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制备核苷化合物的方法

基本信息

  • 申请号 CN00810322.4 
  • 公开号 CN1361827A 
  • 申请日 2000/05/15 
  • 公开日 2002/07/31 
  • 申请人 三井化学株式会社  
  • 优先权日期  
  • 发明人 肉丸诚也 中村武史  
  • 主分类号  
  • 申请人地址 日本东京都 
  • 分类号  
  • 专利代理机构 中国专利代理(香港)有限公司 
  • 当前专利状态 发明专利申请公布 
  • 代理人 曹雯 
  • 有效性 发明公开 
  • 法律状态
  •  

摘要

通过将戊糖-1-磷酸酯与核酸碱基或核酸碱基类似物在核苷磷酸化酶活性存在下反应来制备核苷化合物的方法,其中将能与磷酸形成难以溶于水的盐的金属盐加到反应系统中,这样就将作为副产物形成的磷酸从反应系统中除去,并且使反应平衡朝着合成核苷的方向移动,从而能以高产率获得目标核苷。
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权利要求书


1.制备核苷化合物的方法,包括将戊糖-1-磷酸酯与核酸碱基或 其类似物在核苷磷酸化酶活性存在下在含水反应介质中反应以形成核 苷化合物的步骤, 其特征在于,使用能与含水反应介质中存在的磷酸根离子形成水 不溶性盐的金属阳离子。

2.权利要求1的制备核苷化合物的方法,其中所述戊糖-1-磷酸 酯是核糖-1-磷酸酯或2-脱氧核糖-1-磷酸酯。

3.权利要求1或2的制备核苷化合物的方法,其中所述能与磷 酸形成水不溶性盐的金属阳离子是一种或多种选自钙离子、钡离子和 铝离子的金属阳离子。

4.权利要求3的制备核苷化合物的方法,其中所述能与磷酸形 成水不溶性盐的金属阳离子是作为与一种或多种选自氯离子、硝酸根 离子(nitride)、碳酸根、硫酸根和乙酸根离子的阴离子的金属盐存 在于含水反应介质中。

5.权利要求3的制备核苷化合物的方法,其中所述能与磷酸形 成水不溶性盐的金属阳离子是作为戊糖-1-磷酸酯盐存在于含水反应介 质中。
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说明书

序列表 <110>三井化学株式会社 <120>制备核苷化合物的方法 <150>JP 132144/99 <151>1999-05-13 <160>2 <210>1 <211>30 <212>DNA <213>人工序列 <220> <223>起着用于克隆大肠埃希氏菌K-12的嘌呤核苷磷酸化酶 的PCR引物作用的低聚核苷酸 <400>1 gtgaattcac aaaaaggata aaacaatggc     30 <210>2 <211>29 <212>DNA <213>人工序列 <220> <223>起着用于克隆大肠埃希氏菌K-12的嘌呤核苷磷酸化酶 的PCR引物作用的低聚核苷酸 <400>2 tcgaagcttg cgaaacacaa ttactcttt     29                          技术领域 本发明涉及使用核苷磷酸化酶制备核苷化合物的方法。
有多种核 苷及其类似物在抗病毒剂、抗癌剂或反义剂的制备中用作合成或药物 制剂的原料。
                         背景技术 术语“核苷磷酸化酶”是参与在磷酸存在下核苷中的N-苷键的磷 酸解作用的酶的通用名。
作为使用核糖核苷的实例,其催化下式所代 表的反应: 核糖核苷+磷酸(磷酸酯)→核酸碱基+核糖-1-磷酸酯 通常可归为嘌呤核苷磷酸化酶和嘧啶核苷磷酸化酶的酶在生物世 界中广泛分布;例如,其存在于哺乳动物、鸟和鱼的组织;酵母;和 细菌中。
该酶反应是可逆的,并且使用该可逆反应来合成各种核苷化 合物在数年前就是已知的。
例如,由2'-脱氧核糖-1-磷酸酯与核酸碱基(分别是胸腺嘧啶、 腺嘌呤或鸟嘌呤)制备胸苷(JP-A 01-104190)、2′-脱氧腺苷(JP-A 11-137290)或2′-脱氧鸟苷(JP-A 11-137290)的方法是已知的。
此 外,Agric.Biol.Chem.,Vol.50(1),pp.121-126(1986)描述 了制备抗病毒剂利巴韦林的技术,其中是在磷酸存在下使用得自产气 肠杆菌的嘌呤核苷磷酸化酶将肌苷分解成核糖-1-磷酸酯和次黄嘌呤, 并还使用得自产气肠杆菌的嘌呤核苷磷酸化酶将通过离子交换树脂分 离的核糖-1-磷酸酯与1,2,4-三唑-3-甲酰胺反应。
然而,因为使用这种酶通过可逆反应进行的用于由戊糖-1-磷酸酯 或其盐与核酸碱基形成核苷化合物的反应是平衡反应,所以存在不能 提高转化率的技术缺陷。
当在工业上生产核苷时,必须以较高转化率进行该反应,以降低 原料成本和提高由此获得的产物的纯度。
因此,本发明的目的是提供更广泛地适用于制备核苷化合物的方 法,包括在核苷磷酸化酶活性存在下将戊糖-1-磷酸酯与核酸碱基或其 类似物反应的步骤,其中该反应步骤具有提高的通过反应转化成核苷 化合物的比例。
                        发明公开 为了解决这些问题进行了充分研究后,我们已经发现,通过使用 能与反应溶液中存在的磷酸根离子形成水不溶性盐的金属阳离子,转 化率得以提高,这是因为通过将作为反应副产物的磷酸根离子作为水 不溶性盐沉淀从反应系统中除去,反应平衡朝着合成核苷化合物的方 向移动。
我们还发现,与上述向反应溶液中加入能与磷酸形成水不溶性盐 的金属阳离子相比,在反应溶液中存在戊糖-1-磷酸酯盐形式的能与磷 酸形成水不溶性盐的金属阳离子可获得几乎相同的效果。
本发明是基于这些发现完成的。
特别是,制备核苷化合物的本发明方法包括将戊糖-1-磷酸酯与核 酸碱基或其类似物在核苷磷酸化酶活性存在下在含水反应介质中反应 以形成核苷化合物的步骤,其特征在于,使用能与含水反应介质中存 在的磷酸根离子形成水不溶性盐的金属阳离子。
在本发明制备方法中,可使用核糖-1-磷酸酯或2-脱氧核糖-1-磷 酸酯作为戊糖-1-磷酸酯。
作为能与磷酸形成水不溶性盐的金属阳离子,可使用至少一种选 自钙离子、钡离子和铝离子的金属阳离子。
能与磷酸形成水不溶性盐的金属阳离子可作为与至少一种选自氯 离子、硝酸根(nitride)、碳酸根、硫酸根和乙酸根离子的阴离子的 金属盐加到含水反应介质中。
依据本发明,在能与磷酸形成水不溶性盐的金属阳离子存在下, 使用核苷磷酸化酶的酶活性,用戊糖-1-磷酸酯与核酸碱基或其类似物 来合成核苷化合物的反应中,反应产率可显著提高,并因此可提供制 备核苷化合物的有效方法。
                   进行本发明的最佳方式 本文所用术语“戊糖-1-磷酸酯”是指在第一个位点即1位经由酯 键连接有磷酸酯基的多羟基醛或多羟基酮或其衍生物。
其一般实例包括但不限于核糖-1-磷酸酯、2'-脱氧核糖-1-磷酸酯、 2′,3′-双脱氧核糖-1-磷酸酯和阿拉伯糖-1-磷酸酯。
在本文中多羟基醛或多羟基酮的实例包括但不限于戊醛糖例如D- 阿拉伯糖、L-阿拉伯糖、D-木糖、L-来苏糖和D-核糖;酮戊糖例如D- 木酮糖、L-木酮糖和D-核酮糖;和脱氧糖类例如D-2-脱氧核糖和2′,3'- 双脱氧核糖等天然多羟基醛或多羟基酮。
这样的戊糖-1-磷酸酯可通过已知方法制得,包括如J.Biol.Chem. Vol.184,437(1950)中所述使用核苷磷酸化酶的活性将核苷化合物 磷酸解;和端基异构体选择性化学合成。
在本发明中使用的核酸碱基或其类似物是作为DNA或RNA化学结 构单元的含氮杂环,包括选自嘧啶、嘌呤和核酸碱基类似物的天然或 合成核酸碱基或其类似物。
这样的核酸碱基或其类似物可以被卤素原子、或烷基、卤代烷基、 链烯基、卤代链烯基、链炔基、氨基、烷基氨基、羟基、羟基氨基、 氨基氧基、烷氧基、巯基、烷基巯基、芳基、芳氧基或氰基取代。
作为取代基的卤素原子的实例包括氯、氟、碘和溴原子。
烷基的实例包括具有1-7个碳原子的烷基例如甲基、乙基和丙基。
卤代烷基的实例包括具有1-7个碳原子的卤代烷基例如氟甲基、 二氟甲基、三氟甲基、溴甲基和溴乙基。
链烯基的实例包括具有2-7个碳原子的链烯基例如乙烯基和烯丙 基。
卤代链烯基的实例包括具有2-7个碳原子的卤代链烯基例如溴乙 烯基和氯乙烯基。
链炔基的实例包括具有2-7个碳原子的链炔基例如乙炔基和丙炔 基。
烷基氨基的实例包括具有1-7个碳原子的烷基的烷基氨基,例如 甲基氨基和乙基氨基。
烷氧基的实例包括具有1-7个碳原子的烷氧基例如甲氧基和乙氧 基。
烷基巯基的实例包括具有有1-7个碳原子的烷基的烷基巯基,例 如甲基巯基和乙基巯基。
芳基的实例包括苯基;具有有1-5个碳原子的烷基的烷基苯基例 如甲基苯基和乙基苯基;具有有1-5个碳原子的烷氧基的烷氧基苯基 例如甲氧基苯基和乙氧基苯基;具有有1-5个碳原子的烷基氨基的烷 基氨基苯基例如二甲基氨基苯基和二乙基氨基苯基;卤代苯基例如氯 苯基和溴苯基。
嘧啶化合物的实例包括胞嘧啶、尿嘧啶、5-氟胞嘧啶、5-氟尿嘧 啶、5-氯胞嘧啶、5-氯尿嘧啶、5-溴胞嘧啶、5-溴尿嘧啶、5-碘胞嘧 啶、5-碘尿嘧啶、5-甲基胞嘧啶、5-甲基尿嘧啶(胸腺嘧啶)、5-乙基 胞嘧啶、5-乙基尿嘧啶、5-氟甲基胞嘧啶、5-氟尿嘧啶、5-三氟胞嘧 啶、5-三氟尿嘧啶、5-乙烯基尿嘧啶、5-溴乙烯基尿嘧啶、5-氯乙烯 基尿嘧啶、5-乙炔基胞嘧啶、5-乙炔基尿嘧啶、5-丙炔基尿嘧啶、嘧 啶-2-酮、4-羟基氨基嘧啶-2-酮、4-氨基氧基(aminoxy)嘧啶-2-酮、4- 甲氧基嘧啶-2-酮、4-乙酰氧基嘧啶-2-酮、4-氟嘧啶-2-酮、和5-氟嘧 啶-2-酮。
嘌呤化合物的实例包括嘌呤、6-氨基嘌呤(腺嘌呤)、6-羟基嘌呤、 6-氟嘌呤、6-氯嘌呤、6-甲基氨基嘌呤、6-二甲基氨基嘌呤、6-三氟 甲基氨基嘌呤、6-苯甲酰基氨基嘌呤、6-乙酰基氨基嘌呤、6-羟基氨 基嘌呤、6-氨基氧基(aminoxy)嘌呤、6-甲氧基嘌呤、6-乙酰氧基嘌呤、 6-苯甲酰基氧基嘌呤、6-甲基嘌呤、6-乙基嘌呤、6-三氟甲基嘌呤、6- 苯基嘌呤、6-巯基嘌呤、6-甲基巯基嘌呤、6-氨基嘌呤-1-氧化物、6- 羟基嘌呤-1-氧化物、2-氨基-6-羟基嘌呤(鸟嘌呤)、2,6-二氨基嘌呤、 2-氨基-6-氯嘌呤、2-氨基-6-碘嘌呤、2-氨基嘌呤、2-氨基-6-巯基嘌 呤、2-氨基-6-甲基巯基嘌呤、2-氨基-6-羟基氨基嘌呤、2-氨基-6-甲 氧基嘌呤、2-氨基-6-苯甲酰基氧基嘌呤、2-氨基-6-乙酰氧基嘌呤、2- 氨基-6-甲基嘌呤、2-氨基-6-环丙基氨基甲基嘌呤、2-氨基-6-苯基嘌 呤、2-氨基-8-溴嘌呤、6-氰基嘌呤、6-氨基-2-氯嘌呤(2-氯腺嘌呤)、 和6-氨基-2-氟嘌呤(2-氟腺嘌呤)。
核酸碱基类似物的实例包括6-氨基-3-去氮杂嘌呤、6-氨基-8-氮 杂嘌呤、2-氨基-6-羟基-8-氮杂嘌呤、6-氨基-7-去氮杂嘌呤、6-氨基 -1-去氮杂嘌呤和6-氨基-2-氮杂嘌呤。
本发明中的核苷化合物是指多羟基醛或多羟基酮,其中嘧啶化合 物、嘌呤化合物或核酸碱基类似物在1位经由N-苷键连接在所述多羟 基醛或多羟基酮上。
实例包括胸苷、脱氧胸苷、脱氧尿苷、脱氧鸟苷、 脱氧腺苷、双脱氧腺苷、三氟胸苷、利巴韦林、乳清酸核苷、尿嘧啶 阿拉伯糖苷、腺嘌呤阿拉伯糖苷、2-甲基腺嘌呤阿拉伯糖苷、2-氯次 黄嘌呤阿拉伯糖苷、硫鸟嘌呤阿拉伯糖苷、2,6-二氨基嘌呤阿拉伯糖 苷、胞嘧啶阿拉伯糖苷、鸟嘌呤阿拉伯糖苷、胸腺嘧啶阿拉伯糖苷、 依诺他滨、吉西他滨、叠氮基胸苷、碘苷、双脱氧腺苷、双脱氧肌苷、 双脱氧胞苷、双脱氢双脱氧胸苷、硫双脱氧胞苷、索立夫定、5-甲基 尿苷、三氮唑核苷、硫代肌苷、替加氟、脱氧氟尿苷、布雷青霉素、 水粉蕈素、别嘌醇尿嘧啶、5-氟尿嘧啶、2′-氨基尿苷、2'-氨基腺苷、 2′-氨基胍、和2-氯-2′-氨基肌苷。
核苷磷酸化酶是在磷酸存在下能将核苷中的N-苷键磷酸解的酶的 通用名,并且可通过利用该酶的活性将其可逆反应应用到本发明中。
在本发明反应中使用的酶可以是任何类型或来源的,只要其具有从相 应的戊糖-1-磷酸酯和核酸碱基或其类似物形成所需核苷化合物的活性 即可。
核苷磷酸化酶通常可分为两类,即嘌呤型和嘧啶型。
嘌呤型酶 的已知实例包括嘌呤核苷磷酸化酶(EC2.4.2.1)和鸟苷磷酸化酶 (EC2.4.2.15)。
嘧啶型酶的实例包括嘧啶核苷磷酸化酶(EC2.4.2.2)、 尿苷磷酸化酶(EC2.4.2.3)、胸苷磷酸化酶(EC2.4.2.4)和脱氧尿苷 磷酸化酶(EC2.4.2.23)。
在本发明中,核苷磷酸化酶活性可通过使用具有酶活性的微生物 或者与水反应介质接触来施用到反应系统上。
这样的微生物可以是但 不限于表达至少一种选自嘌呤核苷磷酸化酶(EC2.4.2.1)、鸟苷磷酸 化酶(EC2.4.2.15)、嘧啶核苷磷酸化酶(EC2.4.2.2)、尿苷磷酸化酶 (EC2.4.2.3)、胸苷磷酸化酶(EC2.4.2.4)和脱氧尿苷磷酸化酶 (EC2.4.2.23)的核苷磷酸化酶的微生物。
这样的微生物的优选实例包括下述属的菌株:诺卡氏菌属、微杆 菌属、棒状杆菌属、短杆菌属、纤维单胞菌属、黄杆菌属、克鲁维氏 酵母属、微杆菌属、嗜血杆菌属、Micoplana、精朊杆菌属、念珠菌属、 酵母杆属、芽孢杆菌属、嗜热芽孢杆菌属、假单胞菌属、微球菌属、 哈夫尼菌属、变形杆菌属、弧菌属、葡萄球菌属、丙酸杆菌属、Sartina、 动性球菌属、埃希氏杆菌属、库特氏菌属、红球菌属、不动杆菌属、 黄色杆菌属、白链霉菌属、根瘤菌属、沙门氏菌属、克雷白氏杆菌属、 肠杆菌属、欧文氏菌属、气单胞菌属、柠檬酸杆菌属、无色杆菌属、 土壤杆菌属、节杆菌属、和假诺卡氏菌属。
分子生物学和基因工程中的最新进展已经使得能够并且比较容易 地通过下述方法制备基因工程重组菌株:从上述菌株中获得表达核苷 磷酸化酶的基因,并分析菌株中蛋白的分子生物学性质、氨基酸序列 等;构建重组质粒,将基因和用于其表达的调控区域插到该质粒中; 将质粒置于给定宿主中以获得表达蛋白的重组菌株。
从最近技术水平 的角度来看,通过将核苷磷酸化酶基因置于所需宿主中而获得的基因 工程重组菌株可包括在能够表达本发明磷酸化酶的微生物的范围内。
在本文中,表达所必需的调控区域可以是启动子序列(可包括控 制转录的操纵基因序列)、核糖体结合序列(SD序列)、转录终止序列 等。
启动子序列的实例包括得自大肠杆菌的色氨酸操纵子中的色氨酸 操纵基因;乳糖操纵子中的乳糖启动子;得自λ噬菌体的PL启动子和 PR启动子;得自枯草芽孢杆菌的葡萄糖酸合酶启动子(gnt);碱性蛋 白酶启动子(apr);中性蛋白酶启动子(npr);和α-淀粉酶启动子(amy)。
可使用唯一修饰和设计的序列例如tac启动子。
核糖结合序列可以是 例如得自大肠杆菌或枯草芽孢杆菌的序列,但是可以使用任何序列, 只要其可在所需宿主例如大肠杆菌和枯草芽孢杆菌中行使功能即可。
例如,可使用通过DNA合成形成的共有序列,即具有4个以上与16S 核糖体RNA中的3′-末端区域互补的连续碱基。
转录终止序列不总是必 需的,但是可以使用ρ-因子独立终止子例如脂蛋白终止子和色氨酸操 纵子终止子。
理想情况是,在重组质粒上的这些调控区域可以如下所 示顺序排列:从5′-末端的上游开始,启动子序列、核糖体结合序列、 核苷磷酸化酶编码基因、和转录终止序列。
作为本文所述质粒的具体实例,可使用在大肠杆菌中具有自动复 制区域的pBR322、pUCl8、Bluescript II SK(+)、pKK223-3和pSC101; 在枯草芽孢杆菌中具有自动复制区域的pUB110、pTZ4、pC194、ρ11、 φ1和φ105作为载体。
作为在两个或更多个宿主中可自动复制的质粒的 实例,可使用pHV14、TRp7、YEp7和pBS7作为载体。
在本文中,给定宿主一般是但不限于如在下文实施例中描述的大 肠杆菌,但是也可以使用其它菌株例如芽孢杆菌属,包括枯草芽孢杆 菌,以及酵母和放线菌属。
在本发明中,核苷磷酸化酶或能表达其活性的微生物可以是市售 酶、表现出其活性的微生物菌株、菌株的加工材料或其固定化产品。
菌株的加工材料可以是例如丙酮干燥的细胞或通过适当方法例如机械 破坏、超声破碎、冷冻和融化、加压减压、渗透压方法、自溶、细胞 壁分解和表面活性剂处理制得的细菌碎片。
如果需要的话,可通过硫 酸铵沉淀、丙酮沉淀或柱色谱法进一步纯化菌株。
在本发明中,能与磷酸根离子形成水不溶性盐的金属阳离子可以 是但不限于可以与作为反应副产物的磷酸根离子形成水不溶性盐的任 何金属阳离子。
这样的金属阳离子的实例包括钙离子、镁离子、钡离 子、铁离子、钴离子、镍离子、铜离子、银离子、钼离子、铅离子、 锌离子和锂离子。
在这些离子当中,特别优选的是不给反应带来不利 影响的工业上通用并且安全的金属离子,例如钙离子、钡离子和铝离 子。
在本发明中,能与磷酸根离子形成水不溶性盐的金属阳离子可作 为能与磷酸根离子形成水不溶性盐的金属阳离子与至少一种选自氯离 子、硝酸根离子(nitride)、碳酸根、硫酸根和乙酸根离子的阴离子 的盐加到反应溶液中。
这样的盐的实例包括氯化钙、硝酸钙(calcium nitride)、碳酸钙、硫酸钙、乙酸钙、氯化钡、硝酸钡、碳酸钡、硫 酸钡、乙酸钡、氯化铝、硝酸铝、碳酸铝、硫酸铝和乙酸铝。
在本发明中,金属阳离子可以作为与戊糖-1-磷酸酯的盐存在于反 应溶液中。
这样的盐的具体实例包括核糖-1-磷酸酯钙盐、2-脱氧核糖 -1-磷酸酯钙盐、2,3-二脱氧核糖-1-磷酸酯钙盐、阿拉伯糖-1-磷酸酯 钙盐、核糖-1-磷酸酯钡盐、2-脱氧核糖-1-磷酸酯钡盐、2,3-二脱氧 核糖-1-磷酸酯钡盐、阿拉伯糖-1-磷酸酯钡盐、核糖-1-磷酸酯铝盐、 2-脱氧核糖-1-磷酸酯铝盐、2,3-二脱氧核糖-1-磷酸酯铝盐、和阿拉 伯糖-1-磷酸酯铝盐。
构成用于本发明的反应溶液的含水反应介质是主要包括水的反应 介质。
任何这样的介质都可以使用,只要其能将磷酸根离子作为通过 与金属阳离子反应而形成的不溶性盐沉淀从反应系统中除去,同时使 得在本发明中使用酶活性的所需反应得以进行即可。
这样的含水反应 介质的实例包括水反应介质和通过将水溶性有机溶剂例如低级醇、丙 酮和二甲亚砜加到水中而制备的含水反应介质。
当使用水溶性有机溶 剂时,水溶性有机溶剂与水的比例可以是例如0.1-70wt%。
为了保 证反应的稳定性,可制备作为缓冲液的包括含水反应介质的反应溶液。
可用于本发明酶反应的已知缓冲液可用作缓冲剂。
在本发明中,制备核苷化合物的反应可在诸如适当pH和温度的条 件下进行,这取决于目标核苷产物、作为底物的戊糖-1-磷酸酯和核酸 碱基或其类似物、作为反应催化剂的核苷磷酸化酶或表现出该酶活性 的微生物或由这种微生物制得的一种制备物、和所加入的用于将磷酸 从反应系统中除去的金属盐的性质。
该反应一般可以在5-10的pH以 及10-60℃的温度下进行。
如果pH不在该控制范围内,则反应转化率 可能会由于目标产物或底物的不佳稳定性、酶活性降低、以及不能与 磷酸形成水不溶性盐而下降。
如果pH在反应期间改变,则如果需要的 话可以在适当时间加入酸例如盐酸和硫酸或碱例如氢氧化钠和氢氧化 钾。
戊糖-1-磷酸酯和核酸碱基或其类似物的浓度适当地为约0.1-1000 mM。
至于它们之间的摩尔比,从反应转化率的角度来考虑,核酸碱基 或其类似物与戊糖-1-磷酸酯或其盐的摩尔比可以为1-10、优选0.95 或更低。
当使用两种或更多种核酸碱基或其类似物的混合物时,可选 择作为总用量的上述浓度和摩尔比。
所加入的能与磷酸形成水不溶性盐的金属阳离子与反应所用戊糖- 1-磷酸的摩尔比可以为0.1-10、更优选0.5-5。
在具有更高浓度的 反应中,作为底物的核酸碱基或其类似物与作为产物的核苷可能不能 完全溶于反应溶液中。
本发明也适用于这种情况。
当使用两种或更多 种作为金属阳离子的物质时,可选择作为总用量的上述摩尔比。
可通过常规方法例如浓缩、结晶、溶解、电透析、以及使用离子 交换树脂或木炭的吸附和解吸来将由此制得的核苷化合物从反应溶液 中分离出去。
实施例 用实施例和比较实施例解释本发明,但是本发明并不限于这些实 施例和比较实施例。
分析方法 所制备的所有核苷化合物都是通过高效液相色谱法在下述分析条 件下分析的: 柱:YMC-Pack ODS-A312 150×6.0mm I.D.(YMC Co.,Ltd); 柱温:40℃; 泵流速:0.75mL/分钟; 检测:UV 260nm; 洗脱剂:10mM磷酸∶乙腈=95∶5(v/v)。
实施例1 将1mL由2.5mM 2′-脱氧核糖-1-磷酸酯二(一环己基铵)盐 (SIGMA)、2.5mM腺嘌呤(Wako Pure Chemicals,超纯级)、12单位 /mL嘌呤核苷磷酸化酶(Funakoshi)、10mM氯化钙(Wako Pure Chemicals,超纯级)和10mM Tris-盐酸缓冲液(pH 7.4)组成的反应 混合物在30℃反应24小时。
在反应结束时,已形成了白色沉淀。
稀释 后,分析该反应混合物。
结果表明,以96.0%的产率形成了2.40mM 脱氧腺苷。
比较实施例1 除了不加入氯化钙以外,按照与实施例1所述相同的操作进行反 应。
在反应结束时,没有观察到沉淀。
稀释后,分析该反应混合物。
结果表明,以80.4%的产率形成了2.01mM脱氧腺苷。
实施例2 除了氯化钙浓度是2.5mM以外,按照与实施例1所述相同的操作 进行反应。
在反应结束时,观察到已形成了白色沉淀。
稀释后,分析 该反应混合物。
结果表明,以90.8%的产率形成了2.27mM脱氧腺苷。
实施例3 除了加入的是氯化铝来替代氯化钙以外,按照与实施例1所述相 同的操作进行反应。
在反应结束时,观察到已形成了白色沉淀。
稀释 后,分析该反应混合物。
结果表明,以93.3%的产率形成了2.31mM 脱氧腺苷。
实施例4 除了加入的是氯化钡来替代氯化钙以外,按照与实施例1所述相 同的操作进行反应。
在反应结束时,观察到已形成了白色沉淀。
稀释 后,分析该反应混合物。
结果表明,以92.4%的产率形成了2.31mM 脱氧腺苷。
实施例5 除了氯化钡浓度是2.5mM以外,按照与实施例4所述相同的操作 进行反应。
在反应结束时,观察到已形成了白色沉淀。
稀释后,分析 该反应混合物。
结果表明,以90.2%的产率形成了2.27mM脱氧腺苷。
实施例6 按照在Journal of Biological Chemistry,Vol.184,pp.449- 459(1950)中描述的方法制备2-脱氧核糖-1-磷酸酯钡盐。
将1mL由 2.5mM 2-脱氧核糖-1-磷酸酯钡盐、2.5mM腺嘌呤(Wako Pure Chemicals,超纯级)、12单位/mL嘌呤核苷磷酸化酶(Funakoshi)、10 mM氯化钙(Wako Pure Chemicals,超纯级)和10mM Tris-盐酸缓冲 液(pH7.4)组成的反应混合物在30℃反应24小时。
在反应结束时,已 形成了白色沉淀。
稀释后,分析该反应混合物。
结果表明,以91.1% 的产率形成了2.40mM脱氧腺苷。
实施例7 将1mL由2.5mM 2-脱氧核糖-1-磷酸酯二(一环己基铵)盐 (SIGMA)、2.5mM胸腺嘧啶(Wako Pure Chemicals,超纯级)、12单 位/mL胸苷磷酸化酶(SIGMA)、10mM硝酸钙(Wako Pure Chemicals, 超纯级)和10mM Tris-盐酸缓冲液(pH7.4)组成的反应混合物在30 ℃反应24小时。
在反应结束时,已形成了白色沉淀。
稀释后,分析该 反应混合物。
结果表明,以91.2%的产率形成了2.28mM胸苷。
比较实施例2 除了不加入硝酸钙以外,按照与实施例7所述相同的操作进行反 应。
在反应结束时,没有观察到沉淀。
稀释后,分析该反应混合物。
结果表明,以75.2%的产率形成了1.88mM胸苷。
实施例8 将1mL由2.5mM核糖-1-磷酸酯环己基铵盐(SIGMA)、2.5mM 2,6- 二氨基嘌呤(Aldrich)、12单位/mL嘌呤核苷磷酸化酶(Funakoshi)、 10mM氯化钙(Wako Pure Chemicals,超纯级)和10mM Tris-盐酸 缓冲液(pH7.4)组成的反应混合物在30℃反应24小时。
在反应结束时, 已形成了白色沉淀。
稀释后,分析该反应混合物。
结果表明,以77.6 %的产率形成了1.94mM 2,6-二氨基嘌呤核糖核苷。
比较实施例3 除了不加入氯化钙以外,按照与实施例8所述相同的操作进行反 应。
在反应结束时,没有观察到沉淀。
稀释后,分析该反应混合物。
结果表明,以61.6%的产率形成了1.54mM 2,6-二氨基嘌呤核糖核苷。
实施例9 如下所述制备大肠杆菌染色体DNA。
用大肠杆菌K-12/XL-10菌株(Stratagene Inc.)给50mL LB培 养基接种,并将其在37℃培养过夜。
收集后,用含有1mg/ml溶菌酶 的裂解溶液将细菌裂解。
用苯酚处理该裂解溶液,并通过乙醇沉淀法 将DNA沉淀。
用玻璃棒收集DNA沉淀,并洗涤以制备用于进行多聚酶 链式反应的DNA。
使用基于大肠埃希氏菌中的已知deoD基因序列(具有碱基号为 11531-12250的编码区域的GenBank登记号AE000508)设计的SEQ ID Nos.1和2低聚核苷酸(由合同制造商Hokkaido System Science Co.Ltd. 制备的)作为多聚酶链式反应的引物。
这些引物分别在5′-末端和3′- 末端附加具有EcoRI和Hind III的限制酶识别序列。
    SEQ ID No.1:gtgaattcac aaaaaggata aaaca atg gc     SEQ ID No.2:tcgaagcttg cgaaacacaa tta ctc ttt 使用已经用限制酶Hind III完全消化过的含有6ng/μL上述大肠 埃希氏菌染色体DNA的0.1mL多聚酶链式反应溶液、和引物(分别为 3μM),在下述条件下进行30个循环的多聚酶链式反应:每个循环变 性:96℃、1分钟;退火:55℃、1分钟;延伸:74℃、1分钟。
通过EcoRI和Hind III将上述反应产物和质粒pUC18(Takara Shuzo Co.Ltd.)消化,并使用Ligation-High(Toyobo Co.Ltd.) 连接。
使用由此获得的重组质粒来转化大肠埃希氏菌DH5α。
将转化的 菌株在含有50μg/mL氨苄西林和X-Gal(5-溴-4-氯-3-吲哚基-β-D- 半乳糖苷)的LB琼脂培养基中培养以提供作为白色菌落的Am-抗性转 化体。
从所获得的转化体中提取质粒,并且其中已经插入所需DNA片段 的质粒称为pUC-PNP73。
由此获得的转化体称为大肠埃希氏菌MT- 10905。
将大肠埃希氏菌MT-10905通过在含有50μg/mL氨苄西林的100mL LB培养基中于37℃振摇过夜来进行培养。
将培养基以13000rpm离心 10分钟以收集细胞。
将细胞悬浮在10mL 10mM Tris-盐酸缓冲液(pH8.0) 中,并超声处理以获得用作酶源的匀浆。
将1mL由10mM 2'-脱氧核糖-1-磷酸酯二(一环己基铵)盐 (SIGMA)、10mM腺嘌呤(Wako Pure Chemicals,超纯级)、20mM氯 化钙、100mM Tris-盐酸缓冲液(pH8.0)、和20单位/mL如上所述的 嘌呤核苷磷酸化酶组成的反应混合物在50℃反应20小时。
在反应结束时,已形成了白色沉淀。
稀释后,分析该反应混合物。
结果表明,以96.0%的产率形成了9.6mM脱氧腺苷。
比较实施例4 除了不加入氯化钙以外,按照与实施例9所述相同的操作进行反 应。
在反应结束时,没有观察到沉淀。
稀释后,分析该反应混合物。
结果表明,以79%的产率形成了7.9mM脱氧腺苷。
实施例10 将1mL由10mM 2′-脱氧核糖-1-磷酸酯二(一环己基铵)盐 (SIGMA)、10mM鸟嘌呤(Wako Pure Chemicals,超纯级)、20mM氯 化钙、100mM Tris-盐酸缓冲液(pH8.0)、和20单位/mL如在实施例 9中所述制得的嘌呤核苷磷酸化酶组成的反应混合物在50℃反应20小 时。
在反应结束时,已形成了白色沉淀。
稀释后,分析该反应混合物。
结果表明,以80.0%的产率形成了8.0mM脱氧鸟苷。
比较实施例5 除了不加入氯化钙以外,按照与实施例10所述相同的操作进行反 应。
在反应结束时,没有观察到沉淀。
稀释后,分析该反应混合物。
结果表明,以51%的产率形成了5.1mM脱氧鸟苷。
实施例11 将1mL由10mM 2′-脱氧核糖-1-磷酸酯二(一环己基铵)盐 (SIGMA)、10mM胸腺嘧啶(Wako Pure Chemicals,超纯级)、20mM 氯化钙、100mM Tris-盐酸缓冲液(pH8.0)、和20单位/mL胸苷磷酸 化酶组成的反应混合物在50℃反应20小时。
在反应结束时,已形成了白色沉淀。
稀释后,分析该反应混合物。
结果表明,以90.0%的产率形成了9.0mM胸苷。
比较实施例6 除了不加入氯化钙以外,按照与实施例11所述相同的操作进行反 应。
在反应结束时,没有观察到沉淀。
稀释后,分析该反应混合物。
结果表明,以70%的产率形成了7.0mM胸腺嘧啶。
                      工业实用性 依据本发明,在使用核苷磷酸化酶或表现出其活性的微生物由戊 糖-1-磷酸酯和核酸碱基制备核苷化合物的过程中,可加入能与磷酸形 成水不溶性盐的金属盐以将作为副产物的磷酸从反应系统中除去。
加 入所述金属盐获得了依据现有技术所不能实现的优异产率。
从工业实 施的角度来看,本发明显著降低了成本,从而具有显著进步。
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