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假单胞菌素N-酰基侧链类似物

基本信息

  • 申请号 CN00810291.0 
  • 公开号 CN1360593A 
  • 申请日 2000/06/08 
  • 公开日 2002/07/24 
  • 申请人 伊莱利利公司  
  • 优先权日期  
  • 发明人 M·D·贝尔沃 S·H·陈 C·W·德克 S·L·赫尔曼 J·A·亚米森 L·E·帕特森 M·J·罗德里格茨 X·D·孙 W·W·图尔纳 V·瓦苏德范 M·J·茨维菲尔  
  • 主分类号  
  • 申请人地址 美国印第安纳州 
  • 分类号  
  • 专利代理机构 中国专利代理(香港)有限公司 
  • 当前专利状态 发明专利申请公布 
  • 代理人 温宏艳 
  • 有效性 发明公开 
  • 法律状态
  •  

摘要

描述了具有结构(I)的半合成假单胞菌素化合物,其可用作杀真菌剂或设计杀真菌剂的中间体。
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权利要求书


1.一种结构I表示的化合物和其可药用盐和其溶剂化物 其中R为 其中 Ra和Ra’独立为氢或甲基、或者Ra或Ra’为烷基氨基、与Rb或Rb’一 起形成六元环烷基环、六元芳香环或双键、或与Rc一起形成六元芳 香环; Rb和Rb’独立为氢、卤素或甲基,或者Rb或Rb’为氨基、烷基氨基、 α-乙酰乙酸酯、甲氧基、或羟基,条件是当Ra、Rb、Rd、Re为氢、Rc为氢和Rf为正己基、正辛基或正癸基,或Ra、Rb、Rd、Re为氢,Rc为 羟基和Rf为正辛基、正壬基、或正癸基时,Rb不为羟基; Rc为氢、羟基、C1-C4烷氧基、羟基烷氧基,或与Re一起形成六元 芳香环或C5-C6环烷基环; Re为氢、或与Rf一起形成六元芳香环、C5-C14烷氧基取代的六元 芳香环、或C5-C14烷基取代的六元芳香环,和 Rf为C8-C18烷基、C5-C11烷氧基或联苯基;或 R为 其中 Rg为氢或C1-C13烷基,和 Rh为C1-C15烷基、C4-C15烷氧基、(C1-C10烷基)苯基、-(CH2)n芳基、 或-(CH2)n-(C5-C6环烷基),其中n=1-2;或 R为 其中 Ri为氢、卤素、或C5-C8烷氧基,和 m为1、2或3; R为 其中 Rj为C5-C14烷氧基或C5-C14烷基,和p=0、1或2; R为 其中 Rk为C5-C14烷氧基;或 R为-(CH2)-NRm-(C13-C18烷基),其中Rm为H、-CH3或-C(O)CH3

2.权利要求1的化合物,其中结构I具有下列立体化学:
3.权利要求1的化合物,其中R为 其中 Ra和Ra’独立为氢或甲基,或者Ra或Ra’为烷基氨基,与Rb或Rb’一起形成六元环烷基环、六元芳香环或双键,或与Rc一起形成六元 芳香环; Rb和Rb’独立为氢、卤素、或甲基、或者Rb或Rb’为氨基、烷基氨 基、α-乙酰乙酸酯、甲氧基、或羟基,条件是:当Ra、Rb、Rd、Re为 氢,Rc为氢和Rf为正己基、正辛基或正癸基,或Ra、Rb、Rd、Re为氢, Rc为羟基和Rf为正辛基、正壬基或正癸基时,Rb’不为羟基; Rc为氢、羟基、C1-C4烷氧基、羟基烷氧基、或与Re一起形成六 元芳香环或C5-C6环烷基环; Re为氢,或与Rf一起为六元芳香环、C5-C14烷氧基取代的六元芳 香环、或C5-C14烷基取代的六元芳香环;和 Rf为C8-C18烷基、C5-C11烷氧基、或联苯基。

4.权利要求3的化合物,其中Rb’为羟基,条件是:当Ra、Rb、Rd、 Re为氢和Rf为正己基、正辛基或正癸基时,Rc不为氢或当Rf为正辛 基、正壬基、或正癸基时Rc不为羟基。

5.前述权利要求任一项中要求保护的化合物在制备用于治疗全 身真菌感染或真菌皮肤感染的药物中的用途。

6.一种药物组合物,它包含权利要求2的假单胞菌素化合物和可 药用载体。

7.一种在需要治疗的动物中治疗抗真菌感染的方法,它包括对所 述动物给药权利要求2中的假单胞菌素化合物的步骤。

8.制备假单胞菌素核的方法,它包括提供具有包含至少一个γ或δ 羟基的N-酰基烷基侧链的假单胞菌素化合物和所述假单胞菌素化合 物与一种酸反应制备所述假单胞菌素核的步骤。

9.权利要求8的方法,其中所述假单胞菌素核由结构I-A表示。
其中R’为-NH2或-NHp-Pg,其中Pg为氨基保护基和p为0或1。

10.权利要求8的方法,其中所述具有包含至少一个γ或δ羟基的 N-酰基烷基侧链的假单胞菌素化合物选自假单胞菌素A、假单胞菌素 A’和假单胞菌素C。

11.权利要求8的方法,其中所述酸为三氟乙酸和乙酸。

12.权利要求11的方法,其中所述酸为三氟乙酸。

13.假单胞菌素核,它是由权利要求8的方法制备的。

14.权利要求13的假单胞菌素核,其中所述核由结构I-A表示。
其中R’为-NH2或-NHp-Pg,其中Pg为氨基保护基和p为0或1。

15.由结构I-A表示的假单胞菌素核。
其中R’为-NH2或-NHp-Pg,其中Pg为氨基保护基和p为0或1。
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说明书

                   发明领域 本发明涉及假单胞菌素(pseudomycin)化合物,尤其是具有新N- 酰基侧链的半合成的假单胞菌素化合物。
                   发明背景 假单胞菌素是从丁香假单胞菌(Pseudomonas syringae,与植物 有关的细菌)的液体培养物中分离的天然产物,并且已显示具有抗真 菌活性。
(例如参见,Harrison,L.等,“假单孢菌素,一族得自丁香 假单胞菌的具有广谱抗真菌活性的新肽”  J.Gen.Microbiology, 137(12),2857-65(1991)以及美国专利US5,576,298和 5,837,685)。
与前面所述得自丁香假单胞菌的抗霉菌剂(例如丁香霉 素、丁香假单胞菌毒素和丁香假单胞菌抑制素)不同,假单胞菌素A-C 含有羟基天冬氨酸、天冬氨酸、丝氨酸、脱氢氨基丁酸、赖氨酸和二 氨基丁酸。
假单胞菌素A、A’、B、B’、C、C’的肽部分相应于具有末 端羧基的L-Ser-D-Dab-L-Asp-L-Lys-L-Dab-L-aThr-Z-Dhb-L- Asp(3-OH)-L-Thr(4-Cl),该羧基在N-末端Ser的OH上将大环闭合。
这些类似物是通过N-酰基侧链加以区别的,即假单胞菌素A是被3,4- 二羟基十四烷酰基N-酰化的,假单胞菌素A’是被3,4-二羟基十五烷 酰基N-酰化的,假单胞菌素B是被3-羟基十四烷酰基N-酰化的,假 单胞菌素B’是被3-羟基十二烷酰基N-酰化的,假单胞菌素C是被 3,4-二羟基十六烷酰基N-酰化的,以及假单胞菌素C’是被3-羟基十 六烷酰基N-酰化的。
(例如参见Ballio,A.,等人,“得自丁香假单胞 菌的生物活性脂缩肽:假单孢菌素,”FEBS Letters,355(1),96- 100,(1994)和Coiro,V.M.,等人,“使用得自NMR数据的几何位距 和分子动力学通过计算机模拟确定的丁香假单胞菌MSU 16H植物毒性 脂缩肽假霉素A的溶液构象,”Eur.J.Biochem.,257(2),449-456 (1998))。
已知假单胞菌素具有一定的生物副作用。
例如,当假单胞菌素经 静脉内给药时,已观察到静脉内皮破坏、组织破坏、发炎和宿主组织 的局部毒性。
因此,需要从这类化合物中鉴别出对治疗真菌感染有用 而没有目前观察到的副作用的化合物。
发明简述 本发明提供了用作抗真菌剂或者用于抗真菌剂设计的下面结构 式所表示的假单胞菌素化合物、其可药用的盐及其溶剂化物, 其中R是 其中 Ra和Ra′独立地是氢或甲基,或者Ra或Ra′是烷基氨基,与Rb或Rb′一起形成6-元环烷基环、6-元芳族环或双键,或者与Rc一起形成6- 元芳族环; Rb和Rb′独立地是氢、卤素或甲基,或者Rb或Rb′是氨基、烷基氨 基、α-乙酰乙酸酯、甲氧基或羟基,条件是:当Ra、Rb、Rd、Re为氢、 Rc为氢且Rf为正己基、正辛基或正癸基,或者Ra、Rb、Rd、Re为氢、 Rc为羟基且Rf为正辛基、正壬基或正癸基时,Rb’不是羟基; Rc是氢、羟基、C1-C4烷氧基、羟基烷氧基、或者与Re一起形成 6-元芳族环或C5-C6环烷基环; Re是氢,或者与Rf一起形成6-元芳族环、C5-C14烷氧基取代的6- 元芳族环、或者C5-C14烷基取代的6-元芳族环,和 Rf是C8-C18烷基,或C5-C11烷氧基;或 R是 其中 Rg是氢或C1-C13烷基,并且 Rh是C1-C15烷基、C4-C15烷氧基、(C1-C10烷基)苯基、-(CH2)n-芳 基、或-(CH2)n-(C5-C6环烷基),其中n=1或2;或者 R是 其中 Ri是氢、卤素、或C5-C8烷氧基,而且 m是1、2或3; R是 其中 Rj是C5-C14烷氧基或C5-C14烷基并且p=0、1或2; R是 其中 Rk是C5-C14烷氧基,或者 R是-(CH2)-NRm-(C13-C18烷基),其中Rm是氢、-CH3或-C(O)CH3
在本发明的另一实施方案中,提供了一种药用制剂,它包括上述 结构I代表的假单胞菌素化合物和可药用的载体。
在本发明的又一实施方案中,提供了一种在需要治疗的动物中治 疗抗真菌感染的方法,该方法包括给所述动物施用上述的假单胞菌素 化合物I。
在本发明的另一实施方案中,提供了一种制备假单胞菌素化合物 游离胺核的方法,该胺核可被酰化生成上述结构I代表的化合物。
该 方法包括用三氟乙酸或乙酸处理含有至少具有一个γ或δ羟基的N-酰 基烷基侧链的假单胞菌素化合物(例如,假单胞菌素A、A’或C)的步 骤。
定义 本文所用的术语“游离胺假单胞菌素核”或“假单胞菌素核”是 指下列I-A的结构: 其中,R’是-NH2或-NHp-Pg,其中Pg为氨基保护基及p为0或1。
术语“烷基”指的是含有1-30个碳原子的通式CnH2n+1烃基。
烷 基可以是直链(例如甲基、乙基、丙基、丁基等)、支链(例如异丙基、 异丁基、叔丁基、新戊基等)、环状(例如环丙基、环丁基、环戊基、 甲基环戊基、环己基等)、或者多环状(例如二环[2.2.1]庚烷、螺[2.2] 戊烷等)。
所述烷基可以是被取代或者没有取代的。
类似地,烷氧基、 烷酰基或链烷酸酯中的烷基部分具有上面的相同定义。
术语“烯基”指的是含有至少一个碳碳双键的无环烃。
所述烯基 可以是直链、支链、环状或多环状。
所述烯基可以取代或者没有取代 的。
烯氧基、烯酰基或烯酸酯中的烯基部分具有上面的相同定义。
术语“炔基”是指至少含有一个碳碳三键的无环烃。
炔基可以是 直链的或支链的,可以是取代的或未取代的。
炔氧基、炔酰基或炔酸 酯基团中的炔基部分具有与上述相同的含义。
术语“芳基”指的是具有单环体系(例如苯基)或稠环体系(例如 萘、蒽、菲等)的芳族部分。
所述芳族可以是被取代或者没有取代的。
术语“杂芳基”指在芳环体系中至少含有一个杂原子的芳基(例 如吡咯、吡啶、吲哚、噻吩、呋喃、苯并呋喃、咪唑、嘧啶、嘌呤、 苯并咪唑、喹啉等)。
芳基可包含单或稠合环系。
杂芳基可以是取代 的或未取代的。
“NHp-Pg”和“氨基保护基”是指常用作氨基取代基以在化合物 的其它官能团反应时阻止或保护氨基官能团。
当p为0时,氨基保护 基与其相连的氮一起形成环酰亚胺,例如邻苯二甲酰亚胺和四氯邻苯 二甲酰亚胺。
当p为1时,氨基保护基可与其相连的氮一起形成氨基 甲酸酯,例如甲基、乙基和9-芴基甲基氨基甲酸酯;或酰胺,例如 N-甲酰基和N-乙酰基酰胺。
在有机化学领域,特别是有机生化领域,应广泛地理解为,化合 物的有效取代是允许的,或者甚至是有用的。
例如,在本发明中,术 语烷基允许包括典型的烷基取代基,例如甲基、乙基、丙基、己基、 异辛基、十二烷基、硬脂基(stearyl)等。
术语“基团”特定涉及 并允许包括在本领域常规的烷基上取代,例如羟基、卤素、烷氧基、 羰基、酮基、酯基、氨基甲酸酯基(Carbamato)等,以及包括没有 取代的烷基部分。
然而,本领域技术人员通常理解为,取代基应经选 择,以便对化合物的药理特性没有负面影响,或者对该药物的使用没 有负面干扰。
上面定义的任意基团的合适取代基包括烷基、烯基、炔 基、芳基、卤素、羟基、烷氧基、芳氧基、巯基、烷硫基、芳硫基、 一-和二-烷基氨基、季铵盐、氨基烷氧基、羟基烷基氨基、氨基烷硫 基、氨基甲酰基、羰基、羧基、羟乙酰基、甘氨酰基、肼基、脒基、 及其组合。
术语“溶剂化物”指聚集体,其包含一个或多个溶质分子,例如 结构I的化合物,和一个或多个可药用溶剂分子,例如水和乙醇等。
术语“可用药盐”是指结构I代表的化合物的有机或无机盐,其 对接受者在给药剂量基本无毒。
术语“动物”指的是人、宠物(例如狗、猫和马)、食物源动物(例 如牛、猪、羊和家禽)、动物园动物、海洋动物、鸟类和其它类似动 物种。
发明详述 申请人发现假单胞菌素化合物的L-丝氨酸单元的N-酰基脱酰 化,随后用新的N-酰基重新酰化得到新的化合物,体外实验表明这 些新化合物可能有抗白色念珠菌(C.albican)、新型隐球酵母(C, neoformans)和/或烟曲霉(Aspergillus fumigatus)活性。
下面反应路线I表示由任一种天然存在的假单胞菌素合成化合 物I的一般方法。
虽然在反应路线I中画出了一种天然存在的假单 胞菌素化合物,但本领域的技术人员将理解天然存在的假单胞菌素化 合物的半合成衍生物的侧链修饰可按类似方法完成。
一般地,制备化 合物I需要四步合成:(1)选择性氨基保护;(2)N-酰基侧链的化学 脱酰化或酶促脱酰化;(3)用不同的侧链重新酰化;和(4)所述氨基 脱保护。
反应路线I 在2、4和5位的侧链氨基可用本领域技术人员已知的任何保护 氨基的标准方法进行保护。
氨基保护基的具体种类不很重要,只要衍 生的氨基在中间体分子其它位置上随后发生的反应条件下稳定并且 保护基在合适的时间可以选择性除去而不影响分子的其余部分,包括 任何其它的氨基保护基即可。
合适的氨基保护基包括苄基氧基羰基、 对硝基苄基氧基羰基、对溴苄基氧基羰基、对甲氧基苄基氧基羰基、 对甲氧基苯基偶氮苄基氧基羰基、对苯基偶氮苄基氧基羰基、叔丁基 氧基羰基、环戊基氧基羰基和邻苯二甲酰亚氨基。
优选的氨基保护基 是叔丁氧基羰基(t-Boc)、烯丙基氧基羰基(Alloc)、邻苯二甲酰亚氨 基和苄基氧基羰基(CbZ或CBZ)。
最优选为烯丙基氧基羰基和苄基氧 基羰基。
此外,合适的保护基描述于T.W.Greene“Protective Groups in Organic Synthesis”John Wiley and Sons,New York,N.Y., (2nd ed.,1991),第7章。
具有γ或δ羟基化的侧链(例如,3,4-二羟基十四酸酯 (tetradeconoate))的N-酰基的脱酰化可通过用5-20%酸水溶液处理 氨基保护的假单胞菌素化合物来完成。
合适的酸包括乙酸和三氟乙 酸。
优选的酸是三氟乙酸。
如果用三氟乙酸,该反应可在室温或接近 室温下完成。
但是当用乙酸时,该反应一般在约40℃进行。
可用一 种可水溶的有机溶剂促进假单胞菌素化合物的溶解。
合适的水溶剂体 系包括乙腈、水和其混合物。
当保护的假单胞菌素化合物去酰化时乙 腈特别有用。
用于保护的假单胞菌素化合物脱酰化优选的酸溶液是8% 三氟乙酸的乙腈水溶液。
有机溶剂加速该反应,然而,加入有机溶剂 会导致其它副产物。
侧链上缺少δ羟基的假单胞菌素化合物(例如,假 单胞菌素B和C’)可经酶促脱酰化。
合适的脱酰化酶包括多粘菌素酰 化酶(164-16081脂肪酰化酶(粗品)或161-16091脂肪酰化酶(纯品) 可购自Wako Pure Chemical Industries,Ltd.),或ECB脱酰化酶 (参见,例如U.S.Patent No.5,573,936)。
酶促脱酰化可用本领 域技术人员熟知的标准脱酰化方法完成。
例如,用多粘菌素酰化酶的 一般方法见Yasuda,N.等,Agric.Biol.Chem.,53,3245(1989) 和Kimura,Y.等,Agric.Biol.Chem.,53,497(1989)。
脱酰化产物(也称为假单胞菌素核或“PSN”)用目的酰基的相应 酸在羰基活化剂存在下重新酰化。
“羰基活化基团”是指促进在该羰 基上的亲核加成反应的取代基。
合适的活性取代基是羰基上具有净拉 电子作用的那些。
这些基团包括,但不限于,烷氧基、芳氧基、含氮 芳香杂环或氨基(例如,氧基苯并三唑、咪唑基、硝基苯氧基、五氯 苯氧基、N-氧基琥珀酰亚胺、N,N’-二环己基异脲-O-基和N-羟基-N- 甲氧基氨基);乙酸酯;甲酸酯;磺酸酯(例如,甲烷磺酸酯、乙烷磺 酸酯、苯磺酸酯和对甲苯磺酸酯)和卤化物(例如,氯化物、溴化物和 碘化物)。
或者,可用固相合成,其中用羟基苯并三唑树脂(HOBt-树脂)作 偶联剂用于该酰化反应。
在酰化过程中可应用各种酸。
合适的酸包括含有一个或多个侧链 芳基、烷基、氨基(包括伯、仲和叔胺)、羟基、烷氧基和氨基的脂肪 族酸;在脂肪族链中含有氮或氧的脂肪族酸;被烷基、羟基、烷氧基 和/或烷基氨基取代的芳香族酸;和被烷基、羟基、烷氧基和/或烷基 氨基取代的杂芳香族酸。
酰化产物可用作活性抗真菌剂或用作制备活 性化合物的中间体。
即使一些化合物不如其它化合物有用,其活性谱 也对欲获得最佳活性的设计思路提供有价值的信息。
一旦氨基被酰化,可通过在氢化催化剂(例如10%Pd/C)的存在 下除去氨基保护基(2、4和5位)。
当氨基保护基是烯丙基氧基羰 基时,该保护基可用三丁基锡氢化物和三苯膦钯二氯化物除去。
这一 特定的保护/脱保护路线的优点是降低了氢化假单胞菌素Z-Dhb单元 的乙烯基的可能性。
正如早先所讨论的,假单胞菌素是从丁香假单胞菌分离的天然产 物,它被表征为酯缩肽(Lipodepsinonapetpides),其含有通过内 酯键闭环的环肽部分并包括不寻常的氨基酸4-氯苏氨酸(ClThr)、3- 羟基天冬氨酸(HOAsp)、2,3-脱氢-2-氨基丁酸(Dhb)和2,4-二氨基丁 酸(Dab)。
生长丁香假单胞菌的不同菌株从而生产不同假单胞菌素类 似物(A、A’、B、B’、C和C’)的方法描述如下并且更详细地描述在 Hilton等人于2000年4月14日提交的题为“通过丁香假单胞菌生 产假单胞菌素(Pseudomycin Production by Pseudomonas Syringae)”的PCT专利申请,其序列号为PCT/US00/08728、 Kulanthaivel等人于2000年4月14日提交的题为“假单胞菌素天 然产物(Pseudomycin Natural Products)”的PCT专利申请,其序 列号为PCT/US00/08727、以及US 5,576,298和5,837,685中,在此 将它们都引入作为参考。
产生一种或多种假单胞菌素的丁香假单胞菌分离菌株在本领域 为已知。
野生型菌株MSU 174和通过转座子诱变产生的该菌株突变体 MSU 16H(ATCC 67028),描述在US 5,576,298和5,837,685;Harrison 等人的“Pseudomycins,a family of novel peptides from Pseudomonas syringae possessing broad-spectrum antifungal activity,”J.Gen.Microbiology,137,2857-2865(1991); 以及Lamb等人的“Transposon mutagenesis and tagging of fluorescent pseudomonas:Antimycotic production is necessary for control of Dutch elm disease,”Proc.Natl.Acad.Sci. USA,84,6447-6451(1987)中。
适合生产一种或多种假单胞菌素的丁香假单胞菌菌株可以从包 括植物(例如大麦植物、柑橘植物和丁香植物)的环境源以及,例如土 壤、水、空气和灰尘的源分离。
优选菌株是从植物分离的。
从环境源 分离的丁香假单胞菌菌株可以称之为野生型。
正如本文所用的,“野 生型”是指天然存在于丁香假单胞菌正常菌群中的显性基因型(例如 在自然界中发现且不是通过实验室操作生产的丁香假单胞菌菌株或 分离物)。
与大多数生物体相同,所用的产假单胞菌素(丁香假单胞菌 菌株如MSU 174、MSU 16H、MSU 206、25-B1、7H9-1)的培养物的特 性易于变化。
因此,这些菌株的后代(例如重组体、突变体和变种) 可以通过本领域已知的方法获得。
丁香假单胞菌MSU 16H从the American Type Culture Collection,Parklawn Drive,Rockville,MD,USA是公众可得的, 其保藏号ATCC 67028获得。
丁香假单胞菌菌株25-B1、7H9-1和67 H1 于2000年3月23日保藏在the American Type Culture Collection 并且分别具有以下保藏号: 25-B1保藏号PTA-1622 7H9-1保藏号PTA-1623 67H1保藏号PTA-1621 丁香假单胞菌的突变体菌株也适合生产一种或多种假单胞菌 素。
正如本文所用的,“突变体”是指在菌株表型中突然可遗传的变 化,它可以是自发的或者通过已知诱变剂诱导的,例如辐射(例如紫 外线辐射或x-射线)、化学诱变剂(例如甲基磺酸乙酯(EMS)、二环氧 辛烷、N-甲基-N-硝基-N’-硝基鸟嘌呤(NTG)和亚硝酸)、位置特异性 诱变和转座子介导诱变。
产假单胞菌素的丁香假单胞菌突变体可以通 过用有效地产生突变体的量的诱变剂处理该细菌来生产,所示突变体 过量地生产一种或多种假单胞菌素、生产一种超过其它假单胞菌素的 假单胞菌素(例如假单胞菌素B)、或者在有利的生长条件下生产一种 或多种假单胞菌素。
尽管所用诱变剂的类型和数量可以变化,但是优 选方法是可系列地将NTG稀释到1-100μg/ml的水平。
优选突变体 是过量地产生假单胞菌素B并在最小限定的培养基中生长的那些。
为了以下所需特性:生长习性、生长培养基营养源、碳源、生长 条件、氨基酸需要等,可以对丁香假单胞菌的环境分离物、突变体菌 株和其它所需的丁香假单孢菌菌株经过选择。
优选选择在最小限定的 培养基例如N21培养基上生长和/或产生一种或多种量大于约10 μg/ml的假单胞菌素的产假单胞菌素的丁香假单胞菌菌株。
优选菌株 当在含有三种或更少氨基酸,任选含有脂类、马铃薯产品或其组合的 培养基上生长时,呈现产生一种或多种假单胞菌素的特性。
使用本领域中已知的方法,通过转化丁香假单胞菌菌株,可以培 育重组菌株。
除了这些菌株产生的抗生素之外,通过使用重组DNA技 术,可将丁香假单胞菌菌株转化而表达不同的基因产物。
例如,人们 可以修饰这些菌株,从而引入多重拷贝的内源假单胞菌素生物合成基 因,以获得更大的假单胞菌素产量。
为了从丁香假单胞菌野生型或突变体菌株生产一种或多种假单 胞菌素,该生物体在含有有效量的三种或更少氨基酸,优选谷氨酸、 甘氨酸、组氨酸或其组合的水性营养培养基中搅拌培养。
或者,将甘 氨酸与一种或多种的马铃薯产品和脂类组合。
在丁香假单胞菌能够有 效生长并产生所需假单胞菌素的条件下进行培养。
有效条件包括温度 为约22℃-约27℃,时间为约36小时-约96小时。
在丁香假单胞菌 的培养过程中控制培养基中的氧浓度对假单胞菌素的生产是有益 的。
优选氧水平保持在约5-50%饱和度,更优选约30%饱和度。
用空 气、纯氧或含有氧的气体混合物喷射可以调节培养基中的氧浓度。
在丁香假单胞菌的培养过程中控制培养基的pH也是有益的。
假 单胞菌素在碱性pH下不稳定,并且如果培养基的pH在约6以上持续 约12小时以上的时间,能够产生明显的降解。
优选培养基的pH保持 在6-4之间。
丁香假单胞菌当在分批培养物中生长时可以产生一种或 多种假单胞菌素。
然而,分批补加(fed-bath)或半连续加入葡萄糖 和任选,加入酸或碱(例如氢氧化铵)控制pH可以提高产量。
假单胞 菌素产量还可以使用自动加入葡萄糖和氢氧化铵的连续培养法来提 高。
丁香假单胞菌菌株的选择可以影响产生的假单胞菌素的量和分 布。
例如,菌株MSU 16H和67 H1各自主要产生假单胞菌素A,但是 还产生假单胞菌素B和C,其比例典型地为4∶2∶1。
菌株67 H1典型 地产生的假单胞菌素的量要比菌株MSU 16H所产生的高约3-5倍。
与 菌株MSU 16H和67 H1相比,菌株25-B1产生更多的假单胞菌素B 和更少的假单胞菌素C。
菌株7H9-1的特点是主要产生假单胞菌素B, 并且假单胞菌素B的产量比其它菌株的高。
例如,该菌株可以产生的 假单胞菌素B是假单胞菌素A或C的至少10。
可以通过本领域技术人员已知的任意不同方法将每种假单胞菌 素、假单胞菌素中间体及混合物检测、确定、分离和/或提纯。
例如, 肉汤培养基或分离物或提纯的组合物中的假单胞菌素或假单胞菌素 的活性水平可以通过抗例如假丝酵母属的真菌的抗真菌活性来确 定,并且可以通过高效液相色谱法分离和提纯。
可以将该假单胞菌素化合物分离出并且以本身或以其可药用的 盐或溶剂化物的形式使用。
术语“可药用的盐”是指由无机酸和有机 酸获得的非毒性酸加成盐。
适合的盐衍生物包括卤化物、硫氰酸盐、 硫酸盐、硫酸氢盐、亚硫酸盐、亚硫酸氢盐、芳基磺酸盐、烷基硫酸 盐、磷酸盐、磷酸一氢盐、磷酸二氢盐、偏磷酸盐、焦磷酸盐、链烷 酸盐、环烷基链烷酸盐、芳基链烷酸盐、己二酸盐、藻酸盐、天冬氨 酸盐、苯甲酸盐、富马酸盐、葡糖庚酸盐、甘油磷酸盐、乳酸盐、马 来酸盐、烟酸盐、草酸盐、棕榈酸盐、果胶酯酸盐、苦味酸盐、新戊 酸盐、琥珀酸盐、酒石酸盐、柠檬酸盐、樟脑酸盐、樟脑磺酸盐、二 葡糖酸盐、三氟乙酸盐等。
术语“溶剂化物”是指含有一个或多个溶质分子(即假单胞菌素 前药化合物)和一个或多个药用溶剂分子如水、乙醇等的聚集体。
当 溶剂为水时,该聚集体称之为水合物。
溶剂化物通常是通过将前药加 热溶解于适宜溶剂中并慢慢冷却产生非晶形或结晶溶剂化物形式来 形成的。
典型地将活性成分(即假单胞菌素衍生物)配制成提供易于控制 的药物剂量且给患者、医师或兽医一种高雅且易于操作的产品的药用 剂量形式。
制剂可以含有0.1%-99.9%wt的活性成分,更常规的是约 10%-约30%wt。
正如本文所用的,术语“单位剂量”或“剂量单位”是指含有经 计算产生所需治疗效果的预定量活性成分的物理离散单位。
当单位剂 量经口服或非肠道给药时,典型地以片剂、胶囊、丸剂、粉末包、局 部组合物、栓剂、糯米纸囊剂、安瓿或多剂量容器中的测定单元等的 形式提供。
或者,单位剂量可以可吸入或喷雾的干燥或液体气溶胶的 形式给药。
给药剂量可以根据动物的身体特性、动物病症的严重程度、和用 于给药的方式而变化。
给定动物的具体剂量经常由医师或兽医的判断 来确定。
适合的载体、稀释剂和赋形剂对本领域技术人员为公知并包括如 下物料:碳水化合物、蜡、水溶性和/或水膨胀性聚合物、亲水或疏 水材料、明胶、油、溶剂、水等。
所用的特定载体、稀释剂或赋形剂 将取决于活性成分的使用方式和目的。
制品还可以包括润湿剂、润化 剂、表面活性剂、缓冲剂、增强剂、填充剂、稳定剂、乳化剂、悬浮 剂、防腐剂、甜味剂、香味剂、调味剂及其组合。
药用组合物可以使用各种方法给药。
适合的方法包括局部(例如 软膏或喷雾剂)、口服、注射和吸入。
所用的具体处理方法将取决于 治疗的感染的类型。
当非肠道静脉应用时,在给药之前,这些制品典型地经过稀释或 重新配制(如果经过冻干的话),如果需要的话进一步稀释。
冻干产品 的重新配制说明的例子是将10ml注射用水(WFI)加入到小瓶中并轻 轻搅拌溶解。
典型重新配制时间低于1分钟。
然后在给药之前,将所 得溶液进一步稀释于输液如5%葡萄糖的水(D5W)中。
假单胞菌素化合物已显示具有抗真菌活性,例如包括抑制以下的 传染性真菌的生长:假丝酵母属各种(即白色念珠菌(C.albicans)、 近平滑假丝酵母(C.parapsilosis)、克鲁丝氏假丝酵母(C. krusei)、光滑假丝酵母(C.glabrata)、热带假丝酵母(C. tropicalis)或葡萄牙假丝酵母(C.lusitania));球拟酵母属各种 (即光滑球拟酵母(T.glabrata);曲霉属各种(即烟曲霉(A. fumigatus));组织胞浆菌属各种(即荚膜组织胞浆菌(H. capsulatum));隐球酵母属各种(即新型隐球酵母(C. neoformans));芽生菌属各种(即皮炎芽生菌(B.dermatitidis)); 镰孢属各种;发癣菌属各种、Pseudallescheria boydii、粗球孢子 菌、申克氏孢子丝菌等。
所以,本发明的化合物和制剂在制备可用于对抗全身性真菌感染 或者真菌皮肤感染的药物中有用。
因此,提供了一种抑制真菌活性的 方法,该方法包括将本发明的化合物I与真菌接触。
优选方法包括抑 制白色念珠菌、新型隐球酵母或烟曲霉活性。
术语“接触”包括本发 明化合物与真菌的结合或接合,或者表面接触或相互接触。
该术语对 该方法没有赋予任何其它限制,例如通过抑制机理。
这些方法定义为 包含通过这些化合物的作用及其内在抗真菌性能抑制真菌的活性。
还提供了一种治疗真菌感染的方法,包括对需要这种治疗的宿主 动物给药有效量的本发明药物制剂。
优选方法包括治疗白色念珠菌、 新型隐球酵母或烟曲霉感染。
术语“有效量”是指能够抑制真菌活性 的活性化合物的量。
给药剂量随例如以下因素而变化:感染的性质和 严重程度、宿主的年龄和总体健康状况、宿主对抗真菌剂的耐受性和 宿主的种类。
具体剂量方案同样可以根据这些因素而变化。
药物可以 单一日剂量或在一天期间的多次剂量的方式施用。
该方案可以从约 2-3天延续至约2-3周或更长。
典型的日剂量(以单一或均分剂量给 药)含有约0.01mg/kg-100mg/kg体重的活性化合物的剂量水平。
优选日剂量通常为约0.1mg/kg-60mg/kg,更优选为约2.5mg/kg-40 mg/kg。
宿主可以是任何动物,包括人、宠物(例如狗、猫和马)、食 物源动物(例如牛、猪、羊和家禽)、动物园动物、海洋动物、鸟类和 其它类似的动物种类。
                        实施例 除非另有说明,所有化学试剂购自Aldrich Chemical(Milwaukee, WI)。
                     生物样品 丁香假单孢菌MSU 16H是从美国典型培养物保藏中心(American Type Culture Collection),Parklawn Drive,Rockville,MD,USA 公众可得的,保藏号为ATCC 67028。
丁香假单孢菌菌株25-B1,7H9-1 和67 H1于2000年3月23日保藏于美国典型培养物保藏中心,保藏 号如下: 25-B1保藏号为PTA-1622 7H9-1保藏号为PTA-1623 67H1保藏号为PTA-1621 化学缩写 在所用实施例中用下列缩写表示分别列出的材料: ACN-乙腈 TFA-三氟乙酸 DMF-二甲基甲酰胺 DEAD-二乙基偶氮二甲酸酯 EDCI-1-[3-(二甲基氨基)丙基]-3-乙基碳化二亚胺盐酸盐 BOC=叔丁氧基羰基,(CH3)3C-O-C(O)-CBZ=苄基氧基羰基,C6H5CH2-O-C(O)     FMOC=芴基甲基氧基羰基                    HPLC条件 除非另有说明,分析反相HPLC操作是用装配着Waters μBondapak(C18,3.9×300mm)柱的Waters 600E系统进行的。
所 用的洗脱剂是65∶35乙腈/0.1%TFA水溶剂体系-100%乙腈(用20 分钟),流速是1.5ml/分钟,并在230nm使用UV检测。
制备HPLC处理是用采用Dynamax 60埃C18柱的Waters Prep 2000系统进行的,其中使用与分析HPLC系统相同的溶剂体系,但是 流速为40ml/分钟。
                   生物分析 抗真菌活性的检测和定量测定: 通过使用标准琼脂稀释测试或圆盘展开测试获得化合物的最小 抑制浓度(MIC)来在体外测定抗真菌活性。
在抗真菌活性测试中使用 的典型真菌是白色念珠菌。
当测试样本(50μl)对接种到琼脂板上的 白色念珠菌的抑制引起10-12mm直径区域时认为有显著抗真菌活 性。
尾静脉毒性: 在第0、24、48和72小时,用0.1ml测试化合物(20mg/kg) 经由侧尾静脉静脉内(IV)给药来治疗小鼠。
每组包括2只小鼠。
将化 合物配制在0.5%葡萄糖和无菌注射用水中。
首次治疗后监测小鼠7 天,并仔细观察包括红斑、肿胀、变色、坏死、尾损失在内的刺激征 状以及表明毒性的其它副作用征状。
在该实验中使用的小鼠是远系繁殖的,雄性ICR小鼠的平均体重 为18-20g(得自Harlan Sprangue Dawley,Indianapolis,IN)。
                    一般方法 用于在假单胞菌素A、A’、B、B’、C或C’的2、4和5位保护侧链氨 基的一般方法 将假单胞菌素化合物(R1=H)溶解/悬浮于DMF中(20mg/ml, Aldrich Sure Seal)。
在室温、搅拌下加入N-(苄基氧基羰基氧基) 琥珀酰亚胺(6eq),在室温下搅拌32小时,通过HPLC(4.6×50mm, 3.5μm,300-SB,C8,Zorbax column)监测反应。
在室温、高真空 下旋转蒸发至10ml,将该物料冷冻直至准备好色谱制备。
经反相制 备HPLC并冷冻干燥后得到无定型、白色固体。
用于L-丝氨酸单元N-酰基化学去酰化的一般方法。
将保护的假单胞菌素A溶解/悬浮于水/乙腈(2∶1 H2O∶ACN,约 3.5mg/ml)中并在室温下慢慢加入TFA(8%体积)。
在室温下搅拌反 应直到原料消耗完。
在室温、真空下除去乙腈并冷冻干燥物料。
将 得到的固体溶于少量DMF(若需要,加水,然后加入等量的ACN)中, 经制备HPLC和冷冻干燥后一般得到白色、无定型固体(可能为TFA 盐)。
假单胞菌素核用HOBt树脂的固相酰化。
下列实施例用十四烷酸;然 而对于其它的有机酸,也可用同样的一般方法。
在一100ml两端玻璃烧结的反应管中,将十四烷酸(1.03g, 3.62mmol)溶于50ml 1∶1 DMF/THF中。
向这一溶液中加入树脂HOBt (1.94g,2.9mmol)和EDCI(0.556g,2.9mmol)并震摇过夜。
排 掉溶剂,树脂用2xDMF、2xTHF和2x 1∶1DMF/THF洗涤。
将CBZ-保 护的假单胞菌素核(1.0克,0.723mmol)溶于50ml DMF/THF(20 mg/ml)中,并加到该树脂结合的活化酯中并在旋转器或震摇器上混合 过夜。
将产物与树脂分开并用2xDMF、2xTHF和2x 1∶1 DMF/THF洗 涤剩余树脂。
合并的滤液经反相HPLC分离并冷冻干燥得到(129mg, 10%)十四烷酰基酰化的CBZ-保护的假单胞菌素产物。
假单胞菌素核用活化酯(HOBt-甲磺酸酯)的酰化。
下列实施例用甘氨 酸十四烷酸,然而对于其它有机酸也可使用该一般方法。
在一500ml圆底烧瓶中,将甘氨酸十四烷酸(0.309g,1.1mmol) 溶于100ml DMF中。
向该溶液中加入HOBt-甲磺酸酯(0.229g,1.1 mmol)和三乙胺(0.081g,0.8mmol)。
在1atm N2下快速搅拌该溶液 过夜,在高真空下干燥除去DMF和TEA。
残余油状物用甲苯共沸蒸馏 3次直到形成白色固体。
向该固体中加入100ml DMF和1g CBZ-保 护的假单胞菌素核。
搅拌溶液过夜并在高真空下干燥。
产物经反相 HPLC纯化并冷冻干燥得到(233mg,20%)十四酰基酰化的CBZ-保护 的假单胞菌素产物。
用于经氢化在2、4和5位侧链氨基去保护的一般方法 将CBZ-保护的活化衍生物溶于冷的13%乙酸/甲醇溶液(5mg/ml) 中并加入当量的10%Pd/C。
通过脱气并用H2置换体积4-7次向反应 中充氢气。
在室温下进行反应,用HPLC和质谱仪每15分钟监测反 应一次直到原料消耗完。
当反应完成后,除去气囊并用0.45μm的滤 片(Acrodisk GHP,GF by Gelman)过滤反应液,浓缩到约1/10体积 并用制备HPLC纯化,冷冻干燥含有产物的级分。
制备 侧链前体(1c)的制备 向含有100ml脱气ACN的250ml圆底烧瓶中加入间-溴苯甲醛 (5.000g,27.02mmol)、三乙胺(5.490g,54.25mmol)和1-十二 炔(5.000g,30.06mmol)。
向该混合物中加入PdCl2(243.1mg, 1.370mmol)、三苯膦(718.8mg,2.740mmol)和CuI(173.8mg, 0.9120mmol)。
然后加热回流并反应过夜。
然后将反应液冷至室温并 在真空下除去溶剂,得到的残余物用二氯甲烷处理并用2×1N HCl和1X盐水洗涤。
有机层用MgSO4干燥。
滤出干燥剂,在真空下除去 溶剂,经硅胶柱色谱纯化并用3%EtOAc/己烷洗脱得到3.73克棕色 油状标题化合物。
光谱数据与间-(l-十二炔基)苯甲醛(la)的结构一 致。
向100 mL EtOAc中加入上述化合物(1.00g,3.70mmol)和0.1 g 5%Pd/Al2O3
在室温、50psi的H2下处理反应混合物1小时。
反 应混合物经硅藻土过滤以除去催化剂,硅藻土用大量的EtOAc漂洗。
经旋转蒸发仪除去EtOAc得到882.1mg的产物。
该产物未经进一 步纯化用于下一步。
光谱数据与间-十二烷基苯甲醛(lb)一致。
在氮气氛、-78℃下,向烤箱干燥过的50ml圆底烧瓶中加入6.0 ml无水THF并随后加入二异丙基氨化锂(1.2mL 2M的庚烷/THF/乙 基苯溶液,2.41mmol)。
向其中加入乙酸叔丁酯(0.331ml,2.45mmol) 并将得到的溶液升温到约-40℃并在此温度下保持1小时。
然后向该 阴离子中滴加上述化合物(501.9mg,1.83mmol)溶于4mL无水THF 并预冷至-40℃的溶液。
搅拌反应混合物1小时,然后用2ml饱和的 氯化铵水溶液和10ml水终止反应。
将反应混合物在乙醚和水之间分 配,有机层用盐水洗涤一次并用硫酸钠干燥。
滤出干燥剂,在真空下 除去溶剂,经硅胶柱色谱纯化,用5%EtOAc/己烷洗脱得到238.1mg 黄色油状物。
光谱数据与3-羟基-3-(间十二烷基苄基)丙酸叔丁酯 一致。
将预冷的(0℃)4ml TFA溶液加到含有粗品3-羟基-3-(间十二 烷基苄基)丙酸叔丁酯的50ml圆底烧瓶中。
在这一温度下搅拌反应 25min,TLC(10%EtOAC/己烷)显示原料酯完全消耗。
在真空下除 去TFA得到油状物(1c)。
侧链前体(2c)的制备: 化合物2a用与上述合成化合物1a相同的方法,用1-辛炔代替 1-十二炔合成。
化合物2b和2c分别用与上述合成1b和1c相同的方 法合成。
侧链前体(3b)的制备: 向含有100mL丙酮的500mL圆底烧瓶中加入间羟基苯甲醛 (5.00g,40.94mmol)、1-溴十一烷(9.65g,41.02mmol)和 K2CO3(8.48g,61.36mmol)。
加热反应混合物至回流并反应10小时。
将反应冷却并在真空下除去丙酮。
得到的残余物在醚/水之间分配, 有机层用饱和NaHCO3水溶液洗涤两次并用盐水洗涤一次。
有机层用 MgSO4干燥,然后滤出干燥剂并在真空下除去溶剂,在硅胶柱上纯化, 用3%EtOAc/己烷洗脱得到1.6876黄色油状物。
光谱数据与化合物 3a一致,然后该醛通过用与制备1c描述的相同方法制备化合物3b。
侧链前体(4c)的制备: 除化合物1a在与乙酸叔丁酯缩合前不氢化外,用与上述合成化 合物1c的相同方法合成化合物4a。
在50ml圆底烧瓶中加入3-羟基-3-(间十二炔基苄基)丙酸叔丁 酯4a(346.8mg,0.897)并溶于10ml MeOH/1mL冰AcOH中。
用10% Pd/C(304.5mg)标准氢化24h,通过过滤除去催化剂,在真空下除 去溶剂得到302.4mg 3-(间十二烷基苄基)丙酸叔丁酯,然后用TFA 处理除去叔丁酯得到化合物4b。
侧链前体(5a)的制备: 在-78℃下,向含有5mL THF的50ml圆底烧瓶中加入仲丁基锂 (1.56mmol,1.2mL 1.3M的环己烷溶液)。
向这一混合物中滴加 入溴异丁酸叔丁酯(在-78℃的2ml THF中),搅拌反应30min,然 后向反应混合物中滴加化合物1b(318.9mg,1.16mmol在2ml THF 中,-78℃)。
在-78℃搅拌得到的反应混合物30min,然后在30min 以上时间升温至0℃并在该温度下搅拌1.75小时,然后用2ml饱和 氯化铵水溶液终止反应并温热至室温。
该反应混合物在乙醚/水之间 分配并且有机层用盐水洗涤一次并用MgSO4干燥。
然后滤出干燥剂并 在真空下除去溶剂得到370.5mg粗品,为外消旋混合物。
然后用TFA 除去该叔丁基酯得到化合物5a。
侧链前体(6a)的制备: 向含有100mL MeOH和1mL浓H2SO4的250mL圆底烧瓶中加入 间溴对甲氧基苯甲酸(5.00g,21.6mmol)。
加热所得到的混合物至 回流并维持24小时。
冷却反应液并在真空下除去溶剂,将得到的固 体用乙醚处理,有机层用水洗涤两次,用饱和NaHCO3水溶液和盐水 各洗涤一次并用MgSO4干燥。
然后滤出干燥剂并在真空下除去溶剂得 到4.72g粗品,该粗品未经进一步纯化使用。
然后该产物与1-十四 炔缩合并经过氢化得到与前面实施例类似的烯烃。
该甲酯经下列步骤 转换成甲酸:将甲酯(538.4mg,1.48mmol)悬浮于20ml 30%HBr的AcOH溶液中并加热回流,回流24h后将该溶液倒入150ml水中 并用2×200ml CH2Cl2萃取。
有机相用大量的水洗涤并用MgSO4干燥, 然后滤出干燥剂并在真空下除去溶剂得到398.7g粗品6a,其未经进 一步纯化使用。
侧链前体(7a)的制备: 将化合物6a(385.2mg)加到盐酸吡啶鎓固体中。
加热两固体 至~220℃熔融并维持混合物反应3小时,然后将反应物冷却并在 CH2Cl2/1N HCl之间分配。
有机相然后用1N HCl洗涤5次并用MgSO4干燥,然后滤出干燥剂并在真空下除去溶剂得到158.8mg粗品(7a), 其未经进一步纯化使用。
侧链前体(8b)的制备: 在250ml圆底烧瓶中加入在60mL甲苯/30mL 2 M Na2CO3水溶 液中的联苯基硼酸(2.00g,10.1mmol)和Pd(PPh)4(980.0mg, 0.848mmol)。
向该浆状物中加入间溴苯甲醛(在10mL MeOH中)。
加热反应混合物至回流并维持反应20h。
冷却反应物,有机层用水 洗涤两次,盐水洗涤一次并用用MgSO4干燥,然后滤出干燥剂并在真 空下除去溶剂。
得到的固体用冷的己烷漂洗除去任何残留的间溴苯甲 醛,然后在热己烷中搅拌该固体浆化,并热过滤除去所有固体。
滤液 在真空下除去溶剂得到目的醛8a。
用在制备1c描述的相同方法将 化合物8a转化成8b得到不可分离的非对映异构体。
侧链前体(9a)的制备: 将乙酸叔丁酯(2.02ml,0.015mol)的无水THF(25ml)溶液冷 至-78℃并滴加正丁基锂(1.6M在己烷中)(9.35ml,0.015mol)。
45min后滴加2-十三烷酮(2.0g,0.01mol)的THF溶液,继续在 低温下搅拌1小时,然后在15min以上将反应物温至室温。
加入过量 的1N HCl终止反应,水溶液用乙醚萃取(2x),乙醚层用MgSO4干燥 并在真空下浓缩得到粗品油状物。
经硅胶柱色谱纯化(5%乙酸乙酯/ 己烷)得到1.01g(收率32%)叔丁基酯。
NMR与目的产物一致。
然 后用三氟乙酸处理叔丁酯将叔丁酯分解定量得到化合物9a。
侧链前体(10e)的制备: R=n-C5H11在室温下,向间羟基苯甲醛(1.00g,8.20mmol)的THF溶液 (16mL)中加入DEAD(1.29mL,8.20mmol)、PPh3(2.15g,8.20mmol) 和正戊醇(723mg,8.20mmol)。
在室温下搅拌混合物过夜,用硅胶 纯化后得到1.02g(65%)目的产物10a。
在0℃下,向10a(6.70g,34.90mmol)的THF溶液中加入 Ph3P=CHO(10.6g,34.90mmol)。
在室温下搅拌过夜后,过滤反应 混合物并在真空下浓缩得到残余物,经硅胶色谱纯化得到3.57g (47%)目的不饱和醛10b。
用10%Pd/C(1.64g,1.55mmol)氢化(1.5atm)10b(3.37g, 15.5mmol)的EtOAc溶液(30mL)。
搅拌反应液过夜,经过Celite 板过滤反应混合物。
在真空下浓缩滤液和漂洗液,残余物经硅胶柱色 谱纯化(10%EtOAc/己烷)得到2.37g(70%)10c。
在0℃下,向醛10c(1.26g,5.71mmol)的二氯甲烷溶液(23mL) 中加入烯丙基三甲基甲硅烷(0.91mL,5.71mmol),随后加入TiCl4(0.63mL,5.71mmol)。
在0℃下搅拌1小时后,用饱和的NaHCO3溶液终止反应,用二氯甲烷(75mL)稀释该混合物,有机层依次用饱 和NaHCO3、水和盐水洗涤。
有机层经干燥、浓缩并经硅胶色谱纯化(10% EtOAc/己烷)得到0.91g(61%)目的烯丙基醇10d。
将烯丙基醇10d(0.91g,3.47mmol)溶于丙酮水溶液(各7mL) 中,并向该溶液中加入NMO(704mg,5.21mmol)和OsO4(44mg,0.17 mmol)的THF溶液。
在室温下搅拌2小时后,用NaHSO3(750mg)终 止反应以终止过量的氧化剂。
反应混合物经盐水(10mL)稀释并用 EtOAc(3×50mL)萃取,合并的有机层经干燥并在真空下浓缩得到 850mg(82%)目的三醇中间体。
将如此得到的三醇(850mg,2.87mmol) 溶于MeOH(30mL)和水(6mL)中,在室温下用NaIO4(1.38g,6.46 mmol)处理该溶液,1小时后,反应混合物经Celite板过滤,在真空 下小心浓缩滤液得到相应的β-羟基醛。
将该醛溶于t-BuOH(14mL) 和环己烷(2mL)中,向该溶液中加入含有KH2PO4(2.33g,17.7mmol) 和NaClO2(2.08g,23.0mmol)的水(15mL H2O)溶液,在室温下搅 拌反应5小时,然后用1N HCl酸化至pH=3,反应混合物用EtOAc(3 ×50mL)萃取,合并的有机相用水和盐水洗涤。
有机层经干燥并在真 空下浓缩得到粗品酸10e(1.5g,~3.4mmol)。
用上述相同方法也可制得其中R为n-C6H13、n-C7H15、n-C8H17、 n-C9H19、n-C10H21和n-C14H29的化合物。
侧链前体(11d)的制备: 在-78℃下,向手性缩醛11a(6.22g,19.1mmol)的二氯甲烷 溶液(190mL)中加入三甲基烯丙基硅烷(10.9mL,68.69mmol),然 后加入纯的TiCl4(2.94mL,26.71mmol)。
在-78℃搅拌反应混合 物1小时,然后在-40℃搅拌2小时,此时用甲醇(15mL)终止反应并 用二氯甲烷(200mL)稀释,得到的反应混合物用1N HCl(2×50mL)、 水和盐水洗涤,有机层经干燥并在真空下浓缩得到残余物,其用硅胶 色谱(10%EtOAc/己烷)纯化得到5.51g(78%)目的产物11b。
11a的1H NMR(CDCl3):δ4.73(m,1H),4.21(m,1H),3.86(m, 1H),1.75(m,1H),1.60-1.10(m,35H),0.80(m,3H)。
11b的 1H NMR(CDCl3):δ5.81(m,1H),5.05(m,2H),4.12(m,1H), 3.86(m,1H),3.41(m,1H),2.22(m,2H),1.67-1.18(m,36H), 0.88(m,3H)。
向11b(8.56g,23.3mmol)的二氯甲烷溶液(155mL)中加入 PCC(10.0g,46.5mmol)。
在室温下搅拌反应18小时,然后经过 Celite板过滤。
在真空下浓缩滤液得到微红色残余物,经硅胶色谱 纯化(10%EtOAc/己烷)得到8.36g(80%)甲基酮中间体(结构未给 出)。
将这里得到的中间体(8.36g,22.8mmol)溶于THF(60mL) 和MeOH(30mL)中,向该溶液中加入7.5M KOH(15mL),在室温下 搅拌3小时后,除去部分溶剂,剩下的反应混合物用EtOAc/Et2O(比 例3∶1,350mL)稀释。
有机层用水(3×50mL)和盐水洗涤,得到 的有机层经干燥并在真空下浓缩得到残余物,其经硅胶色谱(10% EtOAc/己烷)纯化得到6.22g(96%)目的产物11c,为白色固体。
11c的1H NMR(CDCl3):δ5.75(m,1H),5.06(m,2H),3.56(m, 1H),2.23(m,1H),2.07(m,1H),1.75-1.17(m,28H),0.80(m, 3H)。
将甲醇11c(6.22g,22.0mmol)溶于THF水溶液(5.5mL水和 55mL THF),向该溶液中加入NMO(4.42g,33.0mmol),随后加 OsO4(280mg溶于THF中,1.10mmol)。
在室温下搅拌反应过夜,此 刻,加入二硫化钠(4g),搅拌反应2小时,然后用EtOAc(300mL) 稀释,全部混合物用水(2×40mL)和盐水洗涤,得到的有机层经干 燥并在真空下浓缩得到相应的三醇中间体。
将其溶于MeOH(200mL) 和水(40mL)中,向该溶液中加入NaIO4(10.6g,49.5mmol),在室 温下搅拌1小时后,经Celite过滤反应混合物并用短硅胶柱色谱纯 化(30%EtOAc/己烷)得到~10g(>100%)的粗品β-羟基醛。
将这 一得到的不纯醛溶于t-BuOH(100mL)和环己烷(14mL)中,在室温 下向该溶液中加入NaClO2(15.97g,176mmol)和KH2PO4(17.8g, 132mmol)的(50mL)水溶液。
在室温下搅拌反应6小时,然后在0 ℃下用5N HCl终止反应到pH4。
用3∶1的EtOAc/Et2O混合溶剂(3× 250ml)萃取,有机层用盐水洗涤、干燥并浓缩得到7.3g(>100%)的粗 品酸11d,其直接用于偶合反应。
11d的1H NMR(CDCl3):δ3.95(m,1H),2.60-2.35(m,2H), 1.40-1.10(m,28H),0.82(m,3H)。
侧链前体(12c)的制备: 在1升的圆底烧瓶中加入在600ml无水MeOH中的十三烷醛 (5.00g,25.2mmol)和Gly-Ome的盐酸盐(12.66g,100.8mmol)。
向该反应混合物中加入NaCNBH3(1.787g,28.44mmol)并在室温下 搅拌反应过夜。
滤出固体并在真空下除去溶剂,所得残余物在CH2Cl2/ 饱和NaHCO3水溶液之间分配。
有机层用NaHCO3溶液洗涤2次并用 MgSO4干燥,然后滤出干燥剂并在真空下除去溶剂,在硅胶柱上纯化, 用50%EtOAc/己烷洗脱得到2.94g白色固体(12a)。
在50ml圆底烧瓶中加入在10ml无水THF中的甘氨酸衍生物 12a(504.6mg,1.86mmol)、三乙胺(224.6mg,2.22mmol)。
向 其中一次加入(BOC)2O(494.3mg,2.26mmol),搅拌反应18小时, 然后在真空下除去溶剂,所得油状物用EtOAc处理并用1N HCl洗两 次,用水和盐水各洗一次并用MgSO4干燥,然后滤出干燥剂并在真空 下除去溶剂得到463.3mg无色油状物(12b),其未经纯化使用。
向含有5ml THF的50ml圆底烧瓶中加入甲酯12b(463.3mg, 1.25mmol),向其中加入1.8ml 1N LiOH溶液,搅拌得到的反应混 合物过夜。
加入1.8ml 1N HCl溶液终止反应,然后在真空下除去 THF并用CH2Cl2萃取得到的水层2次。
有机相用MgSO4干燥,然后滤 出干燥剂并在真空下除去溶剂得到246.2mg无色油状物(12c),其 未经纯化使用。
侧链前体(13a)的制备: 在50mL圆底烧瓶中,将上面得到的甲酯12b(499.7mg/1.84 mmol)溶于1∶1乙酐/吡啶混合物中,搅拌反应过夜。
然后在真空下 除去溶剂,得到的油状物用CH2Cl2处理并用1N HCl洗涤2次,用水 和盐水各洗涤1次并用MgSO4干燥,然后滤出干燥剂并在真空下除去 溶剂得到319.9mg无色油状物(13a),其未经纯化使用。
甘氨酸侧链前体(14-a)的一般制备: 例如下列方法描述用Fmoc-甘氨酸-wang树脂和十三烷酸合成十 三烷酰基-甘氨酸。
在一两端玻璃封端的100mL反应管中,将Fmoc-甘氨酸-wang树 脂(10g,4.4mmol)加到50mL 30%哌啶/DMF中,震摇反应20分钟 并用DMF洗涤3次,用异丙醇洗涤3次,再用DMF洗涤3次。
向树脂 中加入十三烷酸(4.708g,22mmol)的50mL DMF溶液并向这一混合 物中加入HOBt(2.97g,22mmol)和DIC(2.77g,22mmol)。
将反 应器置于振荡器上过夜。
然后用下列溶剂洗涤树脂:DMF 3次,二氯 甲烷3次,MeOH 3次,THF 3次和二氯甲烷3次。
在真空炉中干燥树 脂珠1小时,向树脂中加入100 mL 95%的TFA/H2O,震摇反应1.5小 时并用TFA洗涤非-树脂产物并收集。
在真空炉中干燥得到白色残余 物,用甲苯共沸蒸馏得到十三烷酰基-甘氨酸(1.14g,95%)1H NMR (THF)0.82-0.92(t,J=7.2,3H),1.2-1.4(s,18H),1.52-1.62 (m,2H),2.10-2.17(t,J=7.2,2H),3.83-3.89(d,J=7.1,2H), 7.04-7.17(s,1H),10.8-10.9(s,1H)。
下述结构II用于描述在实施例1-17中得到的产品。
                    实施例1 非对映异构体1-1和1-2的合成: 将羟基苯并三唑(55.8mg,0.413mmol)和1-[3-(二甲基氨基) 丙基]-3-乙基碳化二亚胺盐酸盐(82.4mg,0.430mmol)加到化合 物1c的4ml无水DMF中。
在室温下搅拌反应混合物反应10小 时,此后加入Z-PSN(375.2mg,0.271mmol)。
5小时后HPLC显 示CBZ-保护的假单胞菌素核(Z-PSN)消耗完。
在真空下除去溶剂并 用1∶1 ACN/H2O处理得到的残余物并经制备HPLC纯化,这样得到2 个较大的峰,其质谱表明这些峰相应于2个非对映异构体1-1(88.3 mg)和1-2(166.3mg)。
非对映异构体1-1的去保护: 在一50ml圆底烧瓶中加入10ml MeOH/1ml冰AcOH和非 对映异构体1-1(82.0mg,0.048mmol),脱气后向反应混合物加 入89.1mg 10%Pd/C并在1atm H2氢化30分钟。
经过滤除去催 化剂后经制备HPLC纯化并冷冻干燥得到21.7mg化合物1-3( R1=H)。
MS(Ionspray)对于C58H94ClN12O19(M+H)+计算值为1297.64,实 验值为1297.8。
非对映异构体1-2的去保护: 如对于非对映异构体1-1所述用152.8mg的10%Pd/C氢化非 对映异构体1-2(152.8mg,0.089mmol)30分钟,HPLC显示原料 完全消耗并形成两个产物峰,经制备HPLC纯化并冷冻干燥后得到化 合物1-4(18.0mg)和化合物1-5(11.3mg)。
化合物1-4:MS (Ionspray)对于C58H94ClN12O19(M+H)+计算值为1297.89,实验值为 1297.8。
化合物1-5:MS(Ionspray)C58H92ClN12O18(M+H)+计算值为 1279.63,实验值为1281.7。
下表1中所列的化合物是用与上述相同的酰化和去保护方法,用 标出的侧链前体合成的。
对于表1中列出的每一化合物,R1为氢。
表1 *虽然该化合物和无N-甲基的化合物表现出很低的活性,但其中烷 基链连续从C11增加到C15的化合物,其活性明显升高。
这一类侧链 可通过在14-a的制备中描述的制备方法制备。
                  实施例15 化合物15-1的合成: 向50ml圆底烧瓶中加入31.3mg(0.0237mmol)化合物12-1 和5ml TFA(预冷至0℃)。
在该温度下搅拌该反应混合物15min, 在真空下除去TFA,然后用水处理残余物并冷冻干燥得到24.3mg化 合物15-1。
不需要进一步纯化。
                  实施例16 实施例16说明β-氨基取代的侧链的连接 化合物16a、16b、16c和16d的制备: 加热叔丁氧基羰基亚甲基三苯基正膦(5.0g,13.3mmol)和十 二醛(2.2ml,10mmol)的甲苯(50ml)溶液回流1小时20分钟。
经 硅胶塞过滤该溶液以除去磷试剂,然后在真空下浓缩得到粗品油状 物,该油状物经硅胶柱纯化,用2%的乙酸乙酯的己烷溶液洗脱得到 2.36g(收率84%)的化合物16a。
MS-283.4(M+1)NMR与结构 一致。
在-78℃下,将丁基锂(1.6M在己烷中)(1.19ml,1.9mmol) 慢慢加到(R)-苄基甲基苄基胺(0.42ml,2.0mmol)的THF(5ml)溶 液中,然后滴加16a(500mg,1.77mmol)的THF溶液。
在-78℃下 搅拌混合物1小时,然后将反应混合物倒到饱和的NH4Cl溶液中并 用乙醚萃取(2x)。
乙醚溶液用MgSO4干燥并在真空下浓缩得到0.95g 16b,为粗品油状物,该油状物不用纯化用于下一步。
在55℃下,将16b(0.95g)的乙醇(25ml)溶液和Pd(OH)2/C(0.47g)置于60psi H2下18小时。
过滤悬浮液,然后在真空下浓 缩得到280mg(收率53%)粗品16c,其直接用于下一步。
在THF(10ml)中混合化合物16c(280mg,0.93mmol)和N-苄 基氧基羰基氧基琥珀酰亚胺(274mg,1.1mmol)并搅拌过夜。
在 真空下除去溶剂并将油状产物经硅胶柱色谱纯化,用5%乙酸乙酯的 己烷溶液作为洗脱剂得到268mg(收率66%)的叔丁基酯16d。
NMR 与目标结构吻合。
在0℃下,将该酯(97mg,0.224mmol)溶于三 氟乙酸(2ml)中0.5小时按定量收率除去叔丁基酯(16d)。
化合物16-1的合成: 将化合物16d溶于DMF(2ml)中,加入羟基苯并三唑(36.4mg, 0.269mmol)和1-[3-(二甲基氨基)丙基]-3-乙基碳化二亚胺盐酸 盐(47.1mg,0.246mmol)并搅拌该溶液18小时。
加入CBZ保护的 假单胞菌素核(Z-PSN)(277mg,0.185mmol)并再搅拌反应18 小时。
反应产物经HPLC纯化并冷冻干燥得到136.3mg(收率42%) 酰化的CBZ保护的假单胞菌素衍生物,为白色固体。
MS-1743(M) 并且NMR与预定结构一致。
将酰化的化合物(130mg,0.0746mmol)的甲醇(10ml)和乙酸 (1.5ml)溶液与10%Pd/C(120mg)置于氢气囊下20分钟。
过滤该 溶液并用制备HPLC纯化,冷冻干燥得到23mg(收率18%)16-1 的三氟乙酸盐,为白色固体。
MS-1206.8(M)并且NMR与预定结构一 致。
化合物16-1抗白色念珠菌和新型隐球酵母活性很低或无活性, 与羟基类似物相比,其活性显著降低。
                实施例17 实施例17说明手性侧链的连接 侧链前体17d的制备: 向(S)-联萘酚(240mg,0.84mmol)的THF溶液中加入4A分 子筛(4g),然后加入纯的Ti(OPr-I)4(0.25mL,0.84mmol)。
反应混合物很快变红并保持红色,将由此制备的手性催化剂(17b)用 于以下反应。
在-78℃下、15分钟以上,向新制的(S)-联萘酚-Ti催化剂 17b(0.42mmol)的THF溶液(4mL)中加入含有三甲基甲硅烷基二甲 基乙烯酮缩醇(trimethylsilyldimethylketene acetal)(0.43mL, 2.1mmol)和不饱和醛17a(500mg,2.1mmol)的THF溶液。
在- 78℃下搅拌反应1小时,然后在室温下搅拌过夜。
用饱和NaHCO3溶 液终止反应并用EtOAc(100mL)萃取。
有机层用NaHCO3、盐水洗涤 并用无水MgSO4干燥,过滤并在真空下浓缩,残余物用硅胶柱色谱 纯化(10%EtOAc/己烷)得到257mg(36%)目的产物17c。
17c的1H NMR(CDCl3):δ5.29(m,2H),3.65(s,3H),3.53(t, J=7.3Hz,1H),2.33(d,J=6.3Hz,1H,3’-OH),1.97(m, 4H),1.65-1.22(m,20H),1.13(s,3H),1.12(s,3H),0.84(m, 3H)。
用NaOH水溶液(0.30mL,5N,1.52mmol)处理17c(259mg,0.76 mmol)的THF溶液(5mL),在50℃加热反应过夜。
将反应混合物冷 至0℃并用5N HCl酸化到pH=3,然后用EtOAc(75mL)萃取,有 机层用水和盐水洗涤,干燥并在真空下浓缩得到222mg(90%)粗品 酸17d,其直接用于侧链偶联反应。
17d的1H NMR(CDCl3):δ5.28(m,2H),3.56(m,1H),1.95(m, 4H),1.60-1.10(m,26H),0.83(m,3H)。
17-1和17-2的制备: 在室温下,用HOBt(90.5mg,0.67mmol)和EDCI(128mg,0.67 mmol)处理粗品酸17d(240mg,0.74mmol)的THF溶液(7mL)。
搅拌1.5小时后加入DMAP(41mg,0.33mmol)。
再搅拌2小时 后加入在DMF(4mL)中的CBZ-保护的假单胞菌素核(614mg,0.44 mmol)并在室温下搅拌反应过夜。
反应混合物经制备HPLC纯化,冷 冻干燥得到(160mg,21%)目的产物。
在0℃下,用TMSI(77mg,0.38mmol)处理CBZ-保护的化合 物(53.4mg,0.032mmol)的乙腈溶液(2mL)。
100分钟后,用1∶1 CH3CN/H2O终止反应,得到的反应混合物经反相制备HPLC纯化得到 25.8mg(65%)目的最终产物17-1。
用R*为氢的适当的原料和上述相同的方法制得化合物17-2。
                    实施例18 实施例18说明手性烯基侧链的连接 侧链前体18d的制备: 在-78℃下,向18a(993mg,3.73mmol)的二氯甲烷溶液(25mL) 中加入二甲基乙烯酮缩甲醇缩三甲基甲硅醇(methyl trimethylsilyl dimethylketene acetal)(2.27mL,11.2mmol) 和纯的TiCl4(0.49mL,4.48mmol)。
2小时后,在-78℃下用MeOH(5 mL)终止反应。
反应混合物用二氯甲烷(3×40mL)萃取,合并的有机 层用NaHCO3和盐水洗涤。
有机层经干燥并在真空下浓缩得到残余物, 该残余物经色谱纯化(15-20%EtOAc/己烷)得到837mg(61%)目的 产物18b。
18a的1H NMR(CDCl3):δ6.28-5.87(m,2H),5.62-5.43(m,2H), 4.75(m,1H),4.22(m,1H),3.87(m,1H),2.08-1.93(m,2H), 1.80-1.60(m,3H),1.60-1.40(m,3H),1.38-1.10(m,15H).18b 的1H NMR(CDCl3):5.98-5.90(m,2H),5.55-5.47(m,2H),4.08 (m,1H),3.86(m,1H),3.61(s,3H),3.50(m,1H),2.00-1.96 (m,2H),1.74-1.63(m,3H),1.50-1.00(m,24H)。
向18b(837mg,2.27mmol)的二氯甲烷溶液(22mL)中加入PCC (0.98g,4.54mmol)。
在室温下搅拌反应18小时,然后经过Celite 板过滤,在真空下浓缩滤液得到粉红色残余物,经硅胶色谱纯化 (20%EtOAc/己烷)得到441mg(53%)目的甲基酮18c。
18c的1H NMR(CDCl3):δ5.92-5.87(m,2H),5.48-5.43(m,2H), 3.88(m,1H),3.56(s,3H),3.49(m,1H),2.59(dd,J=6.4, 14.7Hz,1H),2.29(dd,J=5.9,15.2Hz,1H),2.06(s,3H), 1.96(m,2H),1.63(m,2H),1.40-0.90(m,20H)。
在室温下,向18c(440mg,1.20mmol)的THF(4mL)和甲烷 (methane)(2mL)溶液中加入7.5M KOH(1mL)。
在室温下搅拌4 小时后,用1N HCl酸化到pH=3,用EtOAc(3×30mL)萃取反 应混合物,合并的萃取液用水(2×10mL)和盐水洗涤,有机层 经干燥和在真空下浓缩得到388mg(>100%)粗品酸18d,其被直 接用于侧链的偶联反应。
化合物18-1的制备: 向粗品酸18d(~1.66mmol)的THF溶液(10mL)中加入HOBt(244 mg,1.66mmol)和EDCI(318mg,1.66mmol)。
在室温下搅拌5 小时后,加入Alloc-保护的假单胞菌素核(614mg,0.50mmol)的 DMF溶液(5mL),在室温下搅拌几天后,向反应混合物加入DMAP(61 mg,0.50mmol)。
再搅拌12小时后,反应混合物经反相HPLC纯化, 然后冷冻干燥得到225mg(30%)alloc-保护的酰化衍生物。
在室温下,向脱气的alloc-保护的酰化衍生物(240mg,0.16 mmol)的THF(20mL)和HOAc(1mL)溶液中加入PdCl2(PPh3)2(23mg, 0.032mmol)和Bu3SnH(0.87mL,3.23mmol)。
1.5小时后,反应 混合物经制备HPLC纯化得到33mg(17%)化合物18-1。
除了上述实施例中列出的化合物外,也制备了下列N-酰基衍生 物,这些衍生物表现出有限的活性或者非显著的活性。
即使这些化合 物不能用作杀真菌剂,它们也能为设计具有最佳活性的化合物提供有 价值的参考。
除非另有说明,实施例中的每一化合物都表现出适当的抗白色念 珠菌、新型隐球酵母、烟曲霉、近平滑假丝酵母或荚膜组织胞浆菌的 活性。
但根据合成的这些化合物观察到了在活性中有下列基本趋势。
β-羟基的立体化学优选为R型;不考虑立体化学和不饱和程度,较 长的烷基链长(即,C12-C20)趋于比较短的烷基链(例如,<C11)具有 更高的活性;除去β-羟基、α,α-二取代、降低在烷基和烷氧基取代 基中的烷基链长、特别刚性及增加侧链中的支链都趋于具有比长的柔 性链低的活性。
因此,下列结构表示的烷基侧链对杀真菌治疗是优选的: 其中 Ra和Ra’独立为氢或甲基、或者Ra或Ra’之一为烷基氨基、与Rb或Rb’一起形成六元的环烷基环、六元的芳环或双键、或者与Rc一起 形成六元的芳环; Rb或Rb’独立为氢或甲基,及Rb或Rb’为羟基,条件是当Ra、Rb、Rd、 Re为氢,Rc为氢和Rf为正己基、正辛基或正癸基,或者Ra、Rb、Rd、 Re为氢,Rc为羟基和Rf为正辛基、正壬基或正癸基时,Rb’不为羟基; Rc为氢、羟基、C1-C4烷氧基、羟基烷氧基,或者与Re一起形成6 元芳环或C5-C6环烷基环; Re为氢,或与Rf一起为六元芳环、C5-C14烷氧基取代的六元芳环 或者C5-C14烷基取代的六元芳环; Rf为C8-C14烷基,或C5-C11烷氧基。
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