞杂交或PCR技术分离人类的核酸。
大的胞质序列在OX2R多肽中的存在表明OX2R在巨嗜细胞功能中 具有某些作用,信号产生或与胞质成分相互作用。
因而,本发明提供 基于OX2R的试剂,其模拟或识别OX2R的多肽或核酸序列,例如被设 计与OX2R结合位点反应的分子实体,相对于OX2R或反义序列培养的 mAbs,该试剂构成治疗上有效的化合物,用于修饰携带OX2和/或OX2R 细胞表面蛋白的细胞(例如,巨嗜细胞,活化的淋巴细胞,神经元, 内皮细胞,树突细胞,胸腺细胞,和B淋巴细胞)的功能,提高或抑 制细胞的活性。
因而,基于OX2R的试剂,其模拟或者识别OX2R的多 肽或核酸序列,具有潜在的,控制巨嗜细胞较宽范围的功能,包括对 细菌感染,自身免疫疾病等应答的作用。
因为OX2R的胞外区与OX2相互作用,因而本发明人提供一种筛 选影响(积极地或消极地)OX2和OX2R间结合的侯选化合物的方法。
因此,本发明提供的OX2R可用于检测抑制OX2和OX2R间相互作用的 化合物,并因此可能影响巨嗜细胞和免疫系统其它细胞,如淋巴细胞 或滤泡树突细胞间的相互作用。
大鼠OX2R的核酸和氨基酸序列在表1中列出。
下面陈述本发明 的各个方面。
根据详细的描述,其它方面是很清楚的。
因此,在第一方面中,本发明提供一种含多肽的物质,该多肽具 有表1中列出的氨基酸序列。
在另一方面中,本发明提供一种含多肽的物质,该多肽至少50% 的氨基酸序列与表1中列出的氨基酸序列相同。
在另一方面中,本发明提供一种多肽,其是上述多肽的突变体, 变体,衍生物或等位基因,且其具有全长OX2R的特性,例如,与OX2 或全长OX2R抗体的结合能力。
在另一方面中,本发明提供一种物质,其是上述多肽的片段(例 如,具有表1中列出的氨基酸序列的多肽片段),该片段显示全长OX2R 蛋白的特性。
例如,该片段可以与OX2蛋白或全长OX2R蛋白的抗体 结合。
在其中一个实施方案中,该片段包括部分或全部的OX2R胞质 区或该区的活性部分。
在另一个实施方案中,该片段包括部分或全部 的OX2R胞外区或该区的活性部分。
因为胞外区被认为决定与OX2相 互作用,本发明包括部分或全部胞外区的这种片段可用于筛选干预 OX2和OX2R间结合的侯选化合物。
因此,本发明提供筛选侯选化合物的材料和方法,该侯选化合物 可能具有干预巨嗜细胞和其它细胞,包括胸腺细胞,B淋巴细胞,活 化的T淋巴细胞,神经元,内皮细胞和滤泡树突细胞间OX2/OX2R相 互作用的能力。
上述多肽和片段可以是重组的和/或分离的多肽。
在另一方面中,本发明提供一种物质,该物质包含具有表1核苷 酸序列的核酸。
本发明还提供一种物质,其包含编码上述多肽或片段 的核酸分子。
因而,表1列出编码OX2R多肽的示例性核酸分子的cDNA 序列。
该核酸分子至少50%的序列与表1核酸序列同源。
本发明还提供一种含核酸分子的物质,该核酸分子具有部分表1 的编码核苷酸序列。
该物质包含部分表1的编码核苷酸序列,它是 OX2R基因特征的一部分。
因而,该部分可以编码上述多肽片段,其与 OX2或全长OX2R的抗体结合。
选择性地,该部分可以包含至少4-7 个表1核苷酸序列的连续密码子,常常是至少7-9个连续密码子,典 型地至少9-13个连续密码子,最优选地,至少20-30个连续密码子。
选择性地,该部分可以编码至少4-7个表1核苷酸序列的连续氨基 酸,常常是至少7-9个连续氨基酸,典型地至少约9-13个连续氨基 酸,最优选地,至少约20-30个连续氨基酸。
上述核酸分子可以是重组的和/或分离的。
在另一方面中,本发明提供含此处提供的OX2R核酸的载体,例 如,表达载体,其中OX2R核酸序列是可操作连接到控制序列上的, 以指导其表达。
还提供用这种载体转化的宿主细胞。
本发明还提供一 种生产OX2R多肽的方法,包括培养这种宿主细胞并分离所生产的 OX2R多肽。
在另一方面中,本发明提供一种表达宿主细胞中OX2R的方法, 该方法包括将上述核酸分子插入宿主细胞的步骤,并提供所述核酸分 子在宿主细胞中表达的条件。
该方法可以使用表达载体。
在另一方面中,本发明提供一种组合物,其包含上述OX2R多肽 或片段的可溶性形式,该组合物还可以任选地包括辅剂,药物载体, 或赋形剂。
该组合物可用于,例如,生产应答OX2R多肽的抗体。
在另一方面中,本发明提供上述OX2R多肽和核酸分子,以用于 筛选侯选化合物,该侯选化合物有可能被用作治疗剂。
本发明提供上 述OX2R多肽或片段在筛选物质中的用途,该物质对于治疗细菌感染, 自身免疫疾病等的治疗可能是有效的。
本发明还提供OX2R多肽,多肽片段,和核酸鉴定OX2R而非OX2 配位体的用途。
本发明还提供OX2R多肽,多肽片段,和核酸用于设 计OX2模拟(mimics)的用途。
在另一方面中,本发明提供能够特异性结合上述OX2R多肽,多 肽片段,和核酸的抗体,和包含这种抗体的组合物。
这些抗体可用于 检测和量化OX2R存在的测定方法中,和纯化OX2R的方法中。
该抗体 可以是多克隆的。
优选地,该抗体是IgG抗体,更优选单克隆IgG抗 体。
在另一方面中,本发明提供此处提供的OX2R多肽,多肽片段, 和核酸分子生产结合分子的用途,如具有一个或多个抗体区的物质, 其可阻断OX2和OX2R间的相互作用。
这些分子可被包括在一种组合 物中,该组合物在制备治疗细菌感染,自身免疫疾病等的药物中可能 是有用的。
结合分子是抗体,它们可以是IgG抗体,优选单克隆IgG 抗体。
在另一方面中,本发明提供上述OX2R核酸在设计反义寡核苷酸 中的用途,以限制OX2R在巨嗜细胞中的表达,例如硫代磷酸寡核苷 酸或胆固醇-连接的寡核苷酸,其可以促进寡核苷酸的内在化和稳定 化。
在另一方面中,本发明提供一种扩增核酸试验样品的方法,其包 含用自此处提供的序列信息所得到的引物寡核苷酸引发核酸聚合酶 反应。
该核酸试验样品可以是人的,以便使用这种方法扩增编码人 OX2R的核酸。
在另一方面中,本发明提供一种从除大鼠外的物种的OX2R,例 如,人OX2R得到编码部分或全部OX2R的核酸分子的方法,其包含用 一种核酸探针探测感兴趣的物种的核酸试验样品,该核酸探针是从此 处提供的序列信息得到的。
在另一方面中,本发明提供一种从除大鼠外的物种得到OX2R多 肽序列的方法,例如人OX2R,其包含检索数据库,寻找与此处(表1) 提供的OX2R氨基酸序列至少50%同源的多肽序列而获得。
同样地,来 源于除大鼠外的物种,例如,人OX2R的OX2R核酸序列可以通过检索 数据库寻找与此处提供的OX2R核苷酸序列至少50%同源的核苷酸序 列而得到。
本发明还提供此处提供的核酸序列信息在搜索OX2R基因中的突 变的用途,例如,使用单链构象多态性(SSCP)技术。
本发明提供一种组合物,其中的物质选自:一种基本上纯的或重 组的多肽,该多肽包含至少具有四个与SEQ ID NO:2区段相同的氨基 酸的至少三个分离的非重叠区段;一种基本上纯的或重组的多肽,该 多肽包含至少具有五个与SEQ ID NO:2区段相同的氨基酸的至少两个 分离的非重叠区段;一种天然序列的啮齿类动物多肽,包含成熟的SEQ ID NO:2;一种包含大鼠OX2RH1序列的融合多肽;一种基本上纯的或 重组的多肽,该多肽包含至少具有四个与SEQ ID NO:4区段相同的氨 基酸的至少三个分离的非重叠区段;一种基本上纯的或重组的多肽, 该多肽包含至少具有五个与SEQ ID NO:4区段相同的氨基酸的至少两 个分离的非重叠区段;一种天然序列的啮齿类动物OX2RH1多肽,包 含成熟的SEQ ID NO:4;一种包含人OX2RH1序列的融合多肽;一种 基本上纯的或重组的多肽,该多肽包含至少具有四个与SEQ ID NO:6 区段相同的氨基酸的至少三个分离的非重叠区段;一种基本上纯的或 重组的多肽,该多肽包含至少具有五个与SEQ ID NO:6区段相同的氨 基酸的至少两个分离的非重叠区段;一种天然序列的啮齿类动物 OX2RH1多肽,包含成熟的SEQ ID NO:6;一种包含小鼠OX2RH1序列 的融合多肽;一种基本上纯的或重组的多肽,该多肽包含至少具有四 个与SEQ ID NO:8区段相同的氨基酸的至少3个分离的非重叠区段; 一种基本上纯的或重组的多肽,该多肽包含至少具有五个与SEQ ID NO:8区段相同的氨基酸的至少两个分离的非重叠区段;一种天然序列 啮齿类动物OX2RH1多肽,该多肽包含成熟的SEQ ID NO:8;一种包 含人OX2RH2序列的融合多肽;一种基本上纯的或重组的多肽,该多 肽包含至少具有四个与SEQ ID NO:10区段相同的氨基酸的至少三个 分离的非重叠区段;一种基本上纯的或重组的多肽,该多肽包含至少 具有五个与SEQ ID NO:10区段相同的氨基酸的至少两个分离的非重 叠区段;一种天然序列的啮齿类动物OX2RH2多肽,该多肽包含成熟 的SEQ ID NO:10;一种包含小鼠OX2RH2序列的融合多肽;一种基本 上纯的或重组的多肽,该多肽包含至少具有四个与SEQ ID NO:12区 段相同的氨基酸的至少三个分离的非重叠区段;一种基本上纯的或重 组的多肽,该多肽包含至少具有五个与SEQ ID NO:12区段相同的氨 基酸的至少两个分离的非重叠区段;一种天然序列啮齿类动物OX2RH3 多肽,该多肽包含成熟的SEQ ID NO:12;一种包含小鼠OX2RH3序列 的融合多肽;一种基本上纯的或重组的多肽,该多肽包含至少具有四 个与SEQ ID NO:20区段相同的氨基酸的至少三个分离的非重叠区段; 一种基本上纯的或重组的多肽,该多肽包含至少具有五个与SEQ ID NO:20区段相同的氨基酸的至少两个分离的非重叠区段;一种天然序 列灵长类动物OX2RH1.2多肽,该多肽包含成熟的SEQ ID NO:20;一 种包含灵长类动物OX2RH1.2序列的融合多肽;一种基本上纯的或重 组的多肽,该多肽包含至少具有四个与SEQ ID NO:23区段相同的氨 基酸的至少三个分离的非重叠区段;一种基本上纯的或重组的多肽, 该多肽包含至少具有五个与SEQ ID NO:23区段相同的氨基酸的至少 两个分离的非重叠区段;一种天然序列啮齿类动物OX2RH4多肽,该 多肽包含成熟的SEQ ID NO:23;一种包含小鼠OX2RH4序列的融合多 肽。
某些优选的实施方案包括,其中分离的非重叠区段的同一性:包 括至少八个氨基酸中的一个;包括至少四个氨基酸中的一个和至少五 个氨基酸中的第二个,包括四,五,和六个氨基酸中的至少三个区段, 或包括至少十二个氨基酸中的一个。
其它优选的实施方案包括那些其 中:a)OX2RH1多肽:包含表1或2的成熟序列;一种OX2RH多肽的 非糖基化形式;来源于灵长类动物,如人;来源于啮齿类动物,如大 鼠或小鼠;包含SEQ ID NO:2,4,6,或20的至少十七个氨基酸;显示 SEQ ID NO:2,4,6,或20的至少七个氨基酸的至少四个非重叠区段; OX2RH1的天然等位变体;具有至少约30个氨基酸的长度;显示至少 两个非重叠的抗原决定部位,其对于灵长类动物或啮齿类动物的 OX2RH1是特异性的;糖基化的;具有至少30kD的分子量且天然糖基 化;一种合成的多肽;附着在固体基质上;接合到其它化学部分上; 是自天然序列5-折或更少的置换;或是来源于天然序列的缺失或插入 变体;b)OX2RH2多肽:包括表2的成熟序列;是OX2RH2多肽的一种 非糖基化形式;来源于灵长类动物,如人;来源于啮齿类动物,如小 鼠;包含至少十七个SEQ ID NO:8或10的氨基酸;显示SEQ ID NO:8 或10的至少七个氨基酸的至少四个非重叠区段;是OX2RH2的天然等 位变体;具有至少大约30个氨基酸的长度;显示至少两个非重叠的 抗原决定部位,其对于灵长类动物或啮齿类动物的OX2RH2是特异性 的;是糖基化的;具有至少30kD的分子量且天然糖基化;是一种合 成的多肽;附着在固体基质上;接合到其它化学部分上;是自天然序 列的5-折或更少的置换;或是来源于天然序列的缺失或插入变体; c)OX2RH3多肽:包含表3的成熟序列;是OX2RH3的非糖基化形式; 来源于啮齿类动物,如小鼠;包含至少十七个SEQ ID NO:12的氨基 酸;显示SEQ ID NO:12的至少七个氨基酸的至少四个非重叠区段; 是OX2RH3的天然等位变体;具有至少约30个氨基酸的长度;显示至 少两个非重叠的抗原决定部位,其对于啮齿类动物的OX2RH3是特异 性的;是糖基化的;具有至少30kD的分子量且天然糖基化;是一种 合成的多肽;附着在固体基质上;接合到其它的化学部分上;是一种 自天然序列的5-折或更少的置换;或是来源于天然序列的缺失或插入 变体;或d)OX2RH4多肽:包含表2的成熟序列;是OX2RH4的非糖基 化形式;来源于啮齿类动物,如小鼠;包含至少十七个SEQ ID NO:23 的氨基酸;显示SEQ ID NO:23的至少七个氨基酸的至少四个非重叠 区段;是OX2RH4的天然等位变体;具有至少约30个氨基酸的长度; 显示至少两个非重叠的抗原决定部位,其对于啮齿类动物的OX2RH4 是特异性的;是糖基化的;具有至少30kD的分子量且天然糖基化; 是一种合成的多肽;附着在固体基质上;接合到其它的化学部分上; 是一种自天然序列的5-折或更少的置换;或是来源于天然序列的缺失 或插入变体。
在其它的实施方案中,本发明提供一种组合物,其包含: a1)基本上纯的OX2RH1和其它的Ig超家族成员;a2)一种基本上纯的 OX2RH2和:其它的Ig超家族成员,DAP12,或DAP10;a3)一种基本上 纯的OX2RH3和:其它的Ig超家族成员,DAP12,或DAP10;a4)一种 基本上纯的OX2RH4和:其它的Ig超家族成员,DAP12,或DAP10;或 一种无菌的OX2RH1多肽;一种无菌的OX2RH2多肽;一种无菌的OX2RH3 多肽;一种无菌的OX2RH4多肽;OX2RH1,OX2RH2,OX2RH3,或OX2RH4 多肽和载体,其中的载体是含水的混合物,包括水,盐水,和/或缓 冲液;和/或为口服,直肠,鼻,局部,或非肠道给药而配制的制剂。
还提供融合多肽,例如,包含:表1-3的成熟蛋白序列;一种检 测或纯化标记物,包括FLAG,His6,或Ig序列;或其它Ig超家族蛋 白的序列。
还提供试剂盒,例如,包含OX2RH多肽和:包含蛋白或多 肽的区室;或使用或处理试剂盒中试剂的说明书。
本发明还包含各种抗体样试剂,包括来源于不同物种的抗体。
它 提供,例如,包含来源于抗体的抗原结合位点的结合化合物,其特异 性地结合天然OX2RH多肽,例如,OX2RH1,OX2RH2,OX2RH3,和/或 OX2RH4,其中:该结合化合物位于容器中;OX2RH多肽来源于啮齿类 动物或灵长类动物;该结合化合物是Fv,Fab,或Fab2片段;该结合 化合物接合到其它的化学部分上;或抗体:是抗表1-3中成熟多肽的 肽序列的;是抗成熟的OX2RH的;被抗纯的哺乳动物OX2RH;是免疫 选择的;是多克隆抗体;结合变性的OX2RH;显示至少30μM对抗原 的Kd;附着在固体养基质上,包括颗粒或塑料膜,是无菌组合物的形 式;或是可检测地标记的,包括放射性或荧光标记物。
由此提供试剂 盒,例如,包含这种结合化合物和:含结合化合物的隔室 (compartment);或使用或处理试剂盒中试剂的说明书。
还提供方 法,例如,生产抗原:结合化合物或抗原:抗体复合体,包含在适宜 的条件下,使哺乳动物OX2RH多肽与抗体接触,由此使复合体形成。
优选地,在此方法中:该复合体是自其它细胞因子或Ig超家族受体 纯化的;该复合体是自其它的抗体纯化的;是与含哺乳动物OX2的样 品接触;该接触可以定量检测抗原;是与包含抗体的样品接触;或该 接触可以定量检测抗体。
可有效地生产相关组合物,例如,包含:无 菌的结合化合物,或结合化合物与载体,其中载体是:含水混合物, 包括水,盐水,和/或缓冲液;和/或用于口服,直肠,鼻,局部,或 非肠道给药而配制的制剂。
本发明还提供核酸,例如,编码OX2RH多肽的分离或重组核酸, 其中:OX2RH来源于哺乳动物;或该核酸:编码表1-3的抗原性肽序 列;编码表1-3的多个抗原性肽序列;显示与编码区段的天然cDNA 相同的至少十三个核苷酸;是一种表达载体;进一步包含复制起点; 来源于天然源;包含可检测的标记物;包含合成的核苷酸序列;小于 6kb,优选小于3kb;来源于灵长类动物或啮齿类动物;包含天然的 全长编码序列;是编码OX2RH的基因的杂交探针;进一步编码DAP12 或DAP10;或是PCR引物,PCR产物或诱变引物。
还提供含重组核酸 的细胞,例如,其中的细胞是:原核细胞;真核细胞;细菌细胞;酵 母细胞;昆虫细胞;哺乳动物细胞;小鼠细胞;灵长类动物细胞;或 人细胞。
还提供含核酸的试剂盒,例如,具有含核酸的区室;具有进 一步含哺乳动物OX2RH多肽的区室;或具有使用或处理试剂盒中试剂 的说明书。
选择性地,本发明提供一种核酸,其中:在40℃ 30分钟,和小 于2M盐的洗涤条件下,能与SEQ ID NO:1,3,5,7,9,11,19或22的 编码部分杂交;或显示与灵长类动物或啮齿类动物的OX2RH cDNA相 同的至少约30个核苷酸的一段序列。
优选地,该洗涤条件是:50℃ 和/或500mM的盐;或60℃和/或150mM的盐;该一段序列是至少55 个核苷酸或75个核苷酸;或该核酸进一步编码DAP12或DAP10肽。
还包括其它的方法,例如,调节生理学或细胞或组织培养物细胞 发育的方法,包含使该细胞与哺乳动物OX2RH的激动剂或拮抗剂相接 触。
通常,该细胞是用编码OX2RH的核酸转化的。
               优选实施方案的详述 概述 I.总则 II.活性 III.核酸 A.编码片段,序列,探针 B.突变,嵌合体,融合 C.生产核酸 D.载体,细胞包含 IV.蛋白,肽 A.片段,序列,免疫原,抗原 B.突变蛋白 C.激动剂/拮抗剂,功能等价体 D.生产蛋白 V.生产核酸,蛋白 A.合成的 B.重组的 C.天然源 VI.抗体 A.多克隆 B.单克隆 C.片段;Kd D.抗-独特型抗体 E.杂交瘤细胞系 VII.量化OX2RH的试剂盒和方法 A.ELISA B.测定mRNA编码 C.定性/定量 D.试剂盒 VIII.治疗组合物,方法   A.结合组合物   B.单位剂量   C.给药 IX.筛选 X.配位体 I.总则 本发明提供哺乳动物的氨基酸序列和DNA序列,在这里指灵长类 动物和啮齿类动物,受体-样亚单位分子,这些被称作OX2受体同系 物(OX2RH)。
这些基因具有特别限定的特性,或者或全部是结构性 的和生物学的。
各种编码这些分子的cDNA是从哺乳动物,例如,人 和啮齿类动物的cDNA序列文库获得的。
其它的哺乳动物,例如,灵 长类动物,啮齿类动物,或其它,对应物也是想要的。
OX2抗原首先是在大鼠中鉴定的,使用单克隆抗体(mAb)MRC OX2。
见,例如,McMaster和Williams(1979)Eur.J.Immunol.9:426- 433;Barclay(1981)Immunology 44:727-736;Barclay(1981)Immunology 42:593-600;Bukovsky等,(1984)Immunology 52:631-640;和Webb 和Barclay(1984)J.Neurochem.43:1061-1067。
在用于流式细胞计 的细胞悬浮液或组织切片的免疫组织化学(IHC)染色中使用这种抗 体,显示了OX2抗原是通过大范围的细胞,例如神经元,血管内皮细 胞,B细胞,活化的T细胞,滤泡树突细胞,平滑肌细胞和滋养母细 胞表达的。
此外,已知人OX2在正常的脑中是通过B细胞表达的。
McCaughan等,(1987)Immunogenetics 25:329-335。
通过MRC OX2 识别的大鼠蛋白的特性记述(Clark等,(1985)EMBO J.4:113-118) 显示由大约248个含两个胞外免疫球蛋白(Ig)区,一个跨膜结构域 和短的C-端胞质尾区的氨基酸组成。
该分子是通过6N-连接的糖基化 位点糖基化的,其中的三个位于N-端V-样的Ig区,其它的位于膜近 端的C2-样Ig区。
其将OX2放置在Ig超家族(IgSF)中,形成具有 象CD2,CD48,CD58,CD80,CD86,CD90和CD147分子的小IgSF分子的 亚-基,其被结构性地表征,例如,通过免疫球蛋白样区的存在,该 免疫球蛋白样区与Ig可变区和不变区,跨膜区段,胞内区,和特性 半胱氨酸和色氨酸残基的间隔相对应。
见,例如,Campbell等,(1979) Nature 282:341-342。
令人感兴趣的是,CD90也是由神经元高度表 达的。
Williams等,(1997)Cold Spring Harb.Symp.Ouant.Biol. 41Pt 1:51-61。
此外,还显示OX2是CD80和CD86的结构同系物 (Borriello等,(1997)J.Immunol.158:4548-4554),且OX2 基因紧密连接到小鼠染色体16上编码CD80和CD86的基因上。
Borriello等,(1998)Mamm.Genome 9:114-118。
CD80和CD86均 在被称为共同刺激的过程中起配位体的作用,因此,可能OX2也可以 起配位体的作用。
以后称OX2抗原为OX2蛋白或配位体OX2。
结合配 偶体可被称作OX2受体。
为了鉴定OX2的受体(OX2R),使用与荧光颗粒结合的大鼠OX2- 大鼠CD4融合蛋白制备多价试剂。
此试剂结合小鼠和大鼠的腹膜巨嗜 细胞,且此结合可被mAb MRC OX88阻断。
Preston等,(1997) Eur.J.Immunol.27:1911-1918。
此mAb结合自腹膜和脾脏分离的巨 嗜细胞,且在脾脏切片上的IHC染色中,发现其位于含高比例巨嗜细 胞的区域中。
由Barclay组培养的,称作OX102的第二单克隆抗体结合大鼠物 种的巨嗜细胞,且特异性地防止OX2分子与大鼠腹膜巨嗜细胞的结 合。
与OX102分子相结合的材料的分离和N-端测序表明,推定的OX2 受体(OX2R)是一种新的分子。
其如所述方法克隆的。
由OX102抗体 识别的蛋白确实是受体,这是通过相对于OX2分子自身(配位体), 此分子较长的胞质尾部的论证来支持的。
Clark等,(1985)EMBO J. 4:113-118。
OX2R的初步分析未能揭示与已知信号分子一致的明显基 序,虽然其不排除此分子在介导OX2-传递的信号中的潜在作用。
然后,鉴定小鼠同系物,称为OX2RH1。
因为应保留术语OX2R用 于那些已经被证实确实结合OX2的蛋白,所用的原始名称是组1的受 体同系物。
此分子的核苷酸序列和氨基酸序列在此处描述。
有效序列数据库的进一步分析揭示了OX2RH其它独特形式的存 在,即一种分子,其在推定的胞外Ig-区结构中,显示了与OX2RH1, 而不是不同的跨膜和胞质序列的显著同源性。
这些形式在此处被称为 OX2RH2,且已经鉴定了人和小鼠的实施方案。
特别注意的是224位 (人)和170位(小鼠)上赖氨酸的存在,其位于分子的跨膜部分之 内。
这种残基间接表明,此分子与分子配偶体,如DAP12有关,已知 其表达能够为细胞活化信号产生的基序。
见,例如,Lanier等,(1998) Nature 391:703-707;Colonna(1998)Nature 391:642-3;Campbell 等,(1999)Int.J.Biochem.Cell.Biol.31:631-636;和Lopez- Botet等,(1999)Curr.Opin.Immunol.11:301-307。
此外,其间接 表明了各种信号产生途径和相关的生物化学。
见,例如,Lanier等, (1998)Immunity 8:693-701;Smith等,(1998)J.Immunol.161:7-10; Gosselin等,(1999)J.Leukoc.Biol.66:165-171;Tomasello等, (1998)J.Biol.Chem.273:34115-34119;和McVicar等,(1998) J.Biol.Chem.273:32934-32942。
但是,仍然有待于分离全长的小 鼠或人OX2RH2形式。
在小鼠和大鼠OX2RH1分子的胞外区之间有很高的同源性,其已 经被证实结合它们各自物种的OX2。
因而,大鼠和小鼠OX2RH1的实施 方案在功能上被适当地称为OX2R。
均包含特有的胞外,跨膜,和胞内 区结构。
人们已经发现了人OX2RH1的实施方案。
附带地,大鼠和小 鼠OX2RH1的可溶性形式也可以存在。
相关的同系物,称为OX2RH2和OX2RH4,已经被描述,各种起源 于小鼠和人的实施方案。
OX2RH2,H3和H4的实施方案在跨膜区段中 显示了带电荷的赖氨酸残基。
人OX2RH2的实施方案缺少信号序列, 且显示某些基因组的序列标记,间接表明天然的人OX2RH2的功能形 式应是紧密相关的,但与所提供的序列稍不同。
小鼠和人的同系物2 和4的功能关系有待证实。
还在小鼠中发现了另外的OX2R同系物。
虽然它的同源性是更加 趋异的,但是它显示了某些序列相似性。
特别是,它在跨膜区中具有 赖氨酸残基。
因而,像显示此特征的其它OX2RH2,H3,和H4分子,期 望它经由相关的分子,如DAP12信号产生。
称作OX2RH3的实施方案 来源于啮齿类动物,例如,小鼠。
正在进行的OX2RH1表达模式的分析表明,在大鼠,小鼠,和人 的白细胞中,OX2RH1(是通过用OX102抗体的流式细胞染色和/或用 PCR技术分析mRNA表达来确定的)是由单核细胞,粒细胞,和肥大细 胞最强烈表达的,由B细胞勉强表达的,由T细胞弱表达的。
这与早 期研究中,配位体OX2与巨嗜细胞的优先结合相一致。
在正常大鼠的 中枢神经系统中,一部分停留巨嗜细胞(或小胶质细胞)也表达OX2R, 但水平较低。
描述并参考一些可用的标准方法,例如,Maniatis等,(1982) Molecular Cloning,A Laboratory Manual,Cold Spring Harbor Laboratory,Cold Spring Harbor Press;Sambrook等,(1989) Molecular Cloning:A Laboratory Manual,(2d ed.),vols.1-3,CSH Press,NY;Ausubel等,Biology,Greene Publishing Associates,Brooklyn,NY;或Ausubel等(1987和定期增刊)Current Protocols in Molecular Biology,Greene/Wiley,New York;每篇 文献均引入此处作为参考。
啮齿类动物,例如,大鼠的核苷酸(SEQ ID NO:1)和相应的氨基 酸序列(SEQ ID NO:2),编码区段的OX2受体同系物1在表1中列 出。
同样地,还描述了进一步的实施方案,灵长类动物,例如,人, 和啮齿类动物,例如,小鼠,称作OX2RH1,1.2,2和4。
核酸序列是 SEQ ID NO:3,19,5,7,9,和22;相应的氨基酸序列是SEQ ID NO:4,20,6,8,10和23,其在表2中列出。
表3提供其它啮齿类动物, 例如,小鼠的序列,OX2RH3(SEQ ID NO:11和12)。
在表4中提供反向翻译的核酸序列(SEQ ID NO:13-14,21,15- 17,24,和18)。
表5提供多肽序列的数字对比和序列对比。
表1:啮齿类动物OX2R的核甘酸和多肽序列(同系物1) 大鼠OX2RH1 (SEQ ID NO:1和2): agcggaggga tcctggtcat ggtcaccgct gctcccctac ctgtgaagag aaagagcacc  60 gagtgagccg ctgaaaacca gaaaaccgaa atg ctc tgc ttt tgg aga act tct   114                              Met Leu Cys Phe Trp Arg Thr Ser                                              -20 cac gta gca gta ctc ttg atc tgg ggg gtc ttc gcg gct gag tca agt    162 His Val Ala Val Leu Leu Ile Trp Gly Val Phe Ala Ala Glu Ser Ser -15                 -10                  -5              -1 tgt cct gat aag aat caa aca atg cag aac aat tca tca act atg aca    210 Cys Pro Asp Lys Asn Gln Thr Met Gln Asn Asn Ser Ser Thr Met Thr   1               5                  10                  15 gaa gtt aac act aca gtg ttt gta cag atg ggt aaa aag gct ctg ctc    258 Glu Val Asn Thr Thr Val Phe Val Gln Met Gly Lys Lys Ala Leu Leu          20                  25                  30 tgc tgc cct tct att tca ctg aca aaa gta ata tta ata aca tgg aca    306 Cys Cys Pro Ser Ile Ser Leu Thr Lys Val Ile Leu Ile Thr Trp Thr      35                  40                  45 ata acc ctc aga gga cag cct tcc tgc ata ata tcc tac aaa gca gac    354 Ile Thr Leu Arg Gly Gln Pro Ser Cys Ile Ile Ser Tyr Lys Ala Asp  50                  55                  60 aca agg gag acc cat gaa agc aac tgc tcg gac aga agc atc acc tgg    402  Thr Arg Glu Thr His Glu Ser Asn Cys Ser Asp Arg Ser Ile Thr Trp  65                  70                  75                  80 gcc tcc aca cct gac ctc gct cct gac ctt cag atc agt gca gtg gcc    450 Ala Ser Thr Pro Asp Leu Ala Pro Asp Leu Gln Ile Ser Ala Val Ala              85                  90                  95 ctc cag cat gaa ggg cgt tac tca tgt gat ata gca gta cct gac ggg    498 Leu Gln His Glu Gly Arg Tyr Ser Cys Asp Ile Ala Val Pro Asp Gly         100                 105                 110 aat ttc caa aac atc tat gac ctc caa gtg ctg gtg ccc cct gaa gta    546 Asn Phe Gln Asn Ile Tyr Asp Leu Gln Val Leu Val Pro Pro Glu Val     115                 120                 125 acc cac ttt cca ggg gaa aat aga act gca gtt tgt gag gcg att gca    594 Thr His Phe Pro Gly Glu Asn Arg Thr Ala Val Cys Glu Ala Ile Ala 130                 135                 140 ggc aaa cct gct gcg cag atc tct tgg acg cca gat ggg gat tgt gtc    642 Gly Lys Pro Ala Ala Gln Ile Ser Trp Thr Pro Asp Gly Asp Cys Val 145                 150                 155                 160 gct aag aat gaa tca cac agc aat ggc acc gtg act gtc cgg agc aca    690 Ala Lys Asn Glu Ser His Ser Asn Gly Thr Val Thr Val Arg Ser Thr             165                 170                 175 tgc cac tgg gag cag agc cac gtg tct gtc gtg ttc tgt gtt gtc tct    738 Cys His Trp Glu Gln Ser His Val Ser Val Val Phe Cys Val Val Ser         180                 185                 190 cac ttg aca act ggt aac cag tct ctg tct ata gaa ctg ggt aga ggg    786 His Leu Thr Thr Gly Asn Gln Ser Leu Ser Ile Glu Leu Gly Arg Gly     195                 200                 205 ggt gac caa tta tta gga tca tac att caa tac atc atc cca tct att    834 Gly Asp Gln Leu Leu Gly Ser Tyr Ile Gln Tyr Ile Ile Pro Ser Ile 210                 215                 220 att att ttg atc atc ata gga tgc att tgt ctt ttg aaa atc agt ggc    882 Ile Ile Leu Ile Ile Ile Gly Cys Ile Cys Leu Leu Lys Ile Ser Gly 225                 230                 235                 240 tgc aga aaa tgt aaa ttg cca aaa tcg gga gct act cca gat att gag    930 Cys Arg Lys Cys Lys Leu Pro Lys Ser Gly Ala Thr Pro Asp Ile Glu             245                 250                 255 gag gat gaa atg cag ccg tat gct agc tac aca gag aag agc aat cca    978 Glu Asp Glu Met Gln Pro Tyr Ala Ser Tyr Thr Glu Lys Ser Asn Pro         260                 265                 270 ctc tat gat act gtg acc acg acg gag gca cac cca gcg tca caa ggc    1026 Leu Tyr Asp Thr Val Thr Thr Thr Glu Ala His Pro Ala Ser Gln Gly     275                 280                 285 aaa gtc aat ggc aca gac tgt ctt act ttg tca gcc atg gga atc        1071 Lys Val Asn Gly Thr Asp Cys Leu Thr Leu Ser Ala Met Gly Ile 290                 295                 300 tagaaccaag gaaaagaagt caagagacat cataattact gcttttcttt ctttaaactt   1131 ctccaatgga gggaaattag ctcttctgaa gttcttagaa agcacaaatg ttctaatgga   1191 tttgccttta agttcttcta tcattggaag tttggaatct ttgctgctac ctgttaattc   1251 taggaagaac tgatttaatt attacaaaga aagcacattg ttatggtaaa atatcaaatt   1311  gtgcaataca atgatgaaaa ctgagtttcc tcaagaaata actgcagaag gaacaatcat   1371 tactaaagca tttcatgtga gttcttccaa aaaagaaaat ccctgtgtat acgacatgat   1431 tatggtatgt gtgtgccttt atatgtttgt ttacaaatgt gtatatatgc acacatctga   1491 ttatcaagac atctctgtca aaaactcact ggcgttccag atttatgaaa gctaataaag   1551 tgagtattgg agatgttttt ata                                           1574 MLCFWRTSHVAVLLIWGVFAAESSCPDKNQTMQNNSSTMTEVNTTVFVQMGKKALLCCPSISLTKVILITWTITLR GQPSCIISYKADTRETHESNCSDRSITWASTPDLAPDLQISAVALQHEGRYSCDIAVPDGNFQNIYDLQVLVPPEV THFPGENRTAVCEAIAGKPAAQISWTPDGDCVAKNESHSNGTVTVRSTCHWEQSHVSVVFCVVSHLTTGNQSLSIE LGRGGDQLLGSYIQYIIPSIIILIIIGCICLLKISGCRKCKLPKSGATPDIEEDEMQPYASYTEKSNPLYDTVTTT EAHPASQGKVNGTDCLTLSAMGI 表2:附加的OX2R同系物的核苷酸和多肽序列 灵长类动物,例如,人,OX2RH1(SEQ ID NO:3和4): cagagaaaag cttctgttcg tccaagttac taaccaggct aaaccacata gacgtgaagg 60 aaggggctag aaggaaggga gtgccccact gttgatgggg taagaggatc ctgtactgag 120 aagttgacca gagagggtct caccatgcgc acagttcctt ctgtaccagt gtggaggaaa 180 agtactgagt gaagggcaga aaaagagaaa acagaa atg ctc tgc cct tgg aga   234                                     Met Leu Cys Pro Trp Arg                                         -25 act gct aac cta ggg cta ctg ttg att ttg act atc ttc tta gtg gcc   282 Thr Ala Asn Leu Gly Leu Leu Leu Ile Leu Thr Ile Phe Leu Val Ala -20                 -15                 -10                  -5 gaa gcg gag ggt gct gct caa cca aac aac tca tta atg ctg caa act   330 Glu Ala Glu Gly Ala Ala Gln Pro Asn Asn Ser Leu Met Leu Gln Thr          -1   1               5                  10 agc aag gag aat cat gct tta gct tca agc agt tta tgt atg gat gaa   378 Ser Lys Glu Asn His Ala Leu Ala Ser Ser Ser Leu Cys Met Asp Glu      15                  20                  25 aaa cag att aca cag aac tac tcg aaa gta ctc gca gaa gtt aac act   426 Lys Gln Ile Thr Gln Asn Tyr Ser Lys Val Leu Ala Glu Val Asn Thr  30                  35                  40 tca tgg cct gta aag atg gct aca aat gct gtg ctt tgt tgc cct cct   474 Ser Trp Pro Val Lys Met Ala Thr Asn Ala Val Leu Cys Cys Pro Pro  45                  50                  55                  60 atc gca tta aga aat ttg atc ata ata aca tgg gaa ata atc ctg aga   522 Ile Ala Leu Arg Asn Leu Ile Ile Ile Thr Trp Glu Ile Ile Leu Arg              65                  70                  75 ggc cag cct tcc tgc aca aaa gcc tac aag aaa gaa aca aat gag acc   570 Gly Gln Pro Ser Cys Thr Lys Ala Tyr Lys Lys Glu Thr Asn Glu Thr          80                  85                  90 aag gaa acc aac tgt act gat gag aga ata acc tgg gtc tcc aga cct   618 Lys Glu Thr Asn Cys Thr Asp Glu Arg Ile Thr Trp Val Ser Arg Pro      95                 100                 105 gat cag aat tcg gac ctt cag att cgt acc gtg gcc atc act cat gac   666 Asp Gln Asn Ser Asp Leu Gln Ile Arg Thr Val Ala Ile Thr His Asp 110                 115                 120 ggg tat tac aga tgc ata atg gta aca cct gat ggg aat ttc cat cgt   714 Gly Tyr Tyr Arg Cys Ile Net Val Thr Pro Asp Gly Asn Phe His Arg 125                 130                 135                 140 gga tat cac ctc caa gtg tta gtt aca cct gaa gtg acc ctg ttt caa   762 Gly Tyr His Leu Gln Val Leu Val Thr Pro Glu Val Thr Leu Phe Gln             145                 150                 155 aac agg aat aga act gca gta tgc aag gca gtt gca ggg aag cca gct    810 Asn Arg Asn Arg Thr Ala Val Cys Lys Ala Val Ala Gly Lys Pro Ala         160                 165                 170 gcg cat atc tcc tgg atc cca gag ggc gat tgt gcc act aag caa gaa    858 Ala His Ile Ser Trp Ile Pro Glu Gly Asp Cys Ala Thr Lys Gln Glu     175                 180                 185 tac tgg agc aat ggc aca gtg act gtt aag agt aca tgc cac tgg gag    906 Tyr Trp Ser Asn Gly Thr Val Thr Val Lys Ser Thr Cys His Trp Glu 190                 195                 200 gtc cac aat gtg tct acc gtg acc tgc cac gtc tcc cat ttg act ggc    954 Val His Asn Val Ser Thr Val Thr Cys His Val Ser His Leu Thr Gly 205                 210                 215                 220 aac aag agt ctg tac ata gag cta ctt cct gtt cca ggt gcc aaa aaa    1002 Asn Lys Ser Leu Tyr Ile Glu Leu Leu Pro Val Pro Gly Ala Lys Lys             225                 230                 235 atc agc aaa att ata tat tcc ata tat cat cct tac tat tat tat tta    1050 Ile Ser Lys Ile Ile Tyr Ser Ile Tyr His Pro Tyr Tyr Tyr Tyr Leu         240                 245                 250 gac cat cgt ggg att cat ttg gtt gtt gaa agt caa tgg ctg cag aaa    1098 Asp His Arg Gly Ile His Leu Val Val Glu Ser Gln Trp Leu Gln Lys     255                 260                  265 ata taaattgaat aaaacagaat ctactccagt tgttgaggag gatgaaatgc         1151 Ile agccctatgc cagctacaca gagaagaaca atcctctcta tgatactaca aacaaggtga  1211 aggcatctga ggcattacaa agtgaagttg acacagacct ccatacttta taagttgttg  1271 gactctagta ccaagaaaca acaacaaacg agatacatta taattactgt ctgattttct  1331 tacagttcta gaatgaagac ttatattgaa attaggtttt ccaaggttct tagaagacat  1391 tttaatggat tctcattcat acccttgtat aattggaatt tttgattctt agctgctacc  1451  agctagttct ctgaagaact gatgttatta caaagaaaat acatgcccat gaccaaatat  1511 tcaaattgtg caggacagta aataatgaaa accaaatttc ctcaagaaat aactgaagaa  1571 ggagcaagtg tgaacagttt cttgtgtatc ctt                               1604 MLCPWRTANLGLLLILTIFLVAEAEGAAQPNNSLMLQTSKENHALASSSLCMDEKQITQNYSKVLAEVNTSWPVKM ATNAVLCCPPIALRNLIIITWEIILRGQPSCTKAYKKETNETKETNCTDERITWVSRPDQNSDLQIRTVAITHDGY YRCIMVTPDGNFHRGYHLQVLVTPEVTLFQNRNRTAVCKAVAGKPAAHISWIPEGDCATKQEYWSNGTVTVKSTCH WEVHNVSTVTCHVSHLTGNKSLYIELLPVPGAKKISKIIYSIYHPYYYYLDHRGIHLVVESQWLQKI 灵长类动物,例如,人,OX2 RH1.2(SEQ ID NO:19和20): atg ctc tgc cct tgg aga act gct aac cta ggg cta ctg ttg att ttg    48 Met Leu Cys Pro Trp Arg Thr Ala Asn Leu Gly Leu Leu Leu Ile Leu -25                 -20                 -15 act atc ttc tta gtg gcc gaa gcg gag ggt gct gct caa cca aac aac    96 Thr Ile Phe Leu Val Ala Glu Ala Glu Gly Ala Ala Gln Pro Asn Asn -10                  -5              -1   1               5 tca tta atg ctg caa act agc aag gag aat cat gct tta gct tca agc    144  Ser Leu Met Leu Gln Thr Ser Lys Glu Asn His Ala Leu Ala Ser Ser          10                  15                  20 agt tta tgt atg gat gaa aaa cag att aca cag aac tac tcg aaa gta    192 Ser Leu Cys Met Asp Glu Lys Gln Ila Thr Gln Asn Tyr Ser Lys Val      25                  30                  35 ctc gca gaa gtt aac act tca tgg cct gta aag atg gct aca aat gct    240 Leu Ala Glu Val Asn Thr Ser Trp Pro Val Lys Met Ala Thr Asn Ala  40                  45                  50 gtg ctt tgt tgc cct cct atc gca tta aga aat ttg atc ata ata aca    288 Val Leu Cys Cys Pro Pro Ile Ala Leu Arg Asn Leu Ile Ile Ile Thr  55                  60                  65                  70 tgg gaa ata atc ctg aga ggc cag cct tcc tgc aca aaa gcc tac agg    336 Trp Glu Ile Ile Leu Arg Gly Gln Pro Ser Cys Thr Lys Ala Tyr Arg              75                  80                  85 aaa gaa aca aat gag acc aag gaa acc aac tgt act gat gag aga ata    384 Lys Glu Thr Asn Glu Thr Lys Glu Thr Asn Cys Thr Asp Glu Arg Ile          90                  95                 100 acc tgg gtc tcc aga cct gat cag aat tcg gac ctt cag att cgt cca    432 Thr Trp Val Ser Arg Pro Asp Gln Asn Ser Asp Leu Gln Ile Arg Pro     105                 110                 115 gtg gcc atc act cat gac ggg tat tac aga tgc ata atg gta aca cct    480 Val Ala Ile Thr His Asp Gly Tyr Tyr Arg Cys Ile Met Val Thr Pro 120                 125                 130 gat ggg aat ttc cat cgt gga tat cac ctc caa gtg tta gtt aca cct    528 Asp Gly Asn Phe His Arg Gly Tyr His Leu Gln Val Leu Val Thr Pro 135                 140                 145                 150 gaa gtg acc ctg ttt caa aac agg aat aga act gca gta tgc aag gca    576 Glu Val Thr Leu Phe Gln Asn Arg Asn Arg Thr Ala Val Cys Lys Ala             155                 160                 165 gtt gca ggg aag cca gct gcg cag atc tcc tgg atc cca gag ggc gat    624 Val Ala Gly Lys Pro Ala Ala Gln Ile Ser Trp Ile Pro Glu Gly Asp         170                 175                 180 tgt gcc act aag caa gaa tac tgg agc aat ggc aca gtg act gtt aag    672 Cys Ala Thr Lys Gln Glu Tyr Trp Ser Asn Gly Thr Val Thr Val Lys     185                 190                 195 agt aca tgc cac tgg gag gtc cac aat gtg tct acc gtg acc tgc cac    720 Ser Thr Cys His Trp Glu Val His Asn Val Ser Thr Val Thr Cys His 200                 205                 210 gtc tcc cat ttg act ggc aac aag agt ctg tac ata gag cta ctt cct    768 Val Ser His Leu Thr Gly Asn Lys Ser Leu Tyr Ile Glu Leu Leu Pro 215                 220                 225                 230 gtt cca ggt gcc aaa aaa tca gca aaa tta tat att cca tat atc atc    816 Val Pro Gly Ala Lys Lys Ser Ala Lys Leu Tyr Ile Pro Tyr Ile Ile             235                 240                 245 ctt act att att att ttg acc atc gtg gga ttc att tgg ttg ttg aaa    864 Leu Thr Ile Ile Ile Leu Thr Ile Val Gly Phe Ile Trp Leu Leu Lys         250                 255                 260 gtc aat ggc tgc aga aaa tat aaa ttg aat aaa aca gaa tct act cca    912 Val Asn Gly Cys Arg Lys Tyr Lys Leu Asn Lys Thr Glu Ser Thr Pro     265                 270                 275 gtt gtt gag gag gat gaa atg cag ccc tat gcc agc tac aca gag aag    960 Val Val Glu Glu Asp Glu Met Gln Pro Tyr Ala Ser Tyr Thr Glu Lys 280                 285                 290 aac aat cct ctc tat gat act aca aac aag gtg aag gca tct cag gca    1008  Asn Asn Pro Leu Tyr Asp Thr Thr Asn Lys Val Lys Ala Ser Gln Ala 295                 300                 305                 310 tta caa agt gaa gtt gac aca gac ctc cat act tta taa                1047 Leu Gln Ser Glu Val Asp Thr Asp Leu His Thr Leu             315                 320 MLCPWRTANLGLLLILTIFLVAEAEGAAQPNNSLMLQTSKENHALASSSLCMDEKQITQNYSKVLAEVNTSWPVKM ATNAVLCCPPIALRNLIIITWEIILRGQPSCTKAYRKETNETKETNCTDERITWVSRPDQNSDLQIRPVAITHDGY YRCIMVTPDGNFHRGYHLQVLVTPEVTLFQNRNRTAVCKAVAGKPAAQISWIPEGDCATKQEYWSNGTVTVKSTCH WEVHNVSTVTCHVSHLTGNKSLYIELLPVPGAKKSAKLYIPYIILTIIILTIVGFIWLLKVNGCRKYKLNKTESTP VVEEDEMQPYASYTEKNNPLYDTTNKVKASQALQSEVDTDLHTLZ 啮齿类动物,例如,小鼠,OX2RH1(SEQ ID NO:5和6): aaaaccgaa atg ttt tgc ttt tgg aga act tct gcc cta gca gtg ctc tta   51       Met Phe Cys Phe Trp Arg Thr Ser Ala Leu Ala Val Leu Leu         1               5                  10 ata tgg ggg gtc ttt gtg gct ggg tca agt tgt act gat aag aat caa     99 Ile Trp Gly Val Phe Val Ala Gly Ser Ser Cys Thr Asp Lys Asn Gln  15                  20                  25                  30 aca aca cag aac aac agt tca tct cct ctg aca caa gtg aac act aca     147 Thr Thr Gln Asn Asn Ser Ser Ser Pro Leu Thr Gln Val Asn Thr Thr              35                  40                  45 gtg tct gta cag ata ggt aca aag gct ctg ctc tgc tgc ttt tct att     195 Val Ser Val Gln Ile Gly Thr Lys Ala Leu Leu Cys Cys Phe Ser Ile          50                  55                  60 cca ctg aca aaa gca gta tta atc aca tgg ata ata aag ctc aga ggc     243 Pro Leu Thr Lys Ala Val Leu Ile Thr Trp Ile Ile Lys Leu Arg Gly      65                  70                  75 ctg cca tcc tgc aca ata gca tac aaa gta gat aca aag acc aat gaa     291 Leu Pro Ser Cys Thr Ile Ala Tyr Lys Val Asp Thr Lys Thr Asn Glu  80                  85                  90 acc agc tgc ttg ggc agg aac atc acc tgg gcc tcc aca cct gac cac     339 Thr Ser Cys Leu Gly Arg Asn Ile Thr Trp Ala Ser Thr Pro Asp His  95                 100                 105                 110 agt cct gaa ctt cag atc agt gca gtg acc ctc cag cat gag ggg act     387 Ser Pro Glu Leu Gln Ile Ser Ala Val Thr Leu Gln His Glu Gly Thr             115                 120                 125 tac aca tgt gag aca gta aca cct gaa ggg aat ttt gaa aaa aac tat     435 Tyr Thr Cys Glu Thr Val Thr Pro Glu Gly Asn Phe Glu Lys Asn Tyr         130                 135                 140 gac ctc caa gtg ctg gtg ccc cct gaa gta acc tac ttt cca gag aaa     483 Asp Leu Gln Val Leu Val Pro Pro Glu Val Thr Tyr Phe Pro Glu Lys     145                 150                 155 aac aga tct gca gtc tgt gag gca atg gca ggc aag cct gct gca cag     531 Asn Arg Ser Ala Val Cys Glu Ala Met Ala Gly Lys Pro Ala Ala Gln 160                 165                 170 atc tct tgg tct cca gat ggg gac tgt gtc act acg agt gaa tca cac     579 Ile Ser Trp Ser Pro Asp Gly Asp Cys Val Thr Thr Ser Glu Ser His 175                 180                 185                 190 agc aat ggc act gtg act gtc agg agc aca tgc cac tgg gag cag aac     627 Ser Asn Gly Thr Val Thr Val Arg Ser Thr Cys His Trp Glu Gln Asn             195                 200                 205 aat gtg tct gat gtg tcc tgc att gtc tct cat ttg act ggt aac caa     675 Asn Val Ser Asp Val Ser Cys Ile Val Ser His Leu Thr Gly Asn Gln         210                 215                 220 tct ctg tcc ata gaa ctg agt aga ggt ggt aac caa tca tta cga cca    723 Ser Leu Ser Ile Glu Leu Ser Arg Gly Gly Asn Gln Ser Leu Arg Pro     225                 230                 235 tat att cca tac atc ata cca tca att atc att ttg atc atc ata gga    771 Tyr Ile Pro Tyr Ile Ile Pro Ser Ile Ile Ile Leu Ile Ile Ile Gly 240                 245                 250 tgc att tgt ctt ttg aaa atc agt ggc ttc aga aaa tgc aaa ttg cca    819 Cys Ile Cys Leu Leu Lys Ile Ser Gly Phe Arg Lys Cys Lys Leu Pro 255                 260                 265                 270 aaa tta gaa gct act tca gct att gag gag gat gaa atg cag cct tat    867 Lys Leu Glu Ala Thr Ser Ala Ile Glu Glu Asp Glu Met Gln Pro Tyr             275                 280                 285 gct agc tat aca gag aag agc aat cca ctc tat gat act gtg act aag    915 Ala Ser Tyr Thr Glu Lys Ser Asn Pro Leu Tyr Asp Thr Val Thr Lys         290                 295                 300 gtg gag gca ttt cca gta tca caa ggc gaa gtc aat ggc aca gac tgc    963 Val Glu Ala Phe Pro Val Ser Gln Gly Glu Val Asn Gly Thr Asp Cys     305                 310                 315 ctt act ttg tcg gcc att gga atc tagaaccaag aaaaaagaag tcaagagaca   1017 Leu Thr Leu Ser Ala Ile Gly Ile 320                 325 tcataattac tgctttgctt tctttaaaat tcgacaatgg aaggactact tggaaattag  1077 ctcttccaaa gctattaaaa agcacaaatg ttctaatgaa attgcattta aattctatca  1137 ttggaagttt ggaatctctg ctgctacctg ttaattttag gaagaactga tttaattatt  1197 acaaagaaag cacatggtta tggtgaaata tcaagttgtg caataaagta tgatgaaaac  1257 tgagtttcct caagaaataa ctgcaggagg aacaatcatc actaaagaat ttcatgtgag  1317 ttcttacaaa aaaattccta tgtatacatg actatggtat gtgtgtccaa ttacatgttt  1377 atttacaaat gtgtatatat gcacacattt gcttttcagg acatctcctt gtaaaaaaca  1437 cactggagtt ttggatttat aaaagcttat aaagtgagca ttggagatat ttt         1490 MFCFWRTSALAVLLIWGVFVAGSSCTDKNQTTQNNSSSPLTQVNTTVSVQIGTKALLCCFSIPLTKAVLITWIIKL RGLPSCTIAYKVDTKTNETSCLGRNITWASTPDHSPELQISAVTLQHEGTYTCETVTPEGNFEKNYDLQVLVPPEV TYFPEKNRSAVCEAMAGKPAAQISWSPDGDCVTTSESHSNGTVTVRSTCHWEQNNVSDVSCiVSHLTGNQSLSIEL SRGGNQSLRPYIPYIIPSIIILIIIGCICLLKISGFRKCKLPKLEATSAIEEDEMQPYASYTEKSNPLYDTVTKVE AFPVSQGEVNGTDCLTLSAIGI 灵长类动物,例如,人,OX2RH2(SEQ ID NO:7和8): atg ggt gga aag cag atg aca cag aac tat tca aca att ttt gca gaa    48 Met Gly Gly Lys Gln Met Thr Gln Asn Tyr Ser Thr Ile Phe Ala Glu   1               5                  10                  15 ggt aac att tca cag cct gta ctg atg gat ata aat gct gtg ctt tgt    96 Gly Asn Ile Ser Gln Pro Val Leu Met Asp Ile Asn Ala Val Leu Cys          20                  25                  30 tgc cct cct att gca tta aga aat ttg atc ata ata aca tgg gaa ata    144 Cys Pro Pro Ile Ala Leu Arg Asn Leu Ile Ile Ile Thr Trp Glu Ile      35                  40                  45 atc ctg aga ggc cag cct tcc tgc aca aaa gcc tac aag aaa gaa aca    192 Ile Leu Arg Gly Gln Pro Ser Cys Thr Lys Ala Tyr Lys Lys Glu Thr  50                  55                  60 aat gag acc aag gaa acc aac tgt act gtt gag aga ata acc tgg gtc    240 Asn Glu Thr Lys Glu Thr Asn Cys Thr Val Glu Arg Ile Thr Trp Val  65                  70                  75                  80 tct aga cct gat cag aat tcg gac ctt cag att cgt ccg gtg gac acc    288 Ser Arg Pro Asp Gln Asn Ser Asp Leu Gln Ile Arg Pro Val Asp Thr              85                  90                  95 act cat gac ggg tat tac aga ggc ata gtg gta aca cct gat ggg aat    336 Thr His Asp Gly Tyr Tyr Arg Gly Ile Val Val Thr Pro Asp Gly Asn         100                 105                 110 ttc cat cgt gga tat cac ctc caa gtg tta gtt aca ccc gaa gtg aac    384 Phe His Arg Gly Tyr His Leu Gln Val Leu Val Thr Pro Glu Val Asn     115                 120                 125 cta ttt caa agc agg aat ata act gca gta tgc aag gca gtt aca ggg    432 Leu Phe Gln Ser Arg Asn Ile Thr Ala Val Cys Lys Ala Val Thr Gly 130                 135                 140 aag cca gct gcc cag atc tcc tgg atc cca gag gga tct att ctt gcc    480 Lys Pro Ala Ala Gln Ile Ser Trp Ile Pro Glu Gly Ser Ile Leu Ala 145                 150                 155                 160 act aag caa gaa tac tgg ggc aat ggc aca gtg acg gtt aag agt aca    528 Thr Lys Gln Glu Tyr Trp Gly Asn Gly Thr Val Thr Val Lys Ser Thr             165                 170                 175 tgc ccc tgg gag ggc cac aag tct act gtg acc tgc cat gtc tcc cat    576 Cys Pro Trp Glu Gly His Lys Ser Thr Val Thr Cys His Val Ser His         180                 185                 190 ttg act ggc aac aag agt ctg tcc gta aag ttg aat tca ggt ctc aga    624 Leu Thr Gly Asn Lys Ser Leu Ser Val Lys Leu Asn Ser Gly Leu Arg     195                 200                 205 acc tca gga tct cca gcg ttg tcc tta ctg atc att ctt tat gtg aaa    672 Thr Ser Gly Ser Pro Ala Leu Ser Leu Leu Ile Ile Leu Tyr Val Lys 210                 215                 220 ctc tct ctt ttt gtg gtc att ctg gtc acc aca gga ttt gtt ttc ttc    720 Leu Ser Leu Phe Val Val Ile Leu Val Thr Thr Gly Phe Val Phe Phe 225                 230                 235                 240 cag agg ata aat cat gtc aga aaa gtt ctt taaagaagaa ggaagggtct      770 Gln Arg Ile Asn His Val Arg Lys Val Leu             245                 250 tcttttgctt ctcctccttg tctctggact gcaacattgg tgagatgagt gatggtccag  830 cagtgaactt gggccatgga tgatgttaag gatagaagcc actcagtagg atagaagaaa  890 agaaagatgg aagaaggatc ctgggcttga tgaccatgaa gtttccctat aaaccctcaa  950 ccacctattc attgacttct tttgtgttag agtgaataaa attttgttca tgccagtgtt  1010 MGGKQMTQNYSTIFAEGNISQPVLMDINAVLCCPPIALRNLIIITWEIILRGQPSCTKAYKKETNETKETNCTVER ITWVSRPDQNSDLQIRPVDTTHDGYYRGIVVTPDGNFHRGYHLQVLVTPEVNLFQSRNITAVCKAVTGKPAAQISW IPEGSILATKQEYWGNGTVTVKSTCPWEGHKSTVTCHVSHLTGNKSLSVKLNSGLRTSGSPALSLLIILYVKLSLF VVILVTTGFVFFQRINHVRKVL 啮齿类动物,例如,小鼠,OX2RH2(SEQ ID NO:9和10): aga ggc cag cct tcc tgc ata atg gcc tac aaa gta gaa aca aag gag    48 Arg Gly Gln Pro Ser Cys Ile Met Ala Tyr Lys Val Glu Thr Lys Glu   1               5                  10                  15 acc aat gaa acc tgc ttg ggc agg aac atc acc tgg gcc tcc aca cct    96 Thr Asn Glu Thr Cys Leu Gly Arg Asn Ile Thr Trp Ala Ser Thr Pro          20                  25                  30 gac cac att cct gac ctt cag atc agt gcg gtg gcc ctc cag cat gag    144 Asp His Ile Pro Asp Leu Gln Ile Ser Ala Val Ala Leu Gln His Glu      35                  40                  45 ggg aat tac tta tgt gag ata aca aca cct gaa ggg aat ttc cat aaa    192 Gly Asn Tyr Leu Cys Glu Ile Thr Thr Pro Glu Gly Asn Phe His Lys  50                  55                  60 gtc tat gac ctc caa gtg ctg gtg ccc cct gaa gta acc tac ttt ctc    240 Val Tyr Asp Leu Gln Val Leu Val Pro Pro Glu Val Thr Tyr Phe Leu  65                  70                  75                  80 ggg gaa aat aga act gca gtt tgt gag gca atg gca ggc aag cct gct    288 Gly Glu Asn Arg Thr Ala Val Cys Glu Ala Met Ala Gly Lys Pro Ala              85                  90                  95 gca cag atc tct tgg act cca gat ggg gac tgt gtc act aag agt gag    336 Ala Gln Ile Ser Trp Thr Pro Asp Gly Asp Cys Val Thr Lys Ser Glu         100                 105                 110 tca cac agc aat ggc act gtg act gtc agg agc act tgc cac tgg gag    384 Ser His Ser Asn Gly Thr Val Thr Val Arg Ser Thr Cys His Trp Glu     115                 120                 125 cag aac aat gtg tct gct gtg tcc tgc att gtc tct cat tcg act ggt    432 Gln Asn Asn Val Ser Ala Val Ser Cys Ile Val Ser His Ser Thr Gly 130                 135                 140 aat cag tct ctg tcc ata gaa ctg agt aga ggt acc acc agc acc acc    480 Asn Gln Ser Leu Ser Ile Glu Leu Ser Arg Gly Thr Thr Ser Thr Thr 145                 150                 155                 160 cct tcc ttg ctg acc att ctc tat gtg aaa atg gtc ctt ttg ggg att    528 Pro Ser Leu Leu Thr Ile Leu Tyr Val Lys Met Val Leu Leu Gly Ile             165                 170                 175 att ctt ctt aaa gtg gga ttt gct ttc ttc cag aag aga aat gtt acc    576 Ile Leu Leu Lys Val Gly Phe Ala Phe Phe Gln Lys Arg Asn Val Thr         180                 185                 190 aga aca tgaatatcca gatttctgga agctcattag tctgatgaca cataccagaa     632 Arg Thr aacagcattt gtaatcaact ttctcattgg aatccagctt acccgtccct gctgtcttca  692 tgtttgttag acactcacct ccaaattctt aactgagaag ggctcctgtc taaaggaaat  752 atggggacaa attgtggagc atagaccaaa agaaaggcca tccagagact gccccaccta  812 aggacccatc ccatatacag acaccaaacc cagacactac tgaagatgct gcgaagcgtt  872 tgctgacagg agcctgttat agctgtctcc tgagaggctc agccagagcc tgacaaatac  932 ataggtagat gcttgcagcc aacaactgga ctgagcaaaa aatctccatt ggaggagtta  992 gagaaaggac tgaagagggt gaaagggttt gcagccccat aggaagaaca acaatatcaa  1052 ccaaccagat ctcccagagc tcccagggac taa                               1085 RGQPSCIMAYKVETKETNETCLGRNITWASTPDHIPDLQISAVALQHEGNYLCEITTPEGNFHKVYDLQVLVPPEV TYFLGENRTAVCEAMAGKPAAQISWTPDGDCVTKSESHSNGTVTVRSTCHWEQNNVSAVSCIVSHSTGNQSLSIEL SRGTTSTTPSLLTILYVKMVLLGIILLKVGFAFFQKRNVTRT 啮齿类动物,例如,小鼠,OX2RH4(SEQ ID NO:22和23): atg cat gct ctg ggg agg att ccg act ttg act ttg ctg atc ttc atc    48 Met His Ala Leu Gly Arg Ile Pro Thr Leu Thr Leu Leu Ile Phe Ile -25                 -20                 -15                 -10 aat att ttt gtg tct ggg tca agt tgt act gat gag aat caa aca ata    96 Asn Ile Phe Val Ser Gly Ser Ser Cys Thr Asp Glu Asn Gln Thr Ile              -5              -1   1               5 cag aat gac agt tca tct tct ctg aca caa gtt aac act aca atg tct    144 Gln Asn Asp Ser Ser Ser Ser Leu Thr Gln Val Asn Thr Thr Met Ser      10                  15                  20 gta cag atg gat aaa aag gct ctg ctc tgc tgc ttt tct agt cca ctg    192 Val Gln Met Asp Lys Lys Ala Leu Leu Cys Cys Phe Ser Ser Pro Leu  25                  30                  35 ata aat gca gta tta atc aca tgg ata ata aaa cac aga cac ctg cct    240 Ile Asn Ala Val Leu Ile Thr Trp Ile Ile Lys His Arg His Leu Pro  40                  45                  50                  55 tcc tgc aca ata gca tac aac cta gat aaa aag acc aat gaa acc agc    288 Ser Cys Thr Ile Ala Tyr Asn Leu Asp Lys Lys Thr Asn Glu Thr Ser              60                  65                  70 tgc ttg ggc agg aac atc acc tgg gcc tcc aca cct gac cac agt cct    336 Cys Leu Gly Arg Asn Ile Thr Trp Ala Ser Thr Pro Asp His Ser Pro          75                  80                  85 gaa ctt cag atc agt gca gtg gcc ctc cag cat gag ggg act tac aca    384 Glu Leu Gln Ile Ser Ala Val Ala Leu Gln His Glu Gly Thr Tyr Thr      90                  95                 100 tgt gag ata gta aca cct gaa ggg aat tta gaa aaa gtc tat gac ctc    432 Cys Glu Ile Val Thr Pro Glu Gly Asn Leu Glu Lys Val Tyr Asp Leu 105                 110                 115 caa gtg ctg gtg ccc cct gag gta acc tac ttt cca ggg aaa aac aga    480 Gln Val Leu Val Pro Pro Glu Val Thr Tyr Phe Pro Gly Lys Asn Arg 120                 125                 130                 135 act gca gtc tgt gag gca atg gca ggc aag cct gct gca cag atc tct    528 Thr Ala Val Cys Glu Ala Met Ala Gly Lys Pro Ala Ala Gln Ile Ser             140                 145                 150 tgg act cca gat ggg gac tgt gtc act aag agt gag tca cac agc aat    576 Trp Thr Pro Asp Gly Asp Cys Val Thr Lys Ser Glu Ser His Ser Asn         155                 160                 165 ggc act gtg act gtc agg agc acg tgc cac tgg gag cag aac aat gtg    624 Gly Thr Val Thr Val Arg Ser Thr Cys His Trp Glu Gln Asn Asn Val     170                 175                 180 tct gtt gtg tcc tgc tta gtc tct cat tcg act ggt aat cag tct ctg    672 Ser Val Val Ser Cys Leu Val Ser His Ser Thr Gly Asn Gln Ser Leu 185                 190                 195 tcc ata gaa ctg agt caa ggt aca atg acc acc ccc cgt tcc ttg ctg    720 Ser Ile Glu Leu Ser Gln Gly Thr Met Thr Thr Pro Arg Ser Leu Leu 200                 205                 210                 215 acc att ctc tat gtg aaa atg gcc ctt ttg gtg att att ctt ctt aac    768 Thr Ile Leu Tyr Val Lys Met Ala Leu Leu Val Ile Ile Leu Leu Asn             220                 225                 230 gta gga ttt gct ttc ttc cag aag aga aat ttt gcc aga aca tga        813 Val Gly Phe Ala Phe Phe Gln Lys Arg Asn Phe Ala Arg Thr         235                 240                 245 MHALGRIPTLTLLIFINIFVSGSSCTDENQTIQNDSSSSLTQVNTTMSVQMDKKALLCCFSSPLINAVLIT WIIKHRHLPSCTIAYNLDKKTNETSCLGRNITWASTPDHSPELQISAVALQHEGTYTCEIVTPEGNLEKVY DLQVLVPPEVTYFPGKNRTAVCEAMAGKPAAQISWTPDGDCVTKSESHSNGTVTVRSTCHWEQNNVSVVSC LVSHSTGNQSLSIELSQGTMTTPRSLLTILYVKMALLVIILLNVGFAFFQKRNFART 表3:啮齿类动物,例如,小鼠,OX2RH3(SEQ ID NO:11和12): ggcacgagtt acgatttgtg cttaacctga ctccactcca g atg cat gct ttg ggg  56                                           Met His Ala Leu Gly                                           -25 agg act ctg gct ttg atg tta ctc atc ttc atc act att ttg gtg cct    104 Arg Thr Leu Ala Leu Met Leu Leu Ile Phe Ile Thr Ile Leu Val Pro -20                 -15                 -10                  -5 gag tca agt tgt tca gtg aaa gga cgg gag gag atc cca ccg gat gat    152 Glu Ser Ser Cys Ser Val Lys Gly Arg Glu Glu Ile Pro Pro Asp Asp          -1   1               5                  10 tca ttt cct ttt tca gat gat aat atc ttc cct gat gga gtg ggc gtc    200 Ser Phe Pro Phe Ser Asp Asp Asn Ile Phe Pro Asp Gly Val Gly Val      15                  20                  25 acc atg gag att gag att atc act cca gtg tct gta cag ata ggt atc    248 Thr Met Glu Ile Glu Ile Ile Thr Pro Val Ser Val Gln Ile Gly Ile  30                  35                  40 aag gct cag ctt ttc tgt cat cct agt cca tca aaa gaa gca aca ctt    296 Lys Ala Gln Leu Phe Cys His Pro Ser Pro Ser Lys Glu Ala Thr Leu  45                  50                  55                  60 aga ata tgg gaa ata act ccc aga gac tgg cct tcc tgc aga cta ccc    344 Arg Ile Trp Glu Ile Thr Pro Arg Asp Trp Pro Ser Cys Arg Leu Pro              65                  70                  75 tac aga gca gag ttg cag cag atc agt aaa aaa atc tgt act gag aga    392 Tyr Arg Ala Glu Leu Gln Gln Ile Ser Lys Lys Ile Cys Thr Glu Arg          80                  85                  90 gga acc act agg gtc cct gca cat cac cag agt tct gac ctt ccc atc    440 Gly Thr Thr Arg Val Pro Ala His His Gln Ser Ser Asp Leu Pro Ile      95                 100                 105 aaa tca atg gcc ctc aag cat gat ggg cat tac tca tgt cgg ata gaa    488 Lys Ser Met Ala Leu Lys His Asp Gly His Tyr Ser Cys Arg Ile Glu 110                 115                 120 aca aca gat ggg att ttc caa gag aga cat agc atc caa gtg cca ggg    536 Thr Thr Asp Gly Ile Phe Gln Glu Arg His Ser Ile Gln Val Pro Gly 125                 130                 135                 140   gaa aat aga act gta gtt tgt gag gca att gca agc aag cct gct atg    584 Glu Asn Arg Thr Val Val Cys Glu Ala Ile Ala Ser Lys Pro Ala Met             145                 150                 155 cag atc ttg tgg act cca gat gag gac tgt gtc act aag agt aaa tca    632 Gln Ile Leu Trp Thr Pro Asp Glu Asp Cys Val Thr Lys Ser Lys Ser         160                 165                 170 cac aat gac acc atg att gtc agg agc aag tgc cac agg gag aaa aac    680 His Asn Asp Thr Met Ile Val Arg Ser Lys Cys His Arg Glu Lys Asn     175                 180                 185 aat ggc cac agt gtg ttc tgc ttt atc tcc cat ttg act gat aac tgg    728 Asn Gly His Ser Val Phe Cys Phe Ile Ser His Leu Thr Asp Asn Trp 190                 195                 200 att ctc tcc atg gaa cag aat cga ggt aca acc agc atc ctg cct tcc    776 Ile Leu Ser Met Glu Gln Asn Arg Gly Thr Thr Ser Ile Leu Pro Ser 205                 210                 215                 220 ttg ctg agc att ctc tat gtg aaa ctg gct gta act gtt ctc atc gta    824 Leu Leu Ser Ile Leu Tyr Val Lys Leu Ala Val Thr Val Leu Ile Val             225                 230                 235  gga ttt gct ttt ttc cag aag aga aat tat ttc aga gtg cca gaa ggc    872 Gly Phe Ala Phe Phe Gln Lys Arg Asn Tyr Phe Arg Val Pro Glu Gly         240                 245                 250 tcc tgaggagagt ggtctgtggt taagatgaga tttaccacca tctgaaagac         925 Ser atcttgtcta ccgcgcagcg tgctgagatt ccgagaagca gccacagaac ctactaggaa  985 gacaaatctg atgtggttgt caatcctttc aatggacctg agtacttcta taaacccgag  1045 tgaggttgtg ctggacccag gagccaggct aggtcatata tgttgatttt tgctgcaaga  1105 cctcatggtt tatctacaaa tcctaaattc tttcacttcc agttttaaaa cttttggccc  1165 aagcatttta tccacagcat aacaccttta aagaaactct cccacggaaa ctgctggttc  1225  catggaatgg aaaattgcaa catggtttac aagacagtgc aaaccaagca gcattccaag  1285 atatgagctt cagaaagtta caggaactgt cttgggacga gaaagaagga ttaaatagtt  1345 cccagtccc                                                          1354 MHALGRTLALMLLIFITILVPESSCSVKGREEIPPDDSFPFSDDNIFPDGVGVTMEIEIITPVSVQIGIKAQLFCH PSPSKEATLRIWEITPRDWPSCRLPYRAELQQISKKICTERGTTRVPAHHQSSDLPIKSMALKHDGHYSCRIETTD GIFQERHSIQVPGENRTVVCEAIASKPAMQILWTPDEDCVTKSKSHNDTMIVRSKCHREKNNGHSVFCFISHLTDN WILSMEQNRGTTSILPSLLSILYVKLAVTVLIVGFAFFQKRNYFRVPEGS 表4:OX2R同系物的反向翻译: 啮齿类动物,例如,小鼠,OX2RH1(SEQ ID NO:13):   atgytntgyt tytggmgnac nwsncaygtn gcngtnytny tnathtgggg ngtnttygcn 60   gcngarwsnw sntgyccnga yaaraaycar acnatgcara ayaaywsnws nacnatgavn 120   gargtnaaya cnacngtntt ygtncaratg ggnaaraarg cnytnytntg ytgyccnwsn 180   athwsnytna cnaargtnat hytnathacn tggacnatha cnytnmgngg ncarccnwsn 240   tgyathathw sntayaargc ngayacnmgn garacncayg arwsnaaytg ywsngaymgn 300   wsnathacnt gggcnwsnac nccngayytn gcnccngayy tncarathws ngcngtngcn 360   ytncarcayg arggnmgnta ywsntgygay athgcngtnc cngayggnaa yttycaraay 420   athtaygayy tncargtnyt ngtnccnccn gargtnacnc ayttyccngg ngaraaymgn 480   acngcngtnt gygargcnat hgcnggnaar ccngcngcnc arathwsntg gacnccngay 540   ggngaytgyg tngcnaaraa ygarwsncay wsnaayggna cngtnacngt nmgnwsnacn 600   tgycaytggg arcarwsnca ygtnwsngtn gtnttytgyg tngtnwsnca yytnacnacn 660   ggnaaycarw snytnwsnat hgarytnggn mgnggnggng aycarytnyt nggnwsntay 720   athcartaya thathccnws nathathath ytnathatha thggntgyat htgyytnytn 780   aarathwsng gntgymgnaa rtgyaarytn ccnaarwsng gngcnacncc ngayathgar 840   gargaygara tgcarccnta ygcnwsntay acngaraarw snaayccnyt ntaygayacn 900   gtnacnacna cngargcnca yccngcnwsn carggnaarg tnaayggnac ngaytgyytn 960   acnytnwsng cnatgggnat h                                           981 灵长类动物,例如,人,OX2RH1(SEQ ID NO:14):   atgytntgyc cntggmgnac ngcnaayytn ggnytnytny tnathytnac nathttyytn 60   gtngcngarg cngarggngc ngcncarccn aayaaywsny tnatgytnca racnwsnaar 120   garaaycayg cnytngcnws nwsnwsnytn tgyatggayg araarcarat hacncaraay 180   taywsnaarg tnytngcnga rgtnaayacn wsntggccng tnaaratggc nacnaaygcn 240   gtnytntgyt gyccnccnat hgcnytnmgn aayytnatha thathacntg ggarathath 300   ytnmgnggnc arccnwsntg yacnaargcn tayaaraarg aracnaayga racnaargar 360   acnaaytgya cngaygarmg nathacntgg gtnwsnmgnc cngaycaraa ywsngayytn 420   carathmgna cngtngcnat hacncaygay ggntaytaym gntgyathat ggtnacnccn 480   gayggnaayt tycaymgngg ntaycayytn cargtnytng tnacnccnga rgtnacnytn 540   ttycaraaym gnaaymgnac ngcngtntgy aargcngtng cnggnaarcc ngcngcncay 600   athwsntgga thccngargg ngaytgygcn acnaarcarg artaytggws naayggnacn 660   gtnacngtna arwsnacntg ycaytgggar gtncayaayg tnwsnacngt nacntgycay 720   gtnwsncayy tnacnggnaa yaarwsnytn tayathgary tnytnccngt nccnggngcn 780   aaraarathw snaarathat htaywsnath taycayccnt aytaytayta yytngaycay 840   mgnggnathc ayytngtngt ngarwsncar tggytncara arath                 885   灵长类动物,例如,人,OX2RH1.2(SEQ ID NO:21):   atgytntgyc cntggmgnac ngcnaayytn ggnytnytny tnathytnac nathttyytn 60   gtngcngarg cngarggngc ngcncarccn aayaaywsny tnatgytnca racnwsnaar 120   garaaycayg cnytngcnws nwsnwsnytn tgyatggayg araarcarat hacncaraay 180   taywsnaarg tnytngcnga rgtnaayacn wsntggccng tnaaratggc nacnaaygcn 240   gtnytntgyt gyccnccnat hgcnytnmgn aayytnatha thathacntg ggarathath 300   ytnmgnggnc arccnwsntg yacnaargcn taymgnaarg aracnaayga racnaargar 360   acnaaytgya cngaygarmg nathacntgg gtnwsnmgnc cngaycaraa ywsngayytn 420   carathmgnc cngtngcnat hacncaygay ggntaytaym gntgyathat ggtnacnccn 480   gayggnaayt tycaymgngg ntaycayytn cargtnytng tnacnccnga rgtnacnytn 540   ttycaraaym gnaaymgnac ngcngtntgy aargcngtng cnggnaarcc ngcngcncar 600   athwsntgga thccngargg ngaytgygcn acnaarcarg artaytggws naayggnacn 660   gtnacngtna arwsnacntg ycaytgggar gtncayaayg tnwsnacngt nacntgycay 720   gtnwsncayy tnacnggnaa yaarwsnytn tayathgary tnytnccngt nccnggngcn 780   aaraarwsng cnaarytnta yathccntay athathytna cnathathat hytnacnath 840   gtnggnttya thtggytnyt naargtnaay ggntgymgna artayaaryt naayaaracn 900   garwsnacnc cngtngtnga rgargaygar atgcarccnt aygcnwsnta yacngaraar 960   aayaayccny tntaygayac nacnaayaar gtnaargcnw sncargcnyt ncarwsngar 1020   gtngayacng ayytncayac nytn                                        1044 啮齿类动物,例如,小鼠,OX2RH1(SEQ ID NO:15):   atgttytgyt tytggmgnac nwsngcnytn gcngtnytny tnathtgggg ngtnttygtn 60   gcnggnwsnw sntgyacnga yaaraaycar acnacncara ayaaywsnws nwsnccnytn 120   acncargtna ayacnacngt nwsngtncar athggnacna argcnytnyt ntgytgytty 180   wsnathccny tnacnaargc ngtnytnath acntggatha thaarytnmg nggnytnccn 240   wsntgyacna thgcntayaa rgtngayacn aaracnaayg aracnwsntg yytnggnmgn 300   aayathacnt gggcnwsnac nccngaycay wsnccngary tncarathws ngcngtnacn 360   ytncarcayg arggnacnta yacntgygar acngtnacnc cngarggnaa yttygaraar 420   aaytaygayy tncargtnyt ngtnccnccn gargtnacnt ayttyccnga raaraaymgn 480   wsngcngtnt gygargcnat ggcnggnaar ccngcngcnc arathwsntg gwanccngay 540   ggngaytgyg tnacnacnws ngarwsncay wsnaayggna cngtnacngt nmgnwsnacn 600   tgycaytggg arcaraayaa ygtnwsngay gtnwsntgya thgtnwsnca yytnacnggn 660   aaycarwsny tnwsnathga rytnwsnmgn ggnggnaayc arwsnytnmg nccntayath 720   ccntayatha thccnwsnat hathathytn athathathg gntgyathtg yytnytnaar 780   athwsnggnt tymgnaartg yaarytnccn aarytngarg cnacnwsngc nathgargar 840   gaygaratgc arccntaygc nwsntayacn garaarwsna ayccnytnta ygayacngtn 900   acnaargtng argcnttycc ngtnwsncar ggngargtna ayggnacnga ytgyytnacn 960   ytnwsngcna thggnath                                               978 灵长类动物,例如,人,OX2RH2(SEQ ID NO:16):   atgggnggna arcaratgac ncaraaytay wsnacnatht tygcngargg naayathwsn 60   carccngtny tnatggayat haaygcngtn ytntgytgyc cnccnathgc nytnmgnaay 120   ytnathatha thacntggga rathathytn mgnggncarc cnwsntgyac naargcntay 180   aaraargara cnaaygarac naargaracn aaytgyacng tngarmgnat hacntgggtn 240   wsnmgnccng aycaraayws ngayytncar athmgnccng tngayacnac ncaygayggn 300   taytaymgng gnathgtngt nacnccngay ggnaayttyc aymgnggnta ycayytncar 360   gtnytngtna cnccngargt naayytntty carwsnmgna ayathacngc ngtntgyaar 420   gcngtnacng gnaarccngc ngcncarath wsntggathc cngarggnws nathytngcn 480   acnaarcarg artaytgggg naayggnacn gtnacngtna arwsnacntg yccntgggar 540   ggncayaarw snacngtnac ntgycaygtn wsncayytna cnggnaayaa rwsnytnwsn 600   gtnaarytna aywsnggnyt nmgnacnwsn ggnwsnccng cnytnwsnyt nytnathath 660   ytntaygtna arytnwsnyt nttygtngtn athytngtna cnacnggntt ygtnttytty 720   carmgnatha aycaygtnmg naargtnytn                                  750 啮齿类动物,例如,小鼠,OX2RH2(SEQ ID NO:17):   mgnggncarc cnwsntgyat hatggcntay aargtngara cnaargarac naaygaracn 60   tgyytnggnm gnaayathac ntgggcnwsn acnccngayc ayathccnga yytncarath 120   wsngcngtng cnytncarca ygarggnaay tayytntgyg arathacnac nccngarggn 180   aayttycaya argtntayga yytncargtn ytngtnccnc cngargtnac ntayttyytn 240   ggngaraaym gnacngcngt ntgygargcn atggcnggna arccngcngc ncarathwsn 300   tggacnccng ayggngaytg ygtnacnaar wsngarwsnc aywsnaaygg nacngtnacn 360   gtnmgnwsna cntgycaytg ggarcaraay aaygtnwsng cngtnwsntg yathgtnwsn 420   caywsnacng gnaaycarws nytnwsnath garytnwsnm gnggnacnac nwsnacnacn 480   ccnwsnytny tnacnathyt ntaygtnaar atggtnytny tnggnathat hytnytnaar 540   gtnggnttyg cnttyttyca raarmgnaay gtnacnmgna cn                    582 啮齿类动物,例如,小鼠,OX2RH4(SEQ ID NO:24):   atgcaygcny tnggnmgnat hccnacnytn acnytnytna thttyathaa yathttygtn 60   wsnggnwsnw sntgyacnga ygaraaycar acnathcara aygaywsnws nwsnwsnytn 120   acncargtna ayacnacnat gwsngtncar atggayaara argcnytnyt ntgytgytty 180   wsnwsnccny tnathaaygc ngtnytnath acntggatha thaarcaymg ncayytnccn 240   wsntgyacna thgcntayaa yytngayaar aaracnaayg aracnwsntg yytnggnmgn 300   aayathacnt gggcnwsnac nccngaycay wsnccngary tncarathws ngcngtngcn 360   ytncarcayg arggnacnta yacntgygar athgtnacnc cngarggnaa yytngaraar 420   gtntaygayy tncargtnyt ngtnccnccn gargtnacnt ayttyccngg naaraaymgn 480   acngcngtnt gygargcnat ggcnggnaar ccngcngcnc arathwsntg gacnccngay 540   ggngaytgyg tnacnaarws ngarwsncay wsnaayggna cngtnacngt nmgnwsnacn 600   tgycaytggg arcaraayaa ygtnwsngtn gtnwsntgyy tngtnwsnca ywsnacnggn 660   aaycarwsny tnwsnathga rytnwsncar ggnacnatga cnacnccnmg nwsnytnytn 720   acnathytnt aygtnaarat ggcnytnytn gtnathathy tnytnaaygt nggnttygcn 780   ttyttycara armgnaaytt ygcnmgnacn                                  810 啮齿类动物,例如,小鼠,OX2RH3(SEQ ID NO:18):   atgcaygcny tnggnmgnac nytngcnytn atgytnytna thttyathac nathytngtn 60   ccngarwsnw sntgywsngt naarggnmgn gargarathc cnccngayga ywsnttyccn 120   ttywsngayg ayaayathtt yccngayggn gtnggngtna cnatggarat hgarathath 180   acnccngtnw sngtncasat hggnathaar gcncarytnt tytgycaycc nwsnccnwsn 240   aargargcna cnytnmgnat htgggarath acnccnmgng aytggccnws ntgymgnytn 300   ccntaymgng cngarytnca rcarathwsn aaraaratht gyacngarmg nggnacnacn 360   mgngtnccng cncaycayca rwsnwsngay ytnccnatha arwsnatggc nytnaarcay 420   gayggncayt aywsntgymg nathgaracn acngayggna thttycarga rmgncaywsn 480   athcargtnc cnggngaraa ymgnacngtn gtntgygarg cnathgcnws naarccngcn 540   atgcarathy tntggacncc ngaygargay tgygtnacna arwsnaarws ncayaaygay 600   acnatgathg tnmgnwsnaa rtgycaymgn garaaraaya ayggncayws ngtnttytgy 660   ttyathwsnc ayytnacnga yaaytggath ytnwsnatgg arcaraaymg nggnacnacn 720   wsnathytnc cnwsnytnyt nwsnathytn taygtnaary tngcngtnac ngtnytnath 780   gtnggnttyg cnttyttyca raarmgnaay tayttymgng tnccngargg nwsn       834 表5:各物种的OX2R同系物1和2的序列对比: OX2RH1_MU  MFCFWRTSALAVLLIWGVFVAGSS--------------------------CTDKNQTTQN OX2RH1_RT  MLCFWRTSHVAVLLIWGVFAAESS--------------------------CPDKNQTMQN OX2RH2_MU  ------------------------------------------------------------ OX2RH1_HU  MLCPWRTANLGLLLILTIFLVAEAEGAAQPNNSLMLQTSKENHALASSSLCMDEKQITQN OX2RH2_HU  ---------------------------------------------------MGGKQMTQN OX2RH1_MU  NSSSPLTQVNTTVSVQIGTKALLCCFSIPLTKAVLITWIIKLRGLPSCTIAYKVDT-KTN OX2RH1_RT  NSST-MTEVNTTVFVQMGKKALLCCPSISLTKVILITWTITLRGQPSCIISYKADTRETH OX2RH2_MU  ------------------------------------------RGQPSCIMAYKVETKETN OX2RH1_HU  YSKV-LAEVNTSWPVKMATNAVLCCPPIALRNLIIITWEIILRGQPSCTKAYKKETNETK OX2RH2_HU  YSTI-FAEGNISQPVLMDINAVLCCPPIALRNLIIITWEIILRGQPSCTKAYKKETNETK                                                  ** ***  :** :* :*: OX2RH1_MU  ETSCLGRNITWASTPDHSPELQISAVTLQHEGTYTCETVTPEGNFEKNYDLQVLVPPEVT OX2RH1_RT  ESNCSDRSITWASTPDLAPDLQISAVALQHEGRYSCDIAVPDGNFQNIYDLQVLVPPEVT OX2RH2_MU  ET-CLGRNITWASTPDHIPDLQISAVALQHEGNYLCEITTPEGNFHKVYDLQVLVPPEVT OX2RH1_HU  ETNCTDERITWVSRPDQNSDLQIRTVAITHDGYYRCIMVTPDGNFHRGYHLQVLVTPEVT OX2RH2_HU  ETNCTVERITWVSRPDQNSDLQIRPVDTTHDGYYRGIVVTPDGNFHRGYHLQVLVTPEVN        *: *  . ***.* **  .:*** .*   *:* *    ..*:***.. *.*****.***. OX2RH1_MU  YFPEKNRSAVCEAMAGKPAAQISWSPDG-DCVTTSESHSNGTVTVRSTCHWEQNNVSDVS OX2RH1_RT  HFPGENRTAVCEAIAGKPAAQISWTPDG-DCVAKNESHSNGTVTVRSTCHWEQSHVSVVF OX2RH2_MU  YFLGENRTAVCEAMAGKPAAQISWTPDG-DCVTKSESHSNGTVTVRSTCHWEQNNVSAVS OX2RH1_HU  LFQNRNRTAVCKAVAGKPAAHISWIPEG-DCATKQEYWSNGTVTVKSTCHWEVHNVSTVT OX2RH2_HU  LFQSRNITAVCKAVTGKPAAQISWIPEGSILATKQEYWGNGTVTVKSTCPWEGH-KSTVT         *  .* :***:*::*****:*** *:*    .:..*  .******:*** **   * * OX2RH1_MU  CIVSHLT-GNQSLSIELSRGGNQSLRPYIPYIIPSIIILIIIGCICLLKISGFRKCKLPK OX2RH1_RT  CVVSHLTTGNQSLSIELGRGGDQLLGSYIQYIIPSIIILIIIGCICLLKISGCRKCKLPK OX2RH2_MU  CIVSHST-GNQSLSIELSRGTTSTTPSLLTILYVKMVLLGII----LLKV-G--FAFFQK OX2RH1_HU  CHVSHLT-GNKSLYIEL---LPVPG--AKKISKIIYSIYHPY--YYYLDHRG--IHLVVE OX2RH2_HU  CHVSHLT-GNKSLSVKLNSGLRTSGSPALSLLIILYVKLSLF--VVILVTTG--FVFFQR        * *** * **:** ::*                              *   *     . . OX2RH1_MU  LEATSAIEEDEMQPYASYTEKSNPLYDTVTKVEAFPVSQGEVNGTDCLTLSAIGI OX2RH1_RT  SGATPDIEEDEMQPYASYTEKSNPLYDTVTTTEAHPASQGKVNGTDCLTLSAMGI OX2RH2_MU  RNVTRT------------------------------------------------- OX2RH1_HU  SQWLQKI------------------------------------------------ OX2RH2_HU  INHVRKVL----------------------------------------------- OX2R 同系物多肽的亲缘(%)                     人H1     人H2    小鼠H1   小鼠H2    小鼠H3 大鼠  H1   Ig区      54       52      72       73        32            TM/cyt    ?       0       84       0         0 小鼠  H3   Ig区      33       29      39       46            TM/cyt    ?       46      0        54 小鼠  H2   Ig区      60       51      82                     TM/cyt    ?       49      0 小鼠  H1   Ig区      53       47            TM/cyt    ?      0 人    H2   Ig区      79            TM/cyt    ? ?=序列无效;″0″=没有有效的配对 灵长类动物和啮齿类动物H2与啮齿类动物H4多肽的对比; 记录啮齿类动物H2和H4之间的相似性: pOX2RH2      1                     MGGK------QMTQN-YSTIFAEGNISQPVL  24 rOX2RH2      1                                                       0 rOX2RH4      1  MHALGRIPTLTLLIFINIFVSGSSCTDENQTIQNDSSSSLTQVNTTMSVQ  50 pOX2RH2     25  MDINAVLCCPPIALRNLIIITWEIILRGQPSCTKAYKKETNETKETNCTV  74 rOX2RH2      1                            RGQPSCIMAYKVETKETNET-CLG  23 rOX2RH4     51  MDKKALLCCFSSPLINAVLITWIIKHRHLPSCTIAYN-LDKKTNETSCLG  99                                       *  ***  **      * ** * pOX2RH2     75  ERITWVSRPDQNSDLQIRPVDTTHDGYYRGIVVTPDGNFHRGYHLQVLVT  124 rOX2RH2     24  RNITWASTPDHIPDLQISAVALQHEGNYLCEITTPEGNFHKVYDLQVLVP  73 rOX2RH4    100  RNITWASTPDHSPELQISAVALQHEGTYTCEIVTPEGNLEKVYDLQVLVP  149               *** * **.  .***  *   *.* *   . **.**  . * ***** pOX2RH2    125  PEVNLFQSRNITAVCKAVTGKPAAQISWIPEGSILATKQEYWGNGTVTVK  174 rOX2RH2     74  PEVTYFLGENRTAVCEAMAGKPAAQISWTPDG-DCVTKSESHSNGTVTVR  122 rOX2RH4    150  PEVTYFPGKNRTAVCEAMAGKPAAQISWTPDG-DCVTKSESHSNGTVTVR  198             ***. *   * **** *..********* *.*    ** *   ******. pOX2RH2    175  STCPWEG-HKSTVTCHVSHLTGNKSLSVKLNSGLRTSGSPALSLLIILYV  223 rOX2RH2    123  STCHWEQNNVSAVSCIVSHSTGNQSLSIELSRGTTST-TP--SLLTILYV  169 rOX2RH4    199  STCHWEQNNVSVVSCLVSHSTGNQSLSIELSQGTMTT--PR-SLLTILYV  245             *** **  . * *.* *** ***.***. *  *  ..  *  *** **** pOX2RH2    224  KLSLFVVILVTTGFVFFQRINHVRKVL  250 rOX2RH2    170  KMVLLGIILLKVGFAFFQKRNVTRT    194 rOX2RH4    246  KMALLVIILLNVGPAFFQKRNFART    270             *. *   .**. ** ***. *  * OX2RH1和2的实施方案显示了彼此特殊的相似性,见,例如,表5。
大鼠H1的特殊区或位置是:与cys2,leu33,cys35,ile46,trp48,   arg53,pro56,cys58,tyr62,cys74,thr80,trp81,leu91,ile93,   his100,gly102,tyr104,gly113,phe115,leu122,val123,pro127,   asn136,ala139,val140,cys141,ala143,lys147,pro148,ala149,   ile152,trp154,pro156,asn169,thr171,val174,ser176,cys178,   glu181,ser186,val188,cys190,ser193,his194,thr196,asn198,   leu202,gly215,tyr217,leu237,lys238,和ile304.相邻(之 前,之上,或之后)的边界。
许多上述残基是在H1和H2之间是保守 的。
H2和H4也如此。
见表5。
大鼠OX2RH1的特殊区是来源于约 cys2-pro127的C2区,来源于约glu128-gly215的C2区,来源于约 tyr217-leu237的TM区段,和来源于约lys238-ile304的胞内区。
小鼠H1的相应区段是约ser24-pro150,glu151-gly231,tyr239- leu259,和lys260-ile326。
在小鼠H2中,该区段相应的,在有效的 序列中,来源于约arg1-pro74,glu75-gly155,pro161-gly182,和 phe183-thr194。
对于人的H2,该跨膜区段是约ala214-val233,和 thr234-leu250,在小鼠H3中,约pro119-gly237,具有膜内lys228, 和phe238-gly252。
表5也表示H2和H4实施方案的序列对比。
作为 片段的边界,其它感兴趣的位置是在具有大鼠OX2RH1或家族成员各 种亚型的同系物之间保守的那些。
在功能上,大鼠和小鼠H1结合OX2。
对于人的H1,这还未被证实, 但是可以很容易的试验。
下面描述与H2,H4,和H3组匹配的配位体。
如所预测的那样,啮齿类动物的H3与DAP12有关。
在没有陪伴 配偶体共表达的情况下,重组表达的标记DAP12的抗原决定部位不是 膜结合的。
见,例如,Bakker等,(1999)Proc.Nat’l Acad.Sci.USA 96:9792-9796。
小鼠的H3可以起陪伴配偶体的作用。
然而,通过DAP12 的信号途径需要结合H3配位体,其还未被鉴定,但是可以使用适当 的筛选策略,例如,生物化学或物理方法找到。
啮齿类动物H4和H2 的序列相似性显示了与DAP12,或可能是DAP10的相似性。
小鼠的H2和H4和人的H2可能具有这种特性,例如,与DAP12(活 化)或DAP10有关。
已经用一些有关的NK细胞上的受体确定了信号产 生的途径。
见,例如,Lanier等,(1998)Immunity 8:693-701;Smith 等,(1998)J.Immunol.161:7-10;Gosselin等(1999)J.Leukoc.Biol. 66:165-171;Tomasello等,(1998)J.Biol.Chem.273:34115- 34119;和McVicar等,(1998)J.Biol.Chem.273:32934-32942。
由于胞外区与H1成员的相似性,OX2-样基因,特别是OX2,可能是配 位体。
此处使用的术语OX2RH1,OX2RH2,或OX2RH4将用于描述含表1-2 中列出的氨基酸序列的蛋白。
在很多情况中,其基本片段可能是功能 或结构等价的,包括,例如,胞外区或胞内区。
本发明还包括各OX2RH 等位基因的蛋白变体,其中已经提供了它的序列,例如,突变蛋白或 可溶性胞外结构。
代表性地,这种激动剂或拮抗剂将显示小于约10% 的序列差异,因而常常具有1-11之间的残基置换,例如2,3,5,7, 及其它。
它还包括等位的和其它的变体,例如,所述蛋白的天然多态。
典型地,该受体以高亲和力结合相应的生物配位体,例如,至少约 100nM,最好是约30nM,优选约10nM,更优选约3nM。
此处也使用该 术语表示相关的天然存在的形式,例如,哺乳动物蛋白的,等位基因, 多态变体,和代谢变体。
受体复合体的优选形式将以适于配位体-受 体相互作用的选择性和亲和性结合适当的配位体。
本发明还包括具有与表1-3中的氨基酸序列相同的基本氨基酸序 列的蛋白或肽。
它包括具有相对较少的置换,例如,优选少于约3-5 的序列变体。
基本的肽“片段”或“区段”,是至少约8个氨基酸,通常至 少10个氨基酸,更通常至少12个氨基酸,常常至少14个氨基酸, 更常常是至少16个氨基酸,典型地至少18个氨基酸,更典型地至少 20个氨基酸,通常至少22个氨基酸,更特别是至少24个氨基酸,优 选至少26个氨基酸,更优选至少28个氨基酸,且,在特别优选的实 施方案中,至少约30个或更多氨基酸的氨基酸残基的一段序列。
可 互相比较不同蛋白区段序列的适宜长度的一段序列。
在很多情况中, 片段可以显示完整亚单位的功能特性,例如,跨膜受体的胞外区可以 保留配位体的结合特征,且可用于制备可溶性的受体-样复合体。
氨基酸序列的同源性,或序列的同一性,是通过使残基的匹配最 佳化而确定的。
在某些对比中,如果需要,可以引入裂隙。
见,例如, Needleham等,(1970)J.Mol.Biol.48:443-453;Sankoff等,(1983) chapter one in Time Warps,String Edits,and Macromolecules:The Theory and Practice of Sequence Comparison,Addison-Wesley, Reading,MA;和来源于IntelliGenetics,Mountain View,CA的软 件包;and University of Wisconsin Genetics Computer Group(GCG),Madison,WI;每篇文献均引入此处作为参考。
当认为 保守置换匹配时,其发生变化。
保守置换代表性地包括在下列组之内 的置换:甘氨酸,丙氨酸,缬氨酸,异亮氨酸,亮氨酸;天冬氨酸, 谷氨酸;天冬酰胺,谷氨酰胺;丝氨酸,苏氨酸;赖氨酸,精氨酸; 和苯丙氨酸,酪氨酸。
同源氨基酸序列在受体同系物序列中包括天然 的等位变异和种间变异。
典型的同源蛋白或肽具有与表1-3的氨基酸 序列区段50-100%(如果可以引入裂隙)至60-100%的同源性(如果 包括保守置换)。
同源性的测量值为至少约70%,通常至少76%,更 通常至少81%,常常是至少85%,更是至少88%,代表性地至少90%, 更典型地至少92%,通常至少94%,更特别是至少95%,优选至少96%, 更优选97%,在特别优选的实施方案中,至少98%或更多。
同源性的 程度将根据所对比区段的长度而变化。
同源蛋白或肽,如等位变体, 将与表1-3中描述的实施方案共有大多数的生物活性。
此处使用术语“生物活性”用于描述,没有限制,通过受体样蛋 白对炎症应答,先天免疫,和/或形态发展的作用。
例如,这些受体 可能通过磷酸酶或磷酸化酶的活性介导它们的作用,其活性可以通过 标准方法很容易地测量。
见,例如,Hardie等,(eds.1995)The Protein Kinase FactBook vols.I和II,Academic Press,San Diego,CA; Hanks等(1991)Meth.Enzymol.200:38-62;Hunter等,(1992)Cell 70:375-388;Lewin(1990)Cell 61:743-752;Pines等,(1991)Cold Spring Harbor Symp.Ouant.Biol.56:449-463;和Parker等, (1993)Nature 363:736-738。
该受体同系物,或其一部分,作为磷 酸盐标记酶而标记普通或特异性的底物可能是有效的。
该亚单位可能 是引出识别抗体,或能够结合抗体的抗原的功能性免疫原。
术语OX2RH的配位体,激动剂,拮抗剂,和类似物包括一种分子, 其调节对OX2蛋白结合的特征性细胞应答,和具有配位体-受体相互 作用的更标准的结构结合竞争的分子,例如,该拮抗剂是受体同系物 或抗体的可溶性胞外区。
该细胞应答可能是通过受体酪氨酸激酶途径 而代表性介导的。
且,受体同系物可能是这样一种分子,其可作为与所述配位体, 或其类似物相结合的天然受体而起作用,或可能是这样一种分子,其 天然受体的功能性类似物。
该功能性类似物可能是具有结构修饰的受 体同系物,或可能是一种完全不相关的分子,其具有与适当的配位体 结合决定子相互作用的分子形状。
该配位体可作为激动剂或拮抗剂而 起作用,见,例如,Goodman等,(eds.1990)Goodman & Gilman’s:The Pharmacological Bases of Therapeutics,Pergamon Press,New York。
合理的药物设计也可以是基于受体同系物,抗体,或其它与实体 有关的效应子或受体同系物分子形状的结构研究而进行的。
见,例 如,Herz等,(1997)J.Recept.Signal Transduct.Res.17:671-776; 和Chaiken等,(1996)Trends Biotechnol.14:369-375。
效应子 可能是在应答配位体结合中介导其它作用的其它蛋白,或是通常与受 体同系物相互作用的其它蛋白。
确定哪个位点与特异性的其它蛋白相 互作用的方法是一种物理的结构测定方法,例如,X-射线晶体学或2- 维NMR技术。
这些可为氨基酸残基形成分子接触区提供指导。
对于蛋 白结构确定的详细描述,见,例如Blundell和Johnson(1976) Protein Crystallography,Academic Press,New York,其在此引 入作为参考。
II.活性 该受体-样蛋白具有多种不同的生物活性,例如,调节细胞增殖, 或在磷酸盐代谢中,被加入或自特异性底物,如蛋白上除去。
这通常 会引起炎症功能,其它先天免疫应答,或形态学作用的调节。
如所述 的那样,该受体同系物可能具有结合配位体的特异低亲和力。
OX2RH1具有暗示通过受体酪氨酸激酶途径信号的受体的基 序。
见,例如,Ihle等,(1997)Stem Cells 15(suppl.1):105-111; Silvennoinen等,(1997)APMIS 105:497-509;Levy(1997)Cytokine Growth Factor Review 8:81-90;Winston and Hunter(1996)Current Biol.6:668-671;Barrett(1996)Baillieres Clin.Gastroenterol. 10:1-15;和Briscoe等,(1996)Philos.Trans.R.Soc.Lond.B. Biol.Sci.  351:167-171。
OX2R同系物的生物活性可能与磷酸盐部分至底物的加入或除去 有关,代表性地以特异性的方式,但偶然以非特异性的方式。
通过标 准方法可以鉴定底物,或测定酶活性的条件,例如,Hardie等, (eds.1995)The Protein Kinase FactBook vols.I and II,Academic Press,San Diego,CA;Hanks等,(1991)Meth.Enzymol.200:38- 62;Hunter等(1992)Cell 70:375-388;Lewin(1990)Cell 61:743- 752;Pines等(1991)Cold spring Harbor Symp.Ouant.Biol.56: 449-463;和Parker等(1993)Nature 363:736-738。
受体同系物可以与一种或多种其它蛋白结合,形成功能复合体, 例如,其对于结合配位体或制备抗体可能是有效的。
这些将具有基本 的诊断用途,包括检测或量化。
III.核酸 本发明涉及分离的核酸或片段的用途,例如,其编码这些或紧密 相关的蛋白,或其片段,例如,编码相应的多肽,优选其是生物活性 的。
此外,本发明包括分离或重组的DNA,其编码具有同系物特征序 列的这种蛋白或多肽的组合。
代表性地,该核酸能够在适宜的条件下 与表1-3所列的核酸序列区段杂交,但优选不与其它已知Ig超家族 受体的相应区段杂交。
所述生物活性蛋白或多肽可以是全长蛋白,或 片段,且代表性地具有高度同源的氨基酸序列的区段,例如,显示与 表卜3中所列的相同的一段序列。
此外,本发明包括分离或重组核酸, 或其片段的用途,其编码具有与OX2RH蛋白等价的片段的蛋白。
该分 离的核酸可以在5’和3’侧面中具有各自的调节序列,例如,启动子, 增强子,聚-A附加信号,和来源于天然基因的其它序列。
“分离”的核酸是一种核酸,例如,RNA,DNA,或混合聚合物, 其基本上是纯的,例如,自其它的组分分离,该组分天然地伴有天然 序列,如来源于起源物种的旁侧基因组序列和核糖体,聚合酶。
该术 语包括已经从其天然存在的环境中除去的核酸序列,且包括重组或克 隆的DNA分离物,由此其不同于天然存在的组分,和化学合成的类似 物或通过异源系统生物合成的类似物。
基本纯的分子包括分子的分离 形式,完全或基本纯。
分离的核酸通常是分子的均一组分,但是,在某些实施方案中, 包含不均匀性,优选较少的。
此不均匀性代表性地在聚合物末端或对 所期望的生物功能或活性不重要的部分发现。
“重组”核酸代表性地是通过其生产方法或其结构而定义的。
关 于其生产方法,例如,通过这样一种方法制造产品,即使用重组核酸 技术,例如,人干预核苷酸序列。
代表性地,此干预包括体外操纵, 虽然在某些情况下,它可以包含更传统的动物培育技术。
选择性地, 它可以是通过生产一种序列而制造的核酸,该序列包含两个片段的融 合,其互相未天然地连接,但是应排除天然产物,例如,在其天然状 态中发现的天然存在的突变体。
因而,例如,也包括通过用非天然存 在载体转化细胞所生产的产物,是含序列的核酸,该序列是使用任一 合成的寡核苷酸方法得到的。
经常使用这种方法用编码相同或保守氨 基酸的冗余密码子来替换密码子,代表性地引入或除去限制酶序列识 别位点。
选择性地,该方法是通过把所期望功能的核酸区段连成一体 而进行的,以生产单一的遗传实体,该实体包含在普遍使用的天然形 式中找不到的所期望功能的组合,例如,编码融合蛋白。
限制酶识别 位点通常是这种人工操纵的靶,但是其它部位特异性的靶,例如,启 动子,DNA复制位点,调节序列,控制序列,或其它有用的特征均可 引入设计中。
相似的概念是指重组的,例如,融合,多肽。
这包括二 聚的重复。
特别包括合成的核酸,通过遗传密码密码冗余,编码等价 多肽成OX2受体同系物的片段和来源于各种不同的相关分子,例如, 其它的Ig超家族成员的序列融合。
核酸范围中的“片段”是至少大约17个核苷酸,通常至少21个 核苷酸,更通常至少25个核苷酸,一般至少30个核苷酸,更一般至 少35个核苷酸,常常至少39个核苷酸,更常常至少45个核苷酸, 代表性地至少50个核苷酸,更代表性地至少55个核苷酸,通常至少 60个核苷酸,更通常至少66个核苷酸,优选至少72个核苷酸,更优 选至少79个核苷酸,且在特别优选的实施方案中,至少85个或更多 的核苷酸的连续区段。
代表性地,不同遗传序列的片段可以互相比较 适宜长度的一段序列,下面描述特别定义的区段,如区。
编码OX2R同系物的核酸对于鉴定基因,mRNA,和编码自身或紧 密相关蛋白的cDNA类,和编码多态的,等位的,或其它遗传的变体 的,例如,来源于不同个体或相关物种的DNA是特别有效的。
这种筛 选优选的探针是受体同系物的那些区,该受体同系物在不同的多态变 体间保存,或其包含缺少特异性的核苷酸,且优选是全长的或接近全 长的。
在其他情况中,多态变体的特异性序列更有效。
定量或特异性 序列分析作为疾病或医学症状的标记,或在选择特殊治疗处理中的标 记物可能是有效的。
本发明进一步包括重组的核酸分子和具有与所述分离DNA相同或 高度同源的核酸序列的片段。
特别是,该序列常常被可操作地连接到 DNA区段上,其控制转录,翻译,和/或DNA的复制。
这些附加的区段 代表性地促进所期望核酸区段的表达。
同源的,或高度相同的,核酸序列,当互相比较时,例如,OX2RH 序列,显示显著的相似性。
核酸中同源性的标准是通过序列对比而通 常用于本领域中的同源性测量值,或基于杂交情况的测量值。
下面更 详细地描述比较的杂交情况。
核酸序列比较范围中的基本同一性意味着该区段,或它们的互补 链,当比较时,是相同的,当进行最佳序列对比时,与适宜核苷酸的 插入或缺失,在至少约60%的核苷酸中,通常至少66%,一般至少71%, 常常是至少76%,更常常是至少80%,通常至少84%,更通常至少88%, 代表性的至少91%,更代表性的至少约93%,优选至少约95%,更优选 至少约96-98%或更多,且在特别的实施方案中,高达99%或更多的核 苷酸,例如,编码结构区,如下述区段的区段。
选择性地,当该区段 代表性地使用来源于表1-3的序列,在选择性的杂交条件下杂交成链 或其补体时,存在基本上的同一性。
代表性地,当有至少约14个核 苷酸的一段序列的至少约55%,更代表性的至少约65%,优选至少约 75%,更优选至少约90%的同源性时,将发生选择性的杂交。
见, Kanehise(1984)Nucl.Acids Res.12:203-213,其引入此处作为参 考。
同源性对比的长度,如上所述,可以是较长的一段序列,且在某 些实施方案中,可以是至少约17个核苷酸,通常至少约20个核苷酸, 一般至少约24个核苷酸,通常至少约28个核苷酸,代表性的至少约 32个核苷酸,更代表性的至少约40个核苷酸,优选至少约50个核苷 酸,更优选至少约75-100或更多核苷酸的一段序列。
其包括,例如, 125,150,175,200,225,246,273,300,325,350,400,450, 500,550,600,650,700,750,800,850,900,和其它长度。
关于杂交范围中的同源性的严格条件,是杂交反应中控制的盐, 温度,有机溶剂,和其它参数条件的严格组合条件。
严格的温度条件 通常包括超过约30℃,更通常超过约37℃,代表性的超过45℃,更 代表性的超过约50℃,例如55℃或60℃,优选超过约65℃,更优选 超过约70℃的温度。
严格的盐条件一般小于约1M,更一般小于约 500mM,通常小于约400mM,更通常小于约300mM,代表性的小于约 200mM,优选小于约100mM,更优选小于约80mM,例如,小于50mM, 甚至小于约20mM。
然而,参数的组合较之任何单一参数更重要。
见, 例如,Wetmur和Davidson(1968),I.Mol.Biol.31:349-370,其引入 此处作为参考。
分离的DNA可以通过核苷酸置换,核苷酸缺失,核苷酸插入,和 核苷酸一段序列的翻转来修饰。
这些修饰通常产生新的DNA序列,其 编码此蛋白或其衍生物。
这些修饰的序列可用于生产突变蛋白(突变 蛋白)或提高变体物种的表达。
提高的表达可以包括基因扩增,增加 的转录,增加的翻译,及其它机理。
这种突变体OX2R同系物衍生物 包括蛋白或其片段的预先确定的或位点-特异性的突变,包括使用遗 传密码简并性的沉默突变。
此处使用的“突变体OX2的受体同系物” 包括一种多肽,另外落在上述OX2受体同系物的定义内,但是具有与 天然发现的其它Ig超家族不同的氨基酸序列,是否经由缺失,置换, 或插入。
特别是,“位点特异性突变体OX2的受体同系物”包括一种 蛋白,其具有与表1-3的蛋白相同的基本序列,且代表性地,共有某 些或大多数生物活性或效果,例如,此处所公开形式的免疫原性。
虽然位点特异性突变位点是预先确定的,突变体不要求必须是位 点特异性的。
哺乳动物OX2受体同系物的诱变可以通过基因中氨基酸 的插入或缺失而获得,与表达结合。
可以产生置换,缺失,插入,或 多种组合,以达到最终的构造。
插入包括氨基-或羧基-末端融合。
随 机诱变可以在靶密码子下进行,且可为了所期望的活性而筛选所表达 的哺乳动物OX2RH突变体,提供某些结构-活性亲缘关系的某些方面。
在具有已知序列的DNA中的预定位点进行置换突变的方法是本领域所 熟知的,例如,通过M13引物诱变。
见Sambrook等,(1989)和Ausubel 等(1987和定期增刊)。
DNA中的突变通常不应该替换读框外的编码序列,且优选的不会 产生互补区,应该杂交以生产次级mRNA结构,如环状结构或发夹结 构。
根据Beaucage和Carruthers(1981)Tetra.Letts.22:1859- 1862描述的亚磷酰胺方法,可生产适宜的合成DNA片段。
双链片段通 常是通过在适宜的条件下合成互补链并退火该链,或使用具有适宜引 物序列通过DNA聚合酶加入互补链而得到的。
聚合酶链反应(PCR)技术通常用于诱变中。
选择性的,诱变引 物通常用于在预定的位点产生确定突变的方法中。
见,例如,Innis 等(eds.1990)PCR Protocols:A Guide to Methods and Applications Academic Press,San Diego,CA;and Diwffenbach和 Dveksler(1995;eds.)PCR Primer:A Laboratory Mahual Cold Spring Harbor Press,CSH,NY。
本发明的某些实施方案涉及包含所述配位体序列或受体同系物 的结合组合物,在其它的实施方案中,可连接序列的功能性部分以编 码融合蛋白。
在其它形式中,所述序列的变体可被置换。
IV. 蛋白质,肽 如上所述,本发明包括哺乳动物的OX2RH多肽,例如,上述在表 1-3中公开的序列。
还涉及等位和其它变体的多肽,包括,例如,融 合蛋白,该融合蛋白是将这种序列的一部分与其它,包括,例如,抗 原决定部位的标记物,功能域,和DAP12或DAP10序列相结合。
本发明还提供重组蛋白,例如,使用来源于这些灵长类动物或啮 齿类动物蛋白的区段的异源融合蛋白。
异源融合蛋白是蛋白或区段的 融合,其不是以相同的方式天然融合的。
因而,两个OX2RH的融合产 物是连续的蛋白分子,其具有在典型肽键中融合的序列,代表性地作 为单一翻译产物而生产,并显示一些特性,例如,来源于各源肽的序 列或抗原性。
将类似的概念用于异源核酸序列。
还提供将各种指定蛋 白组合而成的复合体。
此外,新结构可以从结合相似的功能或结构区来生产,其来源于 其它相关的蛋白,例如,其它含受体,包括物种变体的ITIM,ITAM, 或YxxM基序。
例如,配位体-结合或其它区段可在不同的新融合多肽 或片段之间被“交换”。
见,例如,Cunningham等,(1989)Science 243:1330-1336;和O’Dowd等,(1988)J.Biol.Chem.263:15985- 15992,每篇文献均引入此处作为参考。
因而,显示新的特异性结合的 嵌合多肽是由受体-结合特异性的功能键产生的。
例如,来源于其它 相关受体同系物分子的配位体结合区可被加入或置换为此蛋白或相 关蛋白的其它区。
最终得到的蛋白常常具有杂交功能和特性。
例如, 融合蛋白可以包括导向区,其可用于提供融合蛋白至特殊的亚细胞器 的鳌合。
侯选融合配偶体和序列可以从各种序列数据库中选择,例如, GenBan k,c/o IntelliGenetics,Mountain View,CA;和BCG, University of Wisconsin Biotechnology Computing Group,Madison, WI,其均引入此处作为参考。
特别是,表1-3中提供的多肽序列的组 合是特别优选的。
蛋白的变体形式可以所述组合中的形式被置换。
本发明特别提供结合OX2-样配位体的突变蛋白,和/或其在信号 转导中受影响的突变蛋白。
OX2受体同系物家族中各成员的结构序列 对比显示了保守的特征/残基。
见,例如,表5。
OX2R同系物序列的 序列对比显示了各种结构上和功能上共有的特征。
见,Bazan等, (1996)Nature 379:591;Lodi等,(1994)Science 263:1762-1766; Sayle和Milner-White(1995)TIBS 20:374-376;和Gronenberg等, (1991)Protein Engineering 4:263-269。
用小鼠序列或者人序列的置换是特别优选的。
相反地,远离配位 体结合相互作用区的保守置换可能保存最多的信号活性;且远离胞内 区的保守置换可能保存最多的配位体结合特性。
哺乳动物OX2RH的“衍生物”包括氨基酸序列突变体,糖基化变 体,代谢衍生物和具有其它化学部分的共价或聚集接合物。
共价衍生 物可以用本领域熟知的方法,通过功能性至基团的连接而制备,该基 团是在OX2RH氨基酸侧链或在N-或C-端找到的。
这些衍生物可包括, 但不限于,羧基末端的酰胺或脂肪族酯,或含羧基侧链的残基,含羧 基残基的O-酰基衍生物,和氨基末端的氨基酸或含氨基,例如,赖氨 酸或精氨酸的残基的N-酰基衍生物。
酰基是自烷基-部分,包括C3- C18的普通烷基,的基团选择的,由此形成链烷基芳酰基类。
特别是,包括糖基化改变,例如,通过在它的合成和加工过程中, 或在进一步的加工步骤中,修饰多肽的糖基化模式来产生。
完成的特 别优选方法是使多肽暴露于糖基化酶,例如,哺乳动物糖基化酶,该 酶来源于通常提供这种加工的细胞。
还涉及脱糖基化酶。
还包括相同 的初级氨基酸序列译本,其具有其它微小的修饰,包括磷酸化的氨基 酸残基,例如磷酸丙糖,磷酸丝氨酸,或磷酸苏氨酸。
衍生物的主要类型是具有其它多肽蛋白的受体同系物或其片段 的共价接合物。
这些衍生物可在重组培养物,如N-或C-端融合的中 合成,或通过本领域的已知的,在通过反应侧基交联蛋白中有效的试 剂来合成。
具有交联剂的优选衍生位点是在游离氨基,碳水化合物部 分,和半胱氨酸残基。
还提供受体同系物和其它同源或异源蛋白之间的融合多肽。
同源 多肽可以是在不同的受体之间融合的,产生,例如,显示对多种不同 的OX2相关配位体,或受体结合特异性的杂交蛋白,或可能已经扩大 或减弱了培养基特异性效果的受体。
同样,可以构造异源融合体,其 显示衍生蛋白活性或特性的结合。
典型的实施例是报道多肽的融合, 例如,萤光素酶,具有受体的区段或区,例如,配位体-结合区段, 以便很容易地测定所期望配位体的位置和存在。
见,例如,Dull等, 美国专利第4,859,609,其引入此处作为参考。
其它的基因融合配偶 体包括谷胱甘肽-S-转移酶(GST),细菌性β-半乳糖苷酶,trpE,蛋 白A,β-内酰胺酶,α-淀粉酶,醇脱氢酶,和酵母α交配因子。
见, 例如,Godowski等(1988)Science 241:812-816。
标记的蛋白通常 是在所述蛋白的组合中置换的。
根据Beaucage和Carruthers(1981)Tetra.Letts.22:1859- 1862描述的亚磷酰胺方法,可生产出适宜的合成DNA片段。
双链片段 通常是通过在适宜的条件下合成互补链和退火该链而得到的,或使用 具有适宜引物序列通过DNA聚合酶加入互补链而得到的。
这种多肽可能还具有通过磷酸化作用,磺化作用,生物素酰化作 用,或加入或除去其它部分,特别是具有与磷酸盐相似分子形状的那 些,而化学修饰的氨基酸残基。
在某些实施方案中,该修饰可以有效 的标记试剂,或作为纯化作用的靶,例如亲和配位体而起作用。
代表性地,融合蛋白可以通过重组核酸方法或合成多肽方法而生 产。
一般性地描述了核酸操作和表达技术,例如,Sambrook等,(1989) Molecular Cloning:A Laboratory Manual(2d ed.),Vols.1-3,Cold Spring Harbor Laboratory,和Ausubel等,(eds.1987和定期增 刊)Current Protocols in Molecular Biology,Greene/Wiley,New York,其均引入此处作为参考。
还描述了多肽合成技术,例如, Merrifield(1963)J.Amer.Chem.Soc.85:2149-2156;Merrifield (1986)Science 32:341-347,和Atherton等,(1989)Solid Phase Peptide Synthesis:A Practical Approach,IRL Press,Oxford; 其均引入此处作为参考。
并见Dawson等,(1994)Science 266:776-779,生产较大多肽的方法。
本发明还涉及除了在氨基酸序列或糖基化作用中的变异之外, OX2RH1衍生物的用途。
这种衍生物可以包含与化学部分的聚集或共价 结合。
这些衍生物通常分为三类:(1)盐,(2)侧链和末端残基的 共价修饰,和(3)吸附复合体,例如,具有细胞膜。
这种共价或聚 集的衍生物作为免疫原,作为免疫测定中的试剂,或在纯化方法,如 受体或其它结合分子,例如,抗体的亲和纯化中是有效的。
例如,OX2 配位体可以通过共价键而被固定在固体支持物,如溴化氰活化的琼脂 糖上,通过本领域熟知的方法,或吸附在聚链烯表面上,有或没有戊 二醛交联,用于测定或纯化OX2RH,抗体,或其它类似的分子。
该配 位体还可以用可检测的基团标记,例如,通过氯胺T方法放射性碘化 的,共价结合于稀土螯合物上,或接合到其它荧光部分上,用于诊断 测定。
本发明的一种包括OX2RH的组合,可用作生产抗血清或抗体特异 性的免疫原,例如,能够辨别其它OX2受体同系物间的,或所期望组 合的特异性。
OX2RH可用于筛选单克隆抗体或抗原-结合片段,其是通 过用含蛋白的各种不同形式的不纯制剂而制备的。
特别是,术语“抗 体”还包含天然抗体的抗原结合片段,例如,Fab,Fab2,Fv等。
纯化 的OX2RH还可用作检测抗体的试剂,该试剂是在应答高水平表达的存 在,或导致对内源受体同系物产生抗体的免疫疾病中产生的。
附带地,OX2RH片段还可以作为生产本发明抗体的免疫原起作 用,如下面立即描述的。
例如,本发明涉及对表1-3中列出的氨基酸 序列具有结合亲和力,或相对于表1-3中列出的氨基酸序列所培养的 抗体,其片段,或各种同源的肽或亚群。
特别是,本发明还涉及对特 异性片段具有结合亲和力,或相对于特异性片段培养的抗体,其中该 特异性片段被预测,或确实是,暴露在天然OX2RH的外蛋白表面。
白组合的复合体也是有用的,且可以生产抗体制剂。
对受体配位体生理应答的阻断可能是由配位体与受体结合的抑 制所引起的,可能通过竞争性抑制,或可能是由于抗体结合的受体表 达减量调节。
因而,本发明的体外测定通常使用抗体或结合这些抗体 区段的抗原,或附着在固相培养基上的片段。
这些测定方法还可评估 配位体结合区的突变和修饰,或其它突变和修饰,例如,影响信号产 生或酶功能,效果的诊断测定。
本发明还涉及竞争性药物筛选测定方法的使用,例如,中和抗 体,使受体复合体或片段与试验化合物竞争结合配位体或其它抗体。
在这种方法中,中和抗体或片段可用于检测多肽的存在,其共有一个 或多个与受体结合的位点,且可用于占据受体上的结合位点,另外可 以结合配位体。
V.生产核酸和蛋白 编码蛋白或其片段的DNA可以通过化学合成,筛选cDNA库,或 筛选从各种细胞系或组织样品所制备的基因组库而得到。
天然序列可 以通过使用标准方法和此处,例如表1-3中提供的序列来分离。
反向 翻译序列在表4中提供。
其它物种的对应物可以通过杂交技术,或通 过各种PCR技术,结合或通过在序列数据库,例如,GenBank中检索 来鉴定。
抗体可用于物种对应物上的表达克隆效果中。
这种DNA可在各种宿主细胞中表达,用于合成全长受体或片段, 其可,例如,用于生产多克隆或单克隆抗体;用于结合研究;用于修 饰配位体的结合或激酶/磷酸酶区的表达和构造;用于结构/功能的研 究。
变体或片段可在宿主细胞中表达,其是用适当的表达载体转化或 转染的。
这些分子基本上没有蛋白或细胞杂质,除了来源于重组宿主 的那些,因此当与药学上可接受的载体和/或稀释剂组合时,在药物 组合物中是特别有效的。
该蛋白,或其一部分,可被表达为与其它蛋 白的融合体。
所述蛋白,或编码它们的核酸的组合,是特别感兴趣的。
表达载体是典型的自复制DNA或RNA结构,其包含所期望的受体 同系物基因或其片段,通常可操作地连接到适当的遗传控制因子上, 该遗传控制因子可在适当的宿主细胞中识别。
这些控制因子能够实现 在适当宿主内的表达。
该多基因可被协同地表达,且可位于多顺反子 信息上。
实现表达所必需的控制因子的特异类型取决于所用的最后的 宿主细胞。
通常,遗传控制因子可包括原核启动子系统或真核启动子 表达控制系统,且代表性地包括转录启动子,控制转录发生的任选操 纵子,升高mRNA表达水平的转录增强子,编码适当核糖体结合位点 的序列,和终止转录和翻译的序列。
表达载体通常还包含复制起点, 以使载体独立于宿主细胞复制。
本发明的载体包括含DNA的那些,其编码蛋白的组合,如所述的, 或生物活性等价的多肽。
该DNA可以在病毒启动子的控制之下,且可 以编码选择标记。
本发明还涉及这种表达载体的用途,其能够在原核 或真核宿主中表达,编码这种蛋白的真核cDNA,该载体与宿主相适 合,且真核cDNA插入到载体中,这样含载体的宿主生长表达所述的 cDNA。
通常,为了在它们的宿主细胞中稳定复制,或为了扩增以大大 增加每个细胞所期望基因的拷贝总数,而设计表达载体。
通常,并非 必需要求表达载体在宿主细胞中复制,例如,可以使用载体,该载体 不含由宿主细胞识别的复制起点,影响蛋白或其片段在各宿主中的瞬 时表达。
还可能使用载体,使蛋白编码部分通过重组整合到宿主DNA 中。
此处使用的载体,包含质粒,病毒,噬菌体,可整合的DAN片段, 和其它媒介物,其可使DNA片段整合到宿主的基因组中。
表达载体是 一种特化的载体,其包含影响可操作连接基因表达的遗传控制因子。
质粒是最普遍使用的载体形式,但是,所有提供等价功能的其它形式 载体,其是,或变成,在本领域中已知的均适用于本发明。
见,例如, Pouwels等,(1985和定期增刊)Cloning Vectors:A Laboratory Mannual,Elsevier,N.Y.,和Rodriguez等,(eds.1988)Vectors:A Survey of Molecular Cloning Vectors and Their Uses, Buttersworth,Boston,其引入此处作为参考。
转化的细胞是已经用载体转化或转染的细胞,该载体是使用重组 DNA技术构造的,优选哺乳动物的。
转化的宿主细胞通常表达所期望 的蛋白,但是为了克隆,扩增,和操纵其DNA,不需要表达目标蛋白。
本发明进一步涉及在营养培养基中培养转化细胞,从而使蛋白积聚。
该蛋白可自培养物或,在特定的情况中,自培养基中回收。
为了本发明的目的,当他们功能上彼此相关时,核酸序列是可操 作连接的。
例如,前序列或分泌前导序列的DNA是可操作连接到多肽 上的,如果它是作为前蛋白表达的,或参与把多肽导向细胞膜,或参 与多肽的分泌。
启动子是可操作连接到编码序列上的,如果它控制多 肽的转录;核糖体结合位点是可操作连接到编码序列上的,如果将它 放置在允许翻译的位置。
通常可操作连接意味着是连续的且在读框 中,然而,特定的遗传因子,如阻抑基因不是连续连接的,但是仍然 结合操纵子序列,由此  控制表达。
适宜的宿主细胞包括,原核生物,低等真核生物和高等真核生 物。
原核生物包括革兰氏阴性和革兰氏阳性生物,例如,大肠杆菌和 枯草芽胞杆菌。
低等真核生物包括酵母,例如,酿酒酵母和毕赤酵母 属,和盘基网柄菌属的物种。
高等真核生物包括从动物细胞,非-哺 乳动物源的,例如,昆虫细胞,和鸟,和哺乳动物源的,例如,人, 灵长类动物,和啮齿类动物所建立的组织培养细胞系。
原核宿主-载体系统包括许多不同物种的各种载体。
下面将描述 大肠杆菌及其载体,但是等价载体和宿主通常可被置换。
扩增DNA的 代表性载体是pBR322或许多其衍生物。
可用于表达受体同系物或其 片段的载体包括,但不限于,这种载体,其含lac启动子(pUC-系列); trp启动子(pBR322-trp);Ipp启动子(pIN-系列);lambda-pP 或pR启动子(pOTS);或杂交启动子如ptac(pDR540)。
见Brosius 等(1988)“Expression Vectors Employing Lambda-,trp-,lac-, 和Ipp-derived Promoters”,in Vectors:A Survey of Molecular Cloning Vectors and Their Uses,(eds.Rodriguez和Denhardt), Buttersworth,Boston,Chapter 10,pp.205-236,其引入此处作为 参考。
低等真核生物,例如,酵母和盘基网柄菌属,可用含OX2RH序列 的载体转化。
最普遍的低等真核宿主是面包酵母,酿酒酵母。
它可用 于举例说明低等真核生物,虽然许多其它的菌株和物种也是可用的。
酵母载体代表性地由复制起点(除整合类型外),选择基因,启动子, 编码受体同系物或其片段的DNA,翻译终止、聚腺苷酸化、和转录终 止序列所组成。
酵母的适宜表达载体包括这样的组成型启动子,如3- 磷酸甘油酸激酶和各种其它的糖酵解酶基因启动子,或这样的诱导型 启动子,如醇脱氢酶2启动子或金属硫蛋白启动子。
适当的载体包括 下列类型的衍生物:自复制低拷贝数(如Yrp-系列),整合型(如 YEp-系列);自-复制高拷贝数(如YIp-系列),或微型-染色体(如 Ycp-系列)。
高等真核生物组织培养细胞通常是优选的,用于表达功能活性的 OX2RH蛋白的宿主细胞。
原则上,许多高等真核组织培养细胞系是可 使用的,例如,昆虫杆状病毒表达系统,不管来源于无脊椎动物或脊 椎动物源。
然而,哺乳动物细胞是优选的。
这种细胞的繁殖和转染或 转化已经变成常规的过程。
有用的细胞系的实施例包括HeLa细胞, 中国仓鼠卵巢(CHO)细胞系,幼龄大鼠肾(BRK)细胞系,昆虫细胞 系,鸟细胞系,和猴细胞系(COS)。
这种细胞系的表达载体通常包 括复制起点,启动子,翻译起始位点,RNA剪接位点(如果使用基因 组DNA),聚腺苷酸化位点,和转录终止位点。
这些载体通常还包含 选择基因或扩增基因。
适宜的表达载体可以是质粒,病毒,或携带启 动子的逆病毒,该启动子来源于这种源,例如,腺病毒,SV40,细小 病毒,痘苗病毒,或巨细胞病毒。
适宜表达载体的代表实施例包括 pCDNA1;pCD,见,Okayama等(1985)Mol.Cell Biol.5:1136- 1142;pMClneo PolyA,见Thomas等(1987)Cell 51:503-512;和杆 状病毒载体如pAC 373或pAC 610。
对于分泌蛋白和某些膜蛋白来说,可读框通常编码多肽,该多肽 是由在它N-末端与信号肽共价连接的成熟或分泌产物组成的。
信号肽 是先于成熟,或活性多肽的分泌而裂开的。
该裂解位点可根据经验规 则高度准确地预测,例如,von-Heijne(1986)Nucleic Acids Research 14:4683-4690,和Nielsen等(1997)Protein Eng.10:1-12。
信号肽的精确氨基酸构成常常对其功能不重要,例如, Randall等(1989)Science 243:1156-1159;Kaiser等(1987)Science 235:312-317。
使用标准方法可以很容易地测定本发明的成熟蛋白。
期望在提供特异性或确定糖基化模式的系统中表达这些多肽。
在 这种情况中,普通模式是通过表达系统天然提供的。
然而,该模式可 以通过暴露多肽,例如,非糖基化形式,于引入异源表达系统中的适 宜糖基化蛋白而修饰。
例如,OX2RH基因可能是与一种或多种编码哺 乳动物或其它糖基化酶的基因共转化的。
使用这种方法,某些哺乳动 物的糖基化模式可在原核生物或其它细胞中得到。
原核细胞中的表达 可代表性地产生非糖基化形式的蛋白。
如上所述,OX2RH源可以是表达重组多肽的真核或原核宿主。
该 源也可以是细胞系,本发明还预期其它哺乳动物的细胞系,和来源于 人类物种的优选细胞系。
既然该序列是已知的,灵长类动物的OX2RH,片段,或其衍生物 可以通过合成肽的常规方法来制备。
这些包括在Stewart和 Young(1984)Solid Phase Peptide synthesis,Pierce Chemical Co..Rockford,IL;Bodanszky和Bodanszky(1984)The Practice of Peptide Synthesis,Springer-Verlag,New York;和Bodanszky (1984)The Principles of Peptide Synthesis,Springer-Verlag,New York中所描述的方法;所有均引入此处作为参考。
例如,可以使用叠 氮化物方法,酰基氯方法,酸酐方法,混合酸酐方法,活化酯方法(例 如,对-硝基苯酯,N-羟基琥珀酰亚胺酯,或氰甲基酯),碳二咪唑 方法,氧化-还原方法,或二环己基碳二亚胺(DCCD)/附加方法。
相 似的技术可以与部分OX2RH序列一起使用。
OX2RH蛋白,片段,或衍生物可以根据用于肽合成的上述方法适 当地制备,通常通过所谓的分步方法,其包含按顺序逐一将氨基酸缩 合到末端氨基酸,或通过将肽片段偶合到末端氨基酸。
未在偶联反应 中使用的氨基必须被保护,以防止在错误的位置偶合。
如果采用固相合成,C-端氨基酸通过它的羧基被束缚在不可溶的 载体或支持物上。
不溶性载体应当具有与反应羧基结合的能力,例 如,卤甲基树脂,如氯甲基树脂或溴甲基树脂,羟甲基树脂,苯酚树 脂,叔-烷氧基羰基hydrazidated树脂等。
氨基保护的氨基酸通过其活化羧基及预先形成的肽或链的反应 氨基的缩合而束缚在序列中的,以逐步合成肽。
在合成完整的序列之 后,该肽从不溶性载体上断裂下来,以产生该肽。
此固相方法通常是 由Merrifield等,(1963)in J.Am.Chem.Soc.85:2149-2156描述 的,其引入此处作为参考。
所制备的蛋白和其片段可以通过肽分离,例如,通过提取,沉淀, 电泳,各种形式的色谱等从反应混合物中分离并纯化。
本发明的受体 同系物可根据所期望的用途,以各种纯度得到。
纯化步骤可以通过使 用标准蛋白纯化技术,或免疫吸附亲和色谱法中描述的抗体来完成。
代表性地,亲和色谱是这样进行的,首先将抗体连接到固体支持物 上,然后使所连接的抗体与适宜细胞的溶解裂解产物,其它表达OX2RH 的细胞的裂解产物,或通过DNA技术生产蛋白的细胞的上清液或裂解 产物相接触。
通常,纯化的蛋白为至少约40%的纯度,一般至少约50%纯度, 通常至少约60%纯度,代表性地至少约70%纯度,更典型地至少约80% 纯度,优选至少约90%纯度,且更优选至少约95%纯度,且在特殊的 实施方案中,为97%-99%或更高。
纯度通常是在重量的基础上,但也 可以是在摩尔的基础上。
可使用不同的测定方法。
各蛋白可被纯化, 然后合并。
VI.抗体 可将抗体培养成各种哺乳动物,例如,灵长类动物,OX2RH的蛋 白及其片段,均是天然存在的天然形式或是它们的变性形式。
所培养 的天然OX2RH的抗体可能识别抗原决定部位,其仅仅存在于天然构象 中。
变性抗原的检测在Western分析中可能是有效的。
还涉及抗-独 特型抗体,其可能是有效的,例如,诊断试剂。
可相对于预定的蛋白片段培养包括结合片段和单链译本的抗 体,该培养可以通过用具有免疫原蛋白的片段接合物免疫接种动物而 进行。
单克隆抗体是从分泌所期望抗体的细胞制备的。
可筛选这些抗 体与正常或缺损蛋白的结合,或筛选激动或拮抗的活性。
这些单克隆 抗体通常以至少约1mM,更通常至少约300μM,典型的至少约100μM, 更典型的至少约30μM,优选至少约10μM,且更优选至少约3μM或更 好的kD结合。
本发明包括抗原结合片段的抗体可能具有重要的诊断或治疗价 值。
它们可能是有效的拮抗剂,其结合受体同系物,并抑制与配位体 结合或抑制受体同系物引起生物应答的能力,例如,作用于其底物。
它们作为非-中和抗体可能也是有效的,且可被偶联到毒素或放射性 核素上,结合产生细胞的OX2RH。
此外,这些抗体可通过连接体被直 接或间接地接合到药物或其它治疗剂上。
本发明的抗体在诊断应用中也是有效的。
作为捕获或非-中和抗 体,它们可以结合OX2RH而不会抑制配位体或底物结合。
作为中和抗 体,它们在竞争性结合测定法中是有效的。
它们在检测和量化配位体 中也是有效的。
它们可被用作Western印迹分析,或用于相应蛋白 免疫沉淀或免疫纯化的试剂。
同样地,核酸和蛋白可固定在固体基质 上,用于亲和纯化或检测方法中。
该基质可以是,例如,固体树脂颗 粒,塑料板,或衍生的玻璃。
蛋白片段可连接到其它材料,特别是多肽上,象融合的或共价连 接的多肽,用作免疫原。
哺乳动物的OX2RH多肽和片段可被融合或共 价连接到各种免疫原,如匙孔血蓝蛋白,牛血清白蛋白,破伤风类 毒素等上。
见Microbiology,Hoeber Medical Division,Harper 和Row,1969;Landsteiner(1962)Specificity of Serological Reactions,Dover Publication,New York;和Williams等(1967) Methods in Immunology and Immunochemistry,Vol.1,Academic Press,New York;其均引入此处作为参考。
典型的方法包括用抗原超 免疫动物。
在重复免疫之后,立即采集动物的血,并分离血清和γ- 球蛋白。
在某些实施例中,期望自各种哺乳动物宿主,如小鼠,啮齿类动 物,灵长类动物,人等制备单克隆抗体。
见,例如,Stites等(eds.) Basic and Clinical Immunology(4th ed.),Lange Medical Publications,Los Altos,CA,和其中引用的参考文献;Harlow和 Lane(1988)Antibodies:A laboratory Manual,CSH Press;Goding (1986)Monoclonal Antibodies:Principles and Practice(2d ed.) Academic Press,New York;和Kohler和Milstein(1975)Nature 256:495-497,其均引入此处作为参考。
简要地,将免疫原注射到动 物中诱发免疫应答。
然后杀死该动物,并从其脾脏采集细胞,其与骨 髓瘤细胞融合,以产生杂交瘤。
然后筛选杂交瘤群体,以分离分泌结 合免疫原抗体的单-克隆。
其它适当的技术包括淋巴细胞至抗原多肽的体外暴露,或选择性 地,选择噬菌体或相似载体中的抗体库。
见,Huse等(1989) “Generation of a Large Combinatorial Library of the Immunoglobulin Repertoire in Phage Lambda,”Science 246:1275-1281;和Ward等(1989)Nature341:544-546,其均引入 此处作为参考。
可以生产嵌合抗体或人源化抗体,见Cabilly,美国 专利第4,816,567;或在转基因小鼠中生产,见Mendez等 (1997)Nature Genetics 15:146-156。
这些文献均引入此处作为参 考。
常常标记多肽和抗体。
各种标记和接合技术是已知的,且在科学 文献和专利文献中广泛地报道。
适宜的标记物包括放射性核素,酶, 底物,辅因子,抑制因子,荧光素部分,化学发光部分,磁性颗粒等。
教导这种标记物的用途的专利包括美国专利第3,817,837;3,850, 752;3,939,350;3,996,345;4,277,437;4,275,149;和 4,366,241。
本发明的抗体还可用于分离OX2RH蛋白或肽的亲和色谱。
可制备 柱子,其中抗体连接到固体支持物,例如,颗粒,如琼脂糖,Sephadex 等上,细胞裂解产物可通过柱子,洗脱柱子,接着增加温和变性剂的 浓度,由此释放纯化的蛋白。
选择性地,该蛋白可用于纯化抗体。
可 以使用适宜的交叉吸收或排除。
该抗体可用于筛选特殊表达产物的表达库。
通常使用由于抗体结 合,可很容易地检测抗原存在的部分标记这种过程中的抗体。
相对于OX2RH培养的抗体可用于培养抗-独特型抗体。
这些在检 测或诊断各种免疫疾病中是有效的,该疾病与表达该蛋白的细胞或蛋 白的表达有关。
它们作为配位体的激动剂或拮抗剂也是有效的,其可 能是天然存在的抗体的竞争性抑制因子或置换物。
受体同系物蛋白代表性地是在免疫测定法中测定的,该受体同系 物蛋白特异性地结合或特异性地与抗体免疫反应,该抗体是相对于所 确定的免疫原,如由抗SEQ ID NO:2的氨基酸序列所组成的免疫原产 生的。
该免疫测定法代表性地使用多克隆抗血清,其被培养为,例如, SEQ ID NO:2的蛋白。
选择此抗血清,以使其具有相对于其它Ig超 家族受体成员,例如,NKG2D的低交叉反应性,优选来源于相同的物 种,且任一这种交叉反应性是在用于免疫测定之前通过免疫吸收除去 的。
为了生产用于免疫测定的抗血清,SEQ ID NO:2的蛋白是如所述 方法分离的。
例如,可以在哺乳动物细胞系中生产重组蛋白。
适宜的 宿主,例如,小鼠如Balb/c的近交品系,是用所选择的蛋白免疫的, 代表性地使用标准佐剂,如Freund’s佐剂,和标准的小鼠免疫方案 (见,Harlow和Lane,supra)。
选择性地,来源于此处公开序列且接 合到载体蛋白上的合成肽可用作免疫原。
采集多克隆血清,且在免疫 测定法中,相对于免疫原蛋白滴定,例如,具有固定在固体支持物上 的免疫原的固相免疫测定法。
选择具有104或更大滴定度的多克隆抗 血清并测试它们相对于其他Ig超家族受体成员的交叉反应性,其是 使用竞争性结合免疫测定法,如Harlow和Lane,supra,570-573页中 描述的方法进行的。
优选至少两个受体家族成员用于此测定中。
这些 受体家族成员可作为重组蛋白而生产,并使用所述的标准分子生物学 和蛋白化学技术分离。
竞争性结合形式中的免疫测定法可用于交叉反应性的测定。
例 如,SEQ ID NO:2的蛋白可被固定在固体支持物上。
加入到试验中的 蛋白与抗血清竞争结合固定抗原。
将上述蛋白竞争抗血清与固定化蛋 白结合的能力与该蛋白进行比较。
使用标准计算法计算上述蛋白交叉 反应性的百分比。
选择并混合上述所列与各种蛋白具有小于10%交叉 反应性的抗血清。
通过用上面列出的蛋白免疫吸收,而从混合抗血清 中除去交叉反应的抗体。
免疫吸收和混合的抗血清用于上述竞争性结合免疫测定中,以将 次级蛋白比作免疫蛋白(例如,SEQ ID NO:2的OX2RH1样蛋白)。
为了进行对比,在较宽浓度范围下,测定这两种蛋白,并确定抑制50% 抗血清与固定化蛋白结合所需的各蛋白量。
如果所需要的次级蛋白的 量小于所选择蛋白或所需蛋白量的两倍,则认为该次级蛋白特异性地 结合对于免疫原所产生的抗体。
这些OX2受体同系物蛋白是同系蛋白家族的成员,其包含至少6 种迄今鉴定的基因。
对于特殊的基因产品来说,如OX2RH1,该术语不 仅指此处公开的氨基酸序列,还指等位的,非-等位的其它蛋白,或 物种变体。
该术语包括通过预先准备的突变而引入的非天然突变,其 是通过使用常规重组技术,如单一位点突变,或通过切除编码各蛋白 的DNA短片,或通过置换新的氨基酸,或加入新的氨基酸而进行的。
这种微小的改变代表性地可基本上维持原始分子的免疫性质和/或其 生物活性。
因而,这些改变包括这样一种蛋白,其与指定的天然存在 的OX2RH蛋白特异性免疫反应。
改变蛋白的生物特性可以通过在适当 的细胞系中表达该蛋白并测量对转染淋巴细胞的适宜效果而确定。
微 小的特殊蛋白修饰包括具有相似化学特性的氨基酸的保守置换,如上 所述对于受体同系物家族整体而言。
通过对蛋白,最好是受体同系物 的蛋白进行序列对比,并使用此处描述的常规免疫测定法,可以确定 本发明的蛋白组分。
VII.试剂盒和定量 本发明所有天然存在和重组形式的受体样分子在试剂盒和测定 法中均是特别有用的。
例如,这些方法可用于筛选结合活性,例如, 这些蛋白的配位体。
近几年已经提出了各种自动测定方法,以便每年 筛选成百上千种化合物。
见,例如,BIOMEK automated workstation, Beckman Instruments,Palo Alto,California,和Fodor等,(1991) Science 251:767-773,其引入此处作为参考。
后者描述了通过大多 数在固体培养基上合成的确定聚合物测试结合的方法。
大量活性状态 的纯化可溶性受体,如本发明提供的受体,可大大地促进用于筛选配 位体或激动剂/拮抗剂同源蛋白的适宜测定法的研究。
纯化的OX2RH可直接被涂在平板上,以用于上述配位体筛选技术 中。
然而,这些蛋白的非-中和抗体可作为俘获抗体使用,以将各受 体同系物固定在固相上,用于诊断用途。
本发明还涉及OX2RH,其片段,肽,和它们的融合产物在检测蛋 白或其配位体存在的各种诊断试剂盒和方法中的用途。
选择性地,或 附带地,可将该分子的抗体加入到试剂盒和方法中,且可用于量化 OX2RH或表达它们的细胞。
代表性地,该试剂盒具有区室,其包含OX2RH 肽或基因区段或试剂,其识别一种或另一种。
代表性地,识别试剂, 在有肽的情况下,是一种受体同系物或抗体,或在基因区段的情况 下,通常是一种杂交探针。
确定样品中OX2RH浓度的优选试剂盒应代表性地包含标记的化合 物,例如,配位体或抗体,具有对OX2RH的已知结合亲和力,作为阳 性对照的一种OX2RH源(天然存在的或重组的),和从游离的标记化 合物分开束缚的工具,例如,在试验样品中固定OX2RH的固相。
一般 提供含试剂和说明书的区室。
还提供合适当核酸或蛋白的试剂盒。
抗体,包括抗原结合片段,对于哺乳动物的OX2RH是特异性的, 或肽片段,或受体同系物片段,其在检测同系物和/或其片段升高水 平存在的诊断应用中是有用的。
诊断测定方法可以是均质的(在游离 试剂和抗体-抗原复合体之间没有分离步骤)或异质的(具有分离步 骤)。
已经有各种商业化的测定方法存在,如放射性免疫测定法 (RIA),酶-联免疫吸收测定法(ELISA),酶免疫测定法(EIA), 酶-复合的免疫测定技术(EMIT),底物标记荧光免疫测定法(SLFIA) 等。
例如,未标记的抗体可以通过使用次级抗体而被应用,该次级抗 体是被标记的,且识别受体同系物或其特殊片段的抗体。
这些测定法 已经在文献中广泛地公开,见,例如,Harlow和 Lane(1988)Antibodies:A Laboratory Manual,CSH.,和 Coligan(ed.1991和定期增刊)Current Protocols In Immunology  Greene/Wiley,New York。
抗-独特型抗体可能具有相似的用途,以作为受体同系物的激动 剂或拮抗剂起作用。
在适宜的环境下,这些作为治疗试剂应当是有效 的。
通常,在试剂盒中提供用于诊断测定法的试剂,以便使测定法的 灵敏性最佳。
对于本发明来说,取决于测定法的特性,提供方案,且 提供标记物,标记或未标记的抗体,或标记的配位体。
这通常与其它 的附加剂,如缓冲液,稳定剂,信号产生所必需的材料,如酶的底物 等相结合。
优选地,该试剂盒还包括适当使用和使用之后处理内容物 的说明书。
代表性地,该试剂盒具有各有用试剂的区室,且包含适当 使用和处理试剂的说明书。
期望,该试剂是以干燥的冻干粉末形式提 供的,其中该试剂可在适宜浓度的含水介质中重新构成,以完成测 定。
诊断测定法的上述组成可以没有改变地使用,或被改变成各种形 式。
例如,标记可以通过共价或非-共价地结合直接或间接地提供可 检测的信号的部分来获得。
在许多测定法中,试验化合物,受体同系 物,或抗体可被直接地或间接地标记。
直接标记的可能性包括标记 组:放射性标记物如125I,酶(美国专利第3,645,090),如过氧化 物酶和碱性磷酸酶,和能够监测荧光强度,波长变换,或荧光极化变 化的荧光标记物(美国专利第3,940,475)。
所有专利均在此引入作 为参考。
间接标记的可能性包括一个组分的生物素酰化,接着结合偶 联到上述标记组其中一个上的抗生物素蛋白。
还有许多从游离配位体上分开束缚的方法,或选择性地从游离的 试验化合物上分开束缚的方法。
该受体同系物可固定在各种基质上, 然后洗涤。
适当的基质包括塑料,如ELISA平板,滤纸,和颗粒。
受体同系物固定在基质上的方法包括,但不限于,直接粘合到塑料 上,利用俘获抗体,化学偶联,和生物素-抗生物素蛋白。
此方法中 的最后一步包括通过各种方法中的任一种沉淀抗体/抗原复合体,该 方法包括利用,例如,有机溶剂,如聚乙二醇或盐,如硫酸铵的那些。
其它适当的分离技术包括,但不限于,荧光素抗体磁性颗粒方法,其 在Rattle等(1984)Clin.Chem.30(9):1457-1461中描述,和美国 专利第4,659,678中描述的双抗体磁性颗粒分离,其均在此引入作为 参考。
将蛋白或片段连接到各种标记物上的方法已经在文献中广泛地 报道了,不需要在此处详细地描述。
许多技术包括活化羧基的使用, 其是通过碳化二胺或活性酯的使用而活化的,从而形成肽键,通过使 巯基与活化的卤素,如氯乙酰基,或活化的石蜡,如马来酰亚胺反应 形成硫醚,键,等。
融合蛋白也可用于这些应用中。
本发明的其它诊断方面包括从受体同系物序列采集的寡核苷酸 或多核苷酸序列。
这些序列可用作检测怀疑具有免疫疾病的患者中体 内相应受体同系物水平的探针。
RNA和DNA核苷酸序列的制备,该序 列的标记,和该序列的优选大小已经在文献中受到了充分的描述和论 述。
通常寡核苷酸探针应具有至少约14个核苷酸,通常至少约18个 核苷酸,且多核苷酸探针可达到若干千对碱基。
可以使用各种标记 物,最通常是放射性核素,特别是32p。
然而,也可以使用其它技术, 如使用生物素修饰的核苷酸引入多核苷酸中。
该生物素作为结合抗生 物素蛋白或抗体的位点起作用,其可以是用各种标记物,如放射性核 素,荧光剂,酶等标记的。
选择性地,可以使用抗体,其能够识别特 异性双链体,包括DNA双链体,RNA双链体,DNA-RNA杂交双链体, 或DNA-蛋白双链体。
还可对该抗体进行标记,并进行测定,其中双链 体束缚在表面上,这样根据表面双链体的形成,可以检测束缚在双链 体上的抗体的存在。
新反义RNA探针的使用可以常规的技术来进行, 如核酸杂交,加和减筛选,重组探测,杂交分子释放翻译(HRT),和 杂交扣留翻译(HART)。
其还包括扩增技术如聚合酶链反应(PCR)。
还涉及诊断试剂盒,其测试其它标记物的定性和定量存在。
诊断 或预后可依赖用作标记物的多指征的组合。
因而,试剂盒可测试标记 物的组合。
见,例如,Viallet等(1989)Progress in Growth Factor Res.1:89-97。
VIII.治疗用途 本发明提供具有重要治疗价值的试剂。
见,例如,Levitzki (1996)Curr.Opin.Cell Biol.8:239-244。
受体同系物(天然存在的 或重组的),其片段,突变蛋白的受体,和抗体,连同被鉴定为与受 体同系物或抗体具有结合亲和性的化合物一起,在疾病的治疗中应当 是有效的,其中骨髓谱系细胞功能的调节是特别期望的。
这种变态代 表性地通过免疫疾病来证明,且通过骨髓细胞活性对生理过程,例 如,CNS成熟或发育等产生影响的疾病来证明。
附带地,本发明还应 当提供在各种疾病或与对配位体应答的变态引发或变态表达相关的 疾病中的治疗价值。
白细胞,包括巨嗜细胞/骨髓谱系细胞,表达OX2R,也包括在病 理学中,且有助于疾病的处理,期望抑制这些细胞的功能。
这可以通 过OX2R的适当刺激而获得,这样调动了信号产生受体的细胞-抑制活 性。
这可以使用,例如,配位体OX2的激动剂或OX2R抗体来获得, 其对于受体具有激动活性。
适当的疾病是这样的疾病,其中动物显示 炎症,白细胞增生,神经变性,或创伤后疾病的病征和症状。
优选的 实施方案包括,其中的病征或症状位于神经组织;淋巴组织;骨髓组 织;胰脏;胃肠组织;甲状腺组织;肌肉组织;或皮肤或胶原组织中。
特定的实施方案包括,其中的动物经受了自身免疫,炎症;组织特异 性自身免疫;变性自身免疫;类风湿性关节炎;动脉粥样硬化;多发 性硬化症;脉管炎;迟发型过敏反应;植皮术;移植;脊柱损伤;中 风;神经变性;或局部缺血的病征或症状。
给药药剂可与:抗炎细胞 因子激动剂或拮抗剂;解热镇痛剂;抗炎剂或类固醇相组合。
相反,如果白细胞,包括巨嗜细胞/骨髓谱系细胞,表达OX2R, 包括在免疫和接种,修复机理,限制病理学,或控制感染,特别是细 菌感染的过程中,期望提高这些细胞的功能。
这可以通过OX2R的适 当刺激而治疗获得,这样可调动信号产生受体的细胞活化活性,或通 过完全地阻断OX2-OX2R相互作用而获得,其应能够使细胞活化进行。
后者出现在配位体OX2基因剔除小鼠中,配位体OX2的缺少引起骨髓 细胞活化。
这可以使用,例如,配位体OX2的拮抗剂(如配位体OX2 的抗体),防止OX2-OX2R相互作用的OX2R的抗体,防止OX2R表达的 反义核酸,Ig-OX2R融合蛋白,例如,其通过竞争性结合,阻断与细 胞束缚OX2R相互作用的细胞束缚OX2的容量,或小分子拮抗剂。
此 感觉模式具有体内促进骨髓细胞功能的用途,这已经通过试验加以证 实了,例如,将产生人IgG-小鼠OX2RH1融合蛋白的腺病毒结构静脉 内注射到小鼠中,已知其中的融合蛋白结合小鼠OX2,其导致这些小 鼠中的自身免疫疾病试验性自身免疫脑脊髓炎(EAE)发病的加速, 与接收仅仅产生脊柱人IgG-融合蛋白的腺病毒结构的小鼠对照。
疾病 加速的程度与在小鼠中所见的是可比较的,其中OX2R的配位体,即 OX2,已经通过基因导向而被失活了。
选择性地,如果此处描述的各种OX2R分子已经使抑制功能活化, 那么包括细胞活化的OX2R的特异性活化可能是适宜的。
这可以通过, 例如,具有特定OX2R激动活性的特异性抗体的使用来获得。
在各种 实施方案中,使用该方法,其中动物经受创伤愈合或凝块形成的病征 或症状,其中期望可以提高巨噬细胞的活化,或动物经受细菌感染, 其中期望通过粒细胞和/或巨噬细胞提高吞噬活性。
给药通常与:血 管生成因子;生长因子,包括FGF或PDGF;抗生素;或凝血因子组合。
可以纯化重组受体,突变蛋白,激动剂或拮抗剂的抗体,或抗体, 然后将其给予患者。
这些试剂可与附加的活性成分,例如,常规的药 学上可接受的载体或稀释剂,连同生理学无害的稳定剂和赋形剂组 合,用于治疗用途。
这些组合可以是无菌的,例如,滤过的,并将冻 干的给药形式分置在小瓶中或在稳定的含水制剂中贮藏。
本发明还涉 及抗体或其结合片段的用途,其不是补体结合。
可使用受体或其片段进行配位体筛选,以鉴定对受体具有结合亲 和力的分子。
然后可以利用随后的生物测定法确定是否推断的配位体 能够提供竞争性结合,其可以阻断内在刺激活性。
可将受体片段用作 阻断剂或拮抗剂,其中它阻断配位体的活性。
同样,具有内在刺激活 性的化合物可以激活受体,且是一种刺激配位体活性,例如,包括信 号产生的激动剂。
本发明还涉及受体的抗体作为拮抗剂的治疗用途。
有效治疗所需的试剂量取决于许多不同的因素,包括给药的方 法,靶位点,试剂的生理寿命,药理寿命,患者的生理状态,和其它 给药的药剂。
因而,应当滴定治疗剂量,以使安全性和有效性最优化。
代表性地,体外给药可以为对这些试剂原位给药有效的量提供有益的 指导。
特殊疾病治疗有效量的动物试验可为人的给药剂量提供进一步 的预示。
描述了各种因素,例如,Gilman等(eds.1990)Goodman and Gilman’s:The Pharmacological Bases of Therapeutics,8th Ed.,Pergamon Press;和Reminton’s Pharmaceutical Science,17th ed.(1990),Mack Publishing Co.,Easton,Penn.,qi 2均引入此处 作为参考。
其中讨论了给药方法,例如,口服,静脉内,腹膜内,或 肌肉内给药,透皮扩散,及其它。
药学上可接受的载体包括水,盐水, 缓冲液,和所述的其它化合物,例如,Merck Index,Merck & Co.,Rahway,New Jersey。
一般期望给药范围低于100mM浓度,代表 性地少于约1mM浓度,通常少于约100μM,优选少于1μM,最优选 少于约10nM,与适宜的载体。
缓释制剂,或缓释设备通常利用于连续 给药。
受体同系物,其片段,和抗体或其片段,拮抗剂,和激动剂,可 以直接给予接受治疗的宿主,根据化合物的大小,期望在给药之前使 它们与载体蛋白,如卵清蛋白或血清白蛋白接合。
治疗制剂可以许多 常规的给药制剂给予。
尽管可以单独给予活性成分,但优选以药物制 剂的形式提供。
制剂包含至少一种活性成分,如上所述的,连同一种 或多种其可接受的载体。
每种载体均必须是药学上和生理学上可接受 的,与其成分相配伍,且不伤害患者。
制剂包括适于口服,直肠,鼻, 或胃肠外(包括皮下,肌肉内,静脉内和透皮)给药的那些。
该制剂 可以常规的单位剂量形式给出,且可以通过制药领域熟知的方法制 备。
见,例如,Gilman等(eds.1990)Goodman and Gilman’s:The Pharmacological Bases of Therapeutics,8th Ed.,Pergamon Press; 和Remington’s Pharmaceutical Sciences 17 th ed.(1990),Mack Publishing Co.,Easton,Penn.;Avis等(eds.1993)Pharmaceutical Dosage Forms:Parenteral Medications Dekker,NY;Lieberman等 (eds.1990)Pharmaceutical Dosage Forms:Tablets Dekker,NY; 和Lieberman等(eds.1990)Pharmaceutical Dosage Forms: Disperse Systems Dekker,NY。
本发明的疗法可以与其它治疗剂,特 别是其它受体家族成员的激动剂或拮抗剂结合或联合使用。
IX.筛选 可以使用OX2RH或其片段进行药物筛选,以鉴定对受体同系物有 结合亲和力的化合物,包括相关组分的分离。
然后可以利用随后的生 物测定法来确定该化合物是否具有内在刺激活性,且因此其是一种阻 断剂或拮抗剂,其中它阻断配位体的活性。
同样,具有内在刺激活性 的化合物可以激活受体,且因而其是一种激动剂,其中它刺激配位 体,例如OX2的活性。
本发明还涉及受体的抗体作为激动剂或拮抗剂 的治疗用途。
同样,含多种蛋白的复合体可用于筛选能够识别复合体的试剂或 配位体。
某些受体包含至少两个亚单位,其可以是相同的,或不同的。
选择性地,跨膜受体可以结合含配位体的复合体,该配位体与作为次 级受体亚单位起作用的其它可溶蛋白相关。
药物筛选的其中一个方法利用真核或原核宿主细胞,其是用表达 OX2RH的重组DNA分子转化的,与其它受体亚单位组合。
可以分离细 胞,其表达从其它功能受体分离的受体。
这种细胞,活动或固定的形 式,可用于标准的抗体/抗原或配位体/受体结合测定法。
见,Parce 等(1989)Science 246:243-247;和Owicki等(1990)Proc.Nat’l Acad.Sci.USA 87:4007-4011,其描述了对检测细胞应答敏感的方 法。
竞争性测定法是特别有用的,其中该细胞(推断配位体的源)是 用标记的受体或对配位体具有已知结合亲和力的抗体,如125I-抗体培 养或接触的,且测量对结合组分具有结合亲和力的试验样品。
然后分 离结合的和游离的标记结合组分,以评估配位体结合的程度。
试验化 合物结合的量与结合已知源的标记受体的量成反比。
许多技术可用于 自游离配位体分开结合配体,以评估配位体结合的程度。
此分离步骤 应代表性地包含一个过程,如与滤纸粘合,接着清洗,与塑料粘合, 接着清洗,或离心细胞膜。
活动细胞可用于筛选药物对OX2介导的功 能,例如,次级信使水平,即Ca++;细胞增殖;肌醇磷酸盐混合变化; 及其它的效果。
某些检测方法可以删除分离步骤,例如,接近敏感的 检测系统。
钙敏感染料对于检测Ca++水平是有效的,使用荧光计或荧 光细胞分选设备。
X.配位体 OX2RH的描述提供了鉴定上述配位体的方法。
这种配位体应当以 相当高亲和性特异性地结合的各受体。
可有效的生产各种构造,其标 记受体以检测它的配位体。
例如,直接标记受体,将它融合在用于次 级标记的标记物上,例如,FLAG或其它抗原决定部位的标记物,等, 以检测受体。
这可能是组织学的,作为生物化学纯化的亲和方法,或 在表达克隆方法中标记或选择。
两-杂交选择系统可用于生产具有有 效受体序列的适宜构造。
见,例如,Fields和Song(1989)Nature 340:245-246。
参考下列实施例更好地理解本发明的较宽范围,该实施例不意味 着本发明局限于特殊的实施方案。
实施例 I.一般方法 描述并参考了一些标准方法,例如,Maniatis等(1982)Molecular Cloning,A Laboratory Manual,Cold Spring Harbor Laboratory, Cold Spring Harbor Press;Sambrook等(1989)Molecular Cloning:A Laboratory Manual,(2d.ed.),vols.1-3,CSH Press, NY;或Ausubel等(1987和增刊)Current Protocols in Molecular Biology,Greene/Wiley,New York。
蛋白纯化方法包括硫酸铵沉淀, 柱色谱,电泳,离心,结晶,及其它。
见,例如,Ausubel等(1987 和定期增刊);Coligan等(ed.1996)和定期增刊,Current Protocols In Protein Science Greene/Wiley,New York;Deutscher(1990) “ Guide to Protein Purification”in Methods in Enzymology,vol.182,及此系列中的其它卷;和利用蛋白纯化产物的 生产者文献,例如,Pharmacia,Piscataway,N.J.,或Bio-Rad, Richmond,CA。
与重组技术结合而融合成适宜的区段,例如,FLAG序 列或可经由蛋白酶-可除去序列融合的一种等价体。
见,例如, Hochuli(1990)“Purification of Recombinant Proteins with Metal Chelate Absorbent”in Setlow(ed.)Genetic Engineering, Principle and Methods 12:87-98,Plenum Press,N.Y.;和Crowe 等(1992)OIAexpress:The High Level Expression & Protein Purification System QUIAGEN,Inc.,Chatsworth,CA。
进行计算机序列分析,例如,使用可用的软件程序,包括来源于 GCG(U.Wisconsin)和GenBank源的那些。
还使用公共序列数据库,例 如,来源于GenBank及其它。
许多可应用于IL-10受体的技术也可用于OX2RH,如所述的,例 如,in USSN 08/110,683(IL-10受体),其引入此处作为参考。
II.阻断巨嗜细胞上的大鼠OX2/OX2RH相互作用的单克隆抗体 使用重组OX2-CD4蛋白和大鼠腹膜巨嗜细胞建立颗粒测定法。
见,Preston等(1997)Eur.J.Immunol.27:1911-1918。
巨嗜细胞结 合于用重组OX2-CD4蛋白涂覆的荧光颗粒。
用0.1-0.25mg的粗膜部 分,或停留大鼠腹膜溢泌物细胞(5百万)免疫接种6周大的BALB/c 小鼠(Williams and Barclay(1986)in Handbook of Experimental Immunology vol.1,22.1-22.24,Blackwell Scientific Publications)。
通过测试标记巨嗜细胞的各种稀释度的血清,其中是通过间接免疫荧光 和流式细胞计而标记的,筛选小鼠识别巨嗜细胞的高滴度抗体。
对大 鼠巨嗜细胞产生良好免疫应答的小鼠通过腹膜溢泌物细胞的注射而 最终被激发。
四天之后,摘除脾脏,并将其融合于NS-1骨髓瘤细胞 上,而产生杂交瘤。
筛选前的最终注射是脾脏内的。
筛选杂交瘤上清 液标记大鼠巨嗜细胞的能力和阻断大鼠OX2与巨嗜细胞相互作用的能 力。
得到并克隆一种被称作OX102的抗体。
此抗体提供清楚的阻断。
此杂交瘤是大批生长的,且该抗体是用标准方法纯化的。
III.OX102 mAb抗原的纯化 纯化的OX102是共价偶联到生产者建议的CNBr活化的琼脂糖-4B (Pharmacia)上的。
膜蛋白是使用吐温40和脱氧胆酸钠溶解的,并 用偶联到OX102 mAb上的琼脂糖颗粒培养70小时。
Williams and Barclay(1986)in Handbook of Experimental Immunology vol.1, 22.1-22.24,Blackwell Scientific Publications。
OX102 mAb- 偶联的琼脂糖颗粒是通过离心成粒的,并在0.1%十二烷基硫酸钠 (SDS)中洗涤,且最终在0.5%SDS中,55℃,洗脱15分钟。
通过 SDS聚丙烯酰胺凝胶电泳(SDS-PAGE)分析洗脱的部分。
IV.OX102 mAb抗原的N-端序列 氨基酸末端的测序是使用自动的Edman降解,在Applied Biosystems Procise 494A蛋白测序仪(Perkin-Elmer Ltd.UK)中 进行的。
证实了表1中所示的N-端序列。
由于通过N-连接的糖基化 作用修饰的天冬酰胺的存在,假设黑色的环是天冬酰胺。
通过筛选已 知的蛋白数据库,其具有OX102 mAb抗原的N-端20个氨基酸,鉴定 该纯化的多肽是新的。
此蛋白是大鼠的OX2RH1。
V.编码OX102 mAb抗原的cDNA克隆的分离 使用RNAzol B(生物起源)从大鼠腹膜溢泌物细胞提取总的RNA, 然后使用生产者推荐的Oligo dT颗粒(Oligotex,QIAGEN)纯化聚- A部分。
在有1μM选择的有义和反义寡核苷酸,1mM dNTPs,2mM DTT,50mM Tris-HCl pH8.3,75mM KCl,3mM MgCl2存在的情况下,用 200U的上标II反向转录酶(GIBCO BRL)处理约50ng聚A+纯化的 mRNA,并在42℃培养1小时。
然后将此cDNA用作PCR反应中的模板,例如,40μl所提供的 10×Advantage Taq嗜热PCR缓冲液(由Clontech提供);8μl 10mM 的dNTP;8μl Advantage Taq(Clontech);2μl上述制备的cDNA; 318μl蒸馏水;16μl反义,10μM降解的寡核苷酸,其与的N-端肽 相对应;8μl 10μM有意义的寡核苷酸。
所有的寡核苷酸引物均是用 5’端磷酸盐合成的(Genosys),以帮助克隆。
将PCR混合物等分成8×50μl的样品,并经过Robocycler PCR 机器中的PCR条件(Stratagene),其使操纵子同时改变分离样品中 的退火温度。
实施例参数是:93℃ 30秒;接着是35个周期:93℃ 30 秒;42-56℃ 1分钟;72℃ 30秒;和最终的72℃ 8分钟周期。
10μl的PCR产物是用标准方法,通过琼脂糖凝胶电泳分析的。
具有42℃,44℃和46℃退火温度的3个样品中,长度在100-300个 碱基对之间的PCR产物是从凝胶上切割的,并使用QIAquick(QIAGEN) 纯化核酸。
这些纯化的产物是使用标准方法,约16℃,48小时,连 接到PCRScript载体(Stratagene)中的,该载体已经被SmaI消化 并磷酸酶处理了。
转化体最初是通过群落PCR筛选的,且含适宜大小插入片段的20 个菌落,其是在LB肉汤中,在有50μg/ml氨苄青霉素情况下生长的 和通过QIAGEN自动机纯化质粒。
插入片段使用BIGDYE荧光双脱氧- 终止子技术和ABI-PRISM型377(Perkin-Elmer Ltd.,UK)测序的。
含核苷酸序列的插入片段,该核苷酸序列编码OX102 mAb抗原的N- 端序列,用于设计3’RACE反应的寡核苷酸。
OX102抗原的完整cDNA序列是通过3’RACE PCR(使用与上面相同 的方案)得到的,但是通过使用适当的寡核苷酸在0.2μM的最终浓度 修饰的。
PCR条件,例如,是:93℃ 30秒;接着是30个周期:93℃ 30秒;51-65℃ 1分钟;72℃ 3.5分钟;和72℃ 12分钟的最终周 期。
大约2.3Kb的带是自65℃的PCR反应割除的,凝胶纯化的,用 NotI和XhoI消化的,使用标准方法连接到NotI/XhoI消化的载体 (PCRScript,Stratagene)中。
按上述方法对插入物测序。
OX102蛋白的cDNA序列,也称作大鼠的OX2RH1,在表1中列出。
其它同系物实施方案的全长分离物被相似地克隆,且证实了序列。
可 以很容易地应用标准方法。
VI.获得其它的OX2RH cDNA 对大鼠的OX2RH1核苷酸和预测的氨基酸序列的了解可使人们从 其它物种获得同源功能的等价物,包括小鼠或人的OX2RH1,根据序列 相似性,且因为大鼠的OX2RH1提供分离这种等价物的工具。
因而,为了鉴定人的OX2RH1,可以检索现有的核苷酸和氨基 酸序列的数据库,对于未知同一性多肽(例如,存储从Human Genome Project得到的序列的数据库),对于具有与此处提供的 大鼠OX2RH1的核酸和氨基酸序列同源性的序列。
该数据库,其在 许多地方存储和更新,包括European Bioinformatics Centre (http://www.ebi.ac.uk/)和National Center for Biotechnology Information(http://www.ncbi.nlm.nih.gov/),可通过广泛使用的 程序,如FASTA或BLAST来评估。
这些数据库包括表达序列标记物 (ESTs)的序列,其是来自随机cDNA克隆测序的核苷酸序列短区。
这使得小鼠或人OX2RH的部分cDNA克隆通过与此处提供的大鼠OX2RH 序列信息进行对比而分离。
然后可通过筛选巨嗜细胞cDNA或基因组 库,或通过引物延伸技术,如此处所述得到全长大鼠OX2RH1克隆的 那些来分离。
与大鼠OX2RH1相关的小鼠和人序列是从遗传序列数据库鉴定 的,其使用,例如,BLAST服务器(Altschul等(1994)Nature Genet.6:119-129)。
标准分析程序可用于评估结构,例如,PHD(Rost 和Sander(1994)Proteins 19:55-72)和DSC(King和 Sternberg(1996)Protein Sci.5:2298-2310)。
标准对比软件包括, 例如,Altschul等(1990)J.Mol.Biol.215:403-10;Waterman (1995)Introduction to Computational Biology:Maps,Sequences, and Genomes Chapman & Hall;Lander和 Waterman(eds.1995) Calculating the Secrets of Life;Applications of the Mathematical Sciences in Molecular Biology National Academy Press;和Speed和Waterman(eds.1996)Genetic Mapping and DNA Sequencing(IMA Volumes in Mathematics and Its Applications, Vol 81)Springer Verlag。
大鼠和人的OX2RH1核酸序列具有50-98%的同源性,例如,可在 表5中观察到。
对于其它的同系物,相似性可能较少,特别是与同系 物3。
作为数据库筛选的一个选择,此处提供的大鼠OX2RH1核酸序列 可用于筛选巨嗜细胞cDNA或基因组库,以鉴定能在适宜的严格条件 下杂交的充分同源的人的序列。
此方法用来分离人的OX2基因,其是 使用大鼠OX2核酸作为探针进行的。
McCaughan等(1987) Immunogenetics25:329-335)。
可广泛地使用PCR,其是基于使用 cDNA,基因组DNA,cDNA克隆,或基因组克隆的模板作为模板的方法, 一般方法可通过从cDNA分离小鼠的OX2来举例说明。
见Preston等 (1997)Eur.J.Immunol.27:1911-1918。
来源于所提供OX2RH序列的PCR引物用于探测人,或其它物种或 组织,cDNA库。
序列可能来源于,例如,表1-4,优选邻近序列末端 的那些。
通过λgt10噬菌体的DNA杂交筛选克隆灵长类动物,啮齿类 动物,或其它物种OX2RH的全长cDNA。
PCR反应是在适宜的条件下使 用T.aquaticus Taqplus DNA聚合酶(Stratagene)进行的。
此外,大鼠的OX2RH1序列可用于分离相应的小鼠OX2RH1序列, 并鉴定在它们之间保守的区。
特别是随着同系物组的发现,可以鉴定 区域的相似性。
保守-区域序列提供在物种范围内鉴定给定基因的有 效试剂。
例如,与相同的人和大鼠区之间的77%同一性相比,小鼠和 大鼠OX2的区1的氨基酸水平是90%同一的。
Preston等,(1997) Eur.J.Immunol.27:1911-1918。
其它的方法是使用抗体试剂表达克隆,或鉴定在cDNA库中表达 的交叉反应蛋白,该库来源于适当的细胞类型,例如,巨嗜细胞,或 来源于其它物种。
VI.染色体定位 将该基因绘制成图谱。
例如,制备染色体分布。
原位杂交是在染 色体制剂上进行的,该染色体制剂是从植物凝集素-激发的淋巴细 胞,例如,从人,培养72小时得到的。
将5-溴脱氧尿苷加入到最后 七小时的培养物中(60μg/ml的培养基),以确保杂交后染色体带的 良好质量。
PCR片段,靠引物的帮助而被扩增,被克隆成适当的载体。
该载 体是通过用3H切口转译而标记的。
使放射性标记的探针杂交,以在杂 交溶液200ng/ml的最终浓度下中期涂布,如  Mattei等 (1985)Hum.Genet.69:327-331所述的。
在用核示踪乳剂(KODAK NTB)涂覆之后,让载玻片曝光。
为了 避免显带过程中银光纹理的任意滑动,染色体涂布首先是用缓冲的吉 姆萨溶液染色,并中期照相。
然后通过荧光染料-光解-吉姆萨带 (FPG)方法完成R-带,并在分析之前中期重照相。
类似的适当方法被用于其它物种。
VIII.各种OX2RH mRNA的定位 当OX2RH1所期望的表达模式主要位于巨嗜细胞,粒细胞,和肥 大细胞上时,同系物H2,H3,和/或H4在功能上可能不是紧密相关的。
因而,那些的分布是特别有趣的。
分布可以在核酸水平评估,例如, 通过杂交或PCR方法,或在蛋白水平评估,例如,通过组织学或免疫 化学方法。
每个泳道含大约2μg的聚(A)+RNA的人多种组织(Cat #1,2)和癌 细胞系印迹,是从Clontech(Palo Alto,CA)购买的。
探针是用[α-32p] dATP放射性标记的,例如,使用Amersham Rediprime随机引物标记试 剂盒(RPN1633)。
在65℃,0.5M Na2HPO4,7%SDS,0.5M EDTA(PH8.0) 的条件下,进行杂交和预杂交。
进行高度严格的洗涤,例如,在65 ℃,在2×SSC中进行两次初始清洗,0.1%SDS 40分钟,接着是在 0.1×SSC中的随后清洗,0.1%SDS 20分钟。
在有增感屏存在的情况下, 于-70℃让膜对X-光胶片(Kodak)曝光。
依据cDNA库DNA的更详细 研究是用所选择的适宜哺乳动物的OX2RH克隆进行的,以检查它们在 造血或其它细胞亚群中的表达。
选择性地,从表-4选择两种适当的引物。
RT-PCR是在适当的mRNA 样品上使用的,该样品是对于信息的存在而选择的,以生产cDNA,例 如,表达基因的样品。
全长克隆可通过来源于适当组织的cDNA库的杂交而分离,该组 织通过PCR-信号预-选择的。
可以进行RNA印迹。
编码OX2RH的基因的信息可以通过适当技术测定,例如,PCR, 免疫测定,杂交,或其它。
组织和器官的cDNA制剂是有效的,例如, 来源于Clontech,Mountain View,CA。
所述天然表达源的鉴定是 有用的。
对于小鼠分布,例如,可以进行Southern分析:来源于原始扩 增cDNA库的DNA(5μg)是用适当的限制酶消化的,以释放插入片段, 在1%琼脂糖凝胶上通过并转移到尼龙膜上(Schleicher and Schuell,Keene,NH)。
小鼠mRNA的分离培养样品可包括:静止的小鼠成纤维L细胞系 (C200);Braf:ER(Braf与雌激素受体融合)转染的细胞,对照 (C201);T细胞,TH1极化的(Mel14 bright,来源于脾脏的CD4+细 胞,用IFN-γ和抗IL-4极化7天;T200);T细胞,TH2极化的(Mel14 bright,来源于脾脏的CD4+细胞,用IL-4和抗-IFN-γ极化7天; T201);T细胞,高度TH1极化的(见Openshaw等(1995) J.Exp.Med.182:1357-1367;用抗-CD3活化的,2,6,16小时混合的; T202);T细胞,高度TH2极化的(见Openshaw等(1995) J.Exp.Med.182:1357-1367;用抗-CD3活化的,2,6,16小时混合的; T203);CD44-CD25+前T细胞,自胸腺分选的(T204);TH1 T细胞克 隆D1.1,在用抗原持续刺激之后静止3周(T205);TH1 T细胞克隆 D1.1,10μg/ml ConA激发15小时(T206);TH2 T细胞克隆CDC35, 用抗原持续刺激之后静止3周(T207);TH2 T细胞克隆CDC35,10 μg/mlConA刺激15小时(T208);来源于脾脏的Mel14+天然T细胞, 静止(T209);Mel14+T细胞,用IFN-γ/IL-12/抗-IL-4极化成Th1, 混合6,12,24小时(T210);Mel14+T细胞,用IL-4/抗-IFN-γ极 化成Th2,混合6,13,24小时(T211);未激发的成熟B细胞白血 病细胞系A20(B200);未激发的B细胞系CH12(B201);来源于脾脏的 未激发的大型B细胞(B202);来源于整个脾脏的B细胞,LPS活化的 (B203);来源于脾脏的三碘苯甲酰氨基丰富的树突细胞,静止 (D200);来源于骨髓的树突细胞,静止(D201);用LPS活化4小时 的单核细胞系RAW 264.7(M200);用GM和M-CSF衍生的骨髓巨噬巨 细胞(M201);巨嗜细胞系J774,静止(M202);巨嗜细胞系J774+LPS+ 抗-IL-10,在0.5,1,3,6,12小时混合的(M203);巨嗜细胞系 J774+LPS+IL-10,在0.5,1,3,5,12小时混合的(M204);气溶胶 攻击的小鼠肺组织,Th2引物,气溶胶OVA攻击,7,14,23小时混 合的(见Garlisi等(1995)Clinical Immunology and Immunopathology 75:75-83;X206);Nippostrongulus-转染的肺组 织(见Coffman等(1989)Science 245:308-310;X200);整个成人 肺脏,正常(O200);整个肺脏,rag-1(见Schwarz等(1993) Immunodeficiency 4:249-252;O205);IL-10 K.O.脾脏(见Kuhn等 (1991)Cell 75:263-274;X201);整个成人脾脏,正常(O201); 整个脾脏,rag-1(O207);IL-10 K.O.派尔斑(O202);整个派尔斑, 正常(O210);IL-10 K.O.肠系膜淋巴结(X203);整个肠系膜淋巴结, 正常(O211);IL-10 K.O.结肠(X203);整个结肠,正常(O212);NOD 小鼠胰脏(见Makino等(1980)Jikken Dobutsu 29:1-13;X205); 整个胸腺,rag-1(O208);整个肾,rag-1(O209);整个心脏,rag- 1(O202);整个脑,rag-1(O203);整个睾丸,rag-1(O204);整个肝, rag-1(O206);大鼠正常关节组织(O300);和大鼠关节炎的关节组织 (X300)。
人mRNA的分离样品可包括:外周血液单核细胞(单核细胞,T细 胞,NK细胞,粒细胞,B细胞),静止(T100);外周血液单核细胞, 用抗-CD3活化的,2,6,12小时混合的(T101);T细胞,THO克隆 Mot 72,静止(T102);T细胞,THO克隆Mot 72,用抗-CD28和抗-CD3 活化的,3,6,12小时混合的(T103);T细胞,THO克隆Mot72,用 特异性肽无变应性处理的,2,7,12小时混合的(T104);T细胞, TH1克隆HY06,静止(T107);T-细胞,TH1克隆HY06,用抗-CD28和 抗CD-3活化的,3,6,12小时混合的(T108);T细胞,TH1克隆HY06, 用特异性肽无变应性处理的,2,6,12小时混合的(T109);T细胞, TH2克隆HY935,静止(T110);T细胞,TH2克隆HY935,用抗-CD28 和抗-CD3活化的,2,7,12小时混合的(T111);在抗-CD28,IL-4, 和抗IFN-γ中,T-细胞CD4+CD45RO-T细胞极化27天,TH2极化的, 用抗-CD3和抗-CD28活化4小时(T116);T细胞瘤系Jurkat和Hut78, 静止(T117);T细胞克隆,混合AD130.2,Tc783.12,Tc783.13, Tc783.58,Tc782.69,静止(T118);T细胞随机γδT细胞克隆,静 止(T119);脾细胞,静止(B100);脾细胞,用抗-CD40和IL-4活 化的(B101);B细胞EBV系混合WT49,RSB,JY,CVIR,721.221,RM3,HSY, 静止(B102);B细胞系JY,用PMA和离子霉素活化的,1,6小时混 合的(B103);NK 20克隆混合的,静止(K100);NK20克隆混合的, 用PMA和离子霉素活化6小时(K101);NKL克隆,来源于LGL白血 病患者的外周血,IL-2处理的(K106);NK细胞毒素克隆640-A30-1, 静止(K107);造血前体系TF1,用PMA和离子霉素活化的,1,6小 时混合的(C100);U937前单核系,静止(M100);U937前单核系,用 PMA和离子霉素活化的,1,6小时混合的(M101);淘选的单核细胞, 用LPS,IFNγ,抗-IL-10活化的,1,2,6,12,24小时混合的(M102); 淘选的单核细胞,用LPS,IFNγ,IL-10活化的,1,2,6,12,24小 时混合的(M103);淘选的单核细胞,用LPS,IFNγ,抗-IL-10活化的, 4,16小时混合的(M106);淘选的单核细胞,用LPS,IFNγ,IL-10活 化的,4,16小时混合的(M107);淘选的单核细胞,活化LPS 1小时 (M108);淘选的单核细胞,活化LPS6小时(M109);DC 70% Cdla+, 来源于CD34+GM-CSF,TNFα12天,静止(D101);DC 70% CDla+,来 源于CD34+GM-CSF,TNFα12天,用PMA和离子霉素活化1小时 (D102);DC 70% CDla+,来源于CD34+GM-CSF,TNFα12天,用PMA 和离子霉素活化6小时(D103);DC 95% CDla+,来源于CD34+GM- CSF,TNFα12天FACS分选的,用PMA和离子霉素活化,1,6小时混 合的(D104);DC 95% CD14+,ex CD34+GM-CSF,TNFα12天FACS 分选的,用PMA和离子霉素活化的,1,6小时混合的(D105);DC CDla+, CD86+,来源于CD34+GM-CSF,TNFα12天FACS分选的,用PMA和 离子霉素活化的,1,6小时混合的(D106);DC,来源于单核细胞 GM-CSF,IL-45天,静止(D107);DC,来源于单核细胞GM-CSF,IL-4 5天,静止(D108);DC,来源于单核细胞GM-CSF,IL-45天,TNFα 活化,单核细胞supe,4,16小时混合的(D110);平滑肌瘤L11良 性肿瘤(X101);正常子宫肌膜M5(O115);恶性平滑肌肉瘤 GS1(X103);肺成纤维样细胞肉瘤系MRC5,用PMA和离子霉素活化的, 1,6小时混合的(C101);肾上皮癌瘤细胞系CHA,用PMA和离子霉 素活化的,1,6小时混合的(C102);胎肾28周雄性(O100);胎肺 28周雄性(O101);胎肝28周雄性(O102);胎心28周雄性(O103); 胎脑28周雄性(O104);胎胆囊28周雄性(O106);胎小肠28周雄 性(O107);胎脂肪组织28周雄性(O108);胎卵巢25周雌性(O109); 胎子宫25周雌性(O110);胎睾丸28周雄性(O111);胎脾脏28周 雄性(O112);成人胎盘28周雄性(O113);和扁桃腺发炎的,来源 于12岁(X100)。
可以在其它物种中分离相似的样品用于评估。
也可以进行组织 学。
IX.哺乳动物OX2RH蛋白的生产 一种适宜的,例如,GST,融合结构被设计在大肠杆菌中表达。
例如,构造小鼠OX2RH pGex质粒,并使其转入大肠杆菌。
新转化细 胞是在含50μg/ml氨苄青霉素的LB介质中生长的,并用IPTG诱导 (Sigma,St.Louis,MO)。
诱导过夜之后,采集细菌并分离含OX2RH 蛋白的小粒。
该小粒在2升的TE缓冲液(50mM Tris-base pH8.0,10mM EDTA和2mM pefabloc)中均质化。
此材料穿过微型流化床 (Microfluidics,Newton,MA)三次。
流化的上清液以13,000rpm在 Sorvall GS-3转子上旋转1小时离心。
过滤含OX2RH蛋白的最终上 清液,并穿过在50mM Tris-碱pH8.0中平衡的谷胱甘肽-琼脂糖柱。
混合并用凝血酶分裂含OX2RH-GST融合蛋白的部分(Enzyme Research Laboratories,Inc.,South Bend,IN)。
然后使分裂的集合体穿过在 50mM Tris-碱中平衡的Q-琼脂糖柱。
混合含OX2RH的部分,并在冷 的蒸馏水中稀释,以降低传导性,并穿过新的Q-琼脂糖柱,单独或与 免疫亲和性抗体柱连接。
混合含OX2RH蛋白的部分,等分,并在-70 ℃的冷却器中贮存, 各种融合结构是用OX2RH制造的。
因而,例如,OX2RH2,H3,或 H4胞外部分的融合可以与DAP的胞内部分,或IgG区或其它标记或功 能区融合。
适宜基因的一部分与抗原决定部位的标记物,例如,FLAG 标记物融合,或与成两种杂交系统结构融合。
见,例如,Fields and Song(1989)Nature 340:245-246。
抗原决定部位标记物可用于表达克隆方法中,用抗-FLAG抗体检 测结合配偶体,例如,各受体同系物的配位体。
该两种杂交系统也可 用于分离特异性结合OX2RH的蛋白。
CD谱与相似Ig超家族受体蛋白的对比可表明该蛋白是恰当折叠 的。
见Hazuda等(1969)J.Biol.Chem.264:1689-1693;和Campbell 等(1979)Nature 282:341-342。
可研究OX2/OX2R的结合反应活性,例如,动力和功能效果。
OX2R 胞质区的相互作用可使用所建立的免疫沉淀法或遗传法,如酵母两- 杂交系统来测定。
将OX2RH转染到正常情况下不表达该蛋白的细胞 中,在生理和信号产生的研究中是有益的。
X.对OX2RH特异的抗体的制备 适宜的物种或菌株,例如,近交Balb/c小鼠,是用蛋白的重组 形式腹膜内免疫的,例如,纯化的OX2RH或稳定的转染NIH-3T3细胞。
用蛋白在适宜的时间点对该动物进行强化免疫,有或没有附加的辅 剂,以进一步激发抗体蛋白。
采集血清,或用采集的脾脏生产杂交瘤。
选择性地,该动物,例如,Balb/c小鼠,是用细胞免疫的,该细 胞是用基因或其片段转化的,内源或外源细胞,或用分离膜,其丰富 抗原的表达。
在适宜的时间点采集血清,代表性在多次进一步的给药 之后。
各种基因治疗技术在原位生产蛋白,以产生免疫反应中可能是 有效的。
血清或抗体制剂可以是交叉-吸收或免疫选择的,以制备具 有确定特异性和高亲和性的基本纯的抗体。
因而,可以制备抗体,其 识别各物种的对应物,或识别特异性物种或亚群,例如,啮齿类动物, 实施方案。
可以制造单克隆抗体。
例如,用适当的融合配偶体融合脾细胞, 并通过标准方法在生长培养基中选择杂交瘤。
为抗体的存在而筛选杂 交瘤上清液,其中该抗体结合大鼠的OX2RH1,例如,通过ELISA或 其它测定法。
也可以选择或制备特异性识别特异性OX2RH实施方案的 抗体。
在其它方法中,将合成肽或纯化蛋白给予免疫系统,以产生单克 隆或多克隆抗体。
见,例如,Coligan(ed.1991)Current Protocols in Immunology Wiley/Greene;和Harlow and Lane(1989) Antibodies:A Laboratory Mannual Cold Spring Harbor Press。
在适当场合下,如上所述标记结合试剂,例如,荧光或其它,或固定 在底物上,用于淘选方法。
核酸也可被引入到动物细胞中以产生抗 原,其引起免疫应答。
见,例如,Wang等(1993)Proc.Nat’l Acad.Sci.90:4156-4160;Barry等(1994)BioTechniques 16:616-619;和Xiang等(1995)Immunity 2:129-135。
XI.配位体结合和配偶体特异性 测试结合选择性和亲和力的方法可很容易地得到。
表面胞质基因 组共振(见,manufacturer’s protocol;BIAcore manual,Pharmacia Biosensor)或其它方法可用于测定OX2RH的配位体。
大鼠和小鼠的 H1结合它们物种对应物的配位体OX2;人的H1也可类似地测试。
H2 可相对于类似的有效配位体而相似地测试,虽然H2胞外区与已知受 体(大鼠和小鼠的H1)的相似性间接表明相同或密切相关的配位体。
受体可用作特异性结合试剂以鉴定其结合配偶体,通过利用它的 结合特异性,可以使用抗体。
结合受体可以是OX2RH,或可以包含, 例如,具有其它亚单位的OX2RH复合体。
如上所述标记结合试剂,例 如,荧光或其它,或固定在底物上,用于淘选法。
结合组分用于筛选从细胞系获得的表达库,该细胞系表达结合配 偶体,即,配位体,优选膜相关的。
标准染色技术用于检测或分选表 面表达的配位体,或通过淘选筛选表达转化细胞的表面。
胞内表达的 筛选是通过各种染色或免疫荧光方法进行的。
见,McMahan等, (1991)EMBO J.10:2821-2832。
选择性地,受体试剂用于亲和纯化或分选表达推断配位体的细 胞。
见,例如,Sambrook等,或Ausubel等。
其它的策略是通过淘选筛选膜结合配位体。
如上所述构造受体 cDNA。
可以利用适宜的抗体来获得固定,该抗体识别,例如,OX2RH 融合构造上的FLAG序列,或利用相对于第一抗体培养的抗体来获得。
扩增和选择的递归循环导致适宜克隆的富集和表达克隆的受体的最 后分离。
噬菌体表达库可以通过哺乳动物OX2RH,例如,标记形式来筛选。
适当的标记技术,例如,抗-FLAG抗体,可特异性标记适当的噬菌体 克隆。
正证实OX2-OX2RH结合象,或其它同系物的配位体的鉴定,可以 测试信号产生途径。
见,例如,Preston等91997)Eur.J.Immunol. 27:1911-1918。
DAP12包含的含义是清楚的。
见,例如,Bakker等 (2000)Human Immunology 61:18-27;Lanier等(1998)Immunity 8:693-701;Smith等(1998)J.Immunol.161:7-10;Gossel in等 (1999)J.Leukoc.Biol.66:165-171;Tomasello等(1998) J.Biol.Chem.273:34115-34119;和McVicar等(1998)J.Biol.Chem. 273:32934-32942。
相似地,或选择性地,可以包括DAP10。
见,例 如,Wu J等(1999)Science285:730-732;和Bauer等(1999)Science 285:727-729。
特别是,DAP12共同受体配偶体与T细胞受体亚单位ζ和FcεR  γ位于相同的家族中,其具有ITIM基序,并通过包含syk/zap70蛋 白酪氨酸激酶的途径信号产生。
DAP10具有YxxM基序,其通过或与类 似地对PI3激酶途径信号产生。
NK细胞上的MHC类I受体的某些同种型在它们的胞质区中缺少 ITIM序列,且这些同种型活化,而不是抑制,NK细胞。
这些活化受 体具有非常短的胞内区,其缺少任一信号产生的基序,且它们在其跨 膜区中全部共有一正电荷的残基,其间接表明与能够信号产生的接合 器分子有关。
DAP12,含ITAM的I型二硫化物连接的均二聚物与人 KIR2DS受体非共价地组合。
DAP12在它的跨膜区中具有负电荷的天冬 氨酸残基,与所报道的12-13kD磷蛋白相对应,发现其与KIR2DS共 同免疫沉淀。
当受体接合时,使得DAP12磷酸化,并恢复Syk激酶,因而诱发 与T细胞受体相似的信号级联。
除了与KIR2DS,HLA-C受体有关,DAP12 也在NK细胞的细胞表面表达,其与活化小鼠Ly49D和识别H-2的 Ly49H受体有关,并与识别HLA-E的人CD94/NKG2C异二聚物受体复 合体有关。
近来通过检索EST数据库而鉴定潜在膜信号蛋白的努力引起 DAP10的鉴定,一种主要在造血细胞中表达的新的10-kD表面接合 器。
虽然DAP10仅限制与DAP12的同源性,它的跨膜区包含一种负荷 电的残基,其保存在DAP12的跨膜区和所有TCR的CD3亚单位中。
此 外,DAP12胞外区内的保守半胱氨酸残基和CD3链也存在于DAP10中。
有趣的是,人DAP10和DAP12基因位于邻近的染色体19q13.1上,在 相反的转录方向,并仅通过约130个碱基对分离,大概是由于基因复 制。
DAP10的一个唯一特征是它的短,但保守的,胞质尾部,其包含 YxxM信号基序,用于磷脂酰肌醇3-激酶(PI3-激酶)的p85调节亚 单位的有效src-同系性2(SH2)区-结合位点。
可以确定各种OX2RH 与DAP12或DAP10的物理和功能的关联。
XII.遗传分析,动物研究 序列使用于确定染色体图谱,疾病标记物相关性,和各基因遗传 结构的分离和确定的试剂和信息有用。
确定内含子/外显子结构,并 制备转基因的和缺失的动物。
见,例如,Goodnow(1992)“Transgenic Animals”in Roitt(ed.)Encyclopedia of Immunology,Academic Press,San Diego,pp.1502-1504;Travis(1992)Science 256:1392-1394;Kuhn等(1991)Science 254:707-710;Capecchi (1989)Science 244:1288;Robertson(ed.1987)Teratocarcinomas and Embryonic Stem Cells:A Practical Approach,IRL Press, Oxford;Rosenberg(1992)J.Clinical Oncology 10:180-199;和 Cournoyer and Caskey(1993)Ann.Rev.Immunol.11:297-329。
为了确定体外和体内OX2-OX2R相互作用的功能,制备腺病毒结 构,其是以可溶性形式生产的,将OX2RH1的胞外区与人IgG融合。
制备对照结构,其是以可溶性形式生产的,仅仅是人的IgG主链。
在 第一个例子中,含这些融合蛋白的上清液是通过体外细胞感染而产生 的,以根据结合普通表达小鼠的OX2测试是否OX2R融合蛋白具有生 物功能。
在研究的第一系列中,制备正常和OX2-基因剔除(KO)小鼠 的小鼠脾脏组织切片,加入OX2R,或对照融合蛋白,通过结合融合蛋 白人Fc部分的抗体的加入而检测这些试剂,随后进行免疫过氧化物 酶染色过程以显示结合。
OX2融合蛋白的微弱结合仅存在于正常小鼠 中,而不存在于在OX2 KO小鼠中,其是在卵泡树突细胞和内皮细胞 上检测的。
所有的细胞类型均表达非常高水平的配位体OX2。
因而, 该试剂结合于OX2的生理形式,且在脾脏中没有观察到结合,其中由 于基因导向,缺少配位体OX2。
已知B细胞表达配位体OX2,但比在卵泡树突细胞和内皮细胞中 的水平要低。
免疫组织化学不是特别敏感的技术。
因而在第二个研究 中,将相同的融合蛋白用于来源于正常小鼠和OX2 KO小鼠的分离脾 白细胞,并在B细胞上使用对B220分子特异的mAb,通过流式血细胞 技术分析来测定与B细胞的结合,并通过偶联到藻红蛋白的人IgG次 级抗体更敏感地检测融合蛋白。
在这种情况中,正常小鼠中的所有B 细胞均是由OX2R融合蛋白标记的,而不是通过对照融合蛋白标记的。
OX2R融合蛋白与B细胞的相互作用是通过称作OX90的mAb的加入而 阻断的,已知其结合与OX2R相互作用的小鼠OX2分子的一部分。
此 外,当OX2R融合蛋白加入到来源于OX2 KO小鼠的B细胞时,用对照 融合蛋白没有见到上述背景水平的结合。
这些研究的结论是:(1)OX2R融合蛋白是生物活性的,并结合于 造血和非-造血细胞上的OX2;和(2)由于OX2R的主要配位体结合确 实是所鉴定的配位体OX2,以抗-OX2(OX90)结合抑制为基础,且缺少 可检测的,与来源于OX2 KO小鼠的结合。
这些数据不能排除这种可 能性,即除了已知的配位体OX2之外,还有通过OX2R的其它配位体 束缚,甚至流式血细胞计数器没有检测在非常低水平表达的细胞表面 分子。
可以使用标准方法生产转基因小鼠。
这种动物对于确定基因缺失 效果是有效的,在特异性组织中,或完全贯穿生物体。
这可以提供对 动物的研究和各区段特殊组织的观察。
此外,可以评估对各种生物应 激应答的效果。
见,例如,Hogan等(1995)Manipulating the Mouse Embrvo:A Laboratorv Manual(2d ed.)Cold Spring Harbor Laboratory Press。
同样,可以生产缺失小鼠,例如,剔除小鼠。
这些动物将经历动物模型以研究基因在体内的功能。
见,例如, Gorczynski等(1999)J.Immunol.163:1654-1660;Mankoo等(1999) Nature 400:69-73;Gorczynski等(1999)Transplant.Proc. 31:577-578;和Gorczynski L等(1999)J.Immunol.162:774-781。
特别感兴趣的是巨嗜细胞或其它骨髓细胞的作用,例如,在血液,淋 巴组织,或实体器官,包括神经系统中的小胶质细胞中。
说明了对神 经变性,自身免疫炎症,感染的易感性试验。
所有拮抗剂和激动剂在 体外或体内模型中均是有效的制剂。
XIII.筛选可能具有治疗价值的物质 OX2R/OX2相互作用的生物效果可以通过使用与OX2R反应的抗体 来研究,以在巨嗜细胞表面膜中交联OX2R分子,并寻找变化,例如, 在含氮的氧化物生产中和信号蛋白的磷酸化中。
干扰OX2R/OX2相互作用的效果可以使用携带OX2R的巨嗜细胞来 测试,通过将它们暴露于交联结合配偶体,如OX2R的mAb(例如, OX102)或在有或没有侯选物质的情况下的OX2重组多价译本上。
在 有或没有侯选化合物情况下的巨嗜细胞活性的对比(例如,含氮氧化 物的生产或信号蛋白的磷酸化作用)可说明侯选物质是否具有调节效 果(例如,抑制或提高)。
侯选物质也可以在很好建立的疾病模型中测试,其中巨嗜细胞包 含在疾病,如自身免疫的病理学中。
例如,可以使用所建立的模型, 如试验变应性脑脊髓炎举例说明,例如,用显示促进自身免疫疾病试 验性自身免疫脑脊髓炎的小鼠模型。
OX2拟态在慢性病如慢性肉芽肿 病中可能是有效的。
OX2/OX2R信号的激动剂或拮抗剂的组合可以是与 现有的,这种疾病的治疗剂组合。
见Physician’s Desk Reference Medical Economics Co,Montvale,NJ。
上述这种分析说明了OX2R/OX2相互作用的干扰方法可能是治疗 有效性的。
例如,本发明提供生产OX2RH重组译本的方法,其可用于 与有效的OX2蛋白接合以筛选可能的,阻断相互作用的药物试剂。
相 互作用蛋白的有效性提供高生产大量小分子筛选程序的方法,用于制 药工业中。
见,例如,meetings on High Throughput Screening, International Business Communications,Southborough,MA 01772-1749。
穿过OX2RH胞质区的相互作用可能是治疗的靶,且序列 和其相互作用的知识提供通过相似的筛选方法研制药物试剂的方 法。
XIV.结构活性关系 特殊残基重要性的信息是使用标准方法和分析确定的。
标准诱变 分析是通过在确定的位置产生许多不同的变体而进行的,例如,在上 述鉴定的位置,并评估变体的生物活性。
这可以进行至确定位置的程 度,其修饰活性,或至特异位置的病灶,以确定残基,其可被置换以 保留,阻断,或调节生物活性。
选择性地,天然变体的分析可以表明什么位置耐受天然突变。
这 可能是由于个体中变化的群体分析,或穿过菌株或物种。
分析来源于 所选个体的样品,例如,通过PCR分析和测序。
这可评估群体多态现 象。
其中所有的引证文献均相同程度地在此引入作为参考,好象各个 出版物或专利申请是特定地和单独地引入作为参考的。
在不背离其精神和范围的情况下,可以对本发明进行多种改变和 变化,这对于本领域的那些技术人员来说是显而易见的。
其中描述的 特殊实施方案仅仅通过实施例来提出,本发明是通过权利要求来限定 的,连同与权利要求等价的整个范围一起被授权;本发明不受以举例 形式提供的特殊实施方案的限定。
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