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家畜肉质、生长、胴体与生殖特性的遗传标志

基本信息

  • 申请号 CN00810324.0 
  • 公开号 CN1361788A 
  • 申请日 2000/05/15 
  • 公开日 2002/07/31 
  • 申请人 宾夕法尼亚州研究基金会  
  • 优先权日期  
  • 发明人 D·L·格雷格尔  
  • 主分类号  
  • 申请人地址 美国宾夕法尼亚州 
  • 分类号  
  • 专利代理机构 中国专利代理(香港)有限公司 
  • 当前专利状态 发明专利申请公布 
  • 代理人 张广育 
  • 有效性 发明公开 
  • 法律状态
  •  

摘要

提供了用于鉴定与家畜生长和生殖特性有关的多态性的组合物和方法。
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权利要求书


1.一种筛选测试对象的方法,用以鉴定那些很可能具有较好的生 长、发育、生殖和胴体特征,如增重率,胴体长度,或窝仔大小的对 象,包括:从测试对象取得遗传材料的样品,测定CYP11a1基因中的 多态性的存在,而后者是与增重率、胴体长度和窝仔大小有关的。

2.权利要求1的方法,其中所述测定步骤选自以下一组方法:限 制性片段长度多态性(RFLP)分析,异源双链分析,单链构象多态性 (SSCP),变性梯度凝胶电泳(DGGE)和温度梯度凝胶电泳(TGGE)。

3.权利要求1的方法,其中所述测定存在所述多态性的步骤包括 以下步骤:用一种能在至少一个位置上切割CYP11a1基因的限制性内 切酶消化该遗传材料;分离消化所得片段;检测该片段生成的限制性 图型;将该图型与用该限制酶所得的CYP11a1基因的第二种图型进行 比较,此处所述第二种限制性图型是与增重率增加、胴体长度增加和 窝仔大小增加相关联的。

4.权利要求1的方法,其中所述测试对象选自猪、乳牛和鸡。

5.权利要求3的方法,其中所述限制性酶是SphI,所述测试对象 是猪。

6.权利要求3的方法,其中所述的分离是凝胶电泳。

7.权利要求3的方法,其中所述比较限制性图型的步骤包括根据 大小来鉴定特定片段,以及比较所述片段的大小。

8.权利要求5的方法,还包括此步骤:在消化步骤之前,扩增猪 CYP11a1基因的量,或其含有该多态性的部分的量。

9.权利要求3的方法,其中所述限制性位点位于CYP11a1基因的 非翻译区。

10.权利要求7的方法,其中所述的扩增包括以下步骤:选择能 扩增猪CYP11a1基因中含有多态性限制位点的一个区域的正向和反向 序列引物。

11.权利要求10的方法,其中所述正向和反向引物长度在10~50 核苷酸之间,并选自SEQ ID NO:1。

12.权利要求10的方法,其中所述正向引物是SEQ ID NO:2, 所述反向引物是SEQ ID NO:3。

13.权利要求6的方法,其中所述检测片段大小的步骤包括:在 有已知大小的对照DNA片段的存在下用凝胶电泳分离所述片段;将已 分离开的片段与探针接触,探针与片段杂交形成探针-片段复合物; 通过检测探针片段的存在确定被分离片段的大小。

14.一种鉴定关于猪生长率、胴体长度、窝仔大小或猪异味的遗 传学标志的方法,包括以下步骤:繁殖同一品种或杂交品种或衍生自 相似遗传谱系的雄性和雌性猪;确定生长率、胴体长度、子代数量、 或猪异味的存在;测定每头猪CYP11a1基因中多态性的存在;找出生 长率、胴体长度、子代数量或猪异味存在与所述多态性之间的关联, 由此鉴定一种关于这些特性的多态性。

15.权利要求14的方法,进一步包括:根据所述标志选择预测为 具有较好生长率、较长胴体、窝仔大小增加、或低猪异味的猪进行饲 养的步骤。

16.权利要求14的方法,其中所述分析包括用限制性酶Sphl消化 PCR扩增的DNA。

17.权利要求12的方法,其中与生长率、胴体长度、窝仔大小或 猪异味相关联的多态性是用正向和反向引物检测的,这些引物包括SEQ NOS:2和3中至少4个连续碱基。

18.一个评价猪DNA样品的试剂盒,包括:在一容器中,一种鉴 定猪CYP11a1基因多态性的试剂。

19.权利要求18的试剂盒,其中的试剂是一种扩增猪CYP11a1基 因或其片段的引物。

20.权利要求18的试剂盒,还包括一种DNA聚合酶,一种在猪 CYP11a1基因的至少一个位置上进行切割的限制性酶;以及能扩增猪 CYP11a1基因中含有一多态位点的区域的正向和反向引物。

21.用于测定猪CYP11a1基因中存在多态性Sphl位点的一种引 物,其中该引物包含一个来自SEQ ID NO:2和SEQ ID NO:3的一个 序列。

22.与猪的生长率、胴体长度、窝仔大小及猪异味有关联的一种 遗传标志,该标志包含猪CYP11a1基因中的多态性。

23.权利要求22中的遗传标志,其中所述多态性是一Sphl限制性 位点。

24.权利要求22的标志,其中所述多态性位于猪CYP11a1基因的 5′非翻译区。

25.猪CYP11a1基因5′非翻译区中的一段DNA序列,该序列由SEQ ID NO:1组成。

26.设计的用于扩增猪CYP11a1基因中多态性Sphl限制性位点的 一种引物,其中该引物是来自SEQ ID NO:1中的4个或更多的连续 碱基。

27.设计的用于扩增猪CYP11a1基因中多态性Sphl限制性位点的 一种引物,其中该引物是从SEQ ID NO:1生成的一种反向引物。

28.筛选猪的一种方法,用以确定那些更可能具有增高的生长率、 较长胴体、较大窝仔、较高猪异味的猪,以及/或者那些较少可能表现 增高生长率、较长胴体、较大窝仔、或较高猪异味的猪,该方法包含 以下步骤:确定猪所存在的CYP11a1基因的等位基因;确定已知影响 生长率、胴体长度、窝仔大小、或猪异味的基因的其它标志的等位基 因;选择具有等位基因的良好组合的动物,而排除那些有不良组合的 动物。

27.权利要求28的方法,其中对CYP11a1等位基因的测定包括测 定至少一个等位基因的存在,该等位基因与至少一个、与CYP11a1直 接或间接相连的DNA标志相关联。

30.权利要求28的方法,其中DNA标志是一微卫星。

31.权利要求28的方法,其中DNA标志是SO 064,SO 102,SO 078,SO 158,SO 066,SW 304,SW 1083,SO 101或SO 212。

32.权利要求28的方法,其中标志选自以下的群:肿瘤坏死因子 α(TFNα),CYP11a1,泌乳素(PPL),雌激素受体(ER)及泌乳 素受体(PRLR)。
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说明书

                       序列表 <110>宾夕法尼亚州研究基金会(The Penn State Research Foundation) <120>家畜肉质、生长、胴体与生殖特性的遗传标志 <130>PSU-99-2102 <140>PCT/US00/13168 <141>2000-05-15 <150>60/134,180 <151>1999-05-13 <160>7 <170>FastSEQ for Windows Version 3.0 <210>1 <211>635 <212>DNA <213>猪(Sus scrofa) <220> <221>misc_feature <222>(0)...(0) <223>多态位点N=C或T <400>1 gctccaaaga gacattttgg ggtggcaaaa tagtctacag gattctatgg cataggagac     60 aactctcaga tagctctgca gacctgctcc aaagaagtat aggagaagcc aggatttata    120 agaacttttt tgttgggaaa ataaatgtag tcaaacataa aaagacaact gctaataaca    180 aacaatagac atgtcaagat aatgacctta gtgcctttct atgtgtggaa agactcaaga    240 atctggggtc attgaacttt tccttagata tgcatcttaa tatcctgggg tcagtataat    300 ccaaatgctt cctgtttttc tccatcctaa agtcccctcc gggtgcactg atgggttccc    360 ctccagtggg caactgcagt ggcaattggc ttgatctctg tagaactgga atggtgggca    420 acattctttt ctttacagta tcctgagtct gggaggggct gtgtgggcca gagcctgnat    480 gcaggaggag gagggagtct gatcgcttag tcagcttctc gcttaacctt gagctggtgg    540 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tgaacggagg ggaagcc                                                   17 发明领域 本发明总体上是关于家畜中与生长、身体成分和生殖特性有关的 遗传差异的检测。
更明确而言,本发明提供预测与类固醇生物合成和 代谢有关的某些遗传特性的组合物和方法。
发明背景 为了更充分地描述本发明有关领域的状况,在此申请中引证了一 些著作,并在括号中引了作者姓名,发表年份和杂志。
这些著作的内 容在此引入作为参考。
类固醇激素在大多数动物组织的分化、发育、生长和生理功能中 起着极重要的作用。
在所有类固醇激素生物合成中,第一个并且是限 速的步骤是藉助胆固醇侧链切割酶p450scc将胆固醇转化为孕烯醇酮。
编码P450scc的基因称作CYP11a1。
细胞色素P450是一组各异的含血 红素的单加氧酶(称作CYP′s;见Nelson等,DNA Cell Biol.(1993) 12:1-51),催化多种氧化反应,主要是类固醇,不过也包括脂肪酸 和异生素。
CYP′s在睾丸、卵巢、胎盘、肾上腺和肝脏表达最丰。
在 睾丸、卵巢和胎盘这些生殖器官中生成的最重要的类固醇激素是雄激 素(如睾酮),雌激素(如雌二醇)和孕激素(如孕酮)。
肾上腺中 最重要的类固醇是盐皮质激素(如醛固酮)和糖皮质激素(如皮质醇)。
煮熟的公猪肉常有一种不佳的气味和不快的味道,通常叫做“猪 腥气”或“猪异味”,这是造成在猪的生产中广泛实行阉割的主要原 因。
造成猪异味的一种重要化合物,5α-雄甾烯酮(5α-雄甾-16烯 -3酮),与其它16-雄甾烯类固醇、雄激素和雌激素一道是在公猪 的睾丸内合成的。
青春期时,Δ16-雄甾烯,特别是5α-雄甾烯酮(雄 甾烯酮)在睾丸中的生成急剧增加。
这引起身体各部位雄甾烯酮的蓄 积,特别是蓄积在全身的脂肪储备和颌下唾液腺(SMG),后者含有Δ16 -雄甾烯的特异结合蛋白。
SMG中雄甾烯酮和其它Δ16-雄甾烯的浓 度与脂肪中Δ16-雄甾烯的浓度高度相关。
测定SMG中的Δ16-雄甾 烯,实际上已用作确定是否存在猪异味的测定方法。
因此,由于Δ16- 雄甾烯的这种增加,在工业上通常对幼公猪进行阉割以使肉中的异味 降到最低。
不过,如果能够克服猪异味的问题,饲养公猪比饲养阉猪 要经济得多。
虽然公猪和阉猪的增重速度相同,但公猪的胴体的脂肪 含量少30%。
因此,公猪在生产瘦肉上更为有效。
此外,公猪利用饲 料比阉猪更有效(每单位体重消耗的饲料少10%)。
因为饲料代表生 猪生产的主要费用,饲养公猪取得猪肉具有显著的经济利益。
在美国,每年约屠宰9千万头猪,价值约为$110亿。
饲料是生猪 生产成本的主要部分,约占生产成本的70%。
因此饲料效益提高10% 就能节省生产总成本的7%。
在全国范围内,仅考虑雄性生猪,便可使 整个市场节约$3.35亿。
因实行阉割而损失的生产效益构成全球生猪工 业的很大经济损失。
对家畜类固醇生物合成改变的遗传型和基因基础进行鉴定对生产 高质量的肉,乳蛋产品是很有用的。
本发明的目的是提供鉴定这种遗 传改变的著作和方法。
发明概述 依据本发明,提供了鉴定与类固醇生物合成相关的遗传改变的方 法。
在本发明的一个实施方案中,对测试对象的CYP11a1 DNA是否存 在多态性标志进行测定。
这类测试对象选自重要的家畜品种,包括猪, 乳牛,小鸡和羊,但不限于此。
依据本发明,已经确定,CYP11a1基 因的某些多态性是与增加生长,生殖和胴体特征有关的。
因此,提供 了一些筛选方法,可以鉴定具有有益的CYP11a1等位基因的测试对象 的方法。
对这种家畜的鉴定可以加速实现发展具有这些改良遗传特性 的家畜的繁殖规划。
本领域的技术人员熟知,为比较核酸分子的序列差异可以采用多 种技术。
这包括:举例来说,限制性片段长度多态性分析,异源双链 分析,单链构象多态分析,变性梯度电泳,和温度梯度电泳。
在本发明的一个优选实施方案中,CYP11a1多态性是一种限制性 片段多态性,其测定包括:在测试对象分离所得的遗传物质中鉴定 CYP11a1基因;将此基因置于一限制性酶的作用下产生该基因的不同 长度的限制性片段;用电泳或高压液相层析分离限制性片段形成限制 性图型,比较一已知为具有或不具有预期标志的测试对象CYP11a1基 因所给出的限制性片段图型。
如果测试对象的标志物测试为阳性,这 样的对象可考虑包含在饲养计划中。
如果测试对象的标志基因型测试 结果不是阳性,那么该对象可从组中剔除或用于其它用途。
在一特别优选的实施方案中,测试对象是猪,多态性是在CYP11a1 基因的5′UTR中,限制性酶是SphI。
因此,在这方面,这就是本发明 的一个目的:提供一个筛选猪的方法,以确定哪些猪在饲养中极可能 睾丸重量低、猪异味轻、胴体较长,增重率改善,或断奶体重较高, 或选择去除另一些猪,这些猪具有的等位基因表明睾丸体积较大,猪 异味强,胴体长度减低,增重率低,或断奶体重较轻。
此处所述“较 小的睾丸体积”的含义是睾丸体积显著地低于一定群体的均值。
此处 所述“猪异味轻”的含义是猪异味显著低于一定群体的平均水平。
此 处所述“胴体长度增加”的含义是胴体长度较一定群体的平均水平有 显著增加。
此处所述“增重率较高”的含义是增重率比一定群体的均 值显著增加。
此处所述“较重的断奶体重”含义是断奶体重高于一定 群体的均值。
本发明的方法包括以下步骤:1)从猪身上取得一个基因 组DNA的样品;及2)分析1)所获得的基因组DNA,确定存在哪种 CYP11a1等位基因。
简言之,从猪身上取得一个遗传物质的样品,然 后分析该样品,确定CYP11a1基因中是否存在一种多态性,这种多态 性是与减轻猪异味,较小的睾丸体积,胴体长度增加,较高的增重率, 以及/或增加断奶体重相关的。
在一个最优选的实施方案中,使用引物和DNA聚合酶对基因中含 有多态性的特定区域进行扩增,分离该基因。
然后将扩增区域用限制 性酶消化并对片段进行分离。
对片段染色,或标记在扩增中使用的引 物或核苷三磷酸便可显现RFLP图象。
在另一实施方案中,本发明包括一种方法,用于鉴定在一特定群 体中公猪异味、睾丸体积、胴体长度、增重率和/或断奶体重的遗传标 志。
繁殖同一品种或杂交品种或相似遗传血统的雄性和雌性猪,测定 其特征,如公猪异味,睾丸体积,胴体长度,增重率和/或断奶体重。
确定每头猪的CYP11a1基因的多态性及与公猪异味、睾丸体积、胴体 长度、增重率、和/或断奶体重等特征的关联。
优选用RFLP分析来测 定多态性,最优选的是:DNA用限制性内切酶SphI或其他有差异地切 割限制性位点的限制性内切酶。
还提供了一些方法,可以确定可替换的DNA标志的特异等位基因 与已知和某种特征有关的特定基因(如此处讨论的CYP11a1基因)有 关的DNA标志的等位基因间的连锁关系。
这样便可以间接地对猪进行 选择,即选择很可能具有较轻公猪异味,较小睾丸,胴体长度增加, 高增重率,和/或较高断奶体重的猪,或选择去除可能具有高公猪异味、 较大睾丸、胴体长度短、低增重率、和/或断奶体重低的猪,其方法是 通过选择位于与CYP11a1同一染色体上的可替换标志的特异等位基 因,选择与CYP11a1关联标志的某些等位基因。
本发明还包括一些试剂盒,用于评价测试对象DNA样品以了解测 试对象的遗传物质中是否存在位于测试对象CYP11a1基因中的预期标 志,这些标志可以指示以下遗传特征,如公猪异味(对猪而言),睾 丸大小,胴体长度,增重率,及/或断奶体重。
至少,以猪为测试对象 时,试剂盒含有一种或更多的能鉴定猪CYP11a1基因多态性的试剂。
优选地,这试剂是一组能扩增猪CYP11a1基因含有多态性的片段的寡 核苷酸引物。
更优选地,试剂盒还包含一种能在猪CYP11a1基因的至 少一个位置上进行切割的限制性酶。
在最优选的实施方案中,限制性 酶是SphI或一种能在此同一识别位点切割的限制性酶。
我们提供以下定义以便于理解本发明: 名词“相符”在此处表示一种多核苷酸序列与参考多核苷酸序列 的全部或一部分同源,或一种多肽序列与参考多肽序列相同。
与之对 比,“互补”在此处的含义是互补序列与参考多核苷酸序列的全部或 一部分同源。
举例说明,核苷酸序列“TATAC”与参考序列“TATAC” 相符,并与参考序列“GTATA”互补。
杂交探针可以是DNA或RNA, 或能以碱基特异的方式与互补的核酸链结合的任一合成的核苷酸结 构。
例如,包括肽核酸的探针如下文所述:Nielsen等,Science 254:1497 -1500(1991)。
“连锁”描述的是基因、等位基因、位点或遗传标志由于它们位 于同一染色体上而具有一起遗传的倾向,可以用两个基因、等位基因、 位点或遗传标志间的重组百分率(也叫重组分数或θ)来衡量。
两个位 点在染色体上的物理位置越近,重组分数就越低。
正常情况下,当测 定一个致病基因中多态性位点与疾病的连锁时,重组分数会等于零, 说明疾病与致病基因总是共遗传的。
在较少见的情况下,当一个基因 在基因组中占一极大节段时,则有可能观察到在基因一端的多态性位 点与另一端成因突变的重组。
不过,如果成因突变就是被测试与疾病 连锁的多态性,就不会观察到重组。
“厘摩”是表示两个遗传标志、等位基因、基因或位点间连锁的 遗传学距离的一种单位,相当于在任一次减数分裂事件中两个标志物 或位点间有1%的重组机率。
“连锁失衡”或“等位基因联合”的含义是:一个特殊的等位基 因、位点、基因或遗传标志与一个位于染色体近处的特定等位基因、 位点、基因、或遗传标志的优先联合,其频率远高于按偶发预期的群 体中任一特殊等位基因的频率。
“寡核苷酸”可以是DNA或RNA,单链的或双链的。
寡核苷酸 可以是天然存在的或合成的,不过通常是用合成方法制备的。
名词“引物”指的是能在DNA合成中起起始点作用的寡核苷酸, 其需要的条件是:能诱导起与一核酸链互补的引物延长产品的合成, 即存在四种不同的三磷酸核苷和一种能发生聚合反应的因子(即,DNA 聚合酶或逆转录酶),适宜的缓冲剂及合适的温度。
优选的引物是单 链寡核苷酸。
一个引物的适宜长度取决于对引物的预期用途,不过通 常为10~30个核苷酸。
短引物分子通常需要较低的温度以便与模板形 成足够稳定的杂交复合物。
一个引物不必反映模板的准确序列,但必 须具有足够的互补性可与模板杂交。
名词“引物”所指的可以是一个 以上的引物,特别是当想扩增靶区的一端或两端有两可的信息时。
例 如,有一区域表现出群体中相当水平的多态性或突变,可制备一些引 物的混合物,这样就可扩增可变序列。
如果需要,可以标记引物,掺 入可用分光光度法、光化学法、生化、免疫化学或化学方法检出的一 种标记。
举例来说,有用的标记包括32P,荧光染料,密电子试剂,酶 (如ELISA中常用的酶),生物素,或能获得相应抗血清或单克隆抗 体的半抗原和蛋白。
标记区可用于“捕获”引物,因而帮助引物或引 物延长产物,如扩增的DNA,固定在固相支持物上。
公猪的“染色体7组”,譬如说,表示一个测试对象或家族成员 的体细胞的染色体7的两个拷贝或是种系细胞中的一个拷贝。
染色体7 的两个拷贝的特定的等位基因,包括位于或邻近所关注位点的等位基 因,可以是相同的或是不同的。
染色体7组可包括染色体7文库如质 粒、酵母或噬菌体文库中收集的染色体7的一些部分。
参见Sambrook 等,Molecular Cloning,第2版,和Mandel等,Science 258:103-108 (1992)。
“外显率”指的是带有缺陷基因或多态性的个体由于此遗传改变 而表现一些特征性症状的百分比。
表现度指的是特征的表现程度(如, 轻度,中度或重度)。
“多态性”指的是在群体中存在两种或更多的由遗传决定的可变 换序列或等位基因。
多态性标志是在该处发生偏离的位点。
优选的标 志具有至少两个等位基因,每个的发生频率高于1%。
一个多态性位点 可以小到只有一个碱基对的差异。
适用于本发明的多态性标志包括限 制性片段长度多态性,同向重复序列可变数(VNTR′s),高可变区, 三核苷酸重复,四核苷酸重复,及其它微卫星序列。
“限制性片段长度多态性”(RFLP)的含义是DNA序列的一种 变异,它改变了限制性片段的长度,如Botstein等描述于Am.J.Hum. Genet.32:314-331(1980)。
限制性片段长度多态性可以产生或消 除一个限制性位点,因而改变了限制性片段的长度。
例如,DNA序列 GAATTC有6个碱基,与它的互补链CTTAAG一起构成限制性内切酶 EcoRI的识别和切割位点。
在DNA任一链上以一不同的核苷酸取代6 个核苷酸的任一个就破坏了EcoRI位点。
此RFLP可用以下方法检出, 例如,扩增包括多态性在内的靶序列,用EcoRI消化扩增的序列,在 琼脂糖凝胶或丙烯酰胺凝胶上对反应产物进行大小分离。
如果在扩增 序列中唯一的EcoRI限制性酶位点就是多态性位点,包含限制性位点 的靶序列就会显示出两个根据扩增序列长度预定大小的片段。
不含限 制性酶位点的靶序列只表现具有扩增序列长度的一个片段。
与之相似, RFLP的检测还可用一邻近区域的探针探查Southern印迹DNA的EcoRI 消化物,这样便可观察到相应大小的EcoRI片段是否存在。
PFLP可因 点突变而引起,后者可产生或破坏一个限制性酶位点、VNTR、二核苷 酸重复序列、缺失、重复,或其它能形成或失去一个限制性酶位点, 或改变限制性片段大小的序列变异而引起。
“同向重复序列可变数”(VNTR′s)是核酸的短序列、以头尾相 接方式串联排列,并在每个个体内发现。
如Wyman等所述,Proc.Nat. Acad.Sci.77:6754-6758(1980)。
概言之,VNTR序列包含一个至 少16个碱基对的核心序列及可变数量的该序列的重复。
此外,在核心 序列内也可有变异,Jefferys等,Nature 314:67-72(1985)。
这些 序列具有高度的个体性,可能是每一个体独特的。
因此,VNTR可生 成限制性片段长度多态性,可又成为一种基于大小的扩增产物差异标 志。
“微卫星序列”包含至少约10碱基对的DNA的一些节段,由可 变数量的DNA短序列(1-6碱基对)串联重复组成(Clemens等,Am. J.Hum.Genet.49:951-960;1991)。
微卫星序列通常广泛分布于一 个个体的染色体DNA上。
特定的纵向列阵中的重复数量在个体与个体 间有很大不同,因此,微卫星序列可以产生限制性片段长度多态性, 又可成为一种基于大小的扩增产物差异标志。
附图简述 图1描述猪CYP11a1基因(SEQ ID NO:1)的5′非翻译区约630 碱基对的序列。
用提自猪睾丸样品的DNA产生PCR片段。
所用引物 为正向引物(SEQ ID NO:2)和反向引物(SEQ ID NO:3)。
图2描述Sph1消化PCR产物的多态性图型。
使用正向和反向引 物的PCR条件如下:94℃2分钟,35次循环的94℃1分钟、55℃1分 钟、72℃1分钟,以及最后的72℃2分钟。
样品用SphI(New England Biolabs)消化,用1.5%琼脂糖凝胶室温下分离,50V,45分。
凝胶用 溴化乙锭染色。
泳道1:低分子量标志;泳道2:未消化的PCR片段; 泳道3及7:CT基因型;泳道4-6:CC基因型。
CC猪的630bp PCR 片段被消化成450bp产物,而CT猪的PCR片段只部分地被消化,表 明存在T等位基因,由此发现其限制片段长度多态性(RFLP)。
图3描述CC型公猪与CT基因型公猪颌下唾液腺(SMG)Δ-16 雄甾烯浓度的比较。
30头CC公猪中有5头显示SMGΔ-16雄甾烯浓 度高于鉴定异味胴体的推荐阈值(55μg/g SMG)。
携有T等位基因的 全部公猪(n=20)都低于公猪异味的推荐阈值。
图4是一个表,表明比较CC公猪与CT公猪所观察到的生长、胴 体、和生殖特征的差异。
睾丸、颌下腺和尿道球腺的重量较大,以及 SMGΔ-16雄甾烯浓度较高都指示CC公猪的猪异味较高。
令人惊异 的是CC猪增重率还增加5.9%,而且胴体也较长。
图5显示牛CYP11a1基因的序列,包括5′UTR的948核苷酸。
图6显示鸡CYP11a1基因的序列,包括5′UTR的137核苷酸。
发明详述 按照本发明,我们提供用于诊断家畜中与异常的、或增高的类固 醇生物合成有关的CYP11a1基因的遗传改变的材料和方法。
小鼠 CYP11a1基因多态性变异是睾酮生成中遗传性差异的原因。
小鼠 CYP11a1基因定位于染色体9。
此区域与猪染色体7同线。
公猪异味的主要原因是由于存在Δ-16类固醇,雄甾烯酮,它是 公猪睾丸中生成的多种类固醇之一。
雄甾烯酮及其代谢物,如雄烯醇 由睾丸分泌,隐存于颌下唾液腺(SMG)。
在交配行为中这些类固醇 通过唾液释放到空气中,起着性信息素的作用,引起雌猪(母猪)的 动情行为。
因为Δ-16类固醇是高度亲脂性的,雄甾烯酮也储存于体 脂肪中,它的高浓度的存在构成猪肉的臭味,即所谓公猪异味。
脂肪中雄甾烯酮的浓度是高度遗传性的。
已鉴定了脂肪雄甾烯酮 定量特征位点(QTL)(微卫星标志SO 102),位于猪染色体7的猪 白细胞抗原复合物(SLA)区域。
根据本发明,已确定了一个与雄甾 烯酮的生成和分猪异味相关的特殊遗传多态性序列。
猪染色体7上存在一个脂肪雄甾烯酮的定量特征位点(QTL), 说明猪的CYP11a1可能定位于染色体7上,而且类固醇合成的限速酶 可能是雄酮合成和存在公猪异味的重要控制点。
为了确定是否存在与引起公猪异味的化合物相关联的多态性,进 行了一项基因组的研究,对预先选择的公猪组的猪CYP11a1基因非翻 译区(5′UTR)的2.4kb进行比较。
首先对5只“高异味”和5只“低 异味”公猪的基因型进行比较,通过对PCR产物直接测序(使用ABI Prism 377,Nacleic Acid Facility,Penn State University Biotechnology Institute)揭示在整个2.4kb 5′UTR中存在一单核苷酸多态性(SNP)。
这个SNP(CT等位基因)只在公猪身上被发现,它表现唾液腺中低浓 度的Δ-16类固醇,这个度量与脂肪中雄甾烯酮浓度高度相关。
此多 态性由位于翻译起始点的-155位置上的一个胸腺嘧啶(T)或一个胞 嘧啶(C)构成。
此多态性位于一限制性酶的识别位点,因而存在T等 位基因时,经特定限制性酶消化后所观察到的限制性片段长度图型就 会发生改变。
在此具体情况下,所用限制性酶为Sphl(England Biolabs)。
能切割此同一DNA序列的其它限制性酶也是可以得到的。
用检查Sphl 对CYP11a1 5′UTR的限制性消化产物确定T等位基因的存在或缺如。
T等位基因的存在,无论是纯合子(TT)或是杂合子(CT),与低猪 异味相关联。
与CC等位基因的存在相关联的是高猪异味,以及睾丸 重量、尿道球腺长度和重量、以及颌下唾液腺重量的增加。
此外,具 有CC等位基因的公猪表现增重率改善5.9%并有较长胴体。
发现此多态性不仅有生殖特征的效应还与增重率和胴体长度的增 加有关联,这说明此多态性影响多种其它生长和发育特征。
因而,存 在或缺少此多态性还可能与饲养效益及出生重量有关。
此多态性与生 殖特征的关联,如睾丸重量,尿道球腺长度和重量,颌下腺重量,以 及Δ-16类固醇浓度等,都是生殖腺类固醇生成的总效应的指征。
此处提供的资料表明CYP11a1多态性的存在或缺如可能对其它生 殖特征有效应,例如排卵率,窝仔大小,产奶,和生育力(包括雌、 雄二者)。
此外,因为肾上腺是CYP11a1表达并生成如皮质醇的糖皮 质类固醇的另一场所,此多态性也可能与疾病反应特征有关,因为这 类特征是由肾上腺类固醇调控的。
本发明的另一方面,此遗传标志还可用于与其它遗传标志相联合 生成有益的等位基因组合,或以筛选防止携有不良组合的测试对象。
这些以往已鉴定的基因的例子如:肿瘤坏死因子α(TNFα),CYP11a1, 泌乳素(PRL),雌激素受体(ER)及泌乳素受体(PRIR)。
这些以 往鉴定的微卫星标志的某些例子有:SO 064,SO 102,SO 078,SO 158, SO 066,SW 304,SW 1083,SO 101,及SO 212。
猪CYP11a1基因中的其它多态性可用本发明的方法鉴定。
这种变 化可能发生在基因的非翻译区,但也可能在翻译区、以及在内含子和 外显子序列中得到鉴定。
很可能一组这类变化会引起、或关联着雄激 素功能和表型特征的变化。
一旦鉴定出这样的遗传改变,就有可能用 已知的技术将这些、或类似的改变导入基因组,用以产生具有所期望 的CYP11a1基因型的转基因动物。
资料还启示:其它农业上重要物种 CYP11a1同源区中的多态性可能会引起、或关联着功能和基因型的相 似变化。
发明的再一方面,提供了乳牛和鸡的相应的CYP11a1序列。
此信 息有利于对牛或鸡CYP11a1的5′UTR进行基因组扫描,以揭露与生长、 胴体特性、和生殖(包括产乳和产蛋)相关联的多态性。
实施本发明方法的诊断试剂盒 本发明还包括实施发明方法的试剂盒。
试剂盒包括一个瓶子、管 子或任何容器,其中含有一种或更多种寡核苷酸,它能与一DNA节段 杂交,这种DNA节段就是CYP11a1基因或是与该基因连接的节段。
某些试剂盒含有两种这样的寡核苷酸,可用作扩增一染色体DNA节段 的引物。
选择扩增的节段可以是一个CYP11a1基因,它包括发生已知 变异的位点。
某些试剂盒包含一对寡核苷酸以检测预定的变异。
例如, 某些试剂盒含有适用于等位基因特异的寡核苷酸杂交、或等位基因特 异的扩增杂交的寡核苷酸。
本发明的试剂盒也可包含扩增系统的成分, 包括如缓冲液和热稳定聚合酶的PCR反应材料。
在其它实施方案中, 本发明的试剂盒可与商售的扩增试剂盒联合使用,这类扩增试剂盒可 购自GIBCO BRL(Gaithersburg,Md.)Stratagene(La Jolla,Calif.), Invitrogen(San Diego,Calif.),Schleicher & Schuell(Keene,N.H.), Boehringer Mannheim(Indianapolis,Ind.)。
试剂盒可随意包含阳性或 阴性对照反应或标志物,凝胶电泳的分子量标志物等。
试剂盒通常包 括标签或说明书,说明试剂盒用于诊断类固醇生物合成变化的适宜性, 并说明为此目的如何使用寡核苷酸。
名词“标签”通常用于包含任何 书面的或记录的材料,这些材料在生产、运输、出售或使用过程的任 何时间都附在或以其它方式带在诊断盒中。
实施发明的方式 1.连锁分析 决定一个多态性标志与一个和特定表型有关的位点间的连锁采用 以下方法,即定位多态性标志,并观察它们在一次提供信息的减数分 裂中是否(例如)与染色体上的高异味表型共分离。
参见,例如,Kerem 等,Science 245:1073-1080(1989);Monaco等,Nature 316:842 (1985);Yamoka等,Neurology 40:222-226(1990),及综述Rossiter 等,FASEB Journal 5:21-27(1991)。
一个单一的系谱很少包含足 够的提供信息的减数分裂以提供确定的连锁,因为家族通常较小,标 志可能不足以提供信息。
例如,一个标志在特定家族中可能不是多态 性的。
连锁可能藉受影响的同胞配对分析法来确定,描述于Terwilliger 和Ott,Handbook of Human Genetic Linkage(Johns Hopkins,Md., 1994),Ch 26。
此方法不需对外显率或变异频率作出假定,而只需考 虑所有已确定了表型和多态性标志的家族成员中较小部分(即同胞配 对)的数据。
特别是,受影响的同胞配对分析法将每对受影响的同胞 计算为共有(一致)或不共有(不一致)每种多态性标志的同一等位 基因变体。
然后,对于每一标志,可计算出几率,即可得到所观察到 的一致性的同胞对与非一致性的同胞对的比例而不用标志物连锁。
如Thompson与Thompson所描述:Genetics in Medicine,5th ed,1991, W.B.Saunders Company,Philadelphia,在连锁分析中,人们计算了在 各种可能的θ值下,从θ=0.0(无重组)到θ=0.50(随机分配)的可能 比值(相对差异)。
这样,在一给定的θ值下可能比值为:(如果α位 点在θ值下相连的数据可能性)/(如果位点不连接,数据的可能性)。
支持连锁的证据通常以此比值的log10表示,并将“差异的对数”称作 “优势对数分”。
例如,优势对数分为5表示100,000∶1的差异,即 所观察到的连锁不是偶然发生的。
采用对数使得从不同家族收集来的数据可用简单相加而综合。
可 利用计算机程序计算不同θ值的优势对数分。
可利用的程序包括 LIPED,和MLINK(Lathrop,Proc.Nat.Acad.Sci.81:3441-3446 (1984))。
对一具体的优势对数分,可从数学表测定重组分数。
参见Smith 等,“人类遗传学研究工作者用的数学表”(Churchill,London,1961) 及Smith,Ann.Hum.Genet.32:127-150(1968)。
优势对数值最高 时的θ值被认为是重组分数的最佳估算,“最大可能估算”。
优势对数正值表示两个位点是相连的,而负值表示连锁的可能性 (在该θ值下)低于两个位点不相连的可能性。
按惯例,综合优势对数 分为+3或更高(相当于1000∶1以上支持连锁)被认为是明确地证明 两个位点是相连的。
与之相似,按惯例,负的优势对数分-2或更小被 认为是确定地证明排除所比较的两个位点的连锁。
如果有充分的负的 连锁数据,一个位点便可从一个整染色体,或其一部分,排除,这个 方法被称作排除定位。
然后便将搜索集中到余下未被排除的染色体位 置上。
关于优势对数分和连锁分析的一般讨论,请参阅,如,T.Strachan, Chapter 4,“人类基因组作图”,The Human Genome,1992 BIOS Scientific Publishers Ltd.Oxford。
这些数据还可提供作单倍型分析。
此分析选定个体的染色体间的 等位基因标志物使得世代间分离所需要的重组事件数为最低。
连锁还 可藉测定对任两个标志物所观察到的分离数据的相对可能性来确定, 此处这两个标志在重组分数θ时其位置对应于两个标志不相连的情况, 因而独立分离。
2.DNA的分离和扩增 患者、先证者、测试对象或家族成员基因组DNA的样品分离自任 一适宜的来源,包括唾液,口腔细胞,毛发根,血液,脐带血,羊水, 以及其它含有无损的间期细胞核或中期细胞的适当细胞或细胞样品。
可以从固体组织和新鲜或保存的器官或从组织样品或活检材料取得细 胞。
样品中可包含一些并非天然地与生物材料相混杂的化合物,如保 存剂,抗凝剂,缓冲液,固定剂,营养剂,抗生素等。
从这些不同来源材料中分离基因组DNA的方法描述于:如,Kirby, DNA Fingerprinting,An Introduction,W.H.Freeman & Co.New York (1992)。
基因组DNA可从培养的原代或次代细胞培养物或从任一前 述组织样品衍生的转化细胞系获得。
患者,先证者,测试对象或家族成员的RNA样品也可使用。
RNA 可分离自表达CYP11a1基因的组织,如Sambrook等(见前)所述。
RNA 可以是细胞总RNA,mRNA,poly A+RNA,或其任何组合。
为得最 好的结果,RNA是纯化的,不过也可以是未纯化的胞质RNA。
RNA 可以被逆转录生成DNA,后者再用作扩增的模板,因而PCR间接地扩 增RNA转录物的一组特异群体。
参见:如Sambrook,见前,Sawasaki 等,PCR Technology第8章,(1992)见前,及Berg等,Hum Genet 85: 655-658(1990)。
3.PCR扩增 最通常的扩增方法是聚合酶链式反应(PCR),描述于U.S.Pat.Nos. 4,683,195,4,683,202,4,965,188,每一项引入于此作为参考。
如果用 PCR来扩增血细胞的靶区,肝素化的全血应注入在密封的真空管中, 保持与其它样品分隔开,并带洁净手套操作。
为得最好的结果,血样 应在收集后立即处理,若不可能,则在使用前应当保存在4℃的密封容 器中。
其它生理液体中的细胞也可用来作测定。
当采用任一种这类液 体时,液体中的细胞应当用离心法从液体成分分离出来。
组织应当用一无菌的一次性小刀和无菌针头(或2把小刀)在一 5mm培养皿中初步粉碎。
从组织切片中除去石蜡的方法描述于本领 域技术人员熟知的多种专业手册中。
要在一样品中用PCR扩增一段靶核酸序列,这段序列必须是扩增 体系的成分可以接近得到的。
分离靶DNA的一个方法是粗提,这是对 较大的样品很有用的。
简言之,血液、羊水中的羊水细胞、培养的绒 膜绒毛细胞等样品中的单个核细胞通过在无菌的Ficoll-Hypaque梯度 液上按标准方法分层分离。
在提取DNA前,收集间期细胞并在无菌的 磷酸盐缓冲盐液中洗三次。
如果测试外周血淋巴细胞的DNA,建议进 行渗透休克(将沉淀细胞用蒸馏水处理10秒),在初次洗涤后若能看 到残余细胞,则再洗2次。
这可防止血红蛋白中血色素基因对PCR反 应的抑制作用。
如果在收集样品后不立即进行PCR试验,每份106细 胞可沉淀收集在无菌的Eppendorf管中,将干的沉淀物冷冻在-20℃直 至使用。
细胞重新悬浮于缓冲液中(106有核细胞/100μl),缓冲液成分为: 50mM Tris-HCl(pH8.3),50mM KCl,1.5mM MgCl2,0.5%Tween 20, 0.5%NP40并加入100μg/ml的蛋白酶K。
在56℃下孵育2小时后,将 细胞加热至95℃10分钟以灭活蛋白酶K,并立即移入湿冰中(骤冷)。
如果还有大的聚集物存在,则需在此同一缓冲液中进行另一周期的消 化。
将此提取物的10μl用于扩增。
当用组织,例如绒膜绒毛细胞或融合的培养细胞提取DNA时,上 述缓冲液与蛋白酶K的量可按组织样品的大小作出改变。
提取物在50° -60℃保温4-10小时然后95℃10分钟以灭活蛋白酶。
在较长的保温 过程中,在大约4小时后应当按原始的浓度再加新鲜的蛋白酶K。
当样品只含少量细胞时,提取方法可按下文进行:Higuchi,“简 易迅速地制备用于PCR的样品”,PCR Technology,Ehrlich,H.A.(ed), Stockon Press,New York,在此引入作为参考。
PCR可用于扩增极少量 细胞(1000-5000)中染色体7的靶区,这些细胞可来自骨髓细胞和 外周血培养的各个集落。
样品中细胞悬浮于20μl PCR溶胞缓冲液(10 mM Tris-HCl(pH 8.3),50mM KCl,2.5mM MgCl2,0.1mg/ml明胶, 0.45%NP40,0.45%吐温20),冷冻直至使用。
当准备进行PCR时, 向PCR溶胞缓冲液中的细胞加入0.6μl蛋白酶K(2mg/ml)。
样品加 温到约60℃,保温1小时。
到停止消化时将样品加热到95℃10分钟以 灭活蛋白酶K,然后在冰上冷却。
提取DNA用于PCR较简单的方法是盐析法,该法由下法修改而 来:Miller等,Nucleic Acids Res.16:1215(1988),在此引入作为参 考。
单个核细胞在Ficoll-Hypeque梯度上进行分离。
细胞再悬浮于3ml 溶胞缓冲液(10mM Tris-HCl,400mM NaCl,2mM Na2EDTA,pH 8.2)。
向细胞加入50μl的20mg/ml的蛋白酶K溶液及150μl的20%SDS 溶液,然后37℃保温过夜。
在保温过程中振摇试管可以改善样品的消 化。
如果保温过夜后蛋白酶K的消化还不充分(仍能见到碎片),再 加入50μl的20mg/ml蛋白酶K溶液,在溶液中混匀,在一温和振摇 或旋转台上37℃保温再过一夜。
待消化充分后,在样品中加入1ml 6M NaCl溶液,剧烈混合。
得到的溶液以3000rpm离心15分钟。
沉淀中 含有沉淀下来的细胞蛋白,而上清中含有DNA。
将上清移入一含有4ml 异丙醇的15ml试管中。
将试管内容轻轻混合,直到水相与醇相完全 混合并形成白色的DNA沉淀。
取出DNA沉淀,浸入70%酒精溶液并 轻轻混合。
将DNA沉淀从酒精中取出,空气干燥。
将DNA沉淀置入 蒸馏水,并溶解。
提取高分子量DNA用于PCR的试剂盒包括:基因组分离试剂盒 A.S.A.P.(Boehringer Mannheim,Indianapolis,Ind.),基因组DNA分 离系统(GIBCO BRL,Gaithersburg,Md.),Elu-Quik DNA纯化试剂 盒(Schleicher & Schuell,Keene,N.H.),DNA提取试剂盒(Stratagene, La Jolla,Calif.),Turbogen分离试剂盒(Invitrogen,San Diego,Calif.), 等。
在实施本发明的方法之前,按照厂商的说明书使用这些试剂盒纯 化DNA一般是合适的。
测定提取到的DNA的浓度和纯度可以用分光光度法分析一份稀释 试样在260nm和280nm的吸收。
在提取了DNA后,便可进行PCR 扩增。
PCR每一循环的第一步包括将由引物延伸形成的核酸双螺旋分 离开。
一旦链被分开后,PCR的下一步包括使分离的链与在靶序列侧 翼的引物杂交。
然后引物延伸,形成靶链的互补拷贝。
为进行成功的 PCR扩增,引物是这样设计的:每一引物沿着一个双螺旋序列杂交的 位置正好使得从一个引物合成的延伸产物在与模板(互补体)分离后 能成为另一引物延伸的模板。
变性、杂交、和延伸的循环周期重复许 多次直至能得到所需的扩增核酸的量。
在一特别有用的PCR扩增实施方案中,链的分离是通过将反应加 热到足够高的温度、持续足够的时间使双螺旋变性而不会引起聚合酶 的不可逆变性而实现的(见U.S.Pat.No.4,965,188,在此引入作为参 考)。
典型的热变性包括从80℃至105℃范围的温度和从数秒到数分 范围的时间。
不过,链的分离还可采用任一适宜的变性方法,包括物 理的、化学的或酶学的方法。
诱导链分离可用,譬如,解旋酶,或能 显示解旋活性的酶。
例如,PecA酶在ATP存在下就具有解旋活性。
用 解旋酶分离链的适宜反应条件在本领域中是熟知的(参见Kuhn Hoffman -Berling,1978,CSH-Quantitative Biology,43:63-67;和Radding, 1982,Ann.Rev.Genetics 16:405-436,每一篇在此引入作为参考)。
PCR中模板依赖的引物延伸是受聚合剂催化的,需要有足够量的 四种脱氧核糖核苷酸三磷酸(典型地是dATP,dGTP,dCTP,和dTTP), 反应介质由适宜的盐,金属阳离子和pH缓冲体系组成。
适宜的聚合剂 是能催化模板依赖的DNA合成的酶。
在某些情况下,靶区能编码至少 是细胞表达的一种蛋白的一部分。
在此情况下,mRNA可用来扩增靶 区。
或者,可用PCR从RNA生成一cDNA文库以供进一步扩增,引 物延伸的起始模板是RNA。
适宜于从RNA模板合成一互补的拷贝DNA (cDNA)序列的聚合剂是逆转录酶(RT),如禽成髓细胞瘤病毒RT, Moloney鼠白血病病毒RT,或嗜热栖热菌(Tth)DNA聚合酶,Perkin Elmer Cetus,Inc.出售的一种耐热的具有逆转录活性的DNA聚合酶。
通 常,基因组RNA模板在起始的逆转录步骤后的第一次变性步骤中受热 降解,只留下DNA模板。
用于DNA模板的适宜聚合酶包括:例如, 大肠杆菌DNA聚合酶I或其Klenow片段,T4 DNA聚合酶,Tth聚 合酶,及Taq聚合酶,一种从栖热水生菌分离出来的热稳定性DNA聚 合酶,可从Perkin Elmer Cetus,Inc购得。
这后一种酶广泛用于核酸的 扩增和序列测定。
使用Taq聚合酶的反应条件在本领域内已知晓,描 述于Gelfand,1989,PCR Technology,见前。
4.等位基因特异PCR 等位基因特异PCR能显示染色体7靶区在存在或缺少一种变异或 多态性方面的差异。
选择的PCR扩增引物只与靶序列的一定等位基因 相结合。
这样,例如,扩增产物便由含有引物结合序列的染色体7组 生成,而不含引物结合序列的染色体7组就不生成扩增产物。
此方法 叙述于Gibbs,Nucleic Acid Res.17:12427-2448(1989)。
5.等位基因特异寡核苷酸筛查方法 进一步的诊断筛查法使用等位基因特异的寡核苷酸筛查法 (ASO),如Saiki等所述,Nature 324:163-166(1986)。
生产了 对应于特定等位基因、带有一个或更多碱基对错配的寡核苷酸。
ASO 筛查法检测变异的靶基因组或PCR扩增DNA与未突变寡核苷酸间的 错配,表现出寡核苷酸的结合比突变寡核苷酸的结合降低。
寡核苷酸 探针可以设计成这样:在低严紧度下可与等位基因的两种多态形式都 结合,但在高严紧度下与其相应的等位基因结合。
或者,严紧性条件 可设计成在该条件下得到一个基本上的二分反应,即相应于CYP11a1 基因变异形式的ASO会与该等位基因杂交,而不与野生型等位基因杂 交。
6.连接酶介导的等位基因检测法 一个测试对象的DNA靶区可用连接酶介导的等位基因检测与未受 影响的及受影响的家族成员的靶区进行比较。
参见Landegren等,Science 241:1077-1080(1988)。
连接酶还可用于检测连接酶扩增反应中的 点突变,见Wu等,Genomics 4:560-569(1989)。
连接酶扩增反应 (LAR)利用特定DNA序列的扩增,使用模板依赖的连接反应的序贯 周转,如Wu,见前,及Barany所述,Proc.Nat.Acad.Sci.88:189- 193(1990)。
7.变性梯度凝胶电泳 用PCR所得之扩增产物可用变性梯度凝胶进行分析。
根据溶液中 DNA的不同的依赖序列的解链性质和电泳迁移可鉴定不同的等位基 因。
在温度升高或变性的条件下,DNA分子在节段,称作解链域,中 解链。
每一解链域在一明确的、碱基特异的解链温度(Tm)下协同解 链。
解链域的长度至少为20碱基对,也可能长达数百碱基对。
等位基因间基于序列特异解链域不同而产生的差异可用聚丙烯酰 胺凝胶电泳进行测定,见Erlich ed.,PCR Technology,第7章,DNA 扩增原理和应用,W.H.Freeman and Co.New York(1992),其内容 在此引入作为参考。
概言之,拟用变性梯度凝胶电泳分析的靶区用靶区侧翼的PCR引 物进行扩增。
扩增后的PCR产物施于有线性变性梯度的聚丙烯酰胺凝 胶上,见Myers等,Meth.Enzymol.155:501-527(1986),及Myers 等,Genomic Analysis,A Practical Approach,K.Davies Ed.IRL Press Limited,Oxford,pp.95-139(1988),其内容在此引入作为参考。
电 泳系统维持的温度略低于靶序列解链域的Tm。
在另一种变性梯度凝胶电泳方法中,靶序列上可以先连接一段GC 核苷酸,称作GC夹子,如Erlich(见前)第7章所述。
最好在GC夹 子中至少80%的核苷酸是鸟嘌呤或胞嘧啶。
最好GC夹子的长度至少 为30个碱基。
这方法特别适宜于具有高Tm的靶序列。
通常,靶区用PCR扩增,如上文所述。
寡核苷酸PCR引物中的 一个在5′端带上GC夹子区,该区至少有30个富含GC序列的碱基, 在扩增时掺入到靶区的5′端。
所得的扩增后的靶区在如上描述的变性 梯度条件下进行凝胶电泳。
有改变了单个碱基的差别的DNA片段在凝 胶中会移动到不同的位置,可用溴化乙锭染色观察。
8.温度梯度凝胶电泳 温度梯度凝胶电泳(TGGE)的原理与变性梯度凝胶电泳相同,只 是变性梯度是由温度差别生成而不是由化学变性剂浓度差别生成。
标 准的TGGE使用一种电泳装置,其温度梯度沿电泳通道分布。
当样品 在含有同一浓度的化学变性剂的凝胶中移动时,它们遇到了增加的温 度。
另一种TGGE方法,时序温度梯度凝胶电泳(TTGE或tTGGE), 采用整块电泳凝胶不断提升温度的方法达到同样的结果。
当样品在凝 胶中移动时,整块凝胶的温度在增加,当样品移动通过凝胶时使它们 遇到了在增加的温度。
样品的制备,包括掺入GC夹子的PCR扩增, 以及对生成物的观察都与变性梯度凝胶电泳相同。
9.单链构象多态性分析 CYP11a1位点上的靶序列或等位基因可用单链构象多态性分析法 鉴别,该法根据单链PCR产物的电泳迁移的变化鉴定碱基差别,如Orita 等所述:Proc.Nat.Acad.Sci.86:2766-2770(1989)。
按上述方法生 成扩增的PCR产物,加热或其它方法使之变性,形成单链扩增产物。
单链核酸可能重折叠成形成次级结构,这部分地取决于碱基序列。
因 此,单链扩增产物的电泳迁移率可以发现等位基因或靶序列间的碱基 序列差别。
10.错配的化学或酶学切割 靶序列间的差异还可用对错配碱基对的差异化学切割检出,如 Grompe等所述:Am.J.Hum.Genet.48:212-222(1991)。
另一种 方法,靶序列间的差异可用对错配碱基对的酶学切割检出,如Nelson 等所述:Nature Genetics 4:11-18(1993)。
简单地说,取自患者或 受影响的家族成员的遗传学材料可被用于生成无错配的异源杂交DNA 双螺旋。
此处所用“异源杂交”的含义是一个DNA双螺旋链的组成中, DNA的一条链来自一个人,通常是病人,第2条DNA链来自另一个 人,通常是受影响的或未受影响的家族成员。
对无错配的异源杂交体 的阳性选择可以确定小的插入、缺失、或可能与雄激素代谢变化有关 联的其它多态性。
11.非PCR的DNA诊断 对病人和家族成员的CYP11a1相连DNA序列的鉴定,基于包括 限制性片段长度多态性在内的多态性分析,也可毋需扩增步骤。
杂交 探针通常是寡核苷酸,它通过与一靶核酸的全部或部分的互补碱基成 对而结合。
取决于杂交条件的严紧性,探针通常与缺少完全互补性的 靶序列相结合。
优选将探针进行直接或间接标记,因而在测定探针的 存在或缺如时,靶序列的存在或缺如也能被测知。
直接标记法包括同 位素标记,如用32P或35S。
间接标记法包括:荧光标签,能与亲和素 或链霉亲和素相结合的生物素复合物,或多肽或蛋白标签。
目视检测 法包括光致发光,德克萨斯红,罗丹明及其衍生物,“红白”染料及 3,3′,5,5′-四甲基联苯胺,荧光素及其衍生物,丹磺酰,伞形酮等,或 用辣根过氧化物酶,碱性磷酸酶等。
杂交探针包括任一种能与存在CYP11a1的猪染色体杂交的核苷酸 序列,从而能确定与CYP11a1相连系的遗传标志,包括:一种限制性 片段长度多态性,一高变区,重复成分,或VNTR。
杂交探针可以是 一个基因或一个适宜的类似物。
此外,适宜的杂交探针包括外显子片 段或已知定位于染色体适当区域的基因或cDNA的一部分。
用于本发明用途的优选串联重复杂交探针为在高严紧性杂交条件 下在一特异点识别小量片段的探针,或在低严紧条件下在该位点上识 别较大数量片段的探针。
我们提供以下例证以说明本发明的实施方案。
但决非企图对此发 明进行限制。
                        例I     反映猪的肉质、生长、胴体和生殖特征的遗传标志 按照本发明,鉴定和表征了一种与猪的肉质改善以及生长和胴体 特征改善有关的遗传标志。
在例I的实践中使用了以下的材料和方法。
睾丸组织样品采用纽克州的50头公猪,这些猪的生长、胴体、和 猪异味数据已事先收集好。
公猪在约10周龄时断奶,指定围栏,饲以 标准的“饲养-完成”饮食,至最终体重约为120kg。
公猪用电击杀 死,在Penn State University肉类实验室放血。
收集睾丸、尿道球腺、 和颌下唾液腺,修净,然后称重。
胴体称重,冷却过夜。
次日采集标 准胴体测量数据,诸如胴体长度,腰眼面积,脂肪厚度以及肉纹理。
对颌下唾液腺Δ-16-雄甾烯的测定采用Squires发展的方法(J. Animal Sci.69:1092-1100,1991)。
简言之,将颌下唾液腺修净, 食物加工器(Cusinart)切碎,取1克切碎的组织置入50ml试管。
加 入甲醇(5ml),用Polytron将混合物打匀浆30秒。
样品以2800rpm 离心5分钟。
在3ml上清中加入3ml蒸馏水,涡旋混合。
加己烷6ml 提取Δ-16-雄甾烯。
将混合物涡旋混合,并静置5分钟,使之分相。
将3ml有机相转入一玻璃培养管,提取物在氮气下水浴(30℃)干燥。
加入显色剂(0.5ml 0.5%间羟苯基醛冰醋酸液加上0.5ml 5%硫酸的 冰醋酸液)。
试管置于95℃加热板块中10分钟。
发生紫色,即为存在 Δ-16-雄甾烯的指征,吸取100μl测试液加到96孔微孔板的一个孔 中进行测量。
在已知Δ-16雄甾烯的最大光吸收(593nm)附近的几 个波长下测量光吸收,并与含有5α-雄甾-16-烯-3β-醇(颌下唾 液腺中主要的Δ-16-雄甾烯)标准测试溶液比较。
用标准测定溶液制 成的标准曲线确定Δ-16-雄甾烯的浓度。
数据分析采用ANOVA,使用SAS的GLM方法(1990)。
从冷藏的(-20℃)10头公猪取睾丸组织样品:5头具有最高浓 度的Δ-16雄甾烯(高公猪异味),5头具有最低浓度的Δ-16-雄甾 烯(低公猪异味)。
用蛋白酶K消化法提取DNA。
约50mg睾丸组织 裹于铝箔内,在液氮中冰冻。
然后将样品粉碎,取约20mg置入微离 心管,加入0.5ml消化缓冲液(50mM Tris,pH8.5;1mM EDTA;0.5% Tween 20;200μg/ml蛋白酶K(Gibco Life Technologies,Grand Island, NY))。
蛋白酶K以储存液保存于-20℃(20mg/ml蛋白酶K;1mM  Tris-HCl,pH7.5;20mM氯化钙,和5%甘油)。
样品悬于消化缓冲液中, 置入55℃水浴,3小时。
将样品以13000g离心1分钟,置入加热板块, 95℃,10分钟。
取出样品,保存于-20℃,直至分析。
得到4组引物,相当于每个约600bp,总共相当于猪CYP11a1基 因的2.4kb的5′UTR(序列得自Urban等,J.Biol.Chem.269:25761 -25769,1994)。
每组引物对10个DNA模板的每一个起动PCR反 应。
PCR按以下程序进行: 1. 2分钟,94C。
2. 1分钟,94C。
3. 1分钟,55C。
4. 1分钟,72C。
5. 35次循环,至(2)。
6. 2分钟,72C。
7. 保持在5C。
反应进行使用10×缓冲液(w/MgCl2);dNTP′s(10nmol);引 物CYPscc Forl(20pmol);引物CYPscc Revl(20pmol);Taq聚合 酶;双蒸水及DNA模板(1∶10稀释的蛋白酶K消化样品,约100ng)。
PCR产物用琼脂糖凝胶电泳分析,然后从琼脂糖凝胶切出~600bp 的带,用QIAquick凝胶提取试剂盒纯化(QIAGEN Inc.,Valencia CA)。
40个PCR产物中每一个的核苷酸序列都用ABI Prism Model 377 Sequencer(Perkin Elmer,CA)进行正向和反向的测定,测定在Penn State Nucleic Acid Facility,PSU Biotechnology Institute进行。
PCR产物的序列用手工排列,检查10只动物间的差异。
与已发表 的序列(Urban等,1994,同前)相比,样品中有37处差异,而只有 一个碱基对在该组动物之间有变异。
在-155位置上(在起始位点ATG 密码子前155碱基),6个样品含有胞嘧啶(CC),而4个是多态的; 即它们有胞嘧啶和胞腺嘧啶二者(CT),表明此碱基对的杂合性。
特 别有意义的是所有5个高异味猪样品都是CC基因型,而5个低异味 猪样品中有4个是CT基因型。
此多态性位于一个限制性酶识别位点,因而T等位基因的存在便 会改变特定限制性酶消化后观察到的限制性片段长度图型。
在此具体 情况下,所用的限制性酶为SphI(New England Biolabs)。
全组50只 猪的DNA样品中T等位基因的存在或缺如用限制性片段长度多态性分 析进行了测定,包括用SphI检查CYP11a1 5′UTR的限制性消化物。
凝 胶例样,见图2。
T等位基因的存在,不论是纯合的(TT)或杂合的 (CT)都与低猪异味相连系。
CC等位基因的存在伴随着高猪异味, 以及睾丸重量增加,尿道球腺长度和重量增加和颌下唾液腺重量增加。
见图3和表4。
此外具有CC等位基因的猪表现出增重率改善5.9%, 有较大量的瘦肉,如较长的胴体所证明,并通过测定后背脂肪深度看 出有脂肪含量较低的倾向。
带有CC等位基因的猪还趋向于在屠宰时 所取血样中血清睾酮浓度较高。
对这些公猪的直系雌性亲属(母畜和同胞)的生产记录进行回顾 性分析,表明与具有T等位基因的公猪相关的雌性趋向于具有略大的 窝仔(+.31猪/窝)和窝仔断奶体重较高(+4.27kg)。
因此,此种多 态性看来能带给雌猪有益的生育力和生产力的特征。
                        例II   反映母牛和鸡的肉质、生长、胴体和生殖特征的遗传标志 对猪的CYP11a1多态性的鉴定和特征阐明促进了牛的改善生殖和 胴体特征的相应多态性的特征阐明。
图5提供了牛CYP11a1的序列。
扩增牛为CYP11a1 5′UTR同源体的一组适宜的引物的序列如下: 有义:5′-GCAGATGTCCCTGGTGATTC-3′;反义: 5′-TGAACGGAGGGGAAGCC-3′。
对扩增的牛CYP11a1序列和相应遗传特性的进行特征阐明如此处 前文所述对猪CYP11a1基因所行。
图6描述鸡的CYP11a1基因。
为了对Genbank提供的鸡CYP11a1 序列确定其在一更长的5′UTR中的遗传改变,图6提供的cDNA序列 被用作进行5′cDNA末端快速扩增的基础,使用的试剂盒为Clontech 含有自鸡制备的已进行RACE的cDNA。
经此RACE途径获得的克隆 产生鸡CYP11a1序列的5′末端供进一步分析5′UTR中与改善生殖和 胴体特性有关的遗传学改变。
这样鉴定的遗传多态性和变化是在本发 明范围内的。
关于操作RACE的适宜方案见Current Protocols of Molecular Biology,J.Wiley及Sons,Inc.1998,第15.6.9章,其整个 内容在此引入作为参考。
本发明并不限于上文所具体描述的实施方案,在不离开所附的权 利要求范围的情况下可以有所变更和修饰。
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