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T-细胞受体r可变阅读框架蛋白(TARP)及其应用

基本信息

  • 申请号 CN00810302.X 
  • 公开号 CN1378594A 
  • 申请日 2000/07/12 
  • 公开日 2002/11/06 
  • 申请人 美国政府健康及人类服务部  
  • 优先权日期  
  • 发明人 艾拉·帕斯坦 马格努斯·埃森德 比扬库克·李 乔治·瓦斯马茨斯 库尔特·沃尔夫冈 乌尔里希·布林克曼  
  • 主分类号  
  • 申请人地址 美国马里兰 
  • 分类号  
  • 专利代理机构 中原信达知识产权代理有限责任公司 
  • 当前专利状态 发明专利申请公布 
  • 代理人 丁业平 
  • 有效性 暂失效-视为撤回 
  • 法律状态 审查中-公开
  •  

摘要

本发明提供了一种含有来自前列腺上皮细胞和很多乳房肿瘤细胞的TCRγ转录本的序列的核酸以及由这些序列翻译表达的T-细胞受体γ可变阅读框架蛋白(“TARP”)。
从TARP制备而来的疫苗对于增加对其中该蛋白被表达的细胞(包括前列腺癌细胞和很多乳房癌的细胞)的免疫应答是有用的。
本发明提供了诊断前列腺癌和表达TARP的乳房癌细胞存在的方法,以及将TARP和编码TARP的核酸给药于个体的方法。
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权利要求书


1.一种分离的多肽,其含有的氨基酸序列选自:TCRγ可变阅读 框架蛋白(TARP),其免疫原性片段,与TARP有至少90%序列同 一性且被特异性识别TARP的抗体特异性识别的多肽,以及,与TARP 有至少90%序列同一性且当被加工并在主要组织相容性复合物分子体 系中被提呈后,激活T淋巴细胞抵抗表达TARP的细胞的多肽。

2.权利要求1所述的分离的多肽,其中的多肽含有TARP的序 列。

3.权利要求1所述的分离的多肽,其中的多肽含有TARP的免 疫原性片段的序列。

4.权利要求1所述的分离的多肽,其中的多肽与TARP至少有 90%的序列同一性且被特异性识别TARP的抗体特异性识别。

5.权利要求1所述的分离的多肽,其中的多肽与TARP至少有 90%的序列同一性,并且,当被加工并在主要组织相容性复合物分子 体系中提呈后,激活T淋巴细胞抵抗表达TARP的细胞。

6.一种含有权利要求2的多肽和一种可药用载体的组合物。

7.一种含有权利要求3的多肽和一种可药用载体的组合物。

8.一种含有权利要求4的多肽和一种可药用载体的组合物。

9.一种含有权利要求5的多肽和一种可药用载体的组合物。

10.一种分离的重组核酸分子,其含有编码具有TCRγ可变阅读 框架蛋白(“TARP”)的氨基酸序列的多肽,其免疫原性片段,与TARP 至少有90%序列同一性且被特异性识别TARP的抗体特异性识别的多 肽,以及,与TARP至少有90%序列同一性且其当被加工并在主要组 织相容性复合物分子体系中被提呈后激活T淋巴细胞抵抗表达TARP 的细胞的多肽的核苷酸序列。

11.如权利要求10所述的分离的重组核酸分子,含有TARP的 序列。

12.如权利要求10所述的分离的重组核酸分子,其中的多肽是 TARP的免疫原性片段。

13.如权利要求10所述的分离的重组核酸分子,其中的多肽与 TARP至少有90%序列同一性且被特异性识别TARP的抗体特异性识 别。

14.如权利要求10所述的分离的重组核酸分子,其中的多肽与 TARP至少有90%序列同一性且其当被加工并在主要组织相容性复合 物分子体系中被提呈后激活T淋巴细胞抵抗表达TARP的细胞。

15.如权利要求10所述的分离的重组核酸分子是一个含有可操 作地连接于核苷酸序列的启动子的表达载体。

16.如权利要求15所述的分离的重组核酸分子,其中所述的核 苷酸编码具有TCRγ可变阅读框架蛋白(″TARP″)的氨基酸序列的多 肽。

17.如权利要求15所述的分离的重组核酸分子,其中所述的核 苷酸序列编码具有TARP的免疫原性片段的氨基酸序列的多肽。

18.如权利要求12所述的分离的重组核酸分子,其中所述的核 苷酸序列编码与TARP至少有90%序列同一性且被特异性识别TARP 的抗体特异性识别的多肽。

19.如权利要求12所述的分离的重组核酸分子,其中所述的核 苷酸序列编码与TARP至少有90%序列同一性且当被加工并在主要组 织相容性复合物分子体系中被提呈后激活T淋巴细胞抵抗表达TARP 的细胞的多肽。

20.一种包括将一种组合物给药于个体的方法,其中的组合物选 自以下成员组成的组:分离的具有TCRγ可变阅读框架蛋白(“TARP”) 的氨基酸序列的多肽,其免疫原性片段,与TARP至少有90%序列同 一性且被特异性识别TARP的抗体特异性识别的多肽,与TARP至少 有90%序列同一性且当被加工并在主要组织相容性复合物分子体系中 被提呈后激活T淋巴细胞抵抗表达TARP的细胞的多肽,一种分离的 编码这些多肽之一的核酸,一种用含有TARP的表位的多肽刺激的抗 原提呈细胞,以及,体外被TARP、其免疫原性片段、与TARP有至 少90%序列同一性且被特异性识别TARP的抗体特异性识别的多肽或 与TARP有至少90%序列同一性且当被加工并在主要组织相容性复合 物分子体系中被提呈后激活T淋巴细胞抵抗表达TARP的细胞的多肽 致敏的细胞。

21.权利要求20的方法,包括给药于个体TARP或其免疫原性 片段。

22.权利要求20的方法,其中的多肽与TARP有至少90%序列 同一性且被特异性识别TARP的抗体特异性识别。

23.权利要求20的方法,其中的多肽与TARP至少有90%的序 列同一性且当被加工并被结合有MHC分子的抗原提呈细胞提呈后激 活T淋巴细胞抵抗表达TARP的细胞。

24.权利要求20的方法,其中给药于患前列腺癌的个体。

25.权利要求20的方法,其中给药于患乳房癌的个体。

26.权利要求20的方法,其中给药于没有进行过乳房癌诊断的 雌性个体。

27.权利要求20的方法,其中给药包括在体外使CD8+细胞对 TARP蛋白的表位敏化并将致敏细胞给药于个体。

28.权利要求20的方法,进一步包括共同给药于个体选自下列 的免疫佐剂:非特异性的免疫佐剂,亚细胞微生物产物和成分,半抗 原,免疫原性蛋白,免疫调节剂,干扰素,胸腺激素和集落刺激因子。

29.权利要求20的方法,包括给药用含有TARP表位的多肽脉 冲的抗原提呈细胞。

30.权利要求20的方法,包括给药编码含有TARP表位的多肽 的核酸序列,其中的核酸包含在重组病毒中。

31.权利要求20的方法,包括给药编码含有TARP蛋白的表位 的多肽的核酸序列。

32.权利要求20的方法,包括给药表达含有TARP蛋白的表位 的多肽的表达载体,其中的表达载体是在重组细菌细胞中。

33.权利要求20的方法,包括用表达含有TARP蛋白的表位的 多肽的表达载体免疫个体,其中的表达载体在自体重组细胞中。

34.权利要求27的方法,其中的CD8+细胞为Tc细胞。

35.权利要求34的方法,其中的Tc细胞为肿瘤浸润淋巴细胞。

36.一种在雄性中检测上皮来源的前列腺细胞或在雌性中检测乳 房癌细胞的方法,包括检测来自所述雄性或所述雌性的细胞中的编码 TARP的核酸转录本,或检测通过转录本的翻译产生的TARP,其中 在来自所述的男性的细胞中检测到所述的转录本或蛋白则该细胞被鉴 定为前列腺上皮细胞,在来自所述的女性的细胞中检测到所述的转录 本或蛋白则该细胞被鉴定为乳房癌细胞。

37.如权利要求36所述的方法,包括检测所述的转录本。

38.如权利要求36所述的方法,包括检测所述的蛋白。

39.如权利要求36所述的方法,包括用在杂交条件下特异性杂 交于转录本的核酸探针接触来自所述细胞的RNA,并检测杂交。

40.如权利要求36所述的方法,包括裂解所述细胞并用含有靶 向元件和可检测标记的嵌合分子接触细胞内容物的部分,其中的靶向 元件特异性结合于所述蛋白,并检测结合于蛋白的标记物。

41.如权利要求36所述的方法,其中的细胞取自淋巴结。

42.如权利要求36所述的方法,其中的细胞取自乳房活组织。

43.一种特异性结合于TCRγ可变阅读框架蛋白的抗体。

44.一种在细胞中调节TARP水平的方法,包括向所述细胞导入 一种选自由以下成员组成的组中的组合物:特异性裂解编码TARP的 核酸的核酶,特异性结合于编码TARP的核酸的反义寡核苷酸,特异 性结合于与编码TARP的核酸结合的蛋白的DNA,以及可操作地连接 于启动子的编码TARP的核酸。
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说明书

相关申请的引用 本申请要求1999年7月13日申请的US临时申请No.60/143,560, 以及1999年10月1日申请的US临时申请No.60/157,471的优先权。
此两个申请的内容通过引用在此引入本文。
关于联邦资助研究和发展的发明的权利的声明 是不适用的。
发明背景 本发明涉及分子生物学以及医学诊断学和治疗学领域。
前列腺癌 是人类最普遍的一种癌症,是导致人的因癌症死亡的第三大原因。
此 种疾病的早期检测和治疗的方法将降低前列腺癌患者的死亡率。
由恶 性肿瘤细胞表达而其它细胞很少表达的肿瘤相关蛋白,可被用作靶来 用于检测和干预。
几种与前列腺癌相关的蛋白已被鉴定,包括前列腺 特异性抗原(PSA)。
免疫疗法是一种用于抵抗癌症的有效的新武器。
免疫疗法包括基 于其靶抗原的产生来激发抵抗癌细胞的免疫应答。
当使用人抵抗癌细 胞的免疫应答时,优选用于激发细胞介导的抵抗癌细胞的免疫应答。
基于细胞介导的免疫应答的免疫疗法包括对产生特定的表位的细胞产 生细胞介导的应答。
癌细胞产生不同的可成为免疫治疗的靶的蛋白。
某些癌产生新的蛋白,例如作为突变的结果,它们是免疫原性的。
然 而,研究者们也发现肿瘤浸润淋巴细胞可特异性地识别癌细胞的未突 变蛋白。
例如,Rosenberg等人已发现肿瘤浸润淋巴细胞靶向和识别 正常黑素瘤细胞和恶性黑素瘤细胞均产生的蛋白MART-1的抗原决定 基。
此外,抗MART-1或其与MHC I类分子(具体的,HLA A2的抗 原决定基)结合的肽的主动或被动免疫治疗导致产生MART-1的黑素 瘤细胞以及正常细胞的破坏。
Y.Kawakami等人,J.Immunol.21:237 (1998)。
新的癌抗原被期望能激发免疫反应,因为免疫系统将识别其为异 己蛋白。
然而,因为免疫系统对自身蛋白具有耐受性,其激发抵抗非 突变的自身蛋白的免疫应答的能力是令人吃惊的。
人们确信这种免疫 应答直接抵抗通常不以足够的量暴露于免疫系统的来激发耐受性或免 疫应答的表位。
然而在癌中,这些决定簇不再避开免疫系统的检测。
这点可能由通过MHC I类分子对表位增加的提呈产生的。
细胞介导的免疫应答涉及主要组织相容性复合物分子的活性。
在 人体中,复合物被称为“HLA”(“人白细胞抗原”)复合物。
在小 鼠中,其是指“H-2”复合物。
主要组织相容性复合物包括3类蛋白, MHC I类、MHC II类和MHC III类。
MHC I类分子几乎在所有有核 细胞的表面上表达。
其提呈抗原肽到Tc细胞(CD8+)。
在人体中有 3个MHC I类基因位点,HLA A,HLA B和HLA C。
每一位点为高 度多态的。
因此,一个人在其细胞的表面可能有六种不同类型的HLA 分子。
MHC II类蛋白主要在抗原提呈细胞例如巨噬细胞、树突状细胞 和B细胞上表达,其提呈被加工过的抗原肽到TH细胞。
在人体中有3 个MHC II类基因位点,HLA DP,HLA DQ和HLA DR。
MHC III类 蛋白与各种的免疫过程相关,包括可溶性血清蛋白,以及补体系统的 组分和肿瘤坏死因子。
J.Kuby,Chapter 9,IMMUNOLOGY,第三版W. H.Freeman and Company,New York(1997)。
在癌细胞和正常细胞中,MHC I类分子将自身蛋白的表位提呈到 Tc细胞。
HLA A,HLA B和HLA C分子结合大约长为8到10氨基 酸的具有特殊锚定残基的肽。
HLA I类分子识别的锚定残基依赖于HLA 分子的特定等位形式。
CD8+T细胞带有能识别当被在细胞上的特定 HLA分子提呈时细胞上的特异性表位的T细胞受体。
当能被抗原提呈 细胞刺激变为细胞毒性T淋巴细胞的Tc细胞接触带有HLA-肽复合 物的细胞时,CTL与此细胞形成结合物并将其破坏。
肽通过MHC I类分子的提呈包括内源产生的蛋白通过蛋白酶体 裂解为肽,通过ER和高尔基体进行加工,通过肽的锚定残基结合到 MHC I类分子的裂口以及最终提呈到细胞的表面。
除其它因素外,依 据特定的锚定残基,某些肽可更紧密的结合于特定的HLA分子。
结 合较好的肽指“显性”表位,而结合较差的肽成为“亚显性”或“阴 性”表位,自身蛋白或外源蛋白的显性表位激发强烈的耐受性或免疫应 答。
亚显性或阴性的表位产生弱的或根本不产生免疫应答。
假设显性 表位与HLA分子的紧密结合导致它们在细胞表面密集提呈,产生更 多的与免疫细胞反应的机会以及更多的激发免疫应答或耐受性的可能 性。
研究表明在自身蛋白MART-1蛋白存在的情况下,免疫系统产 生最多的抵抗亚显性或阴性表位的CTL应答。
Y.Kawakami等,1997 Immunol.Res.16:313。
可能在癌细胞中亚显性或阴性表位比在正常细 胞中提呈得密集或量更大;所以免疫系统遇见这些先前未检测到的表 位时,将其识别为外源的并产生抵抗它们的免疫应答。
无论什么原因, 将免疫系统暴露于自身蛋白的大量的亚显性或阴性表位,作为一种激 发免疫应答抵抗产生所述蛋白的细胞的方式是癌症免疫治疗的关键要 素。
当然,启动抗自身蛋白的免疫应答将对癌性细胞和健康细胞二者 均产生破坏。
因此,为使免疫治疗获得成功,健康细胞必须是维持生 命不必需的或具有通过其它疗法可取代的功能。
在前列腺癌和乳房癌 中,通常的治疗手段是分别将前列腺或乳房手术切除。
在此情况下, 大多数或所有显示出前列腺或乳房抗原的组织将成为肿瘤细胞。
发明概述 我们已发现健康和癌性的上皮来源的前列腺细胞,转录未重排的 TCRγ基因的一部分。
而在体外,此转录产生两种蛋白,一种为TCRγ 的截短形式,令人吃惊的是,我们的研究显示,在体内,表达的蛋白 不是TCRγ蛋白,而是可变阅读框架表达的蛋白。
相应地,此蛋白被 称为TCRγ可变阅读框架蛋白或“TARP”。
我们已经发现TARP在上皮来源的前列腺细胞和前列腺癌细胞 中表达。
令人吃惊的是,我们发现相同的蛋白表达在许多的乳房癌细 胞中。
TARP因此可作为前列腺癌和表达TARP(表达TARP的乳房 癌)的乳房癌细胞的标记,并作为免疫治疗的基础。
本发明提供了分 离的或重组形式的核酸和蛋白。
虽然我们已经发现此种蛋白在许多乳 房癌细胞中被表达,因其被首先在前列腺细胞中鉴定,在下面通常被 称为前列腺特异性(“PS”)—TCRγ。
在一方面,本发明提供了分离的含有TCRγ可变阅读框架蛋白 (“TARP”)的氨基酸序列的多肽。
本发明进一步提供了TARP的 免疫原性片段(此片段可产生能特异性识别和结合于全长TARP的抗 体或其激活识别表达TARP的细胞的T细胞),与TARP至少有90% 序列同一性且其被特异性识别TARP的抗体特异性识别的多肽,以及, 与TARP至少有90%序列同一性且其当被加工并在主要组织相容性复 合物分子体系中被提呈后激活T淋巴细胞抵抗表达TARP的细胞的多 肽。
本发明进一步提供了组合物,其含有TARP,其免疫原性片段, 或具有至少90%序列同一性且满足上述功能条件的肽,并含有可药用 载体。
在另一个实施方案中,本发明提供了分离的重组核酸分子,其编 码具有TCRγ可变阅读框架蛋白(“TARP”)的氨基酸序列的多肽, 编码其免疫原性片段,编码与TARP至少有90%序列同一性且其被特 异性识别TARP的抗体特异性识别的多肽,或者,编码与TARP至少 有90%序列同一性且其当被加工并在主要组织相容性复合体分子体系 中被提呈后激活T淋巴细胞抵抗表达TARP的细胞的多肽。
在另一个实施方案中,本发明提供了一种方法,包括给药于个体 一种组合物,该组合物选自:分离的具有TCRγ可变阅读框架蛋白 (“TARP”)的氨基酸序列的多肽,其免疫原性片段,与TARP至 少有90%序列同一性且被特异性识别TARP的抗体特异性识别的多 肽,以及,与TARP至少有90%序列同一性且其当被加工并在主要组 织相容性复合体分子体系中被提呈后激活T淋巴细胞抵抗表达TARP 的细胞的多肽。
本发明进一步提供了给药于个体一种组合物的方法,其中的组合 物选自:编码TARP、其免疫原性片段、与TARP至少有90%序列同 一性且被特异性识别TARP的抗体特异性识别的多肽、以及与TARP 至少有90%序列同一性且当被加工并在主要组织相容性复合体分子体 系中被提呈后激活T淋巴细胞抵抗表达TARP的细胞的多肽的分离的 核酸。
本发明进一步提供了将组合物给药于个体的方法,其中的组合物 含有用包含TARP表位的多肽刺激的抗原提呈细胞。
另外,本发明提 供了给药于个体一种组合物的方法,其中的组合物含有在体外被 TARP、与TARP至少有90%序列同一性且被特异性识别TARP的抗 体特异性识别的多肽、或者与TARP至少有90%序列同一性且当被加 工并在主要组织相容性复合体分子体系中被提呈后激活T淋巴细胞抵 抗表达TARP的细胞的多肽致敏的细胞。
上述方法中所述的组合物可被给药于患前列腺癌的个体,患乳房 癌的个体,或未进行乳房癌诊断的雌性个体。
该方法还包括在体外致敏CD8+细胞使其对TARP蛋白的表位敏 感并将这些致敏细胞给药于个体。
CD8+细胞可为Tc细胞。
在一些 实施方案中,Tc细胞可为肿瘤浸润淋巴细胞。
此外,该方法可包括共同给药于个体免疫佐剂,其选自非特异性 的免疫佐剂,亚细胞微生物产物和成分,半抗原,免疫原性蛋白,免 疫调节剂,干扰素,胸腺激素和集落刺激因子。
该方法也进一步包括给药一种用含有TARP表位的多肽刺激的抗 原提呈细胞,或给药编码含有TARP的表位的多肽的核酸序列,其中 的核酸存在于重组病毒中。
该方法进一步包括给药编码含有TARP蛋 白的表位的多肽的核酸序列。
此外,该方法包括给药一种表达载体,其表达含有TARP蛋白的 表位的多肽,其中表达载体存在于在重组细菌细胞中。
进一步地,该 方法包括用表达含有TARP蛋白表位的多肽的表达载体免疫个体,其 中的表达载体包含在自体重组细胞中。
在另一方面,本发明提供了一种检测方法,在雄性中为检测上皮 来源的前列腺细胞,雌性中为检测乳房癌细胞,包括检测细胞中的所 述雄性或所述雌性的编码TARP的核酸转录本,或检测转录本的翻译 所产生的TARP,因此在所述的雄性细胞中检测到所述的转录本或蛋 白则该细胞为前列腺上皮细胞,而在所述雌性的细胞中检测到所述的 蛋白或转录本则该细胞为乳房癌细胞。
该方法可包括将来自所述细胞 的RNA与在杂交条件下特异性杂交于转录本的核酸探针接触,并检 测杂交。
此外,该方法包括破坏细胞并使一部分细胞内容物与含有靶 向部分和可检测标记的嵌合分子接触,其中的靶向部分特异性地结合 于所述的蛋白,检测结合于蛋白的标记。
靶向部分本身也可被标记(例 如,抗体如scFv可具有放射性残基)。
被检测的细胞可取自淋巴结,或乳房活组织。
最后,本发明提供了特异性结合于TCRγ可变阅读框架蛋白的表 位的抗体。
附图的简要描述 附图1.PS-TCRγ转录本的核苷酸序列(SEQ ID NO:13)。
在体 外翻译系统中,此转录本产生两种多肽。
第一种多肽具有推导的氨基 酸序列,开始于MQM...(″PS-TCRγ-1″,现在称为″TARP,″SEQ ID NO: 14)。
据估计此多肽的分子量为7.2 kD。
其由与自然TCRγ阅读框架不 一致的阅读框架翻译。
第二种多肽具有开始为MKT…的推导氨基酸序 列(″PS-TCRγ-2″,SEQ ID NO:15)。
据预测,其分子重为13 kD。
其 由与TCRγ相同的阅读框架翻译且表现为TCRγ的截短形式。
图中的单 下划线表示转录起始位点和多聚腺苷酸位点。
附图2.TCRγ mRNA表达的杂交分析。
附图2A)多种组织的点 杂交印迹显示人TCRγ的不同的表达。
阳性组织为前列腺(C7),小 肠(E3),脾(E4),胸腺(E5),外周白细胞(E6),淋巴结(E7),骨髓(E8) 以及肺(F2)。
附图2B,Northern印迹显示正常组织中TCRγ转录本的 大小。
在前列腺中表达的TCRγ转录本为1.1kb和2.8kb,而在脾脏、 胸腺和外周白细胞中的主要转录本为1.5 kb。
底片被曝光20小时。
附图3.TCRγδ表达的Northern印迹分析。
附图3A)TCRγ恒定区 (TCR Cγ)cDNA探针显示了1.1和2.8kb前列腺特异性转录本(与 附图2B比较)。
底片被曝光20小时。
附图3B)TCRδ恒定区(TCR Cδ) cDNA探针显示TCRδ mRNA不在前列腺中表达,而在脾脏、胸腺和 外周白细胞中表达。
底片被曝光50小时。
附图3C)TCR Cγ cDNA探 针表明LNCaP细胞系表达TCRγ而PC-3细胞系不表达。
底片被曝光 20小时。
人β-肌动蛋白mRNA的表达被分析作为对照。
附图4.石蜡包埋的组织通过TCRγ(Cγ1-3′UTR)反义、35S-标记探 针进行的原位杂交。
左边照片来自暗视野显微镜检查而相应的右边的 照片来自明视野显微镜检查。
暗视野照片中所示的明亮颗粒是RNA 杂交信号。
4A)来自67岁男性的前列腺组织显示了阳性的腺泡上皮 细胞和阴性基质细胞,(5倍放大)。
4B)4A的明视野。
4C)高度放大 (40x),显示在右下角的阳性区。
4D)4C的明视野。
4E)肾组织显示 没有RNA杂交,(5倍放大)。
4F)4E的明视野。
附图5.LNCaP mRNA的引物延伸。
在TCRγ恒定区(从Cγ1的5’ 末端开始的75个核苷酸)逆转引退火。
逆转录本终止于大约128核 苷酸处,用箭头表示,其表明转录本在Cγ1的上游大约53核苷酸处 启始。
含有LNCaP的TCRγ逆转录本的泳道被曝光72小时而标记泳 道被曝光8小时。
附图6.前列腺TCRγ转录本。
其图示了前列腺是如何被转录和剪 接的。
转录本包括Jγ1.2片段,Cγ1的3个外显子,接着是非翻译序列。
附图7.前列腺TCRγ的体外转录偶联的翻译分析。
两个大约为8 和13 kDa的蛋白被获得(泳道1)。
使用空载体的阴性对照反应(泳 道)没有产生任何的蛋白产物。
附图8.用于PS-TCRγ转录分析的引物(SEQ ID NOs:1-12)。
附图9.前列腺特异性TCRγ转录本体外翻译的分析。
前列腺特异 性TCRγ转录本在体外编码两种蛋白。
35S-Met体外标记的翻译蛋白被 置于16.5%Tris-Tricene凝胶上进行跑胶并通过放射自显影法进行分 析。
所用突变构建体的图示分析被显示在右边。
空白框代表第一阅读 框架且可能的启动密码子用粗体表示,第二阅读框架用阴影框表示且 可能的启动密码子用斜体表示,“X”表示一个ATG密码子突变为 ATA。
以kDa表示的大小标志被显示于顶部。
附图10.TARP为前列腺中表达的核蛋白。
获自LNCaP细胞、 PC3细胞或前列腺肿瘤样本(癌)的蛋白提取物的Western印迹。
20μg 的每种蛋白提取物被置于16.5%Tris-Tricene凝胶上电泳且用抗TARP (上图)或TCRγ(下图)的抗体进行探测。
作为阳性对照,1μg的His- 标记的TARP(上图)或100ng的His-标记的TCRγ(下图)被置于凝胶 上电泳(重组)。
以kDa表示的大小标志被显示于左边。
(B)LNCaP细 胞的细胞质部分(细胞质),膜部分(膜)以及核部分(核)的Western 印迹。
每一部分40g被置于16.5%Tris-Tricene凝胶上电泳且用抗TARP 的抗体进行探测。
作为阳性对照,1μg His-标记的TARP被置于凝胶 上跑胶(重组)。
以kDa表示的分子大小被显示于左边。
附图11.TARP mRNA在乳房癌细胞中的表达。
(A)用TARP(上 图)或肌动蛋白(下图)特异的引物对获自下列细胞系的RNA进行 RT-PCR:前列腺(LNCaP和PC3),成神经细胞瘤(A172),结肠(COLO 205),胃(KATO III)以及乳房(MCF7,BT-474,Hs57Bst,SK-BR-3, CRL-1897和MDA-468)。
没有模板的RT-PCR反应被显示为dH2O。
(B)用TARP(上图)或肌动蛋白(下图)特异的引物对获自12个人 乳房癌组织样本的cDNA(1-12泳道)进行PCR。
没有模板的PCR反 应被显示为dH2O。
对于两个图,20%的PCR产物被置于1%琼脂 糖凝胶上进行电泳且用溴化乙锭染色进行显影。
附图12.在乳房细胞系中发现的TARP转录本与前列腺特异形 式的相同。
(A)TCRγ座位的图示以及TARP如何在前列腺细胞中被转 录和剪接。
用于在图B中RT-PCR分析的引物被显示了出来。
(B)TARP mRNA表达的RT-PCR分析。
利用获自前列腺细胞系(LNCaP和PC3) 和乳房细胞系(MCF7,BT-474,SK-BR-3和Hs578Bst)的cDNA,并利 用引物1和3(上图),TARP引物2和3(中图)或肌动蛋白引物(下 图)进行PCR反应。
进行没有模板的RT-PCR,并显示为dH2O。
20%的 PCR产物被置于1%的琼脂糖凝胶上进行电泳并用溴化乙锭染色观 察。
(C)TARP转录本的Northern印迹分析。
获自前列腺细胞系(LNCaP 和PC3)和乳房细胞系(MCF7,BT-474,SK-BR-3和Hs578Bst)的2ug poly(A)mRNA利用恒定区片段作为探针进行分析。
24小时曝光产生 放射自显影(上图)。
用人β-肌动蛋白RNA探针在同一滤膜上产生 条带并进行分析以校验证明相同的上样量。
曝光1小时产生放射自显 影(下图)。
表示核苷酸大小的RNA大小标志被显示左边。
附图13.TARP存在于乳房癌细胞的核中。
(A)对获自LNCaP, MCF7,BT-474,SK-BR-3和Hs578Bst细胞的核提取物进行Western印 迹分析。
40μg的每种核提取物被置于16.5%的Tris-Tricene凝胶上电 泳并用抗TARP(上图)或TCRγ(下图)的抗体进行探测。
作为阳性对 照,1μg的His-标记的TARP(His-TARP)和100ng的His-标记的TCRγ (His-TCRγ)在凝胶上跑电泳。
大小标志以kDa为单位显示在左侧。
附图14.TARP的可能的功能区。
(A)TARP含有一个可能的 亮氨酸拉链基元和磷酸化位点。
可能的亮氨酸拉链基元用亮氨酸加框 表示,其后的碱性区加下划线。
cAMP-和cGMP-依赖的蛋白激酶磷酸 化位点(氨基酸46-49和55-58)以及蛋白激酶C磷酸化位点(氨基酸 19-21和20-22)用空心轮廓表示。
(B)TARP与Tupl的蛋白序列比 较。
TARP(42-57),Dictyostelium dicoideum Tupl(dTupl,521-536)以 及Saccharomyces cerevisiae Tupl(yTupl,626-660)的氨基酸序列被显 示。
保守的残基被加框。
本发明的详述 I介绍 令人惊讶地,人们已发现上皮来源的前列腺细胞以及很多乳房癌 细胞表达T细胞受体γ链(″TCRγ″)的mRNA。
前列腺中的主要TCRγ转 录本与T淋巴细胞中表达的大小不同。
前列腺上皮细胞和很多乳房癌 高水平表达被认为仅在T淋巴细胞中表达的基因的转录本的发现是出 乎意料的。
因为TCRγ阅读框架含有很好的Kozak序列(Kozak,M.Cell 44 283-92(1986)),我们最初设想截短的TCRγ蛋白被编码。
因此,另一 个意外的发现是在上皮前列腺细胞和乳房癌细胞中表达的TCRγ座位 编码一个7Kda的核蛋白。
因为该蛋白是由不同于TCRγ的阅读框架所 编码的,我们将其命名为TCRγ可变阅读框架蛋白,缩写为″TARP″。
除了在TCRγ座位的一个内含子中转录本来源的可变的阅读框架被翻 译外,TARP具有另外两种独特的特征。
首先,意外地在细胞中发现 这样的一个小肽,因为大多数是分泌型。
另外,TARP缺少很好的Kozak 序列。
体外和体内应用 在前列腺上皮细胞、前列腺癌细胞以及很多乳房癌的细胞中该种 蛋白的存在为体内和体外的应用创造了大量的机会。
首先抗该种蛋白 的抗体能被用于体外测试来检测样品中表达TARP细胞的存在。
例如 下面描述的实施例中,在正常的乳房细胞中不存在TARP和TARP转 录本,或者低水平存在,但是,在表达TARP的乳房癌细胞很容易被 检测到。
在从个体取出的乳房细胞中检测到高水平的TARP转录本或 TARP,将表明个体存在表达TARP的乳房癌。
鉴于前列腺细胞中TARP 的表达,本领域的技术人员意识到在进行性前列腺癌中去除前列腺是 一种常见的手术干预。
从一个已去除前列腺的个体的细胞中检测到 TARP则表明存在前列腺癌。
(本领域的技术人员将意识到每年大约 有1,000男人被诊断出患有乳房癌。
因此,病人单一的患有乳房癌不 是不可能的。
假定事实上男性的前列腺癌患者超过正常人的200倍, 且所关注的患者已被发现患有前列腺癌,则病人单独患乳房癌的可能 性很小。
诊断可通过取样位点的一些信息被证实,其中样品被进行组 织学和细胞形态学以及其它常规诊断标准的研究。
在任一情况中,由 于任一病征的存在需要进一步的鉴定和监测,检测到TARP表达细胞 存在于前列腺已被切除的男性中是非常有用的,不管该个体是否已患 上前列腺癌,乳房癌,或二者。
在没有前列腺癌的男性中检测到TARP 表达细胞是乳房癌的一个指标。
) TARP本身,TARP的免疫原性片段,以及编码TARP或其免疫原 性片段的核酸也可被用于在体外激活来自个体的细胞毒性T淋巴细胞 (″CTL″),在灌输给所述个体后用以攻击前列腺癌和表达TARP的乳房 癌。
可将TARP本身、TARP的免疫原性片段、编码TARP或其免疫 原性片段的核酸分子通常与可药用载体一起对个体给药,以刺激产生 或加强对前列腺癌或表达TARP的乳房癌的免疫应答。
对已被确诊患 有前列腺癌或表达TARP的乳房癌的个体可治疗性地给药这一类的组 合物。
如下所讨论的,TARP是一种具有调控转录的蛋白结构特征的核 蛋白。
人们预料细胞中TARP水平的调节将影响细胞的生长,细胞的 复制,或二者。
因此,TARP水平的调节在控制癌细胞的入侵方面可 能是很重要的。
细胞中的TARP的水平可以通过不同的减少RNA转 录本被翻译为蛋白例如核酶和反义分子的形式来降低。
细胞中TARP 的水平也可被增加。
例如,含有编码TARP的核酸的表达载体,由强 组成型启动子驱动,其可被导入到细胞中。
核酸的组成型转录导致蛋 白在细胞中高水平的表达。
此部分的余下内容描述了TARP的不同结构特征。
接下来描述的 是本文所用术语的定义,然后是有关TARP的免疫原性片段的选择、 TARP对个体的给药、抗TARP抗体的形成、TARP转录本和蛋白的 检测以及药物组合物的讨论。
TARP的结构特征 TARP在七体重复中含有五个亮氨酸,此表明TARP含有亮氨酸 拉链二聚基元(附图7A)。
所以TARP必定含有一个两亲螺旋。
一 种表明TARP可含有一个两性螺旋的迹象是丝氨酸和脯氨酸残基(这 些残基被认为是螺旋启始位置的残基)被发现紧挨在第一个亮氨酸重 复的前面。
第二,很多的带电氨基酸被发现在七体重复中,因此螺旋 有两性特性且可能充当与其它螺旋的盐桥。
尽管亮氨酸在七体重复中 的存在是亮氨酸拉链基元的指示,有些被鉴定在七体重复中含有5个 亮氨酸的蛋白并没被认为是亮氨酸拉链蛋白。
例如,亲核素 (karyopherin)的晶体结构(Chook,Y.M.等,Nature 399:230-237 (1999)),B.sterarothermophilus嘧啶核苷酸磷酸化酶(Pugmire,M.J.等, Structure 6:1467-1479(1998))以及T.thermophilus苯丙氨酰tRNA合 成酶(Mosyak,L.等,Nat.Struct.Biol.2:537-547(1995))表明这些蛋白 在含有五个亮氨酸的七体重复序列中不含有α-螺旋结构。
需要用相互 作用和结构研究来测定在TARP中发现的亮氨酸重复的意义。
TARP氨基酸序列另一个独特的特征是碱性氨基酸的区域紧接着 可能的亮氨酸拉链基元(附图7A),此表明其可能的DNA结合基元。
然而,其中碱性区域的方向是非常独特的,其紧接着亮氨酸重复而不 是在其前面。
大多数结合DNA的亮氨酸拉链蛋白在亮氨酸重复前面 具有碱性区域(参见(Chook,Y.M.等,Nature 399:230-237(1999)))。
TARP的碱性区域可能仅仅充当核定位信号,但TARP是一种核蛋白 的事实加强了TARP可结合DNA的假说。
为了检测TARP是否与任意已知的蛋白具有同源性,我们在 GenBank中进行了蛋白BLAST检索。
此检索显示TARP的氨基酸序 列与Dictyostelium dicoideum Tupl(GenBank登录号AAC29438)以及 Saccharomyces cerevisiae Tupl(Williams,F.E.等,Mol.Cell.Biol.10: 6500-6511(1990))(附图7C)有一些同源性。
酵母Tupl通常在 Cyc8(Ssn6)复合体发现且是被葡萄糖、氧和DNA损害所调控的基因 的转录抑制所需要的(Tzamarias,D.等,Genes Dev.9:821-831 (1995))。
Cyc8(Ssn6)和Tupl都不结合DNA,但是它们通过特异性 DNA结合蛋白例如α2、Migl、Roxl和al作为共抑制剂复合物的一个 部分而发挥作用(Tzamarias,D.等,Genes Dev.9:821-831(1995))。
Tup1 的C′-末端部分含有富含天门冬氨酸和色氨酸的43个氨基酸序列的6 个重复,已知为WD-40或β-转导素重复子(Williams,F.E.等,Mol.Cell. Biol.10:6500-6511(1990);Fong,H.K.等,Proc.Natl.Acad.Sci.USA 83:2162-2166(1986))。
WD-40重复子已在很多蛋白中被鉴定出,在 蛋白-蛋白的相互作用中起作用。
值得注意的是,Tupl已被显示通过2 个WD-40重复子与α2相互作用(Komachi,K.等,Genes Dev.8:2857- 2867(1994))。
令人感兴趣的是TARP与Tupl的第5个WD-40重复子 具有同源性(附图7C)。
因为TARP是一种核蛋白,其与Tupl同源则 表明TARP是一种涉及转录调控的功能性核蛋白复合物的成员。
TARP抗体识别前列腺和乳房核提取物的双重物质(附图6A)。
最快的7 kDa条带与His-TARP重组蛋白共移动,而最弱的条带为较 大分子量。
对于9kDa条带的一个可能解释则是存在翻译后修饰。
为 了确定TARP是否含有任意已知的翻译后修饰的位点,我们利用 PROSITE程序分析TARP氨基酸序列,其中的PROSITE程序来自 Swiss Institute of Bioinformatics ExPASy proteomics server(http://www. expasy.ch)(Appel,R.D.等,Trends Biochem.Sci.19:248-260(1994); Hofmann,K.等,Nucleic Acids Res.27:215-219(1999))。
如附图7A所 示,许多可能的磷酸化作用位点被发现,包括cAMP和cGMP-依赖性 蛋白激酶磷酸化位点(RRAT和RRGT)以及蛋白激酶C磷酸化位 点(SSR和SRR)。
已在很多例子中表明在SDS PAGE凝胶上磷酸化 作用引起蛋白显示出较大分子量。
如果也是这种情况,附图6的结果表 明未修饰的形式在LNCaP细胞中是普遍的,而且仅仅磷酸化形式存 在于MCF7和SK-BR-3细胞中。
因此,TARP可能在前列腺和乳房 癌细胞中表达后进行了翻译后-修饰。
我们最初的对TARP转录本的研究没有揭示TARP在乳房中表达 (Essand,M.等,Proc.Natl.Acad.Sci.USA 96:9287-9292(1999))。
一种 可能的解释是TARP在正常乳房中表达的水平很低,因此是很难被检 测的。
如在结果部分中所述的,与癌样品中检测到的强烈信号相比, 在正常乳房样品的PCR分析中检测到非常弱的信号。
因此,TARP在 乳房癌细胞中的存在可表明在乳房细胞致癌转化后TARP被诱导表 达。
此外,TARP在乳房癌细胞中的存在表明TARP被雌激素所调控。
在TARP的内含启动子中鉴定出的使雄激素应答元件(ARE)与雌激 素应答元件(ERE)结合的元件加强了这一假说。
此杂交元件含有两个 半-位点,其在5’末端对ARE特异,在3’末端对ERE特异[(Zilliacus,J. 等,Mol.Endocrinol.9:389-400(1995))以及未公开的数据]]。
另外需 要进行一些实验来检测是否雌激素调控TARP。
然而有一些例子,其 中的突变体ARE引起某些前列腺特异性基因在乳房肿瘤中表达。
例 如,前列腺特异性抗原(PSA)已被显示在乳房肿瘤中表达(Majumdar, S.等,Br.J.Cancer 79:1594-1602(1999))。
PSA异常表达的分子分析 使得发现了在PSA启动子中发现的ARE中的单一位点突变。
据信, 该突变导致雄激素调控的PSA在乳房瘤中表达的丧失(Majumdar,S. 等,Br.J.Cancer 79:1594-1602(1999))。
此时是否在3个被检测的乳房 细胞系中在TARP启动子中发生了类似的突变仍不得而知。
前列腺依据雄激素来维持其结构和功能。
当前列腺细胞变为恶性 细胞时,其失去了雄激素依赖性。
在此研究中,我们使用两种对用于 生长的雄激素具有不同依赖性的前列腺细胞系:LNCaP和PC3细 胞。
雄激素受体存在于雄激素依赖的LNCaP细胞系中,但不存在于 雄激素非依赖性的PC3细胞系中(Tilley,W.D.等,Cancer Res.50: 5382-5386(1990))。
如附图3所示,TARP在LNCaP细胞而不在PC3细 胞中表达。
此结果表明TARP表达可通过雄激素刺激来调控。
TARP启 动子中的ARE样元件的鉴定加强了TARP被雄激素诱导的观点。
在 LNCaP细胞而不在PC3细胞中表达表明TARP在调控雄激素依赖的 应答中是重要的 II.名词定义 除非另有定义,此处所用的技术和科学术语具有本领域技术人员 通常理解的含义。
下面引用的文献提供了本发明所用的很多术语的基 本定义:Singleton等,微生物学和分子生物学词典(DICTIONARY OF MICROBIOLOGY AND MOLECULAR BIOLOGY)(第二版,1994);剑 桥科技词典(THE CAMBRIDGE DICTIONARY OF SCIENCE AND TECHNOLOGY)(Walker ed.,1988);遗传学专业词典(THE GLOSSARY OF GENETICS),第5版.,R.Rieger等(编辑),Springer Verlag(1991);和Hale & Marham,HARPER COLLINS生物学词典 (THE HARPER COLLINS DICTIONARY OF BIOLOGY)(1991)。
如此 处所述的,下面的术语除非另有说明,其具有上述词典中的含义。
″T细胞受体″是指在含有一个α链和一个β链或一个γ链和一个δ链 的T细胞表面发现的杂二聚体。
T细胞受体识别与MHC分子结合的 抗原。
″T-细胞受体γ可变阅读框架蛋白″和″TARP″是指一种多肽,其序 列如例如附图14所描述的。
此多肽由T细胞受体γ基因翻译而来,所 述基因转录本存在于上皮来源的前列腺细胞中,前列腺癌细胞中,以 及在很多乳房癌中。
由于″TARP″中的最后一个缩写字母代表单词″蛋 白″,所以″TARP蛋白″是多余的。
此处所用的从其可翻译成TARP的核酸转录本是指″TARP核酸″ 或″编码TARP的核酸″,从中转录TARP的基因在此处是指″TARP基 因。
″ 如此处所用的,TARP的″免疫原性片段″是指TARP的一部分, 当其在主要组织相容性复合物分子体系中被细胞提呈后,可以在T细 胞活化测定中,激活T淋巴细胞抵抗表达TARP的细胞。
尽管较长的 片段也可被使用,典型地,此种片段为TARP的8到12个连续氨基 酸。
在上下文中将一个与另一个多肽比较时,“序列同一性”通过比 较作为参考序列的TARP序列与一个受试序列而被测定。
典型地,两 个序列进行最大和最佳比对。
″配体″是指一种特异性与靶分子结合的化合物。
″受体″是特异性与配体结合的化合物。
″细胞毒素T淋巴细胞″(″CTL″)在对肿瘤细胞的免疫应答中是重 要的。
CTL识别被在几乎所有有核细胞的细胞表面表达的HLA I类分 子提呈的肽的表位。
已知肿瘤特异性辅助T淋巴细胞(″HTL″)对维持有效的抗肿瘤免 疫时是很重要的。
其在抗肿瘤免疫中的作用也已在动物模型中被证 明,其中这些细胞不仅为CTL的诱导和抗体应答提供帮助,而且提 供效应器功能,该功能通过直接细胞接触和通过淋巴因子(例如IFNγ 和IFN-α)的分泌来介导。
″抗体″是指特异性识别和结合表位(例如,抗原)的至少含有轻 链或重链免疫球蛋白可变区的多肽配体。
包括完整的免疫球蛋白和变 体和本领域已知的它们的部分例如Fab′片段,F(ab)′2片段,单链Fv蛋 白(″scFv″),以及二硫化物稳定的Fv蛋白(″dsFv″)。
scFv蛋白是一种 融合蛋白,其免疫球蛋白的轻链可变区和免疫球蛋白的重链可变区通 过接头结合。
天然的免疫球蛋白由免疫球蛋白基因编码。
包括κ和λ 轻链恒定区基因,α、γ、δ、ε和μ重链恒定区基因,以及无数的免疫球 蛋白可变区基因。
术语″抗体″包括多克隆抗体,单克隆抗体,嵌合抗 体和人源化抗体,通过免疫产生的,从杂交瘤产生的,或重组的。
″表位″或″抗原决定基″是指B和/或T细胞对其产生应答的抗原上 的位点。
表位可由抗原上的连续氨基酸形成或由非相邻氨基酸通过蛋 白质的三级折叠形成。
由连续氨基酸形成的表位典型地在变性溶剂中 可保留而由非邻接氨基酸形成的表位典型地在用变性溶剂的处理中会 丢失。
一个表位典型地在独特空间构象中包括至少3个,和通常更多, 至少5个或8-10个氨基酸。
测定表位的空间构象的方法包括,例如,x- 光衍射以及两维核磁共振。
参见,例如.,分子生物学方法,Vol.66, Glenn E.Morris,Ed(1996)中的表位绘图手册(Epitope Mapping Proctocols in Methods in Molecular Biology)。
当配体或受体进行结合反应时,配体或受体“特异性地结合于” 某一化合物,即“待分析物”,该结合是待分析物在异质化合物样品 中存在的决定因素。
因此,配体或受体优选与特定的待分析物结合且 不结合样品中的有效量的其它物质。
例如,多核苷酸特异性地结合于含 有一个互补序列的待分析多核苷酸而抗体在免疫测定条件下特异地与 含有抗体所针对的表位的抗原待分析物结合。
″免疫测定″是指检测样品中待分析物的方法,其中待分析物的特 异性是抗体和配体之间的特异性结合所赋予的。
包括通过抗体和配体 之间的特异性结合来检测抗体待分析物。
参见Harlow和Lane(1988) 抗体,实验室手册,冷泉港出版社,New York,描述了可被用来检测特 异性免疫活性的免疫测定形式和条件。
″疫苗″是指含有有效赋予生物体仅引起较低发病率和致死率的生 物免疫治疗水平的药剂或组合物。
当然,制备疫苗的方法在免疫系统 的的研究并预防和治疗动物和人类疾病方面是有用的。
“免疫有效量”是有效地在个体中引起免疫应答的量 ″多肽″是指由氨基酸残基、相关的天然存在的其结构变体和合成 的通过肽键连接的非天然存在的类似物、相关的天然存在的结构变体, 以及合成的非天然产生的类似物组成的聚合物。
合成多肽可被例如利 用自动多肽合成仪来合成。
术语“蛋白质”典型地是指大的多肽。
术语“肽”典型地是指短的多肽。
在此使用常规的符号来描述多肽序列:多肽序列的左手端为氨基 末端,多肽序列的右手端为羧基末端 ″融合蛋白″是指由两个或多个多肽通过肽键连接形成的多肽,其 中的肽键是由一个多肽的氨基末端和另一个多肽的羧基末端形成的。
融合蛋白可典型地被表达为单一连续的融合蛋白的核酸序列所编码。
然而,融合蛋白也可由组成型多肽的化学偶联来形成。
″保守替代″是指多肽中的氨基酸用功能类似的氨基酸来替代。
下 列6组中均包括作为另一个氨基酸保守替代的氨基酸: 1)丙氨酸(A),丝氨酸(S),苏氨酸(T); 2)天门冬氨酸(D),谷氨酸(E); 3)天冬酰胺(N),谷氨酰胺(Q); 4)精氨酸(R),赖氨酸(K); 5)异亮氨酸(I),亮氨酸(L),甲硫氨酸(M),缬氨酸(V);和 6)苯丙氨酸(F),酪氨酸(Y),色氨酸(W)。
两个蛋白如存在于不同的种中且具有共同的遗传祖先和70%的氨 基酸序列同一性则彼此是″同源物″。
″大体上纯的″或″分离的″是指目的物质是主要存在的物质(例如, 以摩尔计算,在组合物中比其它任意的大分子物质含量更多),而基本 上纯化的部分是一种其中含有在所有存在的大分子物质中至少50% (以摩尔计算)为目的物质的组分。
通常,大体上纯的组分是指组分 中的大约80%到90%或以上的大分子物质是纯化的目的物质。
如果组 分主要含有一种单一的大分子物质,则目的物质被纯化到基本上同质 (通过常规的检测方法在组分中检测不到污染物)。
为了定义,溶剂、 小分子(<500道尔顿)、稳定剂(例如,BSA),以及元素离子在此不 被认为是大分子。
″核酸″是指由通过磷酸二酯键连接的核苷酸(核糖核苷酸,脱氧 核糖核苷酸,其相关的天然存在的结构变体,及合成的非天然存在的 其类似物)单元、相关的天然存在的其结构变体及合成的非天然存在的 其类似物组成的聚合物。
因此,此术语包括核苷酸聚合物,其中的核 苷酸及其之间的键,包括非天然存在的合成类似物,例如(但不限制 于),硫代磷酸酯,氨基磷酸酯,甲基磷酸盐,手性-甲基磷酸盐,2-O- 甲基核糖核苷酸,肽-核酸(PNA),等等。
此种多核苷酸可以利用例如 自动DNA合成仪来合成。
术语“寡核苷酸”典型地是指短的多核苷 酸,通常不长于50个核苷酸。
当通过DNA来表示核苷酸序列时(例 如,A,T,G,C),可以理解的是其也包括RNA序列(例如,A,U,G,C), 其中的″U″替代″T″。
此处所用的描述核苷酸序列的常规表示是:单链核苷酸的左手边 为5’末端;双链核苷酸序列的左手方向作为5’方向。
产生RNA转录 本的核苷酸5’到3’的增加的方向作为转录的方向。
与mRNA具有相 同序列的DNA链被称为“编码链”;与转录自DNA的mRNA具有 相同序列的且位于RNA转录本的5’末端的5’的DNA链的序列为″上 游序列″;与转录自DNA的mRNA具有相同序列的且位于编码RNA 转录本的3’末端的3’的DNA链的序列为″下游序列″; ″cDNA″是指互补于或等同于mRNA的DNA,其为单链或双链的 形式。
″编码″是例如基因、cDNA或mRNA充当模板来合成其它聚合物 的多核苷酸和在生物学的过程中具有所定义的核苷酸序列(例如,rRNA, tRNA和mRNA)或所定义的氨基酸序列大分子中的特定核苷酸序列 固有的特性以及由其产生的生物学特性。
因此,如果由基因产生的 mRNA的转录和翻译在细胞或其它的生物系统中产生蛋白质则此基因 编码了蛋白。
基因或cDNA的编码链(等同于mRNA序列且通常被显 示在序列表中的核苷酸序列),以及被用作转录模板的非编码链可被 称为编码蛋白或基因或cDNA的其它产物。
除非另有说明,“编码氨 基酸序列的核苷酸序列”包括所有的编码相同氨基酸序列的核苷酸序 列简并形式。
编码蛋白的核苷酸序列和RNA可包括内含子。
″重组核酸″是指具有非天然连接在一起的核苷酸序列的核酸。
其 包括含有扩增的或装配的可用于转化合适宿主细胞的核酸的核酸载 体。
含有重组核酸的宿主细胞称为“重组宿主细胞”。
然后基因在 重组宿主中表达来产生,例如,“重组多肽”。
重组核酸也可行使非 编码的功能(例如,启动子,复制区,核糖体结合位点等)。
″表达调控序列″是指多核苷酸中的调控与其可操作地连接的核苷 酸序列的表达(转录和/或翻译)的核苷酸序列。
“可操作地连接”是 指两个部分的功能关系,其中一个部分的活性(例如,调控转录的能 力)是另一个部分作用的结果(例如,序列的转录)。
表达调控序列 可包括,例如,用于举例而并非限制,启动子的序列(例如,诱导型的 或组成型的),增强子,转录终止子,起始密码子(例如,ATG),内含子的 剪接信号,以及终止密码子。
″表达盒″是指含有与可表达的核苷酸序列可操作相连的表达调控 序列的重组核酸构建体。
表达盒通常含有足够用于表达的顺式作用元 件,其它用于表达的元件可由宿主细胞或体外表达系统提供。
″表达载体″是指含有一个表达盒的载体。
表达载体包括所有本领 域已知的载体,例如,粘粒,质粒(例如,裸露的或包含在脂质体中的) 以及包含表达盒的病毒。
如果多核苷酸的序列是与其序列是第二序列的多核苷酸特异地杂 交的第一序列,则相对于第二序列,第一序列是“反义序列”。
用于描述两个或多个核苷酸序列或氨基酸序列之间的关系的术语 包括″参考序列″,″选自″,″对比窗″,″同一性″,″序列同一性的百分 比″,″基本上相同″,″互补″和″基本互补″。
为了核酸序列的序列比较,典型地,一个序列充当参考序列,来 与待测序列进行比较。
当使用序列比较算法时,测试序列和参考序列 被输入到计算机中,指定亚序列坐标系,如果需要,还要设定序列算法 程序的参数。
使用默认的程序参数。
序列比较的比对方法是本领域 公知的。
可进行序列比较的最佳比对通过如下方法进行:例如Smith 和Waterman,Adv.Appl.Math.2:482(1981)的局部同源性算法, Needleman和Wunsch,J.Mol.Biol.48:443(1970)的同源性比对算法, Pearson&Lipman,Proc.Nat’l.Acad.Sci.USA 85:2444(1988)的相似性 检索法,这些算法的计算机处理(GAP,BESTFIT,FASTA,和 TFASTA,Wisconsin Genetics Software Package,Genetics Computer Group,575 Science Dr.,Madison,WI),或通过人工比对和肉眼检察(参 见,例如现代分子生物学手册(Current Proctocols in Molecular Biology) (Ausubel等编辑,1995增补本))。
一个有用算法的例子是PILEUP。
PILEUP利用Feng & Doolittle,J. Mol.Evol.35:351-360(1987)的改进比对法的简化方法。
该方法类似于 Higgins & Sharp,CABIOS 5:151-153(1989)所描述的方法。
利用 PILEUP,比较参考序列与其它的测试序列来测定序列同一性的百分 比,使用下面的参数:默认缺口权值(3.00),默认缺口长度权值(0.10),以 及加权的末端缺口。
PILEUP可从GCG序列分析软件包中获得,例 如,7.0版本(Devereaux等,Nuc.Acids Res.12:387-395(1984)。
另一个适于测定百分序列同一性和相似性的算法的例子是 BLAST和BLAST 2.0算法,其被描述在Altschul等,J.Mol.Biol.215: 403-410(1990)和Altschul等,Nucleic Acids Res.25:3389-3402(1977)) 中。
进行BLAST分析的软件可通过国家生物工程信息中心(http://www. ncbi.nlm.nih.gov/)获得。
BLASTN程序(用于核苷酸程序)使用默认 的字节长(W)为11,校验值(B)为50,期望值(E)为10,M=5,N=-4, 和两个链的比较。
BLASTP程序(用于氨基酸序列)使用默认的字节 (W)长为3,期望值(E)为10,以及BLOSUM62得分矩阵(参见 Henikoff & Henikoff,Proc.Natl.Acad.Sci.USA 89:10915(1989))。
″严格杂交条件″是指50%甲酰胺,5×SSC和1%SDS在42℃下 温育或5×SSC和1%SDS 65℃下温育,并用0.2×SSC和0.1%SDS在 65℃下洗涤。
″自然产生的″这一术语,对研究对象而言是指研究对象可在自然 中找到。
例如,可从天然源中分离得到并没有经过人在实验室中进行 的有意的改造的存在于生物体(包括病毒)中的氨基酸或核苷酸序列。
就可称其为“天然产生的”。
“接头”是指通过共价键或离子键、范德华力或氢键将两个分子 连接在一起的分子,例如,与一互补序列在5’末端杂交并与另一互补 序列在3’末端杂交的核酸分子由此将两个非互补的序列连接起来。
“药物组合物”是指适于在哺乳动物中使用的组合物。
药物组合 物含有药学有效量的活性剂及可药用载体。
“药学有效量的”是能产生所希望的药学结果的有效药剂的量。
“可药用载体”是指任何标准的药物载体、缓冲剂和赋形剂如磷 酸盐缓冲液、5%葡萄糖水溶液、乳液如油/水乳液或水/油乳液和各种 类型的湿润剂和/或佐剂。
合适的药物载体和制剂被描述于Remington’s Pharmaceutical Sciences,第19版,Mack Publishing Co.,Easton,1995 中。
优选的药物载体取决于所希望的活性药物的给药方式。
给药的典 型方式包括肠内(例如,口服)或肠胃外(例如,皮下、肌肉内、静 脉内或腹膜内注射)或局部、经皮或经粘膜给药。
“可药用盐”是可 配制成可药用化合物的盐,例如,金属盐(钠、钾、镁、钙盐等), 以及铵或有机胺的盐。
用于诊断或治疗的″个体″是人或非人的哺乳动物。
组合物的″给药″是指通过一个选择的途径将组合物导入到个体 中,例如,如果所选的途径是静脉内施用,则组合物被通过导入组合 物到个体的血管中来给药。
″治疗″是指预防性治疗或治疗性治疗。
″预防性″治疗是给药于没有显示疾病症状或显示早期症状的个体 来减少病症发展的危险。
″治疗性″治疗是一种给药于表现出病症的个体进行的治疗,目的 是减小或消除这些症状。
″诊断″是指鉴定病症状况的存在或特性。
诊断的方法根据其敏感 性和特异性而不同。
诊断方法的“敏感性”是指进行试验呈阳性的患 病个体的百分数(真阳性的百分数)。
诊断方法的“特异性”是指1 减去假阳性率,其中的假阳性率是指那些试验呈阳性但是却没有患病 的比例。
而一种特定的诊断方法有可能不能提供出一种病况的确定性 诊断,如果该方法提供了有助于诊断的阳性显示,其就足够了。
″预诊″是指对一种病症可能性进展(例如,严重性)的预测。
III.TARP 本发明提供分离的重组的TARP。
因为我们首先发现了分离的 前列腺特异性TCRγ转录本,我们最初使用术语“PS-TCRγ蛋白”和 “PS-TCRγ多肽”来代表能够从约1.1kb PS-TCRγ转录本开始的任何阅 读框架中翻译的任何多肽。
具体地讲,该术语是指两种在体外翻译系 统中翻译的蛋白PS-TCRγ-1(SEQ ID NO:14)和PS-TCRγ-2(SEQ ID NO:15)。
我们现在已知道只有这些阅读框架的第一个在前列腺细胞中 被翻译。
因为这个阅读框架不是产生TCRγ链的阅读框架,该蛋白目 前被称为“T细胞受体可变阅读框架蛋白”。
全长TARP是一个58氨 基酸的蛋白,其序列被描述于SEQ ID NO:14和附图14中。
在某些的实施方案中,本发明提供了含有包含从TARP的至少5 到至少15个保守氨基酸的表位的多肽。
这样的蛋白与抗全长TARP 的抗体结合(在此部分,除非上下文的其它需要,“TARP”是指全 长蛋白)。
其它的实施方案中,本发明提供了含有第一和第二多肽部 分的融合蛋白,其中一个蛋白部分含有被鉴定为TARP表位的至少5 个氨基酸的氨基酸序列。
在一个实施方案中,TARP部分是指TARP 的全部或基本上全部的TARP。
另外一部分可以是一个例如免疫原性 蛋白。
这样的融合子也可以被用于激发抗TARP的免疫反应。
在本发 明其它的实施方案中提供了TARP样肽(“TARP类似物”),其氨 基酸序列至少90%相同于TARP(虽然它们可能具有相对于TARP 91%,92%,93%,94%,95%,或更高的序列同一性)且其被与TARP 特异性结合的抗体特异性地结合。
在其它实施方案中,本发明提供了 TARP样肽(有时此处也称为“TARP类似物”),其氨基酸序列至 少90%相同于TARP(虽然它们可能具有相对于TARP 91%,92%,93%, 94%,95%,或更高的序列同一性)且激活T淋巴细胞抵抗表达TARP 的细胞。
这样的蛋白也可用作免疫原以阻断对PS-TCRγ蛋白的耐受。
在另一个实施方案中,所述多肽含有结合于MHC分子例如HLA 分子或DR分子的表位。
这些分子结合于具有由大约8或9个氨基酸 所间隔的校正锚氨基酸的多肽。
这些肽可通过检测TARP的氨基酸序 列或者通过本领域技术人员所公知的有关MHC结合基元的知识进行 鉴定。
TARP、其免疫原性片段和TARP类似物,可被重组合成。
TARP 的免疫原性片段和TARP自身的58个残基也可通过常规的方法化学 合成。
如果需要,多肽也可通过已有技术来化学合成。
一种这样的方 法被描述于W.Lu等,Federation of European Biochemical Societies Letters.429:31-35(1998)。
IV.TARP核酸 本发明的一个方面提供了含有编码TARP多肽的核苷酸序列的分 离的重组核酸分子(参见,例如附图14)。
该核酸可被用于表达TARP, 然后所表达的TARP可被用于例如产生用于治疗目的的抗体。
如上所 述,该核酸分子具有3个阅读框架,每一个编码由不同可读框所定义 的多肽。
  在此处所述的实施方案中,目的阅读框架就是编码TARP 的阅读框架。
如上所述,两个阅读框架在体外翻译系统中被翻译。
获自LNCaP cDNA的约1.1 kb PS-TCRγ转录本(SEQ ID NO:13)的核苷酸序列和 当转录本在核苷酸位置74(PS-TCRγ-1,SEQ ID NO:14)以及核苷酸位 置247(PS-TCRγ-2,SEQ ID NO:15)的起始密码子开始被翻译的推导的 氨基酸序列被描述在附图1中。
转录的起始点(加下划线)在Jγ1.2区 段的前10个核苷酸内。
序列的数据可获自EMBL/GenBank/DDBJ,其 登录号为AF151103。
应说明的是现在已证实真正的″+1″位置是附图1 所示的序列的第6个核苷酸。
研究者可以利用这个序列制备PCR引物,用于分离本发明的核 苷酸序列。
LNCaP细胞是约1.1 kb转录本序列cDNA的有用的来源。
来自尚未进行TCRγ基因重排的人细胞(例如,除了T-淋巴细胞前体 之外的细胞)的基因组DNA,可用作在转录后被加工成为约1.1 kb转 录本的长序列。
该序列可利用公知技术被修饰成为一个编码本发明相 关分子的核酸。
含有本发明序列的核酸分子可用体外的方法被克隆或扩增,例如 聚合酶链式反应(PCR),连接酶链式反应(LCR),以转录为基础 的扩增系统(TAS),自我维持的序列复制系统(3SR)和Qβ复制酶扩 增系统(QB)。
例如,编码所述蛋白的多核苷酸可利用以该分子的DNA 序列为基础的引物通过cDNA的聚合酶链式反应被分离。
众多的克隆和体外扩增方法是本领域技术人员所公知的。
PCR方 法被描述在,例如,U.S.专利.No.4,683,195;Mullis等(1987)Cold Spring Harbor Symp.Quant.Biol.51:263;和Erlich,ed.,PCR TECHNOLOGY,(Stockton Press,NY,1989)。
多核苷酸也可通过在严格 杂交条件下用选自目的多核苷酸序列的探针筛选基因组或cDNA文库 进行分离。
核酸的工程化形式可通过编码所述蛋白的多核苷酸的定点诱变来 进行,或通过加入0.1mM MnCl2和不平衡浓度的核苷酸增加PCR反 应中原始多核苷酸中错误率导致的随机突变来进行。
1.表达载体 本发明也提供了用于表达由TARP转录本编码的多肽的表达载 体。
表达载体可通过包含用于转录和mRNA的翻译的适宜的启动子、 复制序列、标记物等来使其适用于真核和原核表达系统。
表达载体的 构建和在转染细胞中基因的表达涉及本领域公知的分子克隆技术的应 用。
Sambrook等,MOLECULAR CLONING--A LABORATORY MANUAL,Cold Spring Harbor Laboratory,Cold Spring Harbor,NY, (1989)和CURRENT PROTOCOLS IN MOLECULAR BIOLOGY,F.M. Ausubel等编辑,(Current Protocols,a joint venture between Greene Publishing Associates,Inc.以及John Wiley & Sons,Inc.)。
用于这样 目的的有用启动子包括金属硫蛋白启动子,组成型腺病毒主要后期启 动子,地塞米松诱导型MMTV启动子,SV40启动子,MRP polIII启 动子,组成型MPSV启动子,四环素诱导型CMV启动子(例如,人早 早期CMV启动子),以及组成型CMV启动子。
用于基因治疗的质粒 可能包括其它的功能元件,例如可选择的标记、鉴别区和其它的基因。
用于本发明的表达载体依赖于其目的用途。
当然这样的表达载体 必须含有与宿主细胞相容的表达和复制信号。
用于表达生物活性结合 物的表达载体包括病毒载体,例如逆转录病毒、腺病毒和腺相关病毒, 质粒载体,粘粒,等等。
病毒和质粒载体优选转染哺乳动物细胞。
其 中表达控制序列含有CMV启动子的表达载体pcDNA1(Invitrogen,San Diego,CA),提供了较好的转染和表达率。
腺相关病毒载体在本发明 中适用于基因治疗的方法。
很多的方法适用于将多核苷酸传递到细胞,包括,例如由细胞从 溶液中直接摄取分子,通过脂质转染法(例如脂质体或免疫脂质体) 协助摄取,颗粒介导的转染,以及从具有可操作连接于编码抑制性多 核苷酸的核苷酸序列的表达调控序列的表达盒进行胞内表达。
参见U.S. 专利5,272,065(Inouye等);酶学方法,vol.185,Academic Press,Inc., San Diego,CA(D.V.Goeddel,ed.)(1990)或M.Krieger,GENE TRANSFER AND EXPRESSION-A LABORATORY MANUAL, Stockton出版社,New York,NY,(1990)。
虽然通过体外化学合成法制 备短的寡核苷酸更经济,重组DNA表达质粒也被用于制备本发明的 多核苷酸,用于通过除基因治疗以外的方法进行传递。
构建体也可以含有一个标记物从而简化蛋白的分离程序。
例如, 一个多组氨酸标记,例如,六个组氨酸残基可在蛋白的氨基末端被引 入。
多组氨酸标志使得蛋白仅通过镍-螯合层析法一步即可提取。
2.重组细胞 本发明也提供了含有用于表达本发明核苷酸序列的表达载体的重 组细胞。
可选择高水平表达的宿主细胞来纯化蛋白。
细胞可以是原核 生物细胞,例如E.coli,或真核细胞。
有用的真核细胞包括酵母和哺 乳动物细胞。
该细胞可以是例如,在培养物中的重组细胞或体内细胞。
表达TARP的细胞适用于使个体抵抗表达这些肽的细胞的主动或 被动免疫。
在特定的实施方案中,这些细胞是细菌细胞。
在主动免疫 的情况下,重组细胞是个体的自身固有的细胞,其可以与HLA分子 联合提呈多肽。
例如抗原提呈细胞就适用于该目的。
在此情况下,其 优选利用“自身固有的细胞”,也即这些细胞来源于个体。
这样的细 胞是MHC相容性的。
编码TARP的核苷酸序列在这样的细胞中应该 被一个组成型启动子控制,因为一个目的就是在细胞表面表达高密度 的蛋白,优选的,表达比健康前列腺上皮细胞具有更大密度的多肽。
V.激发抗表达TARP细胞的细胞介导的免疫反应的方法 TARP由上皮来源的前列腺癌细胞和很多乳房癌细胞表达。
因此, TARP可被用作干预治疗前列腺癌和表达TARP的乳房癌的靶,也可 被用作分别从前列腺或乳房转移的癌细胞的标志物。
本发明提供了免 疫治疗学的方法用于治疗前列腺癌和表达TARP的乳房癌。
本发明涉 及对个体进行免疫,使之抗TARP,即激发抗表达TARP细胞的细胞 介导的免疫反应。
免疫可以是主动的或被动的。
在主动免疫中,免疫 反应在个体体内被激发。
在被动免疫中,被激活的抗多肽的Tc细胞 在体外培养并给药于个体。
预料这样的方法导致表达TARP的健康上 皮前列腺组织被破坏。
然而,前列腺并非重要的器官,其损伤必然抵 消个体由于前列腺癌导致的寿命的减少,且前列腺实际上可在建立 TARP免疫治疗前通过外科手术去除。
因为正常的乳房组织尚未发现 表达大量的TARP,抗表达TARP细胞的免疫反应并未表现出导致女 性正常细胞的损伤。
因此TARP组合物可预防给药于女性来提供免疫, 防止表达TARP的乳房癌发育到后期。
免疫剂可以是全长的TARP,含有TARP的抗原决定基的肽,例 如,TARP的免疫原性片段,或基本上等同于TARP的蛋白或肽。
当 激发抗TARP的细胞介导的免疫反应时含有抗原决定基的优选肽是带 有个体的HLA分子的结合基元的肽。
这些基元是本领域公知的。
例 如HLA-A2是人类的一个普遍的等位基因。
此分子的结合包括具有在 第二位具有亮氨酸或甲硫氨酸且在最后位置为缬氨酸或亮氨酸的9或 10个氨基酸的多肽。
基于TARP的多肽序列,可鉴定含有任意特定的 HLA分子的基元的氨基酸序列。
可通过任一典型的方法(例如,重组法, 化学法,等等)制备含有这些基元的肽。
因为TARP是一种自身蛋白, 优选的含有HLA结合基元的氨基酸序列为那些编码亚显性的或阴性 的表位的氨基酸序列。
这些表位可通过HLA分子的与分子中的其它 表位相比的较低的结合亲合力或与其它的结合于HLA分子的分子比 较来鉴定。
含有来自包括HLA结合基元的TARP的氨基酸序列的多肽也适 用于激发免疫应答。
在一定程定上,因为,这样的蛋白将被细胞加工 为可结合于HLA分子且具有TARP表位的肽。
HLA分子和肽抗原的复合物充当被HLA限制性T细胞识别的配 体(Buus,S.等,Cell 47:1071,1986;Babbitt,B.P.等,Nature 317: 359,1985;Townsend,A.和Bodmer,H.,Annu.Rev.Immunol.7:601,1989; Germain,R.N.,Annu.Rev.Immunol.11:403,1993)。
通过单氨基酸替 代的抗原类似物的研究和内源结合的自然加工的肽的测序,与特异性 结合于HLA抗原分子所必需的基元相对应的关键残基已被鉴定(参见, 例如.,Southwood,等,J.Immunol.160:3363,1998;Rammensee,等, Immunogenetics 41:178,1995;Rammensee等,Sette,A.和Sidney,J.Curr. Opin.Immunol.10:478,1998;Engelhard,V.H.,Curr.Opin.Immunol.6: 13,1994;Sette,A.和Grey,H.M.,Curr.Opin.Immunol.4:79,1992)。
此外,HLA-肽复合物的x-射线晶体学分析显示在HLA分子的肽 结合性裂口中的口袋(蛋白质的立体结构)以等位基因的方式容纳通 过肽配体含有的残基;这些残基反过来决定了含有这些残基的肽与 HLA结合的能力。
(参见,例如.,Madden,D.R.Annu.Rev.Immunol.13: 587,1995;Smith,等,Immunity 4:203,1996;Fremont等,Immunity 8: 305,1998;Stern等,Structure 2:245,1994;Jones,E.Y.Curr.Opin. Immunol.9:75,1997;Brown,J.H.等,Nature 364:33,1993)。
相应地,I类和II类等位基因特异性的HLA结合基元或I类和II 类超级基元的定义,涵盖具有结合特定的HLA分子的可能性的TARP 的区域。
与TARP有高度序列同一性的分子对于激发免疫反应也是有用 的。
此种分子可以被免疫系统识别为“外源的”,产生抗体或与TARP 发生交叉反应的CTL。
与TARP具有高度序列同一性的分子包括非人 源的TCRγ同源物,特别是来自灵长目的。
氨基酸序列至少与TARP有 90%(虽然其可为91%,92%,93%,94%,95%,或甚至与TARP有更高 的序列同一性)相同且其特异性地结合于与TARP特异性结合的抗体 的TARP类似物可以被使用。
此外,在此方面被认为有用的还有TARP 类似物,也即,其氨基酸序列与TARP至少90%(虽然其可为91%,92%, 93%,94%,95%,或甚至与TARP有更高的序列同一性)相同且激活T- 淋巴细胞使之抵抗表达TARP的细胞的肽。
另一个与TARP抗原决定基基本上同源的分子可通过修饰天然 TARP表位的序列使其以较大的亲合力结合于HLA分子来制备。
鉴定编码抗原决定基的基因的方法如下:获自患有转移性癌症的 个体的TIL被培养并测试其在体外识别自体固有癌的能力。
将这些TIL 给药到个体中以识别导致肿瘤消退的TIL。
这些TIL被用于筛选表达 被TIL识别的表位的基因的表达文库。
然后用这些基因免疫个体。
可 选择地,在体外致敏淋巴细胞来抵抗这些基因编码的抗原,然后致敏 的淋巴细胞被转移到个体体内并测试其导致肿瘤消退的能力。
Rosenberg,等,(1997)Immunol.Today 1997 18:175。
这些分子的应用现在已被描述。
这些方法也被描述在Rosenberg 等.(1997)Immunol.Today 18:175和Restifo等.(1999)Oncology 11: 50。
一种引起免疫应答的方法包括单独地用含有来自TARP的抗原决 定基的多肽免疫个体,或者更优选地与佐剂结合,例如弗氏不完全佐 剂,类脂或脂质体,gp96,Hsp70或Hsp90。
多肽可以为TARP,TARP 的抗原片段,含有抗原决定基的融合蛋白,或含有与这样的抗原决定 基大体上相同的序列的肽。
另一个方法包括将含有来自TARP的表位的肽结合到抗原提呈细 胞上并将细胞给药于个体。
在另一个方法中,将在表达盒中含有编码具有来自TARP抗原决 定基的多肽的核酸序列的重组病毒给药于个体。
所述病毒选择性地也 可编码细胞因子(例如,IL-2)、共刺激分子或其它的增强免疫应答的基 因。
病毒可以是,例如,腺病毒、鸟痘病毒或牛痘病毒。
通过感染, 感染的细胞将表达TARP肽并在与具有和抗原决定基相同基元的肽结 合的HLA分子结合的情况下在细胞表面表达表位。
这些细胞然后激 活能识别被提呈的抗原的CTL,导致含有决定基的癌细胞的破坏。
在另一个方法中,通过,例如,肌内、biolistic注射或与脂类连 接,个体用编码含有来自TARP的抗原决定基的多肽的裸DNA致免 疫。
此方法显示产生了对细胞介导的抵抗表达所述编码多肽的细胞的 应答的刺激。
在另一种方法中,表达表位的重组细菌例如Bacillus Calmette- Guerin(BCG),Salmonella或Listera给药于个体,可选择地,重组细菌 也编码细胞因子、共刺激分子或其它增强免疫应答的基因。
在另一种方法中,表达抗原的细胞被给药于个体。
包括,例如, 用TARP表位刺激的树突状细胞,用含有TARP抗原决定基的多肽、 HLA和B7基因转染的细胞。
多重转染导致产生了一些对于将抗原决 定基提呈到细胞表面上所必需的几个组分。
在一个实施方案中,分子 为一种融合蛋白,含有抗原决定基的多肽被融合于HLA分子(通常 通过接头)来提高肽与HLA分子的结合。
在一个实施方案中,细胞 为抗原提呈细胞。
优选的,细胞为真核细胞,较优选的为哺乳动物细 胞,更优选的为人细胞,最优选的为获自所述个体的自体固有的人细 胞。
在另一种方法中,抗原提呈细胞(APC)在体外被刺激或与含有来 自TARP的表位的肽共温育。
这些细胞被用于致敏CD8细胞,如来自 前列腺癌肿瘤或外周血淋巴细胞的肿瘤浸润淋巴细胞。
TIL或PBL优 选来自所述个体。
然而,它们至少为在个体具有的HLA型所限制的 MHC I类细胞。
这些致敏细胞然后给药于个体。
在补充的方法中,任意的这些免疫疗法通过给药细胞因子被加 强,例如IL-2,IL-3,IL-6,IL-10,IL-12,IL-15,GM-CSF,干扰素。
除了上述评价肽的免疫原性的方法外,免疫原性也可以通过评价 来自正常个体的初级T细胞培养物来进行(参见,例如,Wentworth,P. A.等,Mol.Immunol.32:603,1995;Celis,E.等,Proc.Natl.Acad.Sci. USA 91:2105,1994;Tsai,V.等,J.Immunol.158:1796,1997; Kawashima,I.等,Human Immunol.59:1,1998);  通过HLA转基因鼠 的免疫来进行(参见,例如,Wentworth,P.A.等,J.Immunol.26:97,1996; Wentworth,P.A.等,Int.Immunol.8:651,1996;Alexander,J.等,J. Immunol.159:4753,1997),以及通过证实已被有效接种或具有肿瘤的患 者的记忆T细胞应答来进行(参见,例如,Rehermann,B.等,J.Exp.Med. 181:1047,1995;Doolan,D.L.等,Immunity 7:97,1997;Bertoni,R.等,J. Clin.Invest.100:503,1997;Threlkeld,S.C.等,J.Immunol.159: 1648,1997;Diepolder,H.M.等,J.Virol.71:6011,1997)。
在选择用于疫苗组合物的CTL诱导性目的肽时,与I类HLA分 子有较高结合力的肽是优选的。
肽的结合被通过测试候选肽与纯化的 HLA分子在体外结合的能力来进行评价。
为确保TARP类似物当用作疫苗时能在体内引起CTL对TARP 的应答(或者,为II类表位时激发与野生型肽交叉反应的辅助T细胞), TARP类似物可被用于在体外免疫来自含适当HLA等位基因的个体 的T细胞。
其后,评价免疫细胞诱导TARP致敏靶细胞的溶解的能力。
通常,来自TARP的肽或其类似物(本发明的肽)被合成,并测 定其结合HLA蛋白和激活HTL或CTL应答或二者的能力。
常规的用于检测T细胞应答的试验包括增殖试验,淋巴因子分泌 试验,直接细胞毒性试验,以及有限稀释试验。
例如,与肽温育的抗 原提呈细胞被检测其在效应器细胞群中诱导CTL应答的能力。
PBMC可被用作CTL前体的效应器细胞来源。
合适的抗原提呈 细胞被与肽温育,然后负载肽的抗原提呈细胞在最适培养条件下与效 应器细胞温育。
阳性CTL激活可通过在培养物中测定杀死放射性标 记靶细胞的CTL的存在,特异性肽刺激的靶以及表达由其获得肽序列 的抗原的内源被加工形式的靶细胞来检测。
抗原特异性T细胞的直接定量检测的方法是用荧光素标记的HLA 四聚体复合物染色法(Altman等,Proc.Natl.Acad.Sci.USA 90:10330 (1993);Altman等,Science 274:94(1996))。
可选择的,胞内淋巴因子 的染色,γ干扰素释放分析或ELISPOT试验,可被用于评价T-细胞应 答。
HTL活化可通过本领域公知的技术来评价,例如T细胞增殖和 淋巴因子例如IL-2的分泌(参见,例如Alexander等,Immunity 1:751- 761(1994))。
VI.抗TARP的抗体 本发明的一个方面提供了一种含有特异性结合TARP的抗体的组 合物。
抗体优选具有至少106M-1,107M-1,108M-1,或109M-1亲和性。
本 发明包括多克隆和单克隆抗体组合物。
很多免疫原可被用来产生特异性与TARP结合的抗体。
全长TARP 是合适的免疫原,典型地,目的免疫原为至少大约3个氨基酸的肽, 更典型地,肽至少为5个氨基酸,优选的该片段至少为10个氨基酸 长,更优选的片段的长度为15个氨基酸。
所述肽可与载体蛋白偶联 (例如,作为融合蛋白),或在免疫载体中进行重组表达。
抗体与之 结合的肽上抗原决定基通长为3-10个氨基酸。
天然存在的多肽可以纯 净的或未纯化的形式使用。
在原核或真核细胞中表达重组的多肽并采用标准技术进行纯化。
将该多肽或其合成的形式注射到能产生抗体的动物中,可产生单克隆 或多克隆抗体,它们随后可用于免疫测定以定性和安量地测量所述的 多肽。
生产多克隆抗体的方法是本领域技术人员公知的。
简言之,将免 疫原(优选纯净形式的多肽、与合适的载体(如GST、鍉孔血蓝蛋 白等)偶联的多肽或掺入到致免疫载体的重组牛痘病毒(参见US专 利No.4722848)中的多肽)与佐剂混合并用混合物免疫动物。
动物对 免疫原制剂的免疫应答被通过取待测血液,并测定对目的多肽反应的 滴度来监测。
当获得对免疫原的合适的高滴度的抗体时,从动物中收 集血液并制备抗血清。
如需要,进一步分级分离抗血清使其富含与多 肽反应的抗体,参见,例如,Coligan(1991)CURRENT PROTOCOLS IN IMMUNOLOGY Wiley/Greene,NY;以及Harlow和Lane(1989) ANTIBODIES:A LABORATORY MANUAL Cold Spring Harbor Press, NY。
针对TARP预定片段的抗体,包括结合性片段及其单链重组变 体,可通过用例如与上述载体蛋白结合的片段的结合物免疫动物来产 生。
单克隆抗体由分泌目的抗体的细胞制备。
这些抗体被筛选用于结 合正常的或修饰的多肽,或用于激动或拮抗活性的筛选。
在一些情况 下,从不同的哺乳动物宿主例如小鼠、啮齿动物、灵长目、人等宿主 中制备单克隆抗体是可行的。
制备这样的单克隆抗体的技术被描述在 例如,Stites等(编辑)BASIC AND CLINICAL IMMUNOLOGY(4th ed.) Lange Medical Publications,Los Altos,CA,此处引入作为参考;Harlow 和Lane,同上;Goding(1986)Monoclonal Antibodies:Principles and Practice(2d ed.)Academic Press,New York,NY;以及,Kohler和 Milstein(1975)Nature 256:495-497。
其它合适的技术涉及筛选噬菌体或类似载体中重组抗体文库的技 术。
参见,Huse等.(1989)Science 246:1275-1281;以及Ward,等. (1989)Nature 341:544-546。
同样,重组免疫球蛋白可被生产。
参见美国专利No.4,816,567 (Cabilly)和Queen等.(1989)Proc.Nat′l Acad.Sci.USA 86:10029- 10033。
通常,多肽和抗体通过共价或非共价连接提供可检测信号的物质 而被标记。
大量的标记物和连接技术是已知的且被广泛公开在科学和 专利文献上。
因此用于检测待分析物的抗体可被可检测的部分直接标 记,或例如通过将所述抗体与被直接或间接标记的第二抗体结合而进 行间接标记。
本发明的抗体也被用于在TARP分离中的亲和层析。
例如,制备 带有与固体支持物例如颗粒如琼脂糖、交联葡聚糖凝胶等连接的抗体 的柱子,使细胞溶解产物通过此柱,洗涤,用浓度递增的温和变性剂 处理,由此纯化的TARP被释放出来。
一种可选择的方法是通过重组DNA技术将非人源抗体的CDR区 连接到人保守区产生人源化的免疫球蛋白。
参见美国专利5,585,089 (Queen等)。
另一个分离编码人单克隆抗体或其结合性片段的DNA序列的方 法是通过从人B细胞中筛选DNA文库,其相应的常规操作参见Huse 等,Science 246:1275-1281(1989),然后克隆和扩增编码具有所需特 异性的抗体(或结合性片段)的序列。
Huse所描述的操作与噬菌体展 示技术结合会更有效,参见,例如WO 91/17271(Dower等)和WO 92/01047(McCafferty等)。
噬菌体展示技术也可被用于诱变先前显示 对TARP有亲合力的抗体的CDR区。
结合亲和性得以改善的抗体被 选择出来。
在本发明的另一个实施方案中,提供了抗TARP或蛋白类似物的 抗体的片段。
典型地,这些片段表现出类似于完整免疫球蛋白的与 TARP结合的特异性。
这些抗体片段包括分离的重链,轻链Fab, Fab′F(ab′)2和Fv。
片段通过重组DNA技术,或通过完整免疫球蛋白 的酶解或化学分离产生。
VII.靶向TARP的嵌合分子 本发明提供了靶向TARP的嵌合分子。
嵌合分子含有一个靶向部 分和一个效应器部分。
嵌合蛋白对于所述多肽和含有它的细胞的检测 是有用的。
A.靶向部分 本发明的嵌合分子含有一个靶向部分,该靶向部分含有一个特异 性结合TARP的配体。
优选的配体为抗体,此处所用的该术语包括抗 体的结合性片段。
然而,其它的这些分子的天然配体也可被使用。
B.效应器部分 效应器部分可为另一个特异性结合部分例如抗体、生长因子或配 体。
嵌合分子充当一个高度特异的双功能接头。
此接头可连接和增强 融合蛋白所结合的细胞或细胞组分之间的相互作用。
在另一个实施方案中,效应器分子可以是药剂(例如,药物)或 含有药剂的载体。
因此,特异性结合于TARP的部分可与药物例如长 春碱、阿霉素、金雀异黄素(酪氨酸激酶抑制剂),反义分子以及其它 的本领域技术人员公知的药剂轭合,由此特异性地使药剂靶向肿瘤细 胞。
可选择地,靶向分子可结合于含有治疗组合物的载体。
这样的载 体包括但不限于脂质体,胶束,各种合成的珠子等。
本领域的技术人员可以理解本发明的嵌合分子可包括结合一个效 应器的多个靶向部分或相反结合一个靶向部分的多个效应器。
在另一 个实施方案中,嵌合分子也可同时包括多个靶向部分和多个效应器的 分子。
适于作为本发明的嵌合分子的效应器分子组分的可检测的标记 包括通过光镜、光化学的、生物化学的、免疫化学的、电学的、目测 的或上述所有化学方式可检测的任意组分。
本领域技术人员可以理解靶向分子和效应器分子可以以任意的顺 序连接。
因此,当其中的靶向分子为多肽,效应器分子可被连接于靶 向分子的氨基端或羧基端。
靶向分子也可被连接到效应器分子的中间 区域,或相反,效应器分子被连接到靶向分子的中间区域,只要这种 连接不影响各自分子的活性。
靶向分子和效应器分子可通过本领域技术人员公知的任意方式连 接。
典型地,效应器分子被直接或通过接头(间隔区)连接于靶向分 子。
然而,当效应器分子和靶向分子都是多肽时,优选重组表达嵌合 分子作为单链融合蛋白。
在一个实施方案中,靶向分子被化学结合于效应器分子(例如细 胞毒素,标记物,配体,或药物或脂质体)。
化学结合分子的方法是 本领域公知的。
将试剂结合到抗体或其它多肽靶向分子的方法可依据 试剂的化学结构而变化。
多肽典型地含有不同的功能基团,例如,羧 酸(COOH)或自由胺(-NH2)基团,其可通过与合适的功能团在效应 器分子上反应来与效应器结合。
可选择地,靶向分子和/或效应器分子 可被衍生化以暴露或连接其它的反应功能基团。
衍生化反应可包括 连接任意的接头分子,例如获自Pierce化学药品公司(Rockford Illinois)的那些。
具有一个与特定试剂的基团反应的功能性基团以及另一个与抗体 反应的基团的双功能接头,可被用来形成目的免疫结合物。
可选择地, 衍生化反应包括靶向分子的化学处理,例如,糖蛋白抗体的糖部分用 高碘酸盐进行乙二醇裂解来产生自由醛基团。
抗体上的自由醛基团可 与试剂上的自由胺或肼基团反应来与试剂结合。
(参见美国专利 4,671,958)。
在多肽例如抗体或抗体片段上产生自由巯基基团的方法是 已知的(参见美国专利4,659,839)。
不同的化合物包括放射性核素金属蝥合物、毒素和药物连接到蛋 白例如抗体上的多种方法和接头分子是已知的,参见,例如欧洲专利 申请No.188,256;美国专利4,671,958;4,659,839;4,414,148; 4,699,784;4,680,338;4,569,789;以及Borlinghaus等,Cancer Res.47: 4071-4075(1987)。
具体地讲,各种免疫毒素的生产在本领域是已知的 且可在″Monoclonal Antibody-Toxin Conjugates:Aiming the Magic Bullet″,Thorpe等,MONOCLONAL ANTIBODIES IN CLINICAL MEDICINE,Academic Press,第168-190页(1982),Waldmann,Science, 252:1657(1991),美国专利4,545,985和4,894,443中找到。
当靶向分子和/或效应器分子相对比较短(例如不到50个氨基酸) 时,它们可通过标准的化学肽合成技术来合成。
当两个分子都相对比 较短时,嵌合分子作为一个单独的连续的多肽可被合成。
可选择的, 靶向分子和效应器分子可被分别合成然后通过一个分子的氨基末端与 另一个分子的羧基末端的缩合反应形成肽键而被融合。
可选择的,靶 向分子和效应器分子可与肽间隔分子的一个末端缩合来形成无间隔的 融合蛋白。
一序列的C-末端氨基酸被连接于一个不溶性支持物然后在序列 中能够依次增加氨基酸的固相合成是本发明的肽的化学合成的优选的 方法。
固相合成的技术被描述于Barany和Merrifield,Solid-Phase Peptide Synthesis;第3-284页。
The Peptides:Analysis,Synthesis,Biology. Vol.2:Special Methods in Peptide Synthesis,Part A.,Merrifield等,J. Am.Chem.Soc.,85:2149-2156(1963),和Stewart等,Solid Phase Peptide Synthesis,第二版,Pierce Chem.Co.,Rockford,Ill.(1984)。
在一个优选的实施方案中,嵌合融合蛋白通过重组DNA技术来 合成。
通常,该技术包括生成编码融合蛋白的DNA序列,在特定启 动子的调控下将DNA置于表达盒中,在宿主中表达蛋白,分离表达 的蛋白以及,如需要的话,让蛋白复性。
本发明的编码融合蛋白的DNA可通过合适的方法被制备,包括, 例如,克隆和适当序列的限制性酶切或通过下列的方法直接化学合 成,例如Narang等,Meth.Enzymol.68:90-99(1979)中所述的磷酸三 酯法;Brown等,Meth.Enzymol.68:109-151(1979)中所述的磷酸二酯 法;Beaucage等,Tetra.Lett.,22:1859-1862(1981)中所述的二乙基 亚磷酰胺法;以及美国专利No.4,458,066中的固相支持体法。
当两个分子优选地基本上直接相连接时,本领域的技术人员可以 理解,分子可被含有一个或更多个氨基酸的肽间隔区隔开。
通常,间 隔区除了连接蛋白或保留最小的距离或其它的空间联系外没有特异的 生物活性。
然而,间隔区的组成性氨基酸可被选择来改变分子的一些 特性例如折叠、净电荷或疏水性。
编码融合蛋白的核酸序列可在不同的宿主细胞中表达,包括E. coli,其它的细菌宿主,酵母,以及各种高等的真核细胞例如COS, CHO和HeLa细胞系和骨髓瘤细胞系。
重组蛋白的基因被可操作地 连接于对每一宿主而言适当的表达调控序列。
对E.coli而言包括启动 子例如T7、trp、或λ启动子、核糖体结合位点,并优选地包含转录 终止信号。
对真核细胞而言,调控序列包括启动子和优选的来自免疫 球蛋白基因的增强子,SV40,巨细胞病毒,等等,以及多聚腺苷酸化 序列,也可包括剪接供体和受体的序列。
本发明的质粒和载体可通过 公知的方法被转移到所选择的宿主细胞中,例如氯化钙转化E.coli和 磷酸钙处理或电穿孔处理哺乳动物细胞。
重组融合蛋白一旦被表达,其可通过本领域的常规方法进行纯 化,包括硫酸铵沉淀,亲和柱层析,层析法,凝胶电泳等(参见,R. Scopes,PROTEIN PURIFICATION,Springer--Verlag,N.Y.(1982), Deutscher,METHOD S IN ENZYMOLOGY Vol.182:Guide to Protein Purification.,Academic Press,Inc.N.Y.(1990))。
用于药物的大体上纯 化的组分优选至少含有90%到95%的同质物,含有98到99%或更 多的同质物为最优选的。
纯化后,部分均质或达到所需同质性的多肽 被用于治疗。
VIII.检测表达TARP的细胞的方法 在本发明的另一个方面,提供了检测表达TARP的细胞的方法。
该方法包括检测TARP转录本或多肽。
因为上皮来源的前列腺癌细胞 和很多的乳房癌细胞表达TARP,检测方法对于前列腺癌和表达TARP 的乳房癌的检测是有用的。
具体地,前列腺癌细胞和很多的乳房癌细 胞可通过TARP的表达来区别于其它的细胞。
组织样本可分别地选自原位的或转移性癌的任一可能的位置包括 前列腺或乳房,以及末梢位置例如淋巴结和其它的器官。
本领域的技 术人员知道男性和女性一样患乳房癌。
乳房癌在男性中比较少,仅占 所有乳房癌患者的1%。
因为其不常见,所以通常在晚期才被诊断, 这样就影响了生存的机会。
因此,改进对男性乳房癌的诊断是可取的。
在一个方法中,对个体进行活体组织检查并在体外测试收集的组 织。
典型地,通过溶解、超声波破坏、渗透压、冷冻和融化、酶处理 或其它的本领域常规的方式破坏细胞来提取没有变性的核蛋白。
细胞 的内容物(或核内容物,如果内容物被分级分离了的话)然后被与例如 抗-TARP抗体接触。
产生的任意免疫复合物指示TARP在活体组织检 查样本中的存在。
为了有助于检测,抗体可以被放射性标记或与被放 射性标记的效应器分子偶联。
在另一个方法中,通过典型地显像系统 细胞可被在体内检测。
例如,该方法可包括给药于个体能够到达细胞 核的标记组分。
然后通过任意的已知检测标记的方法来测定标记的位 置。
任意的显像诊断的常规方法可以被使用。
例如,顺磁同位素可被 用于MRI。
TARP的检测 TARP可通过本领域公知的任意方法来鉴定。
在一个实施方案中, 该方法包括检测带有能特异性识别多肽的配体的多肽(例如,免疫测 定)。
本发明的抗体特别适用于TARP的特异性检测。
各种基于抗体的 检测方法是本领域已知。
它们包括,例如,放射免疫测定,夹心免疫 检测(包括ELISA),免疫荧光检测,Western印迹,亲和层析法(亲和 性配体与固相结合),以及带有标记的抗体的原位检测。
另一个检测 TARP的方法包括通过其质量鉴定多肽,例如,通过凝胶电泳,质谱 分析或HPLC。
个体的样本可取自各种适宜的来源,例如唾液、腹液、 血或血产物(例如,血清)、尿、活组织检查组织(例如,淋巴结组织),等 等。
TARP可在细胞中、在体外、在取自活组织检查的样本中以及在 体内使用上述的显像系统来检测。
编码TARP的转录本的检测 表达TARP转录本的细胞的检测可被通过使之接触带有与转录 本特异性杂交的核酸探针的样本并检测杂交来进行。
包括,例如,原 位杂交法,其中的被标记的探针与样本接触并通过检测结合了的标记 来检测杂交。
然而,转录本在样本存在的量可能很少,因此,其它的 方法被用来扩增,例如RT-PCR。
在这些方法中,选择探针,其起到 从mRNA特异性扩增TARP序列的扩增引物的作用。
然后,扩增的序 列被通过典型的方法来检测。
探针被选择以特异性地与TARP转录本杂交。
通常,使用互补 探针。
然而,探针不需要完全的互补,只要其具有足够的序列同源性 和长度来在严格条件下杂交即可。
IX.药物组合物 在另一个方面,本发明提供了一种药物组合物,其含有可药用的 载体以及本发明的组分。
在一个实施方案中,药物组合物含有有效量的能在个体中激发细 胞介导的免疫反应或体液应答的TARP,其免疫原性片段例如含有 TARP表位的多肽,或TARP类似物,例如含有MHC结合基元的多 肽。
这样的药物组合物可用作本发明治疗方法中的疫苗和制备抗体。
在另一个实施方案中,药物组合物含有包含编码以有效量来在个 体中引发抗表达TARP的细胞的免疫反应的TARP多肽的核苷酸的核 酸分子。
这样的组合物在本发明的治疗方法中也是有用的。
在另一个实施方案中,所述药物组合物含有可以特异性裂解编码 TARP的核苷酸序列的核酶,一种可与此核酸结合的反义分子,或含 有编码TARP的核酸的表达盒,来调整TARP在目的细胞中的表达。
在另外一个实施方案中,所述药物组合物可含有包含靶向分子和 指示分子的嵌合分子以检测表达TARP的细胞。
如指示分子是能够特 异性与编码TARP的核酸结合的分子(例如能特异性地与编码TARP 的DNA结合的DNA结合蛋白),则组合物可被用于检测表达此核酸 的细抱。
本发明的药物组合物可被制备成单位剂量的形式来给药于个体。
给药的量和时间取决于医师欲达到的治疗目的。
实施例 实施例1.前列腺细胞中T-细胞受体γ-链的检测 我们发现T-细胞受体γ链(TCRγ)mRNA在人前列腺中表达,并 显示其最初来自前列腺上皮细胞而不是浸润的T-淋巴细胞。
相反,T- 细胞受体δ链(TCRγδ)基因在人前列腺中是沉默的。
前列腺中的大部分 TCRγ转录本与在胸腺、脾脏和白细胞中表达的转录本大小不同。
其在 正常的前列腺上皮中、前列腺的腺癌以及前列腺腺癌细胞系LNCaP中 表达。
RNA来源于未重排的TCRγ座位且在紧挨Jγ1.2基因区段上游的 内含子序列中启始。
含有Jγ1.2和Cγ1基因区段的前列腺特异性TCRγ 转录本,其具有在3’末端包括聚腺苷酸化信号和poly(A)序列的非翻 译序列。
前列腺上皮细胞表达了被认为仅由T淋巴细胞表达的高水平 的来自基因的转录本,此发现是新颖的并大大地出乎意料。
1.材料和方法 RNA点印迹和Northern印迹杂交 对各种人的组织进行RNA点印迹(RNA master blot,Clontech, Palo Alto,CA)和Northern印迹(MTN,Clontech,Palo Alto,CA)。
对来自前列腺癌细胞系,LNCaP和PC-3(ATCC,Rockville,MD) 的mRNA进行Northern印迹。
poly(A)RNA的分离使用FastTrack试 剂盒(InVitrogen,Carlsbad,CA)来进行。
按照现行的做法,将RNA在 1%的琼脂糖凝胶上跑电泳并被转到尼龙基膜(GeneScreen Plus, DuPont,Wilmington,DE)上。
Ausubel,同上。
由EST质粒 ng79dl1(Genome Systems,St.Louis,MO)制备对TCRγ转录本的非翻译 3’末端(3’UTR)特异的cDNA探针。
对TCRγ转录本(TCR Cγ)恒 定区特异的探针由LNCaP cDNA制备而成,对TCRδ转录本(TCR Cδ) 的恒定区特异的探针由TCRδ质粒制备而成。
人β-肌动蛋白探针被用 作mRNA制备物的定量对照。
探针被用32P标记(Lofstrand Labs Limited, Gaithersburg,MD)通过随机引物延伸到1μCi/ng的比活性。
RNA膜 被在含有50%甲酰胺的杂交溶液中45℃封闭2个小时(Hybrisol I,Oncor, Gaithersburg,MD)然后在20ml杂交溶液中用20μCi cDNA探测15小 时。
膜在室温下用2×SSC/0.1%SDS洗涤两次,每次15分钟,以及55-65 ℃在0.1%SSC/0.1%SDS中洗涤两次,每次20分钟,膜在显影前被 在-80℃下给底片成像显影(X-OMAT,Kodak,Rochester,NY)。
RNA原位杂交 TCRγ恒定区和TCRγ的非翻译3’末端核苷酸序列通过逆转录酶 PCR(RT-PCR)从LNCaP mRNA来扩增,克隆到pBluescript II SK (Stratagene,La Jolla,CA)中并通过DNA测序来证实。
反义和有义 TCRγ35S-核苷酸探针分别通过T7和T3 RNA聚合酶来制备。
来自NCI 的8个存档的前列腺经尿道切除的样本的石蜡块被恢复。
所述的病例 包括恶性和良性前列腺导管的病例两种。
这些病例的平均年龄为69 岁,且肿瘤的Gleason评分为3+3=6/10到4+5=9/10。
在玻片上进行 石醋块的处理且使用核苷酸探针杂交(Molecular Histology, Gaithersburg,MD)。
然后,杂交的玻片用苏木紫和酸性曙红复染色并 利用配备能提供明视野和暗视野的可变聚光器的Zeiss Axiophot显微 镜进行镜检。
RT-PCR分析 从150-250ng的LNCaP和PC-3 poly(A)mRNA利用oligo-dT 引发分别制备单链cDNA(Pharmacia-Biotech,Piscataway,NJ)。
PCR引 物被设计来扩增TCRγ转录本的不同部分。
为了仅扩增cDNA而不扩 增可能存在于mRNA制备物中的痕量的基因组DNA,引物对总是结 合使用来产生跨两个或更多外显子的PCR产物。
一个完整的PCR用 来扩增两个TCRγ恒定区基因中的一个(Cγ1或Cγ2),在外显子CI (TCRCγ.F)中使用正向的引物和在外显子CIII(TCRCγ.R4)中使用反向 的引物,附图8。
利用正向的特异于TCRγ可变基因区段的四个亚型 (TCRVγI.F,TCRVγII.F,TCRVγIII.F,TCRVγIV.F)的引物与TCRγ恒定基 因区段(TCRCγ.R1)中的反向引物结合,进行跨恒定区的PCR的变动, 附图8。
利用高保真的PCR组分,蜡-介导的热启动PCR被进行30个 循环(Expand,Boehringer-Mannheim,Indianapolis,IN)。
在含有0.5μg/ml EtBr的1.2%琼脂糖凝胶上分析PCR产物,特定的PCR产物被凝胶 纯化(Qiagen,Valencia,CA),进行T/A克隆(In Vitrogen,Carlsbad,CA) 以及在自动毛细管测序仪(Perkin Elmer Applied Systems,Foster City, CA)上测序,使用Perkin-Elmer′s dRhodamine终止子循环测序试剂 盒。
TCRγVJ基因重排的分析 由5×107 LNCaP细胞通过既定操作步骤制备基因组DNA。
Ausubel,同上。
一系列12个PCR被进行,每个使用来自Vγ基因区段 的四个亚型(TCRVγI.F,TCRVγII.F,TCRVγIII.F,TCRVγIV.F)之一的正 向引物,并结合来自三个Jγ1基因区段(TCRJγ1.1.R,TCRJγ1.2.R, TCRJγ1.3.R)之一的反向引物,附图8。
热启动的PCR被进行30个 循环,使用500ng的基因组DNA并在1.2%琼脂糖凝胶上用0.5μg/ml 的EtBr进行检查PCR产物。
人胎盘DNA(Clontech,Palo Alto,CA) 被用作引物的阴性对照Jγ1.1至Jγ1.2的基因组DNA进行PCR扩增以 用作模板的阳性对照。
RNA的引物延伸分析 通过LNCaP mRNA的引物延伸分析来测定前列腺TCRγ转录本的 启始位点。
将5μg的mRNA与0.08pmol 32P-末端标记的TCRCγ.R2引 物混合,与Cγ1的5’未端的48-75个核苷酸退火。
使用20U的MMLV- 逆转录酶(Superscript,Gibco-BRL,Gaithersburg,MD)根据既定的步骤进 行分析。
C.P.George等/(1996)″Primer-extension analysis of RNA″In A LABORATORY GUIDE To RNA,ISOLATION,ANALYSIS AND SYNTHESIS.,P.A.Krieg编辑(Wiley-Liss,Inc.,New York,NY),第133- 139页。
样本与32P-末端标记的分子量标记物(MspI digested pBR322, Lofstand Labs Limited,Gaithersburg,MD)一起在6%聚丙烯酰胺-脲 DNA测序凝胶上电泳。
电泳结束后将凝胶印迹到Whatman纸上,干 燥并放射自显影。
5′-RACE PCR分析 通过利用Marathon cDNA扩增试剂盒(Clontech,Palo Alto,CA)和 25pmole的TCRγ基因特异性引物(TCRCγ.R3)由500 ng的LNCaP poly(A)mRNA制备双链cDNA,附图8。
Marathon-连接物然后被结合 到合成的cDNA的末端。
使用基因特异性引物(TCRCγ.R2)进行5′- cDNA末端(5′-RACE)PCR的快速扩增,附图8。
用于逆转录的引物 的上游与连接物特异性引物退火。
热启动条件被应用(Advantage, Clontech,Palo Alto,CA)并且PCR产物如RT-PCR所述被分析和克 隆。
来自5′-RACE PCR分析凝胶的DNA被转到尼龙膜上并且与上 游序列杂交的32P-末端标记的引物(TCRCγ.R1),附图8所示,被应用来 检测EtBr/UV没有检测到的可能的条带。
体外转录与翻译 通过RT-PCR和5′RACE PCR获得的完整的前列腺TCRγ转录 本,被使用T7 RNA聚合酶和小麦胚芽提取物(TNT,Promega,Madison, WI)通过RT-PCR扩增,克隆到pBluescript II SK(Stratagene,La Jolla,CA) 中,进行测序并在体外转录翻译偶联的系统中检测。
35S-Met(ICN, Costa Mesa,CA)被加到反应中用于翻译产物的显影。
反应在还原条 件下在聚丙烯酰胺凝胶(16.5%Tris/Tricine,BioRad,Hercules,CA)上与 预染色的标记物(Gibco-BRL,Gaithersburg,MD)一起被分析。
凝胶被 干燥并用于放射自显影。
结果 A.通过数据库分析鉴定存在的TCRγ的前列腺EST 我们从20个来自6个肿瘤和2个正常前列腺cDNA文库的cDNA 克隆中鉴定了23个TCRγESTs。
由前列腺EST装配成的TCRγ复合序 列由具有76个核苷酸的TCRγ恒定区序列、448个核苷酸的非翻译3’ 区序列和poly(A)序列。
通过前列腺EST与外周血T-淋巴细胞细胞系 的成熟TCRγ转录本(GenBank Acc.No.M16768,M16804和M30894)的 比对,我们发现前列腺EST复合序列等同于来自外周血T-淋巴细胞 的TCRγ转录本。
dbEST数据库分析显示TCRγ基因在人前列腺中是 高度转录的。
B.通过RNA点印迹验证TCRγ(3′UTR)在人前列腺中的表达 为了分析人前列腺中有转录活性的TCRγ,来自TCRγ转录本的 非翻译3’末端(3’UTR)的cDNA探针被用于检测来自50个不同人 组织的mRNA,附图2A。
我们确证正常的前列腺(C7位置)表达 TCRγmRNA并且我们进一步观察到在所有在点印迹上显示的组织中前 列腺具有最强的表达。
TCRγ基因表达也被发现在小肠(E3),脾脏(E4), 胸腺(E5),外周白细胞(E6),淋巴结(E7),骨髓(E8),以及肺(F2) 中。
C.Northern显示人前列腺中的两种大小特异性的TCRγ转录本 利用3′UTR探针的Northern印迹杂交显示前列腺具有两种大约 1.1和2.8kb的TCRγ转录本,附图2B(泳道3),而脾脏,胸腺,小 肠和白细胞中的主要转录本为1.5kb。
1.5kb大小的转录本与来自γδT- 淋巴细胞的TCRγmRNA(GenBank Acc.No.M16768,M16804,(Krangel 等,Science 237,64-67(1987));M30894,(Littman等.Nature 326,85-88 (1987))一致。
由于数据库分析表明了TCRγ的恒定区是前列腺转录本 的一部分,所以我们也使用TCRγ恒定区探针(TCR Cγ)。
我们也在前列 腺中发现了同样的1.1 kb和2.8 kb条带,附图3A(泳道3)。
D.表达TCRγ的前列腺细胞不表达TCRδ或CD3转录本 TCRγ-链蛋白通常与TCRδ链蛋白共表达。
由于TCRγ基因在人前 列腺中是转录活性的,我们继续分析TCRδ基因的转录活性。
使用 TCRδ转录本核苷酸序列进行dbEST分析(http://www.ncbi.nlm.nih. gov/BLAST)。
来自前列腺cDNA文库的EST与TCRδ-链转录本的任 一部分都不匹配。
此外,Northern印迹分析没有检测到任何TCRδ mRNA的前列腺表达,附图3B(泳道3)。
我们得出结论:TCRδ基因 在前列腺中是沉默的。
如所预料的,TCRδ在脾脏,胸腺和血液白细胞 中表达,附图3B。
E.LNCaP细胞,而不是PC-3细胞,表达前列腺-特异性TCRγ转录本 假定TCRγmRNA在正常的前列腺中表达,我们接下来分析是否 其也在前列腺癌中表达。
前列腺-特异性1.1 kb转录本被发现在来自 LNCaP的mRNA制备物中,但不在来自PC-3的mRNA制备物中, 附图3C。
在正常的前列腺中表达的前列腺-特异性2.8 kb转录本,也 存在于LNCaP中,尽管其浓度较低。
F.RNA原位杂交显TCRγ在前列腺上皮细胞中表达 前列腺由腺泡组织和可变混合的初级导管衬上皮细胞群组成,所 述上皮细胞在腺隔室内排成复杂的增生导管。
这些隔室被紧紧地连接 于光滑的肌肉细胞、成纤维细胞和前列腺基质的其它细胞类型。
为了 测定人前列腺TCRγ表达的细胞内位置,用TCR(Cγ-3′UTR)有义和反 义核苷酸探针进行RNA原位杂交。
我们发现TCRγmRNA在前列腺 腺泡导管的上皮细胞中高度表达而在前列腺基质细胞和其它类型的细 胞中为阴性,附图4A,4C。
前列腺的增生和瘤形成的区域也被检测到 TCRγ的表达。
在良性的和肿瘤的腺泡上皮中的表达是相当的。
在人 肾组织中或在人大脑中没有观察到TCRγ的表达,附图4E。
G.前列腺TCRγ转录本含有Cγ1但不含有任何VJγ基因 在已经确定前列腺的TCRγδ表达概况后,我们继续鉴定主要的 1.1kb前列腺特异的TCRγ转录本的特性。
LNCaP细胞系被用于特性分 析,因为人们不能排除来自从大量前列腺组织获得的mRNA制备物 中有浸润T-细胞mRNA污染的可能性。
我们从数据库分析可知前列 腺TCRγ转录本的3’末端序列等同于来自外周血液白细胞的TCRγ转录 本的3’末端序列,且聚腺苷酸化信号的位置是相同的。
因此,前列腺 和白细胞之间的转录本大小的不同取决于通过前列腺EST鉴定的上游 序列的不同。
用RT-PCR扩增TCRγ转录本的恒定区部分来鉴定 TCRCγ1基因。
较大的TCRCγ2不在LNCaP中表达。
跨越可变区(Vγ) 到恒定区(Cγ)的RT-PCR没有产生任何的产物,表明Vγ不是前列腺特 异的TCRγ转录本的一部分。
H.LNCaP在TCRγ座位没有发生VJ基因重排。
由于RT-PCR扩增TCRγ的可变区没有产生任何产物,我们接来 下分析TCRγ座位。
在γδT-细胞发育的过程中,TCR座位发生V(D)J 基因重排来使得基因区段连接在一起,形成受体的可变区。
为了说明 LNCaP细胞是否发生TCRγVJ基因重排,联合使用TCRVγ和TCRJγ 引物对基因组DNA进行PCR,来涵盖每一种可能的重排(参见材料和 方法部分)。
引物联合没有产生任何的PCR产物,此说明了LNCaP细 胞没有发生TCRγ座位的VJ基因的重排。
TCRγ VJ的重排没有在前列 腺上皮细胞中发生说明了前列腺表达不同于成熟的γδT-淋巴细胞的表 达。
I.前列腺上皮细胞表达TCR(JC)γ转录本 既然确定了前列腺TCRγ转录本含有Cγ但不含有任何Vγ基因区 段,我们下面分析Cγ1的上游序列是什么。
进行RNA引物延伸和5′ RACE PCR来获得转录的起始点。
LNCaP mRNA的引物延伸试验,显 示大约128个核苷酸的大量的带和130-135个核苷酸的少量的带,附 图5。
从Cγ1的5’末端碱基75处开始逆转录(参见:材料和方法), 转录本具有大约Cγ1上游序列的53个核苷酸。
LNCaP cDNA的5′ RACE PCR发现了一个特异性PCR产物。
扩增的产物被发现含有恰当 地与Cγ1基因区段剪接的Jγ1.2基因区段。
大量通过RACE PCR分离 的克隆被测序。
它们从引物延伸试验所定义的起始位点附近启动。
录本的可变的起始点与在引物延伸试验中鉴定的少量的带比大量的带 稍长的结果一致。
前列腺TCRγ如何转录和剪接的图示见附图6。
获自 LNCaP的TCRγ转录本的核苷酸序列被显示于表1中。
该复合序列是 1020±3个核苷酸长。
其含有来自Jγ1.2基因区段的53个碱基,Cγ1 的519个碱基,接着是含有聚核苷酸化信号的非翻译序列以及在3’ 末端poly(A)序列的448个碱基。
J.前列腺特异性TCRγ转录本在体外的翻译 前列腺转录本在原始TCRγ阅读框架中具有4个翻译起始密码子 (ATG),表1中加双下划线表示。
由4种不同起始点计算的蛋白大 小分别为12.8,12.0,7.2和3.2 kDa。
为了分析前列腺转录本的翻译活 性,利用全长前列腺TCRγcDNA进行体外转录偶联的翻译。
结果获得 两个大约8和13 kDa的蛋白,附图7(泳道1)。
阴性对照没有产生 任何蛋白产物。
讨论 前列腺上皮细胞中TCRγ转录本的特异性表达细胞 我们在人前列腺中鉴定到T-细胞受体γ链(TCRγ)mRNA的表达, 表明其来源于前列腺上皮细胞而不是来源于浸润γδ T-淋巴细胞。
我们 也阐明了T-细胞受体δ链(TCRδ)基因在前列腺中是沉默的。
TCRγ mRNA在前列腺腺泡管的上皮细胞中表达,也在前列腺癌的上皮细胞 中表达。
2个存在于人前列腺中的TCRγ转录本的大小分别为1.1 kb和 2.8 kb。
与在脾脏,胸腺和外周白细胞中发现的1.5kb的TCRγ转录本 相比有着大小的不同。
通常TCRγδ mRNA的表达图谱表明其在前列 腺中的转录与γδT-淋巴细胞的途径不同。
前列腺TCRγ表达最初的发 现是通过分析公开EST数据库来进行的。
我们的结果表明EST库是 鉴定新的和未知基因表达的强大工具。
代表TCRγ转录本的前列腺EST 均来自由激光捕捉显微解剖所获得的细胞建立的cDNA文库 (Emmert-Buck等,Science 274,998-1001(1996))。
TCRγ转录本被证明 来源于前列腺上皮细胞而不是来源于浸润γδT-淋巴细胞的事实证实显 微解剖是一种有用的技术来从组织特异性显微区获得纯化的细胞亚 群。
前列腺TCR(JC)γ转录本 前列腺腺癌细胞系,LNCaP,其分离自表达易于检测水平的1.1kb 前列腺特异性TCRγ转录本的淋巴结转移(Horoszewicz等,Cancer Res. 43,1809-1818(1983))。
在LNCaP细胞中表达显示转录本来源于上皮 细胞并且其可在前列腺恶性肿瘤的发育中表达。
LNCaP转录本含有 约53个碱基的Jγ1.2基因区段,3个Cγ1外显子,非翻译序列,然后是 poly(A)序列。
前列腺转录本不同于成熟的T-淋巴细胞转录本,因为其 缺少一个Vγ基因区段并且其起始于紧挨Jγ1.2上游区的内含子序列中 (数据没有显示)。
启动子启动前列腺TCRγ转录且其在前列腺上皮 细胞中的活化机制正在研究之中。
2.8kb的前列腺特异性TCRγ转录本 在LNCaP非常微弱且在5′RACE PCR实验中并没有获得任何含有 2.8kb转录本的产物,因此2.8kb转录本需要进一步的研究。
T淋巴细胞中TCR(JC)γ转录本的比较 很多的研究表明可能在造血细胞中发生V(D)J重排之前或重 排时能检索到TCR基因的转录(Wang等,Mol.Immunol.33,957-964 (1996);Shimamura,M.,和Ohta,S.,Eur.J.Immunol.25,1541-1546(1995); Villey等,Eur.J.Immunol.27,1619-1625(1997);Sikes等,J.Immunol. 161,1399-1405(1998))。
已有报道TCRγ基因在带有未重排的γ座位的鼠 骨髓T淋巴细胞前体细胞中具有转录活性,产生纯粹的TCR Cγ转录 本(Wang等,Mol.Immunol.33,957-964(1996))。
此外,未重排TCR Vγ 转录本的表达也在个体发育中有报道(Goldman等.J.Exp.Med.177, 729-739(1993))。
TCR的非翻译转录本和免疫球蛋白基因区段在很大 程度上被限制于来自淋巴细胞系的细胞中(Lauzurica,P.,和Krangel,M. S.,J.Exp.Med.179,1913-1921(1994))。
此外,几乎所有TCR和免疫 球蛋白的座位的种系转录的激活均暂行性地与座位重组的激活相关 (Sikes等,J.Immunol.161,1399-1405(1998);Goldman等.J.Exp.Med. 177,729-739(1993);Lauzurica,P.,and Krangel,M.S.,J.Exp.Med. 179,1913-1921(1994);Sleckman等,Annu.Rev.Immunol.14,459-481 (1996))。
我们已经阐明,通过基因组DNA和cDNA的独立性试验, 前列腺上皮细胞并未在TCRγ座位发生基因重排。
因此在前列腺上皮 细胞中TCR(JC)γ转录本的表达并不与重排相关,并且与T-淋巴前体 细胞中观察到的非翻译转录本相比可能具有不同的功能。
TCRγ座位的新的前列腺特异性蛋白的可能性的最初假说 前列腺TCRγ转录本是高度表达的,我们设想其必定具有生物学 上的重要原因。
VJ基因重排并未发生在前列腺上皮细胞的TCRγ座位 的事实排除了成熟TCRγ链蛋白产生的可能性。
因为在Cγ上游并没有 发现翻译起始密码子(ATG),我们还排除了没有TCRγ可变区的TCRγ 恒定区蛋白产生的可能性。
在TCRγ链蛋白中,Jγ区段编码16-20个氨 基酸的可变区,而可变区的绝大部分由Vγ区段编码。
除非由Jγ区段编 码的氨基酸与由Vγ基因区段编码的氨基酸结合,它们便不能在MHC 识别中作为TCR发挥作用。
这增加了由Cγ编码的新的前列腺特异性 蛋白的可能性。
我们的最初假设就是,从原始TCRγ阅读框架的一个 ATG密码子处开始翻译,虽然也可使用其它不同的阅读框架或较少使 用的启始密码子。
利用前列腺TCRγcDNA进行的体外转录偶联翻译试验显示该转 录本具有全部的功能。
共得到了2个蛋白。
13KDa的蛋白最可能启始 于附图1所示第一个加双下划线ATG,其产生一个12.8KDa大小的蛋 白(PS-TCRγ-1)。
8KDa的蛋白最可能来自第二个双下划线ATG,计算 的蛋白大小约7.2 kDa(PS-TCRγ-2)。
在下一个实施例中进一步讨论对 这两个蛋白的研究报道。
总之,前列腺上皮细胞,或非淋巴来源的细 胞类型表达高水平的被认为仅由淋巴细胞系所表达的基因的转录本的 事实是一个非常出乎意料的发现。
实施例2.TCRγ可变阅读框架蛋白的发现 上一个实施例阐述了意外发现了在前列腺和前列腺癌细胞中的 TCRγ转录本,这些转录本的体外翻译,并且最初假这一转录本导致细 胞中存在TCRγ链的截短形式。
本实施例阐述另一个意外的发现,即 该转录本产生以前未知的由可变阅读框架表达的蛋白,现命名为 “TARP”。
更出乎意料的是,下面的研究显示TARP是一个核蛋白, 存在于很多乳房癌细胞中。
材料和方法: 引物TCRγ-upATGmut#1(5’-TTACAGATAAACAACTTGATAC   AGATGTTTCCCCCAAGCCC-3’);TCRγ-upATGmut#2(5’-GGGCTTGGGGGAAAC   ATCTGTATCAAGTTGTTTATCTGTAA-3’);TCRγ-upATGmut#3(5’-   GATAAACAACTTGATGCAGATATTTCCCCCAAGCCC-3’);TCRγ-upATGmut#4   (5’-GGGCTTGGGGGAAATATCTGCATCAAGTTGTTTATC-3’);TCRγ-   upATGmut#5(5’-GATAAACAACTTGATACAGATATTTCCCCCAAGCCC-3’);   TCRγ-upATGmut#6(5’-GGGCTTGGGGGAAATATCTGTATCAAGTTGTTTATC-   3’);TCRγ-downATGmut#1(5’-CCCAGGAGGGGAACACCATAAAGACTAAC   GACACATAC-3’);TCRγ-downATGmut#2(5’-GTATGTGTCGTTAGTCTTT   ATGGTGTTCCCCTCCTGGG-3’);TCR5.1(5’-GATAAACAACTTGATGCA   GATGTTTCC-3’);TCR3.1(5’-TTATGATTTCTCTCCATTGCAGCAG-3’);   TCRJγ1.2R(5’-AAGCTTTGTTCCGGGACCAAATAC);B-肌动蛋白正向引物(5’-   ATCTGGCACCACACCTTCTACAATGAGCTGCG-3’);B-肌动蛋白反向引物(5’-   CTTCATACTCCTGCTTGCTGATCCACATCTGC-3’).通过Sigma- Genosys(The Woodlands,TX)和Lofstrand Labs Limited(Gaithersbur g,MD)合成引物。
构建体 如前面所述进行构建被克隆到pBluescript II SK(+)(Stratagene,La Jolla,CA)中的TARP转录本(Essand,M.等,Proc.Natl.Acad.Sci.USA 96:9287-9292(1999))。
在该过程中,该质粒被称为pBSSK-TCRγ。
核 苷酸位置69处的ATG被变异为ATA的pBSSK-TCRγmutATGup1, 通过Quickchange Site-Directed Mutagenesis试剂盒(Stratagene)构建。
利用TCRγ-upATGmut#1和TCRγ-upATGmut#2作为引物并以pBSSK- TCRγ为模板进行PCR反应。
在核苷酸位置73处的ATG突变为ATA 的pBSSK-TCRγmutATGup2,如上所述采用TCRγ-upATGmut#3和 TCRγ-upATGmut#4为引物并以pBSSK-TCRγ为模板来构建。
在核苷酸 位置69和73处的两个ATG都突变为ATA的pBSSK- TCRγmutATGup-both,如上所述通过用TCRγupATGmut#5和TCRγ- upATGmut#6作为引物并以pBSSK-TCRγmutATGup1为模板来构建。
在位置242处的ATG突变为ATA的pBSSK-TCRγmutATGdown,如 上所述通过用TCRγ-downATGmut#1和TCRγ-downATGmut#2作为引 物并以pBSSK-TCRγ为模板来构建。
pET-TCRγ含有被亚克隆到 pET23a载体(Novagen,Madison,WI)中的TARP转录本(Essand,M.等, Proc.Natl.Acad Sci.USA 96:9287-9292(1999))的242-469位核苷酸。
pET-TARP含有被亚克隆到pET23a载体中的TARP转录本(Essand, M.等,Proc.Natl.Acad.Sci.USA 96:9287-9292(1999))的56-242位 核苷酸。
pVC4D-TARP含有被亚克隆到pVC4D载体(Bruggemann,E.P. 等,BioTechniques 10:202-209(1991))的TARP转录本(Essand,M.等, Proc.Natl.Acad.Sci.USA 96:9287-9292(1999))中的69-242位核苷 酸。
逆转录聚合酶链式反应(RT-PCR) 根据生产商的操作说明利用Micro-FastTrackTM 2.0试剂盒 (Invitrogen,Carlsbad,CA)进行分离poly(A)RNA。
500 ng的poly(A) RNA或5μg的总RNA在50 pmol oligo-dT引物(Invitrogen)存在的 条件下70℃变性2分钟。
在10μl含有250 uM dNTPs,2 mM DTT,8 U RNasin(Roche Molecular Biochemicals,Indianapolis,IN),50 U Superscript IITM RT(Life Technologies,Rockville,MD)的反应混合物中 制备单链cDNA并42℃温育90分钟。
样本然后用75μl 10mM的Tris-HCl[pH 7.5]稀释并72℃温育10分钟。
3μl的cDNA用于含有250μM dNTPs、25 pmol的各种引物、1单位的AmpliTaqDNA聚合酶(Roche) 的PCR并扩增35个循环。
相似的PCR条件用于人乳房RAPID-SCANTM基因表达部分(OriGene Technologies,Rockville,MD)。
引物TCRγJ 1.2R, TCR5.1和TCR3.1被用于检测TARP转录本,而正向引物B-肌动蛋 白和反向B-肌动蛋白引物被用于肌动蛋白转录本的检测。
Northern印迹杂交 如前所述利用2μg的poly(A)RNA进行Northern印迹杂交 (Essand,M.等,Proc.Natl.Acad.Sci.USA 96:9287-9292(1999))。
体外转录偶联的翻译 在体外偶联的翻译反应已被在前面描述(Essand,M.等,Proc. Natl.Acad.Sci.USA 96:9287-9292(1999))。
pBSSK-TCRγ,pBSSK- TCRγmutATGdown,pBSSK-TCRγmutATGup1,pBSSK-TCRγmutATGup2 和pBSSK-TCRγmutATGup-both被用作模板。
细胞培养 LNCaP,PC3,MCF7,BT-474和SK-BR-3细胞于37℃在5%CO2条件下培养在RPMI-1640培养基(Quality Biological,Inc.,Gaithersburg, MD)中。
培养基含10%的胎牛血清(FBS,Quality Biological,Inc.),2 mM L-谷氨酰胺,1 mM丙酮酸钠和青霉素/链霉素。
Hs57Bst细胞于37℃ 用5%CO2温孵培养在RPMI-1640培养基中。
该培养基含有10%FBS, 30 ng/ml表皮生长因子(EGF,Harlan,Cincinnati,OH),2 mM L-谷氨酰 胺,1 mM丙酮酸钠和青霉素/链霉素。
抗体产物. 多克隆ΔPE-TARP抗体的制备如下。
含有与假单胞菌外毒素(ΔPE) (Bruggemann,E.P.等,BioTechniques 10:202-209(1991))的催化性失 活形式的C’末端融合的完整TARP可读框的pVC4D-TARP,在Epicurian ColiBL21-CodonPlusTM(DE3)-RIL细胞(Stratagene)中表达。
包涵体 的制备以及兔免疫如前面所述(Brinkmann,U.等,Proc.Natl.Acad.Sci. USA 88:8616-8620(1991))。
依据制造商(Pierce,Rockford,IL)的说明用 ImmunoPureIgG(Protein A)纯化试剂盒纯化抗血清。
利用pET-TCRγ如前面所述的进行制备TCRγ抗体,pET-TCRγ是 一个含有与C’末端6个组氨酸标记融合的TCRγ细胞外结构域的表达 质粒。
在免疫前,利用Ni-NTA琼脂糖柱按照制造商(QIAGEN,Valencin, CA)的说明纯化该组氨酸标记的TCRγ蛋白。
细胞提取物的制备 如下制备全细胞蛋白提取物。
收获来自各细胞系的5×106个培养 的细胞并将其悬浮在含有蛋白酶抑制剂的1×RIPA缓冲液(50mM Tris-HCl[pH7.5],150nM NaCl,1mM EDTA,0.1%Triton X-100,1mM PMSF,1μg/ml aprotinin,1μg/ml亮抑酶)中。
提取物直接用超声破碎, 并进行离心分离。
根据制造商(Pierce)的说明利用CoomassiePlus 蛋白试验试剂来测定蛋白浓度。
通过用冷的研钵和研棒将-80℃冰冻的 0.5g前列腺癌组织研磨成粉末来制备前列腺组织的蛋白提取物。
收 集粉末状组织,悬浮于1X RIPA中如上所述进行处理。
前列腺和乳房细胞中的核、膜以及细胞质提取物的制备如目前已 公开的方法进行(Dignam,J.D.等,Nucleic Acids Res.11:1475-1489 (1983);Sladek,F.M.等,Genes Dev.4:2353-2365(1990)). Western印迹分析。
20或40μg的蛋白提取物,1μg的重组His-TARP或100ng的 重组His-TCRγ在16.5%Tris Tricene凝胶上电泳(BIO-RAD,Hercules, CA)然后在转移缓冲液(25 mM Tris,192 mM甘氨酸,20%(v/v)甲醇, pH 8.3)4℃和30 V下4小时转移到0.2μm Immun-BlotTM PVDF膜 (BIO-RAD)上。
用10μg/ml ΔPE-TARP抗血清或1μg/ml TCRγ抗血 清来对滤膜进行探测,依据制造商(Roche)的说明,用化学萤光western 印迹试剂盒检测各自的信号。
TARP是在前列腺癌细胞中表达的核蛋白。
为了证实TARP或TCRγ是否存在于前列腺癌细胞中,我们制备 抗两种蛋白的抗体并在不同的前列腺癌细胞提取物中进行western印 迹反应。
如附图3A(上图所示),在前列腺癌LNCaP细胞系和一 个前列腺癌肿瘤提取物中检测到TARP。
与重组物His-TARP共迁移 的7kDa大小的片段表明在LNCaP和癌提取物中检测到的产物是 TARP。
以前,我们证实了前列腺特异性TCRγ转录本在前列腺癌细胞 系PC3中并不表达(Essand,M.等,Proc.Natl.Acad.Sci.USA 96:9287- 9292(1999))。
因此我们使用PC3细胞提取物作为阴性对照从而证实 7kDa片段在这些提取物中并不存在(附图3A,上图)。
重要的是,当 利用取血前抗血清和抗假单胞菌外毒素(PE,参见材料和方法)的抗血 清时,没有检测到7kDa片段(数据未显示)。
在这些提取物中没有 检测到TCRγ,虽然重组蛋白与所用抗体表现很强的信号(附图3A, 下图)。
这些结果表明前列腺特异性TCR转录本编码TARP。
为了鉴定TARP在细胞中的位置,我们从LNCaP细胞中制备核、 细胞质和膜部分。
如附图3B所示,在核部分而非细胞质或膜中检测 到TARP。
通过蔗糖垫进行的细胞提取物分级分离纯化的核中我们得 到了相似的结果(Sladek,F.M.等,Genes Dev.4:2353-2365(1990)) (数据没有显示)。
TARP转录本在乳房细胞中表达。
我们在以前已有报道TCRγEST库也包括一些来自脑文库的EST (Vasmatzis,G.等,Proc.Natl.Acad.Sci.USA 95:300-304(1998))。
在 这些最初的报道之后,其它的EST亦被存放到这个数据库中,目前这 个库包括来自乳房,结肠,肾以及胃的文库的EST。
为了鉴定这些EST 的出现是否说明TARP转录本在这些细胞中就表达或者当这些文库建 成时是否就归因于浸润γBT-淋巴细胞的存在,我们对不同的细胞系进 行RT-PCR来检测TARP转录本的存在。
如附图4A所示,在乳房细 胞系MCF7,BT-474,SK-BR-3和CRL-1897中检测到TARP的表达。
在成纤维细胞瘤细胞系A172,成胶质细胞瘤细胞系IMR32,结肠细胞 系COLO 205,胃细胞系KATO III或肾细胞系COS7和293中没有 检测到信号(附图4A,数据未显示)。
为了鉴定TARP转录本是否 在除上述细胞系以外的人乳房组织中表达,我们利用RAPID-SCANTM(OriGeneTechnologies,Rockville,MD)检测了12个不同的乳房癌细胞 的cDNA。
显示出TARP mRNA在一些乳房样品中是大量存在的(附 图4B,上图),而正常乳房中的TARP mRNA在35个PCR循环后只达 到可检测的水平(结果未显示)。
值得注意的是,在缺少cDNA的反应 中未检测到信号。
用于显示相同cDNA量的肌动蛋白存在于每一个泳 道(下图)。
在正常乳房样品中的微弱信号与附图4A和5的Hs57Bst细 胞系所显示的TARP信号的缺乏相关,Hs57Bst细胞系来自正常的乳 房组织。
这些结果表明乳房发生致癌性转化后TARP转录本的表达提 高。
但是在做出任何最后的结论前必须进行更多的研究。
为了确定在乳房细胞系中观察到的TARP转录本与前列腺细胞系 中发现的转录本是否相同,我们利用抗不同TARP转录本区域的引物 进行PT-PCR。
如附图5A所示,前列腺中的TARP转录本含有Jγ1.2 基因区段部分,3个Cγ1外显子以及跟随一个poly(A)尾(7)的一些非 翻译序列。
引物组1和3扩增了全部TARP转录本(附图5B,上图) 而引物组2和3仅扩增了Cγ1区域(附图5B,中间部分)。
如附图5B 所示,与利用任一个引物组的前列腺细胞系(LNCaP)相比在三个乳房 细胞系(MCR7,BT-474和SK-BR-3)中检测到相似大小的条带。
重要 地,在缺少cDNA(dH2O)的反应中没有检测到信号,且使用了肌动 蛋白对照所示的相同量的cDNA(附图5B,下图)。
这些数据表明在 乳房细胞系中发现的TARP转录本与在前列腺细胞系中发现的转录本 相同。
为了进一步证明这个结论,我们用Northern印迹分析了来自每 个细胞系的TARP转录本的大小。
如上所述,1100和2800个核苷酸 转录本存在于LNCaP细胞系中,其中1100个核苷酸的转录本是主要 的形式(Essand,M.等,Proc.Natl.Acad.Sci.USA 96:9287-9292 (1999))。
如附图5C所示,与前列腺细胞系LNCaP相比,在3个乳房 细胞系(MCF7,BT-474和SK-BR-3)中都发现了相似大小的TARP转 录本,尽管强度较弱。
因此我们得出结论TARP在前列腺和乳房癌细 胞中表达。
为了确定TARP蛋白是否存在于乳房癌细胞系中,我们用抗TARP 的抗体和乳房癌细胞核提取物进行Western印迹。
如附图6(上图) 所示,在MCF7,BT-474和SK-BR-3细胞中检测到TARP反应条带。
在这些乳房癌细胞学中的膜或细胞质部分没有检测到TARP(数据未 列出)。
重要地,TARP是乳房细胞系的TARP转录本所编码的蛋白 产物的一部分,因为在任一这些核提取物中都未检测到TCRγ,即使 重组蛋白与所用抗体表现出很强的信号(附图6,下图)。
这些数据 表明TARP也存在于乳房癌细胞中。
我们报道了鉴定到一个来自TCRγ座位由特异性转录本编码的在 前列腺和乳房癌细胞中表达的7KDa的核蛋白。
因为该蛋白由不同于 TCRγ的读框编码,我们把TCRγ可变阅读框架蛋白称之为TARP。
除 了从起始于TCRγ一个内含子内的位点可变阅读框架被翻译外,TARP 还有其它的两个特征。
首先,令人意外的发现这样的小肽存在于细胞 中,因为大多数是分泌型的。
其次,TARP缺少一个较好的Kozak序 列(Kozak,M.Cell 44:283-92(1986))。
由于TCRγ阅读框架含有好的 Kozak序列,我们最初设想的截短的TCRγ蛋白被编码。
但是,如附 图3所示,我们最初的设想是错误的,有趣的是体外翻译结果表明TARP 蛋白的偏好和TARP阅读框架中的两个ATG之一可被用于起始蛋白 的合成。
蛋白应被测序来鉴定哪个ATG被用于启动TARP蛋白的合 成。
TARP蛋白序列的有趣之处在于七体重复序列中有五个亮氨酸, 这表明TARP可能含有一个二聚化亮氨酸的拉链基元(附图7A。
) 如果是这样,TARP必须含有一个两亲螺旋。
其一暗示TARP可能含 有一个两亲螺旋,据信其中丝氨酸和脯氨酸残基作为螺旋的起点,这 些残基被发现恰好在第一个亮氨酸重复之前。
第二,很多带电的氨基 酸被发现存在于七体重复中,即为螺旋提供了两亲特征并可能充当与 其它的螺旋盐桥。
即使亮氨酸存在于七体重复中是亮氨酸拉链基元的 好的指示,但是也存在被鉴定的在七体重复中含有5个亮氨酸的蛋白 其并非亮氨酸拉链蛋白的情况。
例如karyopherin的晶体结构(Chook,Y. M.等,Nature 399:230-237(1999)),嗜热脂肪芽孢杆菌(B. sterarothermophilus)嘧啶核苷磷酸化酶(Pugmire,M.J.等,Structure 6: 1467-1479(1998))以及嗜热柄热菌(T.Thermophilus)苯丙氨酰-tRNA 合成酶(Mosyak,L.等,Nat.Struct.Biol.2:537-547(1995))表明这些 蛋白在七体重复中含有5个亮氨酸的区域并不含有螺旋结构。
需要研 究相互作用和结构来探索TARP中发现的亮氨酸重复的意义。
TARP氨基酸序列的另一个独特的特征是碱性氨基酸区连接了一 个可能的亮氨酸拉链基元(图7A),此表明可能是一个DNA结合元。
但是碱性区的定位是独特的,其在亮氨酸重复的后面而不是在前面。
大多数结合DNA的亮氨酸拉链蛋白在亮氨酸重复的前面具有碱性区 域(参见(Chook,Y.M.等,Nature 399:230-237(1999)))。
TARP的碱 性区域可能仅仅行使核定位信号的功能,但是TARP是一种核蛋白的 事实加强了TARP可能结合DNA的假说。
在作出最后的结论之前有 必要进行功能的研究。
为了测定TARP与任何已知的蛋白是否具有同源性,我们在 GenBank中进行了蛋白质的BLAST检索。
检索的结果显示TARP的 氨基酸序列与Dictyostelium dicoideum Tupl(GenBank入藏号 AAC29438)和Saccharomyces cerevisiae Tupl(Williams,F.E.等,Mol. Cell.Biol.10:6500-6511(1990))具有一些同源性(附图7C)。
酵母Tupl 通常被发现与Cyc8(Ssn6)结合且由葡萄糖、氧和DNA损伤调控基因 的转录表达所需要的(Tzamarias,D.等,Genes Dev.9:821-831 (1995))。
既不是Cyc8(Ssn6)也不是Tupl结合DNA,而是通过与特 异性结合DNA的蛋白例如a2,Migl,Roxl等蛋白相互作用,各自充当 共表达复合物的一部分(Tzamarias,D.等,Genes Dev.9:821-831 (1995))。
Tupl的C`末端部分含有六个富含门冬氨酸盐和色氨酸的43 氨基酸序列的重复,已知为WD-40或β-转导素重复(Williams,F.E. 等,Mol.Cell.Biol.10:6500-6511(1990);Fong,H.K.等,Proc.Natl Acad.Sci.USA 83:2162-2166(1986))。
WD-40重复已在很多的蛋白 中被鉴定出,且在蛋白与蛋白之间的相互作用中起作用。
重要的是, Tupl已被显示通过其两个WD-40重复与a2相互作用(Komachi,K.等, Genes Dev.8:2857-2867(1994))。
有趣的是,TARP与Tupl的第5个 WD-40重复有同源性(附图7C)。
因为TARP是一种核蛋白,其与 Tupl的同源性表明TARP可能是一个与转录调控有关的功能性核蛋白 复合物。
因此,鉴定TARP相互作用蛋白来检测其功能是必要的。
TARP抗体识别前列腺和乳房细胞核提取物中的双联体(附图 6A)。
最快的7kDa条带与His-TARP重组蛋白共迁移,而最弱的条 带为分子量较大的分子。
一种可能的解释是9kDa的条带是翻译后修 饰的。
为了检测TARP是否含有任何已知的翻译后的修饰位点,我们 利用瑞士生物信息学研究所ExPASy蛋白组学服务器(Swiss Institute of Bioinformatics ExPASy proteomics server)(http://www.expasv.ch)的 PROSITE分析程序来分析TARP氨基酸序列(Appel,R.D.等,Trends Biochem.Sci.19:248-260(1994);Hofmann,K.等,Nucleic Acids Res. 27:215-219(1999))。
如附图7A所示,发现很多可能的磷酸化作用位 点包括cAMP和cGMP-依赖的蛋白激酶磷酶化位点(RRAT和RRGT) 以及蛋白激酶C磷酸化位点(SSR和SRR)。
磷酸化作用被显示在很多 的情况下来引起蛋白质在SDS PAGE凝胶上以较大分子量运行。
如果 这种情况属实,附图6的结果表明未修饰的形式在LNCaP细胞中是 普遍的且磷酸化的形式仅存在于MCF7和SK-BR-3细胞中。
需要进 行另一个试验来检测9kDa条带的特性以及当在前列腺和乳房癌细胞 中表达时TARP是否是翻译后修饰的。
我们在此报道了TARP mRNA和蛋白在乳房癌细胞中的表达。
们最初的对TARP转录本的研究并没有揭示TARP在乳房中的表达 (Essand,M.等,Proc.Natl.Acad.Sci.USA 96:9287-9292(1999))。
一种 可能的解释是TARP在正常的乳房中低水平表达且很难去检测。
如结 果部分所述的,与癌样本中检测到的强烈信号相比正常乳房样本的 PCR分析检测到非常弱的信号。
因此,TARP在乳房癌细胞中的存在 说明TARP的表达是在乳房细胞被致癌转化后被诱导的。
此外,TARP 在乳房癌细胞中的存在可以表明TARP由雌激素调控。
这种假说通过 鉴定结合雄激素应答元件(ARE)和雌激素应答元件(ERE)的TARP 的内含启动子的元件得以加强。
此种杂合的元件由两个半位点组成, 它们对ARE在5’末端特异且对ERE在3’末端特异[(Zilliacus,J.等, Mol.Endocrinol.9:389-400(1995))以及未公开的数据]]。
需要进行另 一个实验,来检测是否雌激素调控TARP。
然则,有一些例子,其中 的突变体ARE引起某些前列腺特异的基因在乳房肿瘤中的表达。
例 如,前列腺特异性抗原(PSA)已显示在乳房肿瘤中表达(Majumdar,S. 等,Br.J.Cancer 79:1594-1602(1999))。
PSA异常表达的分子分析导 致发现了在PSA启动子中发现的ARE中的单一位点突变。
突变导致 雄激素调控的PSA在乳房瘤中的表达的丢失是可信的(Majumdar,S.等, Br.J.Cancer 79:1594-1602(1999))。
此时TARP启动子中的类似突变 是否发生在3个被检测的乳房细胞系中仍不得而知。
前列腺依赖雄激素来维持其结构和功能。
当前列腺细胞变为恶性 细胞时,其经常失去了雄激素依赖。
在此研究中,我们使用两种对雄 激素具有不同依赖性的前列腺细胞系:LNCaP和PC3细胞。
雄激 素受体存在于雄激素非依赖的LNCaP细胞系中,但不存在于雄激素 依赖性的PC3细胞系中(Tilley,W.D.等,Cancer Res.50:5382-5386 (1990))。
如附图3所示,TARP在LNCaP细胞而不在PC3细胞中表 达。
此结果表明TARP表达可通过雄激素刺激来调控。
TARP启动子 中的ARE类元件的鉴定加强了TARP被雄激素诱导的观点。
确定雄 激素是否诱导TARP mRNA表达的实验正在进行中。
在LNCaP细胞 而不在PC3细胞中表达表明TARP在调控雄激素依赖的应答中是重 要的。
本发明提供了新的涉及前列腺细胞,前列腺癌,以及乳房细胞和 乳房癌的材料和方法。
特异性的样本已被提供,上面所述的是例证且 非限制的。
在本发明说明书基础上的许多变化对本领域的技术人员来 说是显而易见的。
本发明的保护范围,因此,不应局限于上面的具体 描述而应参照后附的权利要求书及其等同物的全部含义来确定。
本申请中所引证的所有出版物和专利文献以其全文引入本文做参 考,就各种目的而言,其引用程度就如同每一出版物或专利文献被单 个地整个引入一样。
在本专利申请中所引入的任何文献不应看成是本 发明的现有技术。
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