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假单孢菌素酰胺和酯类似物

基本信息

  • 申请号 CN00810330.5 
  • 公开号 CN1362966A 
  • 申请日 2000/06/08 
  • 公开日 2002/08/07 
  • 申请人 伊莱利利公司  
  • 优先权日期  
  • 发明人 陈曙辉 C·S·加尔卡 S·L·赫尔曼 J·L·克尔斯特南斯基 M·J·罗德里格茨 孙喜成 A·Y·乌斯亚廷斯基 V·瓦苏德范 M·J·茨维菲尔  
  • 主分类号  
  • 申请人地址 美国印第安纳州 
  • 分类号  
  • 专利代理机构 中国专利代理(香港)有限公司 
  • 当前专利状态 发明专利申请公布 
  • 代理人 温宏艳 
  • 有效性 发明公开 
  • 法律状态
  •  

摘要

本发明涉及天然或半合成假单孢菌素化合物的天冬氨酸和/或羟基天冬氨酸单元的酸修饰,以及抗真菌活性治疗的方法。
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权利要求书


1.具有下述结构I的假单孢菌素化合物、及其可药用盐和溶剂 化物, 其中 R是 Ra和Ra′独立地为氢或甲基,或者Ra或Ra′为烷基氨基、与Rb或Rb′一起形成6-元环烷基环、6-元芳环或双键、或者与Rc一起形成6-元 芳环; Rb和Rb′独立地为氢、卤素、或甲基,或者Rb或Rb′是氨基、烷基 氨基、α-乙酰乙酸酯、甲氧基、或羟基; Rc是氢、羟基、C1-C4烷氧基、羟基(C1-C4)烷氧基,或者与Re一起形成6-元芳环或C5-C6环烷基环; Re是氢,或者与Rf一起形成6-元芳环、C5-C14烷氧基取代的6-元 芳环、或C5-C14烷基取代的6-元芳环,且 Rf是C8-C18烷基或C5-C11烷氧基; R是 其中 Rg是氢、或C1-C13烷基,且 Rh是C1-C15烷基、C4-C15烷氧基、(C1-C10烷基)苯基、-(CH2)n- 芳基、或-(CH2)n-(C5-C6环烷基),其中n=1或2;或者 R是 其中 Ri是氢、卤素、或C5-C8烷氧基,且 m是1、2或3; R是 其中 Rj是C5-C14烷氧基或C5-C14烷基,且p=0、1或2; R是 其中 Rk是C5-C14烷氧基;或者 R是-(CH2)-NRm-(C13-C18烷基),其中Rm是H、-CH3或-C(O)CH3; R1独立地为-NH2或-NHp-Pg,其中p是0或1; R2和R3独立地为-OR2a、或-N(R2b)(R2c), 其中 R2a和R2b独立地为氢、C1-C10烷基、C3-C6环烷基、羟基(C1-C10) 烷基、烷氧基(C1-C10)烷基、C2-C10烯基、氨基(C1-C10)烷基、一- 或二烷基氨基(C1-C10)烷基、芳基(C1-C10)烷基、杂芳基(C1-C10) 烷基、或环杂烷基(C1-C10)烷基, 或者 R2b是氨基酸烷基酯的羧酸烷基酯残基,且 R2c是氢或C1-C6烷基, 条件是R2和R3都不是-OH。

2.具有下述结构的假单孢菌素前药、及其可药用盐和溶剂化物, 其中 R是 其中 Ra和Ra′独立地为氢或甲基,或者Ra或Ra′为烷基氨基、与Rb或Rb′一起形成6-元环烷基环、6-元芳环或双键、或者与Rc一起形成6-元 芳环; Rb和Rb′独立地为氢、卤素、或甲基,或者Rb或Rb′是氨基、烷基 氨基、α-乙酰乙酸酯、甲氧基、或羟基; Rc是氢、羟基、C1-C4烷氧基、羟基(C1-C4)烷氧基,或者与Re一起形成6-元芳环或C5-C6环烷基环; Re是氢,或者与Rf一起形成6-元芳环、C5-C14烷氧基取代的6-元 芳环、或C5-C14烷基取代的6-元芳环,且 Rf是C8-C18烷基、C5-C11烷氧基、或联苯基; R是 其中 Rg是氢、或C1-C13烷基,且 Rh是C1-C15烷基、C4-C15烷氧基、(C1-C10烷基)苯基、-(CH2)n- 芳基、-(CH2)n-(C5-C6环烷基),其中n=1或2;或者 R是 其中 Ri是氢、卤素、或C5-C8烷氧基,且 m是1、2或3; R是 其中 Rj是C5-C14烷氧基或C5-C14烷基,且p=0、1或2; R是 其中 Rk是C5-C14烷氧基;或者 R是-(CH2)-NRm-(C13-C18烷基),其中Rm是H、-CH3或-C(O)CH3; R1独立地为-NH2或-NHp-Pg,其中p是0或1; R2和R3是-OR2a,其中R2a是C1-C3烷基。

3.通过下述步骤制得的假单孢菌素化合物的3-酰氨基衍生物 (i)提供具有下述结构的假单孢菌素化合物、及其可药用盐和 溶剂化物, 其中 R是 其中 Ra和Ra′独立地为氢或甲基,或者Ra或Ra′为烷基氨基、与Rb或Rb′一起形成6-元环烷基环、6-元芳环或双键、或者与Rc一起形成6-元 芳环; Rb和Rb′独立地为氢、卤素、或甲基,或者Rb或Rb′是氨基、烷基 氨基、α-乙酰乙酸酯、甲氧基、或羟基; Rc是氢、羟基、C1-C4烷氧基、羟基(C1-C4)烷氧基、或者与Re一起形成6-元芳环或C5-C6环烷基环; Re是氢、或者与Rf一起形成6-元芳环、C5-C14烷氧基取代的6-元 芳环、或C5-C14烷基取代的6-元芳环,且 Rf是C6-C18烷基、C5-C11烷氧基、或联苯基; R是 其中 Rg是氢、或C1-C13烷基,且 Rh是C1-C15烷基、C4-C15烷氧基、(C1-C10烷基)苯基、-(CH2)n- 芳基、或-(CH2)n-(C5-C6环烷基),其中n=1或2;或者 R是 其中 Ri是氢、卤素、或C5-C8烷氧基,且 m是1、2或3; R是 其中 Rj是C5-C14烷氧基或C5-C14烷基,且p=0、1或2; R是 其中 Rk是C5-C14烷氧基;或者 R是-(CH2)-NRm-(C13-C18烷基),其中Rm是H、-CH3或-C(O)CH3; R1是-NH2; R2和R3是-OH; (ii)用氨基保护基将在2、4和5位的氨基R1保护; (iii)使用邻苯并三唑-1-基-N,N,N’,N’-四甲基脲鎓四氟硼酸盐或 2-(1H-苯并三唑-1-基)-1,1,3,3-四甲基脲鎓六氟磷酸盐作为偶联 剂在3位形成酰胺键; (iv)除去所述的氨基保护基。

4.权利要求3的3-酰氨基衍生物,其中形成酰胺键的步骤(iii) 是在庞大的胺存在下进行的。

5.权利要求3的3-酰氨基衍生物,其中形成酰胺键的步骤(iii) 是在庞大的胺存在下于约0℃--20℃温度下进行的。

6.通过下述步骤制得的假单孢菌素化合物的8-酰氨基衍生物 (i)提供具有下述结构的假单孢菌素化合物、及其可药用盐和 溶剂化物, 其中 R是 其中 Ra和Ra′独立地为氢或甲基,或者Ra或Ra′为烷基氨基、与Rb或Rb′一起形成6-元环烷基环、6-元芳环或双键、或者与Rc一起形成6-元 芳环; Rb和Rb′独立地为氢、卤素、或甲基,或者Rb或Rb′是氨基、烷基 氨基、α-乙酰乙酸酯、甲氧基、或羟基; Rc是氢、羟基、C1-C4烷氧基、羟基(C1-C4)烷氧基,或者与Re一起形成6-元芳环或C5-C6环烷基环; Re是氢,或者与Rf一起形成6-元芳环、C5-C14烷氧基取代的6-元 芳环、或C5-C14烷基取代的6-元芳环,且 Rf是C6-C18烷基、C5-C11烷氧基、或联苯基; R是 其中 Rg是氢、或C1-C13烷基,且 Rh是C1-C15烷基、C4-C15烷氧基、(C1-C10烷基)苯基、-(CH2)n- 芳基、-(CH2)n-(C5-C6环烷基),其中n=1或2;或者 R是 其中 Ri是氢、卤素、或C5-C8烷氧基,且m是1、2或3; R是 其中 Rj是C5-C14烷氧基或C5-C14烷基,且p=0、1或2; R是 其中 Rk是C5-C14烷氧基;或者 R是-(CH2)-NRm-(C13-C18烷基),其中Rm是H、-CH3或-C(O)CH3; R1是-NH2; R2和R3是-OH; (ii)用氨基保护基将在2、4和5位的氨基R1保护; (iii)使用苯并三唑-1-基氧基-三吡咯烷基鏻六氟磷酸盐作为偶联 剂在8位形成酰胺键; (iv)除去所述的氨基保护基。

7.前述权利要求任一项的化合物在制备用于抗全身性真菌感染 或真菌皮肤感染的药物中的应用。

8.制备假单孢菌素化合物的3-酰氨基衍生物的方法,包括下述 步骤 (i)提供具有下述结构的假单孢菌素化合物、及其可药用盐和 溶剂化物, 其中 R是 其中 Ra和Ra′独立地为氢或甲基,或者Ra或Ra′为烷基氨基、与Rb或Rb′一起形成6-元环烷基环、6-元芳环或双键,或者与Rc一起形成6-元 芳环; Rb和Rb′独立地为氢、卤素、或甲基,或者Rb或Rb′是氨基、烷基 氨基、α-乙酰乙酸酯、甲氧基、或羟基; Rc是氢、羟基、C1-C4烷氧基、羟基(C1-C4)烷氧基,或者与Re一起形成6-元芳环或C5-C6环烷基环; Re是氢,或者与Rf一起形成6-元芳环、C5-C14烷氧基取代的6-元 芳环、或C5-C14烷基取代的6-元芳环,且 Rf是C6-C18烷基、C5-C11烷氧基、或联苯基; R是 其中 Rg是氢、或C1-C13烷基,且 Rh是C1-C15烷基、C4-C15烷氧基、(C1-C10烷基)苯基、-(CH2)n- 芳基、-(CH2)n-(C5-C6环烷基),其中n=1或2;或者 R是 其中 Ri是氢、卤素、或C5-C8烷氧基,且 m是1、2或3; R是 其中 Rj是C5-C14烷氧基或C5-C14烷基,且p=0、1或2; R是 其中 Rk是C5-C14烷氧基;或者 R是-(CH2)-NRm-(C13-C18烷基),其中Rm是H、-CH3或-C(O)CH3; R1是-NH2; R2和R3是-OH; (ii)用氨基保护基将在2、4和5位的氨基R1保护; (iii)使用邻苯并三唑-1-基-N,N,N’,N’-四甲基脲鎓四氟硼酸盐或 2-(1H-苯并三唑-1-基)-1,1,3,3-四甲基脲鎓六氟磷酸盐作为偶联 剂在3位形成酰胺键; (iv)除去所述的氨基保护基。

9.制备假单孢菌素化合物的8-酰氨基衍生物的方法,包括下述 步骤 (i)提供具有下述结构的假单孢菌素化合物、及其可药用盐和 溶剂化物, 其中 R是 其中 Ra和Ra′独立地为氢或甲基,或者Ra或Ra′为烷基氨基、与Rb或Rb′一起形成6-元环烷基环、6-元芳环或双键,或者与Rc一起形成6-元 芳环; Rb和Rb′独立地为氢、卤素、或甲基,或者Rb或Rb′是氨基、烷基 氨基、α-乙酰乙酸酯、甲氧基、或羟基; Rc是氢、羟基、C1-C4烷氧基、羟基(C1-C4)烷氧基,或者与Re一起形成6-元芳环或C5-C6环烷基环; Re是氢,或者与Rf一起形成6-元芳环、C5-C14烷氧基取代的6-元 芳环、或C5-C14烷基取代的6-元芳环,且 Rf是C6-C18烷基、C5-C11烷氧基、或联苯基; R是 其中 Rg是氢、或C1-C13烷基,且 Rh是C1-C15烷基、C4-C15烷氧基、(C1-C10烷基)苯基、-(CH2)n- 芳基、或-(CH2)n-(C5-C6环烷基),其中n=1或2;或者 R是 其中 Ri是氢、卤素、或C5-C8烷氧基,且m是1、2或3; R是 其中 Rj是C5-C14烷氧基或C5-C14烷基,且p=0、1或2; R是 其中 Rk是C5-C14烷氧基;或者 R是-(CH2)-NRm-(C13-C18烷基),其中Rm是H、-CH3或-C(O)CH3; R1是-NH2; R2和R3是-OH; (ii)用氨基保护基将在2、4和5位的氨基保护; (iii)使用苯并三唑-1-基氧基-三吡咯烷基鏻六氟磷酸盐作为偶联 剂在8位形成酰胺键; (iv)除去所述的氨基保护基。

10.一种药物制剂,它包含权利要求1的化合物和可药用载体。

11.一种药物制剂,它包含权利要求2的前药和可药用载体。

12.治疗动物中抗真菌感染的方法,包括给所述动物施用权利要 求1的假单孢菌素化合物。

13.治疗动物中抗真菌感染的方法,包括给所述动物施用权利要 求2的前药。
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说明书

                     发明领域 本发明涉及假单孢菌素(pseudomycin)化合物,特别是酸修饰 的半合成假单孢菌素化合物。
                     发明背景 假单孢菌素是从丁香假单胞菌(Pseudomonas syringae,与植 物有关的细菌)的液体培养物中分离出的天然产物,并且已表明有抗 真菌活性(参见Harrison,L.等人,“假单孢菌素,一族得自丁香 假单胞菌的具有广谱抗真菌活性的新肽”J.Gen.Microbiology,137 (12),2857-65(1991)以及美国专利5,576,298和5,837,685)。
与以前描述过的得自丁香假单胞菌的抗霉菌剂(例如丁香霉素、丁香 毒素和丁香抑制素)不同,假单孢菌素A-C含有羟基天冬氨酸、天冬 氨酸、丝氨酸、脱氢氨基丁酸、赖氨酸和二氨基丁酸。
假单胞菌素A、A’、B、B’、C、C’的肽部分相应于具有末端羧基 的L-Ser-D-Dab-L-Asp-L-Lys-L-Dab-L-aThr-Z-Dhb-L-Asp(3-OH)- L-Thr(4-Cl),该羧基在N-末端Ser的OH上将大环闭合。
这些类似 物的区别在于N-酰基侧链,即假单孢菌素A被3,4-二羟基十四烷酰 基N-酰化,假单孢菌素A’被3,4-二羟基十五烷酰基N-酰化,假单孢 菌素B被3-羟基十四烷酰基N-酰化,假单孢菌素B’被3-羟基十二烷 酰基N-酰化,假单孢菌素C被3,4-二羟基十六烷酰基N-酰化,假单 孢菌素C’被3-羟基十六烷酰基N-酰化(参见Ballio,A.,等人,“得 自丁香假单胞菌的生物活性脂缩肽:假单孢菌素,”FEBS Letters,355 (1),96-100,(1994)和Coiro,V.M.,等人,“使用得自NMR数 据的几何位距和分子动力学通过计算机模拟确定的丁香假单胞菌MSU 16H植物毒性脂缩肽假单孢菌素A的溶液构象,”Eur.J.Biochem., 257(2),449-456(1998))。
已知假单孢菌素具有一些不利的生物作用。
例如,当静脉内施用 假单孢菌素时,已观察到了其破坏静脉的内皮、破坏组织、炎症、和 对宿主组织的局部毒性。
因为假单孢菌素具有得以证实的抗真菌活性 和相当多未研究的化学特性,所以需要研究这类化合物以找到可用作 具有较少不利副作用的抗真菌剂的其它潜在化合物。
                    发明概述 本发明提供了可用作抗真菌剂或者可用于设计抗真菌剂的下述 结构所代表的假单孢菌素化合物、及其可药用盐和溶剂化物, 其中R是 其中 Ra和Ra′独立地为氢或甲基,或者Ra或Ra′为烷基氨基、与Rb或Rb′一起形成6-元环烷基环、6-元芳环或双键,或者与Rc一起形成6-元 芳环; Rb和Rb′独立地为氢、卤素、或甲基,或者Rb或Rb′是氨基、烷基 氨基、α-乙酰乙酸酯、甲氧基、或羟基; Rc是氢、羟基、C1-C4烷氧基、羟基(C1-C4)烷氧基,或者与Re一起形成6-元芳环或C5-C6环烷基环; Re是氢,或者与Rf一起形成6-元芳环、C5-C14烷氧基取代的6-元 芳环、或C5-C14烷基取代的6-元芳环,且 Rf是C6-C18烷基、C5-C11烷氧基、或联苯基; R是 其中 Rg是氢、或C1-C13烷基,且 Rh是C1-C15烷基、C4-C15烷氧基、(C1-C10烷基)苯基、-(CH2)n- 芳基、-(CH2)n-(C5-C6环烷基),其中n=1或2;或者 R是 其中 Ri是氢、卤素、或C5-C8烷氧基,且 m是1、2或3; R是 其中 Rj是C5-C14烷氧基或C5-C14烷基,且p=0、1或2; R是 其中 Rk是C5-C14烷氧基;或者 R是-(CH2)-NRm-(C13-C18烷基),其中Rm是H、-CH3或-C(O)CH3; R1独立地为-NH2或-NHp-Pg,其中p是0或1; R2和R3独立地为-OR2a、或-N(R2b)(R2c), 其中 R2a和R2b独立地为氢、C1-C10烷基(例如甲基、乙基、正丙基、异 丙基、正丁基、异丁基、仲丁基、叔丁基、正戊基、异戊基、正己基、 正庚基、正辛基、正壬基、正癸基等)、C3-C6环烷基(例如环丙基、 环丁基、环戊基、环戊基甲基、甲基环戊基、环己基等)、卤代烷基 (例如CF3CH2-)、羟基(C1-C10)烷基、烷氧基(C1-C10)烷基(例如 甲氧基乙基)、烯丙基、C2-C10烯基、氨基(C1-C10)烷基、一-或二 烷基氨基(C1-C10)烷基、芳基(C1-C10)烷基(例如苄基)、杂芳基 (C1-C10)烷基(例如3-吡啶基甲基、4-吡啶基甲基)、或环杂烷基 (C1-C10)烷基(例如N-四氢-1,4-恶嗪基乙基和N-哌嗪基乙基), 或者 R2b是氨基酸烷基酯的羧酸烷基酯残基(例如-CH2CO2CH3、-CH(CO2CH3)CH(CH3)2、-CH(CO2CH3)CH(苯基)、-CH(CO2CH3)CH2OH、 -CH(CO2CH3)CH2(对羟基苯基)、-CH(CO2CH3)CH2SH、-CH(CO2CH3)CH2(CH2)3NH2、-CH(CO2CH3)CH2(4-或5-咪唑)、-CH(CO2CH3)CH2CO2CH3、 -CH(CO2CH3)CH2CO2NH2等),且 R2c是氢或C1-C6烷基, 条件是R2和R3都不是-OH。
在另一个本发明实施方案中,提供了具有上述结构I的假单孢菌 素化合物的前药,其中R2和R3是-OR2a,其中R2a是C1-C3烷基。
在另一个本发明实施方案中,提供了假单孢菌素化合物的3-酰 氨基衍生物,其中该化合物是通过下述步骤制得的:(i)提供其中 R1是-NH2、且R2和R3都是-OH的具有上述结构I的化合物;(ii)用 氨基保护基将在2、4和5位的氨基R1保护;(iii)使用邻苯并三 唑-1-基-N,N,N’,N’-四甲基脲鎓四氟硼酸盐作为偶联剂在3位形成 酰胺键;和(iv)除去所述的氨基保护基。
除了使用苯并三唑-1-基 氧基-三吡咯烷基鏻六氟磷酸盐作为偶联剂外,采用上述步骤还可以 提供8-酰氨基衍生物。
在另一个本发明实施方案中,提供了药物制剂,其中包含上述结 构I所代表的假单孢菌素化合物和可药用载体。
在另一个本发明实施方案中,提供了在动物中治疗抗真菌感染的 方法,包括给所述动物施用上述假单孢菌素化合物I。
                          定义 除非另有说明,本文所用术语“烷基”是指含有1-30个碳原子 的通式CnH2n+1烃基。
烷基可以是直链烷基(例如甲基、乙基、丙基、 丁基等)、支链烷基(例如异丙基、异丁基、叔丁基、新戊基等)、 环状烷基(例如环丙基、环丁基、环戊基、甲基环戊基、环己基等)、 或多环烷基(例如二环[2.2.1]庚烷、螺[2.2]戊烷等)。
所述烷基可 以被取代或未取代。
类似地,烷氧基、烷酰基或烷酸酯的烷基部分具 有与上述相同的定义。
术语“烯基”是指含有至少一个碳碳双键的无环烃。
烯基可以呈 直链、支链、环状、或多环。
烯基可以被取代或未取代。
烯氧基、烯 酰基或烯酸酯的烯基部分具有与上述相同的定义。
术语“炔基”是指含有至少一个碳碳三键的无环烃。
炔基可以呈 直链或支链。
炔基可以被取代或未取代。
炔氧基、炔酰基或炔酸酯的 炔基部分具有与上述相同的定义。
术语“芳基”是指具有单环(例如苯基)或稠合环系(例如萘、 蒽、菲等)的芳族基团。
所述芳基可被取代或未取代。
术语“杂芳基”是指在芳环系内含有至少一个杂原子的芳族基团 (例如吡咯、吡啶、吲哚、噻吩、呋喃、苯并呋喃、咪唑、噁嗪、嘧 啶、嘌呤、苯并咪唑、喹啉等)。
该芳族基团可由单环或稠合环系构 成。
杂芳基可以被取代或未取代。
“NHp-Pg”和“氨基保护基”是指当化合物上的其它官能团反应 时通常用来阻断或保护氨基官能团的氨基取代基(Pg)。
当p是0时, 氨基保护基可以与其所连接的氮形成环亚酰胺例如邻苯二甲酰亚胺 和四氯邻苯二甲酰亚氨基。
当p是1时,保护基可以与其所连接的氮 形成氨基甲酸酯,例如甲基、乙基和9-芴基甲基氨基甲酸酯;或酰胺, 例如N-甲酰基和N-乙酰基酰胺。
在有机化学领域内,特别是在有机生物化学领域内,众所周知有 效取代的化合物是可耐受或甚至有用的。
在本发明中,例如,术语烷 基包括作为标准烷基的取代基例如甲基、乙基、丙基、己基、异辛基、 十二烷基、十八烷基等。
术语“基团”特定涉及并包括烷基上的本领 域常用取代基,例如羟基、卤素、烷氧基、羰基、酮基、酯、氨基甲 酸酯等,并包括未取代的烷基。
然而,本领域技术人员通常知道,应 当选择取代基以不给化合物的药理特征带来不利影响或者不有害地 干扰药物的应用。
对于任意上文定义的基团,合适的取代基包括烷 基、烯基、炔基、芳基、卤素、羟基、烷氧基、芳氧基、巯基、烷硫 基、芳硫基、一-和二烷基氨基、季铵盐、氨基烷氧基、羟基烷基氨 基、氨基烷硫基、氨基甲酰基、羰基、羧基、羟乙酰基、甘氨酰基、 肼基、脒基、和它们的组合。
术语“溶剂化物”是指包含一个或多个溶质分子例如结构I化合 物分子和一个或多个可药用溶剂分子例如水、乙醇等分子的聚集体。
术语“可药用盐”是指在施用剂量下对接受者基本上无毒的结构 I化合物的有机或无机盐。
术语“前药”是指在体内由于被代谢过程(例如生物转化)转化 而产生药理作用的一类药物。
在本发明中,假单孢菌素前药化合物包 含可被血浆中的酯酶裂解而生成活性药物的酯官能团。
术语“动物”是指人、宠物(例如狗、猫和马)、食物供应动物 (例如牛、猪、绵羊和家禽)、动物园动物、海洋动物、鸟类以及其 它类似种属动物。
                             发明详述 本申请人已经发现,通过修饰连接在假单孢菌素天然产物或半合 成衍生物的羟基天冬氨酸和/或天冬氨酸单元上的酸官能团,体外实 验表明新化合物可有效地抗白色念珠菌(C.albican)、新型隐球酵 母(C.neoformans)和/或烟曲霉(A.fumigatus)。
已经发现,某些 二酯能起前药的作用;因此,这些特定化合物具有降低的体外活性, 但是表现出体内效力。
下述合成方案I表示的是从任一种天然假单孢菌素或N-酰基修饰 的衍生物合成化合物I的一般方法。
通常使用三个合成步骤来制备化 合物I:(1)选择性地氨基保护;(2)与适当醇或胺缩合以分别生 成酯或酰胺;和(3)将氨基脱保护。
                      合成方案I 可使用本领域技术人员已知的保护氨基的标准方法将在残基2、4 和5上的侧链氨基保护。
所用的氨基保护基的特定种类不是至关重要 的,只要是在随后于中间体分子的其它位点上进行反应的条件下其保 持稳定,并且可在适当位点选择性地除去、同时又不断裂包括其它氨 基保护基在内的分子的其余部分即可。
优选的氨基保护基是叔丁氧基 羰基(t-Boc)、烯丙氧基羰基、邻苯二甲酰亚氨基、和苄氧基羰基 (CBZ)。
最优选的是烯丙氧基羰基(Alloc)和苄氧基羰基(CBZ)。
合适的保护基的其它实例描述在T.W.Greene,“有机合成中的保护 基(Protective Groups in Organic Synthesis)”John Wiley and Sons,New York,N.Y.,(2nd ed.,1991),第7章。
可使用本领域技术人员众所周知的标准酯化方法形成酯基。
在酸 性条件下酯化一般包括在质子酸(例如HCl、TFA、对甲苯磺酸等) 存在下将假单孢菌素化合物溶于或悬浮在适当醇中。
在碱性条件下, 一般是在弱碱(例如无水条件下的碳酸氢钠)存在下将假单孢菌素化 合物与适当的烷基卤反应。
酰氨基的形成可使用本领域技术人员众所周知的标准酰胺化方 法来实现。
然而,要选择偶联剂来选择性地修饰酸基团。
例如,使用 苯并三唑-1-基氧基三吡咯烷基鏻六氟磷酸盐(PyBOP)作为偶联剂使 得能够同时分离出纯的在残基8的单酰胺和(在有些情况下)纯的二 酰胺。
然而,偶联剂例如邻苯并三唑-1-基-N,N,N’,N’-四甲基脲四氟 硼酸盐(TBTU)和2-(1H-苯并三唑-1-基)-1,1,3,3,-四甲基脲六 氟磷酸盐(HBTU)有利于形成在残基3的单酰胺。
本申请人还发现,加入庞大的胺能提高在残基3的单酰胺的比 例。
通过加入庞大的胺,在残基3上酰胺化与在残基8上酰胺化的比 例从约1∶1提高至约6∶1,并且降低了二酰胺的量。
术语“庞大的胺” 是指在氮原子上具有多个和/或大取代基的胺。
可使用与反应条件相 容的任何叔胺。
优选的庞大的胺包括N,N-二异丙基乙基胺(DIEA) 和N-乙基二环己基胺。
庞大的胺的加入量一般为约1-10当量、优选 3-8当量、更优选5-6当量。
该反应一般在约室温(25℃)-约-20℃ 进行。
然而,本申请人发现,低温(约0℃-约-20℃)能进一步提高 在残基3上形成单酰胺。
通过加入庞大的胺并降低反应温度,在残基 3上酰胺化与在残基8上酰胺化的比例提高至20∶1。
然而,本领域技 术人员应该知道,低温限度将取决于反应组分的溶解度。
一旦酸基团被修饰,即可以使用适于所用的特定保护基的标准方法除 去所述的氨基保护基(在2、4和5位)。
例如,CBZ基团可通过在氢化 催化剂(例如10%Pd/C)存在下氢化来除去。
当氨基保护基是烯丙氧 基羰基时,该保护基可通过使用氢化三丁基锡和二氯化三苯基膦钯来 除去。
该特定保护/脱保护方案的优点在于降低了假单孢菌素结构的 Z-Dhb单元的乙烯基被氢化的可能性。
如上所述,假单孢菌素是从丁香假单胞菌分离出的天然产物,并 且其特征在于,它是含有被内酯键闭合的环肽部分,并包含特殊氨基 酸例如4-氯苏氨酸(ClThr)、3-羟基天冬氨酸(HOAsp)、2,3-去 氢-2-氨基丁酸(Dhb)、和2,4-二氨基丁酸(Dab)的脂缩肽。
下文 描述了生长不同丁香假单胞菌的菌株以制备不同假单孢菌素类似物 (A、A’、B、B’、C、和C’)的方法,并且在Hilton等人于2000年 4月14日提交的名称为“由丁香假单胞菌制备假单孢菌素”的第 PCT/US00/08728号PCT专利申请、Kulanthaivel等人于2000年4 月14日提交的名称为“假单孢菌素天然产物”的第PCT/US00/08727 号PCT专利申请、以及美国专利5,576,298和5,837,685中对此作了 更详细的描述,这4篇专利文献都引入本发明以作参考。
产生一种或多种假单孢菌素的分离出的丁香假单胞菌菌株是本 领域内已知的。
下述文献中描述了野生型菌株MSU 174和通过转座子 诱变生成的该菌株的突变型MSU 16H:美国专利5,576,298和 5,837,685;Harrison,等人,“假单孢菌素,一族得自丁香假单胞菌 的具有广谱抗真菌活性的新肽”J.Gen.Microbiology,137(12), 2857-2865(1991);和Lamb等人,“转座子诱变和荧光假单胞菌标 记:抗真菌生成是控制Dutch elm疾病所必需的,”Proc.Natl.Acad. Sci.USA,84,6447-6451(1987)。
适于制备一种或多种假单孢菌素的丁香假单胞菌菌株可从环境 来源包括植物(例如大麦作物、柑橘作物、和丁香植物)以及来源例 如土壤、水、空气和灰尘中分离得到。
优选的菌株是从植物分离的。
从环境来源中分离的丁香假单胞菌菌株可称为野生型。
本文所用的 “野生型”是指天然存在于标准丁香假单胞菌群体中的显性遗传型 (例如天然发现并且不是由实验室操作制得的的丁香假单胞菌菌株 或分离物)。
象大多数生物体一样,所用的假单孢菌素制备培养物(丁 香假单胞菌菌株例如MSU 174、MSU 16H、MSU 206、25-B1、7H9-1) 的特征可发生变异。
因此,可通过本领域已知方法获得这些菌株的后 代(例如重组物、突变体和变种)。
丁香假单胞菌MSU 16H可以以保藏号ATCC 67028从American Type Culture Collection,Parklawn Drive,Rockville,MD,USA 公众获得。
丁香假单胞菌菌株25-B1、7H9-1、和67 H1是在2000年 3月23日由American Type Culture Collection保藏的,并且指定 了下述保藏号: 25-B1    保藏号PTA-1622 7H9-1    保藏号PTA-1623 67H1     保藏号PTA-1621 丁香假单胞菌的突变体菌株也适于制备一种或多种假单孢菌 素。
本文所用的“突变体”是指在菌株表型中的突然可遗传的变化, 这种变化可以是自发的,或者是通过已知的诱变剂例如放射(例如紫 外放射或X-射线)、化学诱变剂(例如甲磺酸乙酯(EMS)、二环氧 辛烷、N-甲基-N-硝基-N’-亚硝基鸟嘌呤(NTG)、和亚硝酸)、位点 特异性诱变和转座子介导的诱变引起的。
制备假单孢菌素的丁香假单 胞菌突变体可通过用一定量能有效地产生下述突变体的诱变剂处理 细菌而制得:即能过度地产生一种或多种假单孢菌素、相对于其它假 单孢菌素过量产生一种假单孢菌素(例如假单孢菌素B)、或在有利 的生长条件下产生一种或多种假单孢菌素。
虽然所用的诱变剂的类型 和量可以改变,但是优选的方法是将NTG系列稀释至1-100μg/ml的 水平。
优选的突变体是能过度产生假单孢菌素B、并在基本培养基中 生长的突变体。
可选择环境分离物、突变体菌株、和其它所需的丁香假单胞菌菌 株以获得所需的生长习性、生长培养基营养来源、碳来源、生长条件、 氨基酸需求等的特征。
优选地,选择制备假单孢菌素的丁香假单胞菌 菌株以使其能在基本培养基例如N21培养基中生长和/或能产生水平 大于约10μg/ml的一种或多种假单孢菌素。
优选的菌株表现出这样 的特征:当在包含3种或3种以下的氨基酸和任选的脂质、马铃薯产 品或其组合的培养基中生长时,能产生一种或多种假单孢菌素。
重组菌株可通过使用本领域已知的方法转化丁香假单胞菌菌株 而制得。
通过使用重组DNA技术,可将丁香假单胞菌菌株转化以表达 出除了这些菌株产生的抗生素以外的多种不同基因产物。
例如,可修 饰菌株以引入多个内源性假单孢菌素生物合成基因的拷贝,来获得更 高的假单孢菌素产率。
为了从野生型或丁香假单胞菌的突变体菌株中产生一种或多种 假单孢菌素,在搅拌下将生物体在包含有效量的3种或3种以下氨基 酸,优选谷氨酸、甘氨酸、组氨酸、或其组合的含水营养培养基中培 养。
或者,将甘氨酸与一种或多种马铃薯产品和脂质混合。
在能有效 地使丁香假单胞菌生长并且生成所需假单孢菌素的条件下进行培 养。
有效条件包括约22℃-约27℃的温度、和约36小时-约96小时 的培养时间。
在丁香假单胞菌的培养期间控制培养基中氧的浓度对于 生成假单孢菌素是有利的。
优选地,将氧水平保持在约5-50%饱和、 更优选约30%饱和。
用空气、纯氧、或包含氧的气体混合物吹扫可控 制培养基中氧的浓度。
在丁香假单胞菌的培养期间控制培养基的pH也是有利的。
假单 孢菌素在碱性pH下不稳定,并且如果培养基的pH在大于约6的水平 保持约12小时,则可发生显著的降解。
优选将培养基的pH维持在 6-4。
当在分批培养物中生长时,丁香假单胞菌可产生一种或多种假 单孢菌素。
然而,分批补入或半连续补入葡萄糖和任选补入酸或碱(例 如氢氧化铵)以控制pH能提高产量。
通过使用其中自动补入葡萄糖 和氢氧化铵的连续培养方法可进一步提高假单孢菌素产量。
选择丁香假单胞菌可影响所生成的假单孢菌素的量和分布。
例 如,菌株MSU 16H和67 H1分别主要生成假单孢菌素A,但是也生成 假单孢菌素B和C,三者的比例通常为4∶2∶1。
通常情况下,菌株67H1 生成的假单孢菌素的水平比菌株MSU 16H生成的水平高约3-5倍。
与 菌株MSU 16H和67 H1相比,菌株25-B1生成更多的假单孢菌素B和 更少的假单孢菌素C。
菌株7H9-1的与众不同之处在于,其主要生成 假单孢菌素B,并且假单孢菌素B的产量大于其它菌株。
例如,该菌 株生成的假单孢菌素B的量可比假单孢菌素A或C大至少10倍。
可通过本领域技术人员已知的任何不同方法检测、测定、分离和 /或纯化各种假单孢菌素、假单孢菌素中间体和混合物。
例如,肉汤 或分离物或纯化的组合物中假单孢菌素活性水平可通过抗真菌例如 假丝酵母属的抗真菌作用来确定,并且可通过高效液相色谱法分离和 纯化。
或者,可由N-酰基半合成化合物形成酰氨基或酯衍生物。
半合 成假单孢菌素化合物可通过交换L-丝氨酸单元上的N-酰基来合成。
各种N-酰基衍生物的实例描述在Belvo,等人于同一日期提交的名称 为“假单孢菌素N-酰基侧链类似物”的第___号PCT专利申请中,该 专利申请引入本发明以作参考。
通常使用4个合成步骤来从天然假单 孢菌素化合物制备半合成化合物:(1)选择性地保护氨基;(2)用 化学或酶法将N-酰基侧链脱酰;(3)用不同侧链再酰化;和(4) 将所述的氨基脱保护。
在将氨基脱保护之前,可将天冬氨酸和/或羟 基天冬氨酸单元修饰。
具有γ或δ羟基化侧链的N-酰基(例如3,4-二羟基十四烷酸 酯)的脱酰可通过在含水溶剂中用酸处理氨基保护的假单孢菌素化合 物来实现。
合适的酸包括乙酸和三氟乙酸。
优选的酸是三氟乙酸。
如 果使用三氟乙酸,该反应可在室温或接近室温的温度下完成。
然而, 当使用乙酸时,该反应通常在约40℃进行。
合适的含水溶剂系统包 括乙腈、水、及其混合物。
有机溶剂能促进该反应;然而,加入有机 溶剂可导致生成其它副产物。
在侧链上没有δ或γ羟基的假单孢菌素 化合物(例如假单孢菌素B和C’)可用酶方法脱酰。
合适的脱酰酶包 括多粘菌素酰基转移酶(164-16081 Fatty Acylase(粗产物)或 161-16091 Fatty Acylase(纯),得自Wako Pure Chemical Industries, Ltd.)、或ECB脱酰酶。
酶法脱酰可使用本领域技术人员众所周知的 标准脱酰方法来完成。
例如,使用多粘菌素酰基转移酶的一般方法可 参见Yasuda,N.,等人,Agric.Biol.Chem.,53,3245(1989)和 Kimura,Y.,等人,Agric.Biol.Chem.,53,497(1989)。
在羰基活化剂存在下,使用所需酰基的相应酸将脱酰产物(也称 为假单孢菌素核)再酰化。
“羰基活化基团”是指能促进在该羰基上 进行的亲核加成反应的取代基。
合适的活化取代基是对羰基有净吸电 子作用的基团。
这样的基团包括但不限于烷氧基、芳氧基、含氮芳香 杂环、或氨基(例如羟苯并三唑、咪唑基、硝基苯氧基、五氯苯氧基、 N-氧基琥珀酰亚胺、N,N’-二环己基异脲-O-基、和N-羟基-N-甲氧基 氨基);乙酸酯;甲酸酯;磺酸酯(例如甲磺酸酯、乙磺酸酯、苯磺 酸酯、和对甲苯磺酸酯);卤化物(例如氯化物、溴化物、和碘化物)。
在酰化方法中可使用多种不同的酸。
合适的酸包括含有一个或多 个侧链的芳基、烷基、氨基(包括伯胺、仲胺和叔胺)、羟基、烷氧 基、和酰氨基的脂族酸;在脂族链内含有氮或氧的脂族酸;被烷基、 羟基、烷氧基和/或烷基氨基取代的芳族酸;和被烷基、羟基、烷氧 基和/或烷基氨基取代的杂芳族酸。
或者,可使用固相合成,其中是使用羟基苯并三唑-树脂(HOBt- 树脂)作为酰化反应的偶联剂。
然后如下所述进行保护的N-酰基半合成化合物的酸修饰:将至少 一个连接在N-酰基修饰的半合成假单孢菌素化合物的天冬氨酸或羟 基天冬氨酸肽单元上的侧链羧基反应以形成所需的酰氨基或酯键。
然 后如上所述除去保护基。
可分离出假单孢菌素化合物,并以其自身的形式或其可药用盐或 溶剂化物的形式使用。
术语“可药用盐”是指用无机酸和有机酸形成 的无毒酸加成盐。
合适的盐衍生物包括卤化物、硫氰酸盐、硫酸盐、 硫酸氢盐、亚硫酸盐、亚硫酸氢盐、芳基磺酸盐、烷基磺酸盐、磷酸 盐、磷酸一氢盐、磷酸二氢盐、偏磷酸盐、焦磷酸盐、链烷酸盐、环 烷基链烷酸盐、芳基链烷酸盐、己二酸盐、藻酸盐、天冬氨酸盐、苯 甲酸盐、富马酸盐、葡萄庚糖酸盐、甘油磷酸盐、乳酸盐、马来酸盐、 烟酸盐、草酸盐、棕榈酸盐、果胶酸盐、苦味酸盐、新戊酸盐、琥珀 酸盐、酒石酸盐、柠檬酸盐、樟脑酸盐、樟脑磺酸盐、二葡萄糖酸盐、 三氟乙酸盐等。
术语“溶剂化物”是指包含一个或多个溶质分子(即假单孢菌素 化合物)和一个或多个可药用溶剂分子例如水、乙醇等分子的聚集 体。
当溶剂是水时,该聚集体称为水合物。
溶剂化物一般是通过在加 热条件下将化合物溶于适当溶剂中,并缓慢地冷却以生成无定形或结 晶溶剂化物形式。
一般是将活性组分(即假单孢菌素化合物)配制成药物剂型以提 供易于控制的药物剂量和给患者、医师或兽医提供雅致且易于使用的 产品。
制剂可含有0.1%-99.9%重量的活性组分、更通常约10%- 约30%重量的活性组分。
本文所用的术语“单位剂量”或“剂量单位”是指含有经计算能 产生所需疗效的预定量活性组分的物理不连续单位。
当剂量单位经口 服或非胃肠道途径施用时,其一般以片剂、胶囊、丸剂、粉末小包、 局部施用的组合物、栓剂、糯米纸囊剂、在安瓿或多剂量容器中的测 定量单位等形式提供。
或者,剂量单位可以以干燥或液体气雾剂的形 式施用,这样的气雾剂可吸入或喷雾给药。
给药剂量可根据动物的身体状况、动物症状的严重程度、施用药 物的方式以及动物种类而变。
对于给定动物,具体剂量通常由负责医 生或兽医决定。
合适的载体、稀释剂和赋形剂是本领域技术人员众所周知的,并 且包括材料例如碳水化合物、蜡、水溶性和/或可水膨胀的聚合物、 亲水或疏水性物质、明胶、油、溶剂、水等。
所用的特定载体、稀释 剂或赋形剂将取决于施用活性组分的手段和目的。
制剂还可以包含润 湿剂、润滑剂、表面活性剂、缓冲剂、增强剂、增量剂、稳定剂、乳 化剂、悬浮剂、防腐剂、甜料、香料、矫味剂和它们的组合。
可使用不同方法施用药物组合物。
合适的方法包括局部施用(例 如膏剂或喷雾剂)、口服、注射和吸入。
特定治疗方法将取决于所治 疗的感染类型。
在非胃肠道静脉内施用中,通常是将制剂稀释或重新配制(如果 是冷冻干燥的话)并且如果需要的话在给药前进一步稀释。
对于冷冻 干燥产品的重新配制规程的实例是将10ml注射用水(WFI)加到小 瓶中,并轻微搅拌以溶解。
重新配制时间一般少于1分钟。
然后在给 药前将所得溶液在输注溶液例如5%葡萄糖水溶液(D5W)中进一步 稀释。
已表明假单孢菌素化合物表现出抗真菌活性,例如抑制各种传染 性真菌的生长,所述真菌包括假丝酵母属各种(即白色念珠菌(C. albicans)、近平滑假丝酵母(C.parapsilosis)、克鲁丝氏假丝 酵母(C.krusei)、光滑假丝酵母(C.glabrata)、热带假丝酵 母(C.tropicalis)或葡萄牙假丝酵母(C.lusitania));球拟 酵母属各种(即光滑球拟酵母(T.glabrata));曲霉属各种(即 烟曲霉(A.fumigatus));组织胞浆菌属各种(即荚膜组织胞浆菌 (H.capsulatum));隐球酵母属各种(即新型隐球酵母(C. neoformans));芽生菌属各种(即皮炎芽生菌(B.dermatitidis)); 镰孢属各种;发癣菌属各种、Pseudallescheria boydii、粗球孢子 菌、申克氏孢子丝菌等。
因此,本发明化合物和制剂可用于制备用于抗全身真菌感染或真 菌皮肤感染的药物。
所以本发明提供了用于抑制真菌活性的方法,包 括将本发明假单孢菌素化合物与真菌接触。
优选的方法包括抑制白色 念珠菌或烟曲霉的活性。
术语“接触”包括本发明化合物与真菌的结 合或接合或明显的接触或相互接触。
该术语不意味着对本发明方法进 一步限制,例如通过抑制机理限制。
所述方法定义为包括通过本发明 化合物的作用或其固有的抗真菌特性抑制真菌活性。
本发明还提供了治疗真菌感染的方法,包括给需要这种治疗的宿 主动物施用有效量的本发明药物制剂。
优选的方法包括治疗白色念珠 菌或烟曲霉感染。
术语“有效量”是指能抑制真菌活性的活性化合物 的量。
给药剂量将随诸如感染的性质和严重程度、宿主的年龄和一般 健康状况、宿主对抗真菌剂的耐受性和宿主种类这样的因素而变。
特 定给药方案同样可根据这些因素而变。
药物可以以单次日剂量或者在 一天期间多次剂量的方式施用。
给药治疗可持续约2-3天到约2-3周 或更长。
日剂量(以单剂量或均分剂量施用)一般含有约0.01 mg/kg-100mg/kg体重活性化合物的剂量水平。
优选的日剂量一般为 约0.1mg/kg-60mg/kg、更优选为约2.5mg/kg-40mg/kg。
宿主可 以是任何动物,包括人、宠物(例如狗、猫和马)、食物供应动物(例 如牛、猪、羊和家禽)、动物园动物、海洋动物、鸟类以及其它类似 种属动物。
                      实施例 除非另有说明,所有化学药品均得自Aldrich Chemical (Milwaukee,WI)。
在整个实施例中使用下述缩写以代表各物质: ACN-乙腈 TFA-三氟乙酸 DMF-二甲基甲酰胺 EDCI-1-[3-(二甲基氨基)丙基]-3-乙基碳化二亚胺盐酸盐 BOC=叔丁氧基羰基,(CH3)3C-O-C(O)-CBZ=苄氧基羰基,C6H5CH2-O-C(O)-PyBOP=苯并三唑-1-基氧基三吡咯烷基鏻六氟磷酸盐 TBTU=邻苯并三唑-1-基-N,N,N’,N’-四甲基脲鎓四氟硼酸盐 DIEA=N,N-二异丙基乙基胺                    HPLC条件 除非另有说明,分析反相HPLC操作是用装配着Waters μBondapak(C18,3.9×300mm)柱的Waters 600E系统进行的。
所 用的洗脱剂是65∶35乙腈/0.1%TFA水溶剂体系-100%乙腈(用20 分钟),流速是1.5ml/分钟,并在230nm使用UV检测。
制备HPLC处理是用采用Dynamax 60埃C18柱的Waters Prep 2000系统进行的,其中使用与分析HPLC系统相同的溶剂体系,但是 流速为40ml/分钟。
                    生物分析 抗真菌活性的检测和定量测定: 通过使用标准琼脂稀释测试或圆盘展开测试获得化合物的最小 抑制浓度(MIC)来在体外测定抗真菌活性。
在抗真菌活性测试中使 用的典型真菌是白色念珠菌。
当测试样本(50μl)对接种到琼脂板 上的白色念珠菌的抑制引起10-12mm直径区域时认为有显著抗真菌 活性。
尾静脉毒性: 在第0、24、48和72小时,用0.1ml测试化合物(20mg/kg) 经由侧尾静脉静脉内(IV)给药来治疗小鼠。
每组包括2只小鼠。
将 化合物配制在0.5%葡萄糖和无菌注射用水中。
首次治疗后监测小鼠 7天,并仔细观察包括红斑、肿胀、变色、坏死、尾损失在内的刺激 征状以及表明毒性的其它副作用征状。
在该实验中使用的小鼠是远系繁殖的,雄性ICR小鼠的平均体重 为18-20g(得自Harlan Sprangue Dawley,Indianapolis,IN)。
                        一般方法 CBZ保护的假单孢菌素:用CBZ保护假单孢菌素A、A’、B、B’、C或 C’的2、4和5位侧链氨基的一般方法 将假单孢菌素化合物(R1=H)溶解/悬浮在DMF(20mg/ml,Aldrich Sure Seal)中。
在室温搅拌下加入N-(苄氧基羰基氧基)琥珀酰亚 胺(6当量)。
在室温下搅拌32小时。
通过HPLC(4.6×50mm,3.5 μm,300-SB,C8,Zorbax柱)监测反应。
用高度真空旋转蒸发仪将 反应浓缩至10ml。
将材料置于冰箱中直至用于通过色谱法制备。
通 过反相制备HPLC纯化,冷冻干燥后获得了无定形白色固体(在下述 结构II中R1=CBZ)。
Alloc保护的假单孢菌素:用Alloc保护假单孢菌素A、A’、B、B’、 C或C’的2、4和5位侧链氨基的一般方法 将焦碳酸二烯丙酯(diallyl pyrocarbonate)(558mg,3.0 mmol)加到假单孢菌素A(1.22g,1.0mmol)在600ml DMF内的 溶液中。
将该反应在室温搅拌过夜。
真空除去溶剂,获得了油状残余 物,用乙醚将其洗涤3次。
将油状残余物再溶于水与ACN(约1∶1) 的混合物中,冷冻干燥,以90%的产率获得了Alloc保护的假单孢菌 素A。
使用相同方法,以90%的产率制得了Alloc保护的假单孢菌素B (在下述结构II中R1=alloc)。
通过氢化除去2、4和5位的CBZ保护基的一般方法 将CBZ保护的酰化衍生物溶于冷的1%-10%乙酸/甲醇溶液(5 mg/ml)中,并加入等量10%Pd/C。
通过脱气反应并用H2替换体积4-7 次来给反应装载氢气。
让反应在室温进行。
每隔1小时用HPLC检测 反应直至原料消耗完毕。
当反应完全时,除去氢气囊,并经由0.45μm 滤器板(Acrodisk GHP,GF by Gelman)过滤该反应。
浓缩至约1/10 体积,并通过HPLC纯化。
将含有产物的级分冷冻干燥。
用氢化三丁基锡和二氯化三苯基膦钯除去2、4和5位的Alloc保护 基的一般方法 将乙酸(1ml)加到Alloc保护的假单孢菌素B(0.05mmol) 在5ml二氯甲烷内的悬浮液中。
真空脱气后,将溶液用6.0mg PdCl2(PPH3)2(0.008mmol)和0.40ml氢化三正丁基锡(1.5mmol) 于室温处理2小时。
将溶剂在真空下蒸发,把残余物溶于水/ACN(约 1∶1)中并过滤。
通过制备HPLC纯化所得溶液,以93%的产率获得了 所需假单孢菌素B化合物。
或者,可使用5ml四氢呋喃和0.1ml乙 酸作为溶剂来替代5ml二氯甲烷和1.0ml乙酸。
使用下述结构II来描述在实施例1-27中观察的产物。
虽然在下 述实施例中使用的是特定假单孢菌素天然产物(假单孢菌素B),但 是本领域技术人员应当理解,可以使用其它假单孢菌素天然产物或半 合成衍生物作为原料。
实施例1-3举例说明了在残基3和8的二酯的形成。
                      实施例1 合成二乙酯1-1:                       R1=H                      R2=-OCH2CH3                      R3=-OCH2CH3                      1-1 向50ml园底烧瓶中加入10ml绝对乙醇和CBZ保护的假单孢菌 素B(251.7mg,0.156mmol)。
向该混合物中加入约1ml酸化的 乙醇(预先用HCl气体酸化),并将该反应在室温搅拌过夜。
然后在 真空下除去溶剂,残余物不用进一步纯化即用于下一步反应,将残余 物溶于10ml MeOH/1.5ml冰醋酸的溶液中。
使用249.7mg 10%Pd/C进行30分钟的标准氢化,经过滤除去催化剂,并通过制备HPLC纯化, 冷冻干燥后获得了化合物1-1(120.9mg)。
MS(离子喷雾)C55H96ClN12O19(M+H)+的计算值1264.89,实测值1264.3。
在反应之后通过HPLC小心地进行分离可得到单酯。
在适当时间, 即当原料:单酯∶二酯的比例最大时停止该反应。
操作保持相同。
分离 所得单酯混合物,其中一些酯是在天冬氨酸残基上形成的,一些是在 是在羟基天冬氨酸残基上形成的。
使用标准方法将该CBZ保护的单酯 的混合物氢化,获得了假单孢菌素B单乙酯的混合物。
使用与上述相同的方法合成化合物1-2和1-3。
                      R=-H          R=-H                      R2=-OCH3    R2=-OCH(CH3)2                      R3=-OCH3    R3=-OCH(CH3)2                      1-2             1-3 实施例2举例说明了使用碱性条件合成二酯。
                      实施例2 合成二丙酯2-1:                       R=-H                      R2=-OCH2CH2CH3                      R3=-OCH2CH2CH3                      2-1 将CBZ保护的假单孢菌素B(247.3mg,0.154mmol)溶于5ml DMF中。
然后加入大大过量的丙基碘和过量NaHCO3
将该反应在室温 下搅拌10小时。
通过制备HPLC进行纯化,然后冷冻干燥,获得了 147.6mg保护的二酯。
使用149.3mg 10%Pd/C在标准条件下将该 化合物氢解,给HPLC纯化和冷冻干燥后,获得了78.9mg化合物2-1。
                          实施例3                       R=-H                  R=-H                      R2=-O(CH2)4CH3    R2=-OH                      R3=-OH               R3=-O(CH2)4CH3                      3-1                      3-2 将CBZ保护的假单孢菌素B(282.3mg,0.175mmol)溶于5ml DMF中。
然后加入大大过量的正戊基碘和过量NaHCO3
将该反应在室 温下搅拌10小时。
通过制备HPLC进行纯化,然后冷冻干燥,获得了 49.1mg保护的单戊酯的混合物。
使用47.3mg 10%Pd/C在标准条 件下将该混合物氢解,经HPLC纯化和冷冻干燥后,获得了30.6mg 化合物3-1和3-2。
R=-H                  R=-H                   R=-HR2=-O(CH2)3CH3    R2=-O(CH2)3CH3    R2=-OHR3=-O(CH2)3CH3    R3=-OH               R3=-O(CH2)3CH33-3                      3-4                       3-5 用正丁基碘代替丙基碘,获得了二丁基酯(3-3),单酯混合物 (3-4+3-5)和单酯+下述环亚酰胺化合物3-6的混合物:                       实施例4 合成环戊基甲基酯4-1:                       R=-H                      R2=-OCH2(环戊基)                       R3=-OH                      4-1 将CBZ保护的假单孢菌素B、大大过量的对甲苯磺酸和环戊烷甲 醇混合,并搅拌过夜。
在第二天加入另外10当量的醇。
通过制备HPLC 分离该CBZ保护的酯,然后使用标准方法进行氢化以制得化合物4- 1。
在实施例1-4中合成的各化合物表现出可测得的抗白色念珠菌、 新型隐球酵母、烟曲霉、Candida Parapsilosis、或荚膜组织胞浆菌 的活性。
然而,基于所合成的化合物观察到了下述在活性方面的基本 趋势。
简单的酯(二甲酯、二乙酯和单乙酯)有活性并且有效力;而 较大的酯表现出较小效力(例如丙酯和更大的酯)。
ADME已表明化合 物1-1和2-1迅速裂解成假单孢菌素B母化合物。
实施例5-11举例说明了在残基3的酰胺衍生物。
                      实施例5 合成化合物5-1:                       R=-H                      R2=-NH2                      R3=-OH                      5-1 将CBZ保护的假单孢菌素B(1.12g)和224mg TBTU、0.56ml DIEA和1.0g脱保护的rink酰胺树脂(4-(2’,4’-二甲氧基苯基氨 基甲基)苯氧基树脂,得自Advance ChemTech,Inc.,Louisville, KY)混合3天。
将该混合物过滤,并将树脂用DMF洗涤3次,用二氯 甲烷洗涤3次。
将树脂用5%水在1∶1 TFA/CH2Cl2中的混合物处理3 小时。
将该混合物过滤,并用TFA将树脂洗涤3次。
收集滤液并在真 空下浓缩。
通过HPLC纯化,分离得到了60mg(5.3%)CBZ保护的 酰氨基产物。
将该保护的酰氨基化合物(60mg)溶于6ml 1%AcOH的甲醇溶 液,并加入60mg 10%Pd/C。
将该混合物在氢气氛下于室温搅拌30 分钟。
过滤后,将该溶液在真空下浓缩。
把残余物溶于50%ACN/水中, 并冷冻干燥,获得了45mg(90%)化合物5-1。
                      实施例6 合成化合物6-1:                       R=-H                      R2=-NH(环丙基)                       R3=-OH                      6-1 将CBZ保护的假单孢菌素B(400mg,0.25mmol)溶于4ml无 水DMF中。
依次加入TBTU(79mg,0.25mmol)、DIEA(200μl,6 当量)和环丙基胺(14.2mg,0.25mmol)。
将该反应在室温下于氮 气氛下搅拌,同时通过HPLC监测反应。
在反应结束时,将该反应在 真空下浓缩。
通过制备HPLC纯化粗产物。
冷冻干燥,获得了209.2mg (51.1%)无色粉末。
将该3-酰氨基化合物(279.1mg,0.169mmol)在10%Pd/C的 催化下于1%HOAc/MeOH中在氢气下氢化45分钟。
将该反应过滤,并 在真空下浓缩。
将残余物置于1∶1的水∶ACN混合物中,然后冷冻干 燥,获得了208.3mg(98.6%)无色粉末。
H1-NMR证实了该结构。
也可以使用下述方法由Alloc保护的假单孢菌素B制备化合物 6-1。
将1-羟基苯并三唑水合物(136mg,1.0mmol)和EDCI(211mg, 1.1mmol)加到Alloc保护的假单孢菌素B(730mg,0.50mmol) 在7ml DMF内的溶液中。
搅拌过夜后,加入环丙基胺(85.6mg,1.5 mmol)。
通过HPLC监测该反应的进程。
反应完全后,通过制备HPLC 和冷冻干燥分离到了Alloc保护的假单孢菌素衍生物(334mg,产率 为50%)。
将该Alloc保护的中间体(117mg,0.078mmol)溶于15ml 二氯甲烷和1ml乙酸中。
用干燥氮气将该反应混合物脱气后,向该 混合物中加入30mg(PPH3)2PdCl2和1ml氢化三丁基锡。
通过HPLC 监测该反应的进程。
反应完全后,通过反相制备HPLC纯化该反应混 合物,获得了88mg(产率为91%)化合物6-1。
下表I列出了使用与上述相同的一般方法用适当的相应胺原料合 成的其它3-酰氨基衍生物。
                                表I                       实施例7 合成3-酰氨基化合物7-1: 在烘箱干燥过的500mL园底烧瓶中,将CBZ保护的假单孢菌素B (0.5g,0.311mmol)溶于25mL DMF中。
向该溶液中加入TBTU (0.2g,0.622mmol)、3-(氨基甲基)吡啶(0.067g,0.622mmol)、 和N-乙基二环己基胺(0.391g,1.87mmol)。
将该溶液搅拌3小 时,然后浓缩。
通过反相制备HPLC分离产物,并冷冻干燥,获得了 (96mg,产率为18%)CBZ保护的酰胺。
通过将等量的10%Pd/C缓 慢地加到CBZ保护的酰胺在1%乙酸/甲醇内的冷溶液中来将CBZ基团 脱保护。
将该溶液温至室温,并在1atm H2下迅速搅拌3.5小时。
经 由过滤除去催化剂后,通过反相HPLC纯化,并冷冻干燥,获得了40mg (产率为55%)化合物7-1。
MS数据C57H93ClN14O18分子量计算值= 1296.6 实测值ES+1297.15,ES-1294.95                       实施例8 合成3-酰氨基化合物8-1: 可使用与实施例7中所述相同的一般方法。
当不加入任何碱时, 观察到了8和3酰氨基取代的化合物的混合物。
                      实施例9 合成3-酰氨基化合物9-1:                   R=-H             R=-H                  R2=-NH(苄基)    R2=-NH(苄基)                   R3=-OH          R3=-NH(苄基)                   9-1                 9-2 可使用与实施例7中所述相同的一般方法。
当不加入任何碱时, 观察到了化合物9-1和9-2的混合物。
                      实施例10 合成3-酰氨基化合物10-1: 使用与实施例7中所述相同的一般方法,用适当的相应胺原料合 成化合物10-1。
                      实施例11 合成3-酰氨基化合物11-1: 使用与实施例7中所述相同的一般方法,用4-(氨基甲基)吡啶 作为胺原料合成化合物11-1。
                      实施例12 合成3-酰氨基化合物12-1:                   R=-H                  R2=-N(CH3)2                  R3=-OH                    12-1 将CBZ保护的假单孢菌素B(260mg,0.16mmol)、51.8mg TBTU 和152μl DIEA溶于3ml DMF和320ml二甲基胺(0.16mmol)的 THF溶液(2M溶液)中。
将该反应在室温下搅拌20分钟,然后经由 HPLC纯化。
将产物冷冻干燥,获得了172mg(产率为66%)所需的 CBZ保护的酰胺。
使用上述一般方法将该CBZ保护的酰胺氢化,获得了化合物12- 1。
实施例13举例说明了其中将羧酸基团与各种氨基酸烷基酯反应 的假单孢菌素化合物的合成。
                      实施例13 合成3-酰氨基化合物13-1:              R=-H             R2=-NHCH(CO2CH3)CH2CH2CH2CH2NH2             R3=-OH                      13-1 将CBZ保护的赖氨酸甲酯(164mg,0.49mmol)加到CBZ保护 的假单孢菌素B(800mg,0.49mmol)、TBTU(158mg,0.49mmol) 和400ml DIEA(2.51mmol)在8ml DMF内的溶液中。
将该反应在 室温搅拌20分钟,然后经由HPLC纯化,获得了260mg(产率为32 %)CBZ保护的酰胺。
使用上述一般方法将该CBZ保护的酰胺氢化,获得了化合物13- 1。
在表II列出的化合物13-2-13-4是使用与上述相同的一般方法 用适当的相应氨基酸酯合成的。
                                表II 实施例14-16举例说明了在残基8上的酰胺衍生物的合成。
                      实施例14 合成8-酰氨基化合物14-1:                       R=-H                      R2=-OH                      R3=-NH2                        14-1 化合物14-1是用与上述使用rink酰胺树脂制备化合物6-1的方 法相同的方法合成的,只是使用PyBOP作为偶联剂以代替TBTU。
                      实施例15 合成8-酰氨基化合物15-1:                       R=-H                      R2=-OH                      R3=-NH(CH2)3CH3                      15-1 将正丁基胺(45.4mg,0.62mmol)加到CBZ保护的假单孢菌素 B(1000mg,0.62mmol)和PyBop(323mg,0.62mmol)溶解在 10ml DMF内的溶液中。
将该反应在室温下搅拌1小时,然后经由HPLC 纯化。
将产物冷冻干燥,获得了280mg(产率为27%)CBZ保护的 酰胺。
将该CBZ保护的酰胺(280mg,0.17mmol)在10%Pd/C的催化 下于1%乙酸/甲醇中在氢气下氢化45分钟。
将该反应混合物过滤, 并在真空下浓缩。
将残余物溶于50%ACN在水中的混合物,并冷冻干 燥,获得了189mg(产率为89%)化合物15-1。
在表III中列出的8-酰氨基化合物是使用与上述相同的一般方法 用适当的相应胺原料合成的。
                               表III     实施例  #
    R1
    R2
    R3
    15-2
    -H
    -OH
-NHCH3
    15-3
    -H
    -OH
-NHCH2CH3
    15-4
    -H
    -OH
-NH(CH2)2CH3
    15-5
    -H
    -OH
-NH(环丙基)
    15-6
    -H
    -OH
-NH(环丁基)
    15-7
    -H
    -OH
-NHCH2CH2OH
    15-8
    -H
    -OH
-NHCH2CH2N(CH3)2
    15-9
    -H
    -OH
-NHCH2CH2CH2N(CH3)2
                      实施例16 合成8-酰氨基化合物16-1: 在100ml园底烧瓶中,将Alloc保护的假单孢菌素B(0.25g, 0.171mmol)溶于25ml DMF中。
向该溶液中加入Pybop(0.089g,0.171 mmol)和4-(2-氨基乙基)吗啉(0.022g,0.171mmol)。
将该溶 液在1atm N2下迅速搅拌过夜。
将该溶液浓缩,通过反相HPLC分离 出产物,并冷冻干燥,获得了(140mg,0.089mmol,52%)Alloc 保护的假单孢菌素B吗啉衍生物。
通过向Alloc保护的假单孢菌素B 吗啉衍生物在1%乙酸/二氯甲烷内的溶液(10mg/mL)中加入Bu3SnH(0.648g,2.23mmol)、和(PH3P)2PdCl2(0.009g,0.013mmol) 来将Alloc基团脱保护。
反应时间为30分钟。
通过HPLC监测反应。
将该溶液浓缩,通过反相制备HPLC分离出产物,并冷冻干燥,获得 了38mg(32%)化合物16-1。
MS数据:C57H99ClN14O19分子量计算值 为1318.7,实测值ES+1320.0,ES-1318.0。
在表IV中列出的8-酰氨基化合物是使用与上述相同的一般方法 用适当相应的胺原料合成的。
                         表IV 在实施例5-16中合成的各化合物表现出可测得的抗白色念珠 菌、新型隐球酵母、烟曲霉、Candida Parapsilosis、或荚膜组织胞 浆菌的活性。
然而,基于所合成的化合物观察到了下述在活性方面的 基本趋势。
当测定8-酰氨基衍生物抗白色念珠菌的作用时,从数据中显然看 见几个趋势。
体外效力沿着下述R3取代基顺序下降:-NH2>-NHCH3> -NHCH2CH3>-NH(CH2)2CH3>-NH(CH2)3CH3;-NHCH2CH2N(CH3)2> -NH(CH2)3N(CH3)2;和-NH(GlyOMe)>-NH(PheOMe)。
通常用 具有较小烷基的酰氨基能实现更好的活性。
发现具有游离酰胺基团的 化合物是该系列中活性最高的。
此外,经证实,环烷基酰胺的活性比 相应的直链烷基强。
在烷基链末端具有极性取代的烷基表现出的活性 比相应的天然产物低。
与母体天然产物不同,没有任何8-酰氨基衍生 物表现出尾静脉刺激。
与母体天然产物比较,经证实3-酰氨基衍生物具有与8-酰氨基 衍生物类似的趋势(例如在R2具有较短烷基链的酰胺取代基比具有较 长烷基链的酰胺取代基的活性强)。
与8-酰氨基衍生物不同,3-酰氨 基衍生物在抗白色念珠菌的活性方面没有表现出任何显著下降直至 达到7个碳原子或更长(其中R2=-NH(CH2)6CH3的3-酰氨基PSB 化合物具有MIC=20μg/ml),而对于8-酰氨基衍生物是直至4个 碳原子或更长(其中R3=-NH(CH2)3CH3的8-酰氨基PSB化合物具 有MIC=20μg/ml)。
大多数测试的3-酰氨基衍生物在尾静脉刺激 方面表现出改善。
例外的是R2=-NH(异戊基)、-NH(正己基)、 -NH(CH2)2N(CH2CH3)2、和-NH(CH2)3N(CH3)2
虽然经证实与相应的天然产物(假单孢菌素B)相比,在残基3 和8都形成酰胺键使毒性得到改善,但是体内效力通常会下降。
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