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假单胞菌素前药

基本信息

  • 申请号 CN00810331.3 
  • 公开号 CN1373770A 
  • 申请日 2000/06/08 
  • 公开日 2002/10/09 
  • 申请人 伊莱利利公司  
  • 优先权日期  
  • 发明人 S·H·陈 M·J·罗德里格茨 X 孙.  
  • 主分类号  
  • 申请人地址 美国印第安纳州 
  • 分类号  
  • 专利代理机构 中国专利代理(香港)有限公司 
  • 当前专利状态 发明专利申请公布 
  • 代理人 温宏艳 
  • 有效性 暂失效-视为撤回 
  • 法律状态 审查中-公开
  •  

摘要

本发明描述了一种结构(A)所代表的假单胞菌素前药,其中R展开

权利要求书


1.一种具有以下结构的假单胞菌素前药、其可药用盐及其溶剂 化物, 其中R是 其中 Ra和Ra′独立地是H或甲基,或者Ra或Ra′是烷基氨基,与Rb或Rb′一起形成6-元环烷基环、6-元芳族环或双键,或者与Rc一起形成6-元 芳族环; Rb和Rb′独立地是H、卤素或甲基,或者Rb或Rb′是氨基、烷基氨基、 α-乙酰乙酸酯、甲氧基或羟基; Rc是H、羟基、C1-C4烷氧基、羟基烷氧基、或者与Re一起形成6- 元芳族环或C5-C6环烷基环; Re是H,或者与Rf一起是6-元芳族环、C5-C14烷氧基取代的6-元 芳族环、或者C5-C14烷基取代的6-元芳族环,和 Rf是C8-C18烷基,C5-C11烷氧基或联苯基; R是 其中 Rg是H或C1-C13烷基,而且 Rh是C1-C15烷基、C4-C15烷氧基、(C1-C10烷基)苯基、-(CH2)n-芳基、 或-(CH2)n-(C5-C6环烷基),其中n=1或2;或者 R是 其中 Ri是H、卤素、或C5-C8烷氧基, 而且m是1、2或3; R是 其中 Rj是C5-C14烷氧基或C5-C14烷基,并且 p=0、1或2; R是 其中 Rk是C5-C14烷氧基,或者 R是-(CH2)-NRm-(C13-C18烷基),其中Rm是H、-CH3或-C(O)CH3; R1独立地是H、酰氧基亚甲基-1,3-二氧杂环戊烯-2-酮、或者酰氧 基亚甲基羧酸酯,条件是至少一个R1是酰氧基亚甲基-1,3-二氧杂环戊 烯-2-酮或者酰氧基亚甲基羧酸酯; R2和R3独立地是-OR2a、或者-N(R2b)(R2c), 其中 R2a和R2b独立地是H、C1-C10烷基、C3-C6环烷基、羟基(C1-C10)烷 基、烷氧基(C1-C10)烷基、C2-C10链烯基、氨基(C1-C10)烷基、一-或二- 烷基氨基(C1-C10)烷基、芳基(C1-C10)烷基、杂芳基(C1-C10)烷基、环杂 烷基(C1-C10)烷基,或者 R2b是氨基酸烷基酯的羧酸烷基酯残基并且R2c是H或C1-C6烷基。

2.权利要求1的前药,其中所述酰氧基亚甲基-1,3-二氧杂环戊 烯-2-酮是由下式1(a)所表示的: 其中R1a是C1-C10烷基、C1-C10烯基、苄基、或芳基,而且R1b是H或甲 基。

3.权利要求1的前药,其中所述酰氧基亚甲基羧酸酯是由下式 1(b)所表示的: 其中R1a是C1-C10烷基、C1-C10烯基、苄基、或芳基,而且R1b是H或甲 基。

4.权利要求2的前药,其中R由下面结构所表示: 其中Rb′是羟基,Ra、Ra′、Rb、Rc、Rd和Re都是H,并且Rf是正辛基。

5.权利要求3的前药,其中R由下面结构所表示: 其中Rb′是羟基,Ra、Ra′、Rb、Rc、Rd和Re都是H,并且Rf是正辛基。

6.权利要求1的前药,其中所述氨基酸烷基酯的羧酸烷基酯残 基是由以下表示的:-CH2CO2CH3、-CH(CO2CH3)CH(CH3)2、-CH(CO2CH3)CH(苯 基)、-CH(CO2CH3)CH2OH、-CH(CO2CH3)CH2(对羟基苯基)、 -CH(CO2CH3)CH2SH、-CH(CO2CH3)CH2(CH2)3NH2、-CH(CO2CH3)CH2(4-咪唑)、 -CH(CO2CH3)CH2(5-咪唑)、-CH(CO2CH3)CH2CO2CH3、或者 -CH(CO2CH3)CH2CO2NH2

7.一种具有以下结构的假单胞菌素前药、其可药用盐及其溶剂 化物, 其中 R是 其中 Ra和Ra′独立地是H或甲基,或者Ra或Ra′是烷基氨基,与Rb或Rb′一起形成6-元环烷基环、6-元芳族环或双键,或者与Rc一起形成6-元 芳族环; Rb和Rb′独立地是H、卤素或甲基,或者Rb或Rb′是氨基、烷基氨基、 α-乙酰乙酸酯、甲氧基或羟基; Rc是H、羟基、C1-C4烷氧基、羟基烷氧基、或者与Re一起形成6- 元芳族环或C5-C6环烷基环; Re是H,或者与Rf一起是6-元芳族环、C5-C14烷氧基取代的6-元 芳族环、或者C5-C14烷基取代的6-元芳族环,和 Rf是C8-C18烷基,C5-C11烷氧基或联苯基; R是 其中 Rg是H或C1-C13烷基,且 Rh是C1-C15烷基、C4-C15烷氧基、(C1-C10烷基)苯基、-(CH2)n-芳基、 或-(CH2)n-(C5-C6环烷基),其中n=1或2;或者 R是 其中 Ri是H、卤素、或C5-C8烷氧基, 而且m是1、2或3; R是 其中 Rj是C5-C14烷氧基或C5-C14烷基,并且 p=0、1或2; R是 其中 Rk是C5-C14烷氧基,或者 R是-(CH2)-NRm-(C13-C18烷基),其中Rm是H、-CH3或-C(O)CH3; R1独立地是H、酰氧基亚甲基-1,3-二氧杂环戊烯-2-酮、或者酰氧 基亚甲基羧酸酯,条件是至少一个R1是酰氧基亚甲基-1,3-二氧杂环戊 烯-2-酮或者酰氧基亚甲基羧酸酯; R2和R3独立地是-OR2a、或者-N(R2b)(R2c), 其中 R2a和R2b独立地是H、C1-C10烷基、C3-C6环烷基、羟基(C1-C10)烷基、 烷氧基(C1-C10)烷基、C2-C10烯基、氨基(C1-C10)烷基、一-或二-烷基氨 基(C1-C10)烷基、芳基(C1-C10)烷基、杂芳基(C1-C10)烷基、环杂烷基(C1-C10) 烷基,或者 R2b是氨基酸烷基酯的羧酸烷基酯残基并且R2c是H或C1-C6烷基。

8.权利要求7的前药,其中所述酰氧基亚甲基-1,3-二氧杂环戊 烯-2-酮是由下式1(a)所表示的: 其中R1a是C1-C10烷基、C1-C10烯基、苄基、或芳基,而且R1b是H或甲 基。

9.权利要求7的前药,其中所述酰氧基亚甲基羧酸酯是由下式 1(b)所表示的: 其中R1a是C1-C10烷基、C1-C10烯基、苄基、或芳基,而且R1b是H或甲 基。

10.权利要求8的前药,其中R由下面结构所表示: 其中Rb′是羟基,Ra、Ra′、Rb、Rc、Rd和Re都是H,并且Rf是正辛基。

11.权利要求9的前药,其中R由下面结构所表示: 其中Rb′是羟基,Ra、Ra′、Rb、Rc、Rd和Re都是H,并且Rf是正辛基。

12.权利要求7的前药,其中所述氨基酸烷基酯的羧酸烷基酯残 基是由以下表示的:-CH2CO2CH3、-CH(CO2CH3)CH(CH3)2、-CH(CO2CH3)CH(苯 基)、-CH(CO2CH3)CH2OH、-CH(CO2CH3)CH2(对羟基苯基)、 -CH(CO2CH3)CH2SH、-CH(CO2CH3)CH2(CH2)3NH2、-CH(CO2CH3)CH2(4-咪唑)、 -CH(CO2CH3)CH2(5-咪唑)、-CH(CO2CH3)CH2CO2CH3、或者 -CH(CO2CH3)CH2CO2NH2

13.前述权利要求任一项的化合物在制备用于对抗全身性真菌感 染或者真菌皮肤感染的药物中的用途。

14.一种药用制剂,含有权利要求1或7的假单胞菌素前药和可 药用载体。

15.一种治疗动物抗真菌感染的药物,其中所述药物含有权利要 求1或7的化合物。

16.一种治疗需要治疗的动物抗真菌感染的方法,包括向所述动 物给药权利要求7、8、9、10或11的假单胞菌素前药。
展开

说明书

                            发明领域 本发明涉及假单胞菌素(pseudomycin)化合物,尤其是假单胞菌素 化合物前药。
                            发明背景 假单胞菌素是从丁香假单胞菌(Pseudomonas syringae,与植物有 关的细菌)的液体培养物中分离的天然产物,并且已显示具有抗真菌活 性。
(例如参见,Harrison,L.等,“假单孢菌素,一族得自丁香假单胞 菌的具有广谱抗真菌活性的新肽”,J.Gen.Microbiology,137(12), 2857-65(1991)以及美国专利US5,576,298和5,837,685)。
与前面所 述得自丁香假单胞菌的抗霉菌剂(例如丁香霉素、丁香假单胞菌毒素和 丁香假单胞菌抑制素)不同,假单胞菌素A-C含有羟基天冬氨酸、天冬 氨酸、丝氨酸、脱氢氨基丁酸、赖氨酸和二氨基丁酸。
假单胞菌素A、 A’、B、B’、C、C’的肽部分相应于具有末端羧基的L-Ser-D-DabL- Asp-L-Lys-L-Dab-L-aThr-Z-Dhb-L-Asp(3-OH)-L-Thr(4-Cl),该羧基 在N-末端Ser的OH上将大环闭合。
这些类似物是通过N-酰基侧链加 以区别的,即假单胞菌素A是被3,4-二羟基十四烷酰基N-酰化的,假 单胞菌素A’是被3,4-二羟基十五烷酰基N-酰化的,假单胞菌素B是 被3-羟基十四烷酰基N-酰化的,假单胞菌素B’是被3-羟基十二烷酰 基N-酰化的,假单胞菌素C是被3,4-二羟基十六烷酰基N-酰化的, 以及假单胞菌素C’是被3-羟基十六烷酰基N-酰化的。
(例如参见Ballio, A.,等人,“得自丁香假单胞菌的生物活性脂缩肽:假单孢菌素,”FEBS Letters,355(1),96-100,(1994)和Coiro,V.M.,等人,“使用得自 NMR数据的几何位距和分子动力学通过计算机模拟确定的丁香假单胞菌 MSU 16H植物毒性脂缩肽假霉素A的溶液构象,”Eur.J.Biochem., 257(2),449-456(1998))。
已知假单胞菌素具有一定的生物副作用。
例如,当假单胞菌素经 静脉内给药时,已观察到静脉内皮破坏、组织破坏、发炎和宿主组织 的局部毒性。
因此,需要从这类化合物中鉴别出对治疗真菌感染有用 而没有目前观察到的副作用的化合物。
                          发明简述 本发明提供了一种用作抗真菌剂的下面结构式所表示的假单胞菌 素前药、其可药用的盐及其溶剂化物, 其中R是 其中 Ra和Ra′独立地是H或甲基,或者Ra或Ra′是烷基氨基,与Rb或Rb′一起形成6-元环烷基环、6-元芳族环或双键,或者与Rc一起形成6-元 芳族环; Rb和Rb′独立地是H、卤素或甲基,或者Rb或Rb′是氨基、烷基氨基、 α-乙酰乙酸酯、甲氧基或羟基; Rc是H、羟基、C1-C4烷氧基、羟基C1-C4烷氧基、或者与Re一起形 成6-元芳族环或C5-C6环烷基环; Re是H,或者与Rf一起形成6-元芳族环、C5-C14烷氧基取代的6- 元芳族环、或者C5-C14烷基取代的6-元芳族环,和 Rf是C8-C18烷基,或C5-C11烷氧基; R是 其中 Rg是H或C1-C13烷基,而且 Rh是C1-C15烷基、C4-C15烷氧基、(C1-C10烷基)苯基、-(CH2)n-芳基、 或-(CH2)n-(C5-C6环烷基),其中n=1或2;或者 R是 其中 Ri是H、卤素、或C5-C8烷氧基,而且 m是1、2或3; R是 其中 Rj是C5-C14烷氧基或C5-C14烷基并且p=0、1或2; R是 其中 Rk是C5-C14烷氧基,或者 R是-(CH2)-NRm-(C13-C18烷基),其中Rm是H、-CH3或-C(O)CH3; R1独立地是H、酰氧基亚甲基-1,3-二氧杂环戊烯-2-酮(例如下面所述 的化合物1(a))、或者酰氧基亚甲基羧酸酯(例如下述的化合物1(b)) 其中 R1a是H、C1-C10烷基、C1-C10烯基、苄基、或芳基,而且 R1b是H或甲基 条件是至少一个R1是酰氧基亚甲基-1,3-二氧杂环戊烯-2-酮或者 酰氧基亚甲基羧酸酯; R2和R3独立地是-OR2a、或者-N(R2b)(R2c), 其中 R2a和R2b独立地是H、C1-C10烷基(例如甲基、乙基、正丙基、异丙 基、正丁基、异丁基、仲丁基、叔丁基等)、C3-C6环烷基(例如环丙基、 环丁基、环戊基、环戊基亚甲基、甲基环戊基、环己基等)、羟基(C1-C10) 烷基、烷氧基(C1-C10)烷基(例如甲氧基乙基)、或C2-C10烯基、氨基(C1-C10) 烷基、一-或二-烷基氨基(C1-C10)烷基、芳基(C1-C10)烷基(例如苄基)、 杂芳基(C1-C10)烷基(例如3-吡啶基甲基、4-吡啶基甲基)、或环杂烷基 (C1-C10)烷基(例如N-四氢-1,4-噁嗪基乙基和N-哌嗪基乙基),或者 R2b是氨基酸烷基酯的羧酸烷基酯残基(例如-CH2CO2CH3、 -CH(CO2CH3)CH(CH3)2、-CH(CO2CH3)CH(苯基)、-CH(CO2CH3)CH2OH、 -CH(CO2CH3)CH2(对羟基苯基)、-CH(CO2CH3)CH2SH、 -CH(CO2CH3)CH2(CH2)3NH2、-CH(CO2CH3)CH2(4-或5-咪唑)、 -CH(CO2CH3)CH2CO2CH3、-CH(CO2CH3)CH2CO2NH2等),而且 R2c是H或C1-C6烷基。
在本发明的另一实施方案中,提供了一种药用制剂,它包括上述 的假单胞菌素前药和可药用的载体。
在本发明的又一实施方案中,提供了一种在需要治疗的动物中治 疗抗真菌感染的方法,该方法包括向所述动物给药上述的假单胞菌素 前药。
本发明还提供了上述假单胞菌素前药在生产用于治疗动物内抗 真菌感染的药物的用途。
                                定义 除非另有说明,本文所用的术语“烷基”指的是含有1-30个碳原 子的通式CnH2n+1烃基。
烷基可以是直链(例如甲基、乙基、丙基、丁基 等)、支链(例如异丙基、异丁基、叔丁基、新戊基等)、环状(例如环 丙基、环丁基、环戊基、甲基环戊基、环己基等)、或者多环状(例如 二环[2.2.1]庚烷、螺[2.2]庚烷等)。
所述烷基可以是被取代或者没有 取代的。
类似地,烷氧基、烷酰基或链烷酸酯中的烷基部分具有上面 的相同定义。
术语“烯基”指的是含有至少一个碳碳双键的无环烃。
所述烯基 可以是直链、支链、环状或多环状。
所述烯基可以是被取代或者未取 代的。
链烯氧基、链烯酰基或链烯酸酯中的烯基部分具有上面的相同 定义。
术语“芳基”指的是具有单环体系(例如苯基)或稠环体系(例如萘、 蒽、菲等)的芳族部分。
所述芳族可以是被取代或者没有取代的。
在有机化学领域,特别是有机生化领域,应广泛地理解为,化合 物的有效取代是允许的,或者甚至是有用的。
例如,在本发明中,术 语烷基允许包括典型的烷基取代基,例如甲基、乙基、丙基、己基、 异辛基、十二烷基、硬脂基(stearyl)等。
术语“基团”特定假设并 允许包括在本领域常规的烷基上取代,例如羟基、卤素、烷氧基、羰 基、酮基、酯基、氨基甲酸酯基(Carbamato)等,以及包括没有取代 的烷基部分。
然而,本领域技术人员通常理解为,取代基应经选择, 以便对化合物的药理特性没有负面影响,或者对该药物的使用没有负 面干扰。
上面定义的任意基团的合适取代基包括烷基、烯基、炔基、 芳基、卤素、羟基、烷氧基、芳氧基、巯基、烷硫基、芳硫基、一-和 二-烷基氨基、季铵盐、氨基烷氧基、羟基烷基氨基、氨基烷硫基、氨 基甲酰基、羰基、羧基、羟乙酰基、甘氨酰基、肼基、脒基、及其组 合。
术语“前药”指的是一类药物,它们在体内由于代谢过程转化(即 生物转化)产生药理作用。
在本发明中,假单胞菌素前药化合物含有连 接体,所述连接体在血浆中可以经酯酶裂开,从而产生所述活性药。
术语“动物”指的是人、宠物(例如狗、猫和马)、食物源动物(例 如牛、猪、羊和家禽)、动物园动物、海洋动物、鸟类和其它类似动物 种。
                           发明详述 申请人发现假单胞菌素天然或半合成产物的前药衍生物的副作用 比相应天然产物的低并且在体内保留了抗白色念珠菌(C.albican)、 新型隐球酵母(C.neoformas)和烟曲霉(A.fumigatus)的功效。
该 前药是通过将与假单胞菌素环肽环体系中的赖氨酸或2,4-二氨基丁酸 肽单元相连的侧氨基中至少一个酰化以形成酰基取代基生产的。
酰化剂 (或连接体)通常是含有合适的离去基团的酰氧基亚甲基-1,3-二氧杂环 戊烯-2-酮或酰氧基亚甲基羧酸酯酰化化合物,以便可以形成与假单胞 菌素结构上的侧氨基连接的氨基甲酸酯键。
合适的离去基团对本领域 技术人员为公知并包括例如对硝基苯氧基和N-氧基琥珀酰亚胺的基 团。
酰氧基亚甲基-1,3-二氧杂环戊烯-2-酮酰化化合物可以使用下面 路线I所示的合成路径合成。
为了说明的目的,描述了一特定酰化化 合物。
然而,本领域技术人员应理解的是,人们可以使用相同的基本 合成方法合成各种衍生物。
                            路线I 对于这些合成步骤更详细的描述,参见下面实施例的制备部分。
酰氧基亚甲基羧酸酯酰化化合物可以使用下面路线II所示的合成 路径合成。
为了说明的目的,描述了一特定的酰化化合物。
然而,本 领域技术人员应理解的是,人们可以使用相同的基本合成方法合成各 种衍生物。
                         路线II 对于这些合成步骤更详细的描述,参见下面实施例的制备部分。
正如早先所讨论的,假单胞菌素是从丁香假单胞菌分离的天然产 物,它被表征为酯缩肽(Lipodepsinonapetpides),其含有通过内酯 键闭环的环肽部分并包括不寻常的氨基酸4-氯苏氨酸(ClThr)、3-羟基 天冬氨酸(HOAsp)、2,3-脱氢-2-氨基丁酸(Dhb)和2,4-二氨基丁酸 (Dab)。
生长丁香假单胞菌的不同菌株从而生产不同假单胞菌素类似物 (A、A’、B、B’、C和C’)的方法描述如下并且更详细地描述在Hilton 等人于2000年4月14日提交的题为“通过丁香假单胞菌生产假单胞 菌素(Pseudomycin Production by Pseudomonas Syringae)”的PCT 专利申请,其序列号为PCT/US00/08728、Kulanthaivel等人于2000 年4月14日提交的题为“假单胞菌素天然产物(Pseudomycin Natural Products)”的PCT专利申请,其序列号为PCT/US00/08727、以及US 5,576,298和5,837,685中,在此将它们都引入作为参考。
产生一种或多种假单胞菌素的丁香假单胞菌分离菌株在本领域为 已知。
野生型菌株MSU 174和通过转座子诱变产生的该菌株突变体MSU 16H,描述在US 5,576,298和5,837,685;Harrison等人的 “Pseudomycins,a family of novel peptides from Pseudomonas syringae possessing broad-spectrum antifungal activity,”J.Gen. Microbiology,137,2857-2865(1991);以及Lamb等人的“Transposon mutagenesis and tagging of fluorescent pseudomonas:Antimycotic production is necessary for control of Dutch elm disease,”Proc. Natl.Acad.Sci.USA,84,6447-6451(1987)中。
适合生产一种或多种假单胞菌素的丁香假单胞菌菌株可以从包括 植物(例如大麦植物、柑橘植物和丁香植物)的环境源以及,例如土壤、 水、空气和灰尘的源分离。
优选菌株是从植物分离的。
从环境源分离 的丁香假单胞菌菌株可以称之为野生型。
正如本文所用的,“野生型” 是指天然存在于丁香假单胞菌正常菌群中的显性基因型(例如在自然界 中发现且不是通过实验室操作生产的丁香假单胞菌菌株或分离物)。
与 大多数生物体相同,所用的产假单胞菌素(丁香假单胞菌菌株如MSU 174、MSU 16H、MSU 206、25-B1、7H9-1)的培养物的特性易于变化。
因此,这些菌株的后代(例如重组体、突变体和变种)可以通过本领域 已知的方法获得。
丁香假单胞菌MSU 16H从the American Type Culture Collection,Parklawn Drive,Rockville,MD,USA是公众可得的, 其保藏号为ATCC 67028。
丁香假单胞菌菌株25-B1、7H9-1和67 H1 于2000年3月23日保藏在the American Type Culture Collection 并且分别具有以下保藏号: 25-B1保藏号PTA-1622 7H9-1保藏号PTA-1623 67 H1保藏号PTA-1621 丁香假单胞菌的突变体菌株也适合生产一种或多种假单胞菌素。
正如本文所用的,“突变体”是指在菌株表型中突然可遗传的变化,它 可以是自发的或者通过已知诱变剂诱导的,例如辐射(例如紫外线辐射 或x-射线)、化学诱变剂(例如甲基磺酸乙酯(EMS)、二环氧辛烷、N-甲 基-N-硝基-N’-硝基鸟嘌呤(NTG)和亚硝酸)、位置特异性诱变和转座子 介导诱变。
产假单胞菌素的丁香假单胞菌突变体可以通过用有效地产 生突变体的量的诱变剂处理该细菌来生产,所示突变体过量地生产一 种或多种假单胞菌素、生产一种超过其它假单胞菌素的假单胞菌素(例 如假单胞菌素B)、或者在有利的生长条件下生产一种或多种假单胞菌 素。
尽管所用诱变剂的类型和数量可以变化,但是优选方法是可系列 地将NTG稀释到1-100μg/ml的水平。
优选突变体是过量地产生假单 胞菌素B并在最小限定的培养基中生长的那些。
为了以下所需特性:生长习性、生长培养基营养源、碳源、生长 条件、氨基酸需要等,可以对丁香假单胞菌的环境分离物、突变体菌 株和其它所需的丁香假单孢菌菌株经过选择。
优选选择在最小限定的 培养基例如N21培养基上生长和/或产生一种或多种量大于约10μg/ml 的假单胞菌素的产假单胞菌素的丁香假单胞菌菌株。
优选菌株当在含 有三种或更少氨基酸,任选含有脂类、马铃薯产品或其组合的培养基 上生长时,呈现产生一种或多种假单胞菌素的特性。
使用本领域中已知的方法,通过转化丁香假单胞菌菌株,可以培 育重组菌株。
除了这些菌株产生的抗生素之外,通过使用重组DNA技 术,可将丁香假单胞菌菌株转化而表达不同的基因产物。
例如,人们 可以修饰这些菌株,从而引入多重拷贝的内源假单胞菌素生物合成基 因,以获得更大的假单胞菌素产量。
为了从丁香假单胞菌野生型或突变体菌株生产一种或多种假单胞 菌素,该生物体在含有有效量的三种或更少氨基酸,优选谷氨酸、甘 氨酸、组氨酸或其组合的水性营养培养基中搅拌培养。
或者,将甘氨 酸与一种或多种的马铃薯产品和脂类组合。
在丁香假单胞菌能够有效 生长并产生所需假单胞菌素的条件下进行培养。
有效条件包括温度为 约22℃-约27℃,时间为约36小时-约96小时。
在丁香假单胞菌的培 养过程中控制培养基中的氧浓度对假单胞菌素的生产是有益的。
优选 氧水平保持在约5-50%饱和度,更优选约30%饱和度。
用空气、纯氧或 含有氧的气体混合物喷射可以调节培养基中的氧浓度。
在丁香假单胞菌的培养过程中控制培养基的pH也是有益的。
假单 胞菌素在碱性pH下不稳定,并且如果培养基的pH在约6以上持续约12 小时以上的时间,能够产生明显的降解。
优选培养基的pH保持在6-4 之间。
丁香假单胞菌当在分批培养物中生长时可以产生一种或多种假 单胞菌素。
然而,分批补加(fed-bath)或半连续加入葡萄糖和任选, 加入酸或碱(例如氢氧化铵)控制pH可以提高产量。
假单胞菌素产量还 可以使用自动加入葡萄糖和氢氧化铵的连续培养法来提高。
丁香假单胞菌菌株的选择可以影响产生的假单胞菌素的量和分 布。
例如,菌株MSU 16H和67 H1各自主要产生假单胞菌素A,但是还 产生假单胞菌素B和C,其比例典型地为4∶2∶1。
菌株67 H1典型地产 生的假单胞菌素的量要比菌株MSU 16H所产生的高约3-5倍。
与菌株MSU 16H和67 H1相比,菌株25-B1产生更多的假单胞菌素B和更少的假单 胞菌素C。
菌株7H9-1的特点是主要产生假单胞菌素B,并且假单胞菌 素B的产量比其它菌株的高。
例如,该菌株可以产生的假单胞菌素B 是假单胞菌素A或C的至少10。
另外,该前药可以由N-酰基半合成化合物形成。
半合成假单胞菌 素化合物可以通过交换L-丝氨酸单元上的N-酰基基团来合成。
各种N- 酰基衍生物的例子描述在Belvo等人于同期申请的题为“假单胞菌素N- 酰基侧链类似物(Pseudomycin N-Acyl Side-Chain Analogs)”的PCT 专利申请序列号____中,将其引入本文作为参考。
一般说来,使用 以下的四个合成步骤将天然存在的假单胞菌素化合物生产为其半合成 化合物:(1)选择性氨基保护;(2)所述N-酰基侧链的化学或酶促脱 酰化;(3)用不同侧链再酰化;和(4)所述氨基去保护。
位置2、4和5的侧氨基可以使用氨基保护领域的技术人员已知的 任意标准方法加以保护。
所用氨基保护基团的精确种类不关键,只要 衍生化的氨基在中间体分子的其它位置上相对接下来的反应条件稳定 并且所述保护基团可以在适宜时候选择性地除去,而对包括任意其它 氨基保护基团的分子剩余部分没有破坏即可。
适合的氨基保护基团包 括苄氧基羰基、对硝基苄氧基羰基、对溴苄氧基羰基、对甲氧基苄氧 基羰基、对甲氧基苯基偶氮苄氧基羰基、对苯基偶氮苄氧基羰基、叔 丁氧基羰基、环戊氧基羰基和邻苯二甲酰亚氨基。
优选的氨基保护基 团是叔丁氧基羰基(t-Boc)、烯丙氧基羰基(Alloc)、邻苯二甲酰亚氨 基和苄氧基羰基(CbZ或CBZ)。
适合的保护基团的进一步的例子描述在 T.W.Greene,“Protective Groups in Organic Synthesis,”John Wiley and Sons,New York,N.Y.,(2nd ed.,1991),at chapter 7。
具有γ或δ羟基化侧链(例如3,4-二羟基十四碳酸酯)的N-酰基的脱 酰作用可以用含水溶剂中的酸处理氨基保护的假单胞菌素化合物来实 现。
适合的酸包括乙酸和三氟乙酸。
优选的酸是三氟乙酸。
如果使用 三氟乙酸的话,可以在室温或接近室温下进行该反应。
然而,当使用 乙酸时,反应通常在约40℃下进行。
适合的含水溶剂体系包括乙腈、 水、及其混合物。
有机溶剂加大该反应速度;然而,加入有机溶剂可 能导致其它副产物。
在侧链上缺少δ或γ羟基的假单胞菌素化合物(例如 假单胞菌素B和C’)可以经酶促脱酰。
适合的脱酰酶包括多粘菌素酰基 转移酶(164-16081脂酰转移酶(粗品)或161-16091脂酰转移酶(纯 品),可从Wako Pure Chemical Industries,Ltd.获得)、或者ECB 脱酰酶。
可以使用本领域技术人员公知的标准脱酰步骤进行该酶促脱 酰作用。
例如,使用多粘菌素酰基转移酶的常规步骤可以在如下文献 中找到:Yasuda,N.等,Agric.Biol.Chem.,53,3245(1989)和Kimura, Y.等,Agric.Biol.Chem.,53,497(1989)。
脱酰产物(也称作假单孢菌素核)在有羰基活化剂的情况下使用 所需酰基的相应酸再酰化。
“羰基活化基团”是指在该羰基处促进亲核 加成反应的羰基取代基。
适合的活化取代基是在所述羰基上具有净吸 电子效果的那些。
这些基团包括,但不限于,烷氧基、芳氧基、含氮 芳族杂环、或者氨基(例如氧基苯并三唑、咪唑基、硝基苯氧基、五氯 苯氧基、N-氧基琥珀酰亚胺、N,N’-二环己基异脲-O-基和N-羟基-N-甲 氧基氨基);乙酸酯、甲酸酯、磺酸酯(例如甲基磺酸酯、乙基磺酸酯 基、苯磺酸酯和对甲苯磺酸酯);和卤化物(例如氯化物、溴化物和碘 化物)。
可以将各种酸用于该酰化方法中。
适合的酸包括含有一个或多个 侧芳基、烷基、氨基(包括伯、仲和叔胺)、羟基、烷氧基和酰氨基的 脂肪酸;在脂肪链内含有氮或氧的脂肪酸;用烷基、羟基、烷氧基和/ 或烷基氨基取代的芳族酸;和用烷基、羟基、烷氧基和/或烷基氨基取 代的杂芳族酸。
或者,可以使用固相合成法,其中将羟基苯并三唑树脂(HOBt-树 脂)用作酰化反应的偶合剂。
一旦氨基脱酰并再酰化(如上所述)之后,可以在有氢化催化剂(例 如10%Pd/C)的情况下通过氢化除去氨基保护基团(2、4和5位的)。
当氨基保护基团是烯丙氧基羰基时,可以使用氢化三丁基锡和二氯化 三苯基膦钯除去所述保护基团。
该特定的保护/去保护方案的优点是降 低了该假单胞菌素结构中Z-Dhb单元的乙烯基氢化潜能。
然后通过以下生产前药:酰化赖氨酸或与N-酰基改性的半合成假 单胞菌素化合物中2,4-二氨基丁酸肽单元相连的侧氨基中的至少一 个,以形成所需氨基甲酸酯键。
通过酰胺化或酯化假单胞菌素环中天冬氨酸和/或羟基天冬氨酸 单元的侧羧酸基团,可以合成其它改性的前药假单胞菌素化合物。
各种酸改性的衍生物的例子描述在Chen等人于同期申请的题 为“Pseudomycin Amide & Ester Analogs”的PCT专利申请序列 号____中,并将其引入本文作为参考。
这些酸改性的衍生物可以通 过将前述的任意前药与适宜醇或胺缩合产生相应的酯或酰胺来形成。
这些酯基团的形成可以使用本领域技术人员公知的标准酯化步骤 来实现。
在酸性条件下的酯化典型地包括在有质子酸(例如HCl、TFA 等)的情况下将所述假单胞菌素化合物溶于或悬浮于适宜醇中。
在碱性 条件下,在有弱碱(例如碳酸氢钠和碳酸钾)的情况下所述假单胞菌素 化合物通常与适宜的烷基卤反应。
酰胺基团的形成可以使用本领域技术人员公知的标准酰胺化步骤 来实现。
然而,偶合剂的选择提供了所述酸基团的选择性修饰。
例如, 使用苯并三唑-1-基氧基-三吡咯烷基鏻六氟磷酸盐(PyBOP)作为偶合 剂,使得人们同时能够分离纯的在残基8位上的一酰胺和(某些情况下) 纯二酰胺。
然而,使用邻苯并三唑-1-基-N,N,N’,N’-四甲基脲鎓四氟 硼酸盐(TBTU)作为偶合剂偏向形成残基3位上的一酰胺。
可以将该假单胞菌素前药分离出并且以本身或以其可药用盐或溶 剂化物的形式使用。
如上所述,该前药是通过形成至少一个酰氧基烷 基氨基甲酸酯键制备的。
术语“可药用盐”是指由无机酸和有机酸获 得的非毒性酸加成盐。
适合的盐衍生物包括卤化物、硫氰酸盐、硫酸 盐、硫酸氢盐、亚硫酸盐、亚硫酸氢盐、芳基磺酸盐、烷基硫酸盐、 磷酸盐、磷酸一氢盐、磷酸二氢盐、偏磷酸盐、焦磷酸盐、链烷酸盐、 环烷基链烷酸盐、芳基链烷酸盐、己二酸盐、藻酸盐、天冬氨酸盐、 苯甲酸盐、富马酸盐、葡糖庚酸盐、甘油磷酸盐、乳酸盐、马来酸盐、 烟酸盐、草酸盐、棕榈酸盐、果胶酯酸盐、苦味酸盐、新戊酸盐、琥 珀酸盐、酒石酸盐、柠檬酸盐、樟脑酸盐、樟脑磺酸盐、二葡糖酸盐、 三氟乙酸盐等。
术语“溶剂化物”是指含有一个或多个溶质分子(即假单胞菌素前 药化合物)和一个或多个药用溶剂分子如水、乙醇等的聚集体。
当溶剂 为水时,该聚集体称之为水合物。
溶剂化物通常是通过将前药加热溶 解于适宜溶剂中并慢慢冷却产生非晶形或结晶溶剂化物形式来形成 的。
可以通过本领域技术人员已知的任意不同方法将每种假单胞菌 素、半合成假单胞菌素、假单胞菌素前药及其混合物检测、确定、分 离和/或提纯。
例如,肉汤培养基或分离物或提纯的组合物中的假单胞 菌素或假单胞菌素前药的活性水平可以通过抗例如假丝酵母属的真菌 的抗真菌活性来确定并且可以通过高效液相色谱法分离和提纯。
典型地将活性成分(即假单胞菌素前药)配制成提供易于控制的药 物剂量且给患者、医师或兽医一种高雅且易于操作的产品的药用剂量 形式。
制品可以含有0.1%-99.9%wt的活性成分,更常规的是约10%-约 30%wt。
正如本文所用的,术语“单位剂量”或“剂量单位”是指含有经计 算产生所需治疗效果的预定量活性成分的物理离散单位。
当单位剂量经 口服或非肠道给药时,典型地以片剂、胶囊、丸剂、粉末包、局部组合 物、栓剂、糯米纸囊剂、安瓿或多剂量容器中的测定单元等的形式提供。
或者,单位剂量可以可吸入或喷雾的干燥或液体气溶胶的形式给药。
给药剂量可以根据动物的身体特性、动物病症的严重程度、用于 给药的方式和动物种类而变化。
给定动物的具体剂量经常由医师或兽 医的判断来确定。
适合的载体、稀释剂和赋形剂对本领域技术人员为公知并包括如 下物料:碳水化合物、蜡、水溶性和/或水膨胀性聚合物、亲水或疏水 材料、明胶、油、溶剂、水等。
所用的特定载体、稀释剂或赋形剂将 取决于活性成分的使用方式和目的。
制品还可以包括润湿剂、润化剂、 表面活性剂、缓冲剂、增强剂、填充剂、稳定剂、乳化剂、悬浮剂、 防腐剂、甜味剂、香味剂、调味剂及其组合。
药用组合物可以使用各种方法给药。
适合的方法包括局部(例如软 膏或喷雾)、口服、注射和吸入。
所用的具体处理方法将取决于进行注 射的类型。
当非肠道静脉应用时,在给药之前,这些制品典型地经过稀释或 重新配制(如果经过冻干的话),如果需要的话进一步稀释。
冻干产品 的重新配制说明的例子是将10ml注射用水(WFI)加入到小瓶中并轻轻 搅拌溶解。
典型重新配制时间低于1分钟。
然后在给药之前,将所得 溶液进一步稀释于输液如5%葡萄糖的水(D5W)中。
假单胞菌素化合物已显示具有抗真菌活性,例如包括抑制以下的 传染性真菌的生长:假丝酵母属各种(即白色念珠菌(C.albicans)、 近平滑假丝酵母(C.parapsilosis)、克鲁丝氏假丝酵母(C.krusei)、 光滑假丝酵母(C.glabrata)、热带假丝酵母(C.tropicalis)或葡萄 牙假丝酵母(C.lusitania));球拟酵母属各种(即光滑球拟酵母(T. glabrata);曲霉属各种(即烟曲霉(A.fumigatus));组织胞浆菌属 各种(即荚膜组织胞浆菌(H.capsulatum));隐球酵母属各种(即新型 隐球酵母(C.neoformans));芽生菌属各种(即皮炎芽生菌(B. dermatitidis));镰孢属各种;发癣菌属各种、Pseudallescheria boydii、粗球孢子菌、申克氏孢子丝菌等。
所以,本发明的化合物和制剂在制备用于对抗全身性真菌感染或 者真菌皮肤感染的药物中有用。
因此,提供了一种抑制真菌活性的方 法,该方法包括将本发明的假单胞菌素前药与真菌接触。
优选方法包 括抑制白色念珠菌或烟曲霉活性。
术语“接触”包括本发明化合物与 真菌结合或接合,或者表面接触或相互接触。
该术语对该方法没有赋 予任何其它限制,例如通过抑制机理。
这些方法定义为包含通过这些 化合物的作用及其内在抗真菌性能抑制寄生物和真菌的活性。
还提供了一种治疗真菌感染的方法,包括对需要这种治疗的宿主 动物给药有效量的本发明药物制剂。
优选方法包括治疗白色念珠菌、 新型隐球酵母或烟曲霉感染。
术语“有效量”是指能够抑制真菌活性 的活性化合物的量。
给药剂量随例如以下因素而变化:感染的性质和 严重程度、宿主的年龄和总体健康状况、宿主对抗真菌剂的耐受性和 宿主的种类。
具体剂量方案同样可以根据这些因素而变化。
药物可以 单一日剂量或在一天期间的多次剂量的方式施用。
该方案可以从约2-3 天延续至约2-3周或更长。
典型的日剂量(以单一或均分剂量给药)含 有约0.01mg/kg-100mg/kg体重的活性化合物的剂量水平。
优选日剂 量通常为约0.1mg/kg-60mg/kg,更优选为约2.5mg/kg-40mg/kg。
宿主通常是包括以下的动物:人、宠物(例如狗、猫和马)、食物源动 物(例如牛、猪、羊和家禽)、动物园动物、海洋动物、鸟类和其它类 似的动物种类。
                           实施例 在整个实施例中使用以下缩写代表各自所列的物料: ACN-乙腈 TFA-三氟乙酸 DMF-二甲基甲酰胺 EDCI-1-[3-(二甲基氨基)丙基]-3-乙基碳化二亚胺盐酸盐 BOC=叔丁氧基羰基,(CH3)3C-O-C(O)-CBZ=苄氧基羰基,C6H5CH2-O-C(O)-PyBOP=苯并三唑-1-基氧基-三吡咯烷基鏻六氟磷酸盐 TBTU=邻苯并三唑-1-基-N,N,N’,N’-四甲基脲鎓四氟硼酸盐 DIEA=N,N-二异丙基乙胺 使用以下结构II描述实施例1-7中得到的产品。
抗真菌活性的检测和定量: 通过使用标准琼脂稀释试验或圆盘扩散试验获得化合物的最小抑 制浓度(MIC)在体外测定抗真菌活性。
在测定抗真菌活性中所用的典型 真菌是白色念珠菌。
当测定样品(50μl)在白色念珠菌x657接种的琼 脂平皿上产生10-12mm直径区域的抑制时,认为抗真菌活性显著。
尾静脉毒性: 在0、24、48和72小时通过侧部尾静脉用0.1ml的测定化合物(20 mg/kg)经静脉(IV)处理小鼠。
每一组中有2只小鼠。
化合物配制于5.0% 葡萄糖和注射用无菌水中。
在第一次处理之后对小鼠监控7天并密切 观察包括以下的刺激信号:红斑、肿胀、变色、坏死、尾失掉和任何 其它的显示毒性副作用的信号。
本研究所用的小鼠是均重为18-20g的远系繁殖的雄性ICR小鼠(可 从Harlan Sprangue Dawley,Indianapolis,IN获得)。
制备 制备4-溴甲基-5-甲基-1,3-二氧杂环戊烯-2-酮(1a-1): 回流加热0.1mol 4,5-二甲基-1,3-二氧杂环戊烯-2-酮、0.1mol N-溴琥珀酰亚胺和0.1g 2,2-偶氮二(2-甲基丙腈)的70ml四氯化碳 (CCl4)混合物。
6小时之后,该混合物用冰冷却并过滤。
滤液用2×50ml 水、2×50ml氯化钠溶液和另一50ml水洗涤。
溶液用硫酸钠干燥并蒸 发至干,在真空下干燥获得16.5g(85%产率)的油,它具有与结构1a- 1一致的1H-NMR数据。
制备化合物(1a-2): 化合物1a-2是使用Synthetic Communication,22(9),1297(1992) 中所述的方法合成的,获得11.5g(78%产率)的粗品油。
制备化合物1a-3: 在4℃下将11.5g化合物1a-2(粗品油)、500ml 37%HCl和300ml 甲醇的混合物搅拌过夜。
然后将该混合物浓缩形成油。
通过柱色谱(1∶1 乙酸乙酯/己烷)提纯获得5.27g(33.8%)产品,它具有与结构1a-3一 致的1H-NMR数据。
制备化合物1a-4: 将3.0g化合物1a-3和2.02g吡啶的30ml氯仿混合物冷却至 0-4℃。
将5.08g氯甲酸对硝基苯酯的30ml氯仿溶液加入到该混合 物中并搅拌约4.5小时。
该混合物用冷1%氢氧化钠(3×30ml)、1N HCl(2×30ml)、水(2×30ml)和盐水(2×30ml)洗涤。
该溶液用硫酸钠 干燥、过滤并用二氯甲烷洗涤。
除去溶剂得到静置固化的油。
将该固 体放入10ml二氯甲烷中并加入己烷形成沉淀。
将混合物过滤,用己 烷洗涤,并在真空下干燥过夜,获得6.39g(94%产率)的产物,其1H- NMR数据与1a-4的结构一致。
制备化合物1b-1: 化合物1b-1可以使用Synthesis,1159(1990)中所述的方法合成。
制备化合物b-2: 在0℃下将4.57g(30mmol)粗品1b-1的40ml二氯甲烷溶液加 入到3.91g(34mmol)N-羟基琥珀酰亚胺和2.7g(34mmol)吡啶的100 ml二氯甲烷溶液中。
0℃下搅拌30分钟之后,在室温下将该混合物静 置过夜。
混合物然后用水洗涤四次并将有机相用硫酸钠干燥。
过滤之 后,蒸发掉溶剂,获得4.0g(58%产率)的油状粗品,其1H-NMR数据与 1b-2的结构一致。
制备CBZ-保护的假单胞菌素B(2a-1): 将假单胞菌素B溶解/悬浮于DMF(20mg/ml,Aldrich Sure Seal) 中。
在室温下搅拌的同时加入N-(苄氧基羰基氧基)琥珀酰亚胺(6eq)。
室温下搅拌32小时。
通过HPLC(4.6×50mm,3.5μm,300-SB,C8,Zorbax 柱)监控反应。
在室温下于高真空旋转蒸发器上将反应物浓缩至10ml。
将物料放入冷冻器中直到准备好制备色谱。
在逆相制备HPLC纯化并冷 冻干燥之后获得一非晶形白色固体(化合物2a-1)。
制备化合物2b-1:                 R1′、R1″和R1=H                R2=-NH(环丙基)                 R3=-OH                         2b-1 将CBZ-保护的假单胞菌素B(2a-1)(400mg,0.25mmo1)溶于4ml 无水DMF中。
依次加入TBTU(79mg,0.25mmol)、DIEA(200μl,6当 量)和环丙胺(14.2mg,0.25mmol)。
在室温、氮气下搅拌反应,同时 通过HPLC监控。
结束之后于真空下将反应物浓缩。
粗品通过制备HPLC 提纯。
冷冻干燥获得209.2mg(51.1%)无色粉末。
在氢气囊下用10%Pd/C于1%HOAc/MeOH中催化氢化所述3-酰氨 基化合物(279.1mg,0.169mmo1)45分钟。
将反应物过滤并在真空下 浓缩。
将残余物用1∶1水∶ACN混合物处理,然后冷冻干燥获得208.3 mg(98.6%)无色粉末(2b-1)。
该结构通过H1-NMR证实。
制备化合物3a-1:           R1′、R1″和R1=H          R2=-OCH3          R3=-OCH3                       3a-1 向50ml圆底烧瓶中加入10ml绝对乙醇和251.7mg CBZ-保护的 假单胞菌素B(2a-1)(0.156mmol)。
向该混合物中加入约1ml酸化乙 醇(使用HCl气提前酸化)并在室温下将反应物搅拌过夜。
然后在真空 下将溶剂除去并将残余物在没有进一步提纯的情况下通过将其溶于10 ml MeOH/1.5ml冰AcOH溶液中进行下一步。
使用249.7mg 10%Pd/C标准氢解30分钟,过滤除去催化剂并经过制备HPLC提纯,冷冻干燥 之后得到120.9mg的化合物3a-1。
C55H96ClN12O19(M+H)+的MS(Ionspray) 计算值是1264.89,实验值是1264.3。
制备C-18侧链(4a-1): -78℃下向手性缩醛4a-1(6.22g,19.1mmol)的二氯甲烷溶液(190 mL)中加入三甲基烯丙基甲硅烷(10.9mL,68.69mmol),接着加入纯 TiCl4(2.94mL,26.71mmol)。
反应物在-78℃下搅拌1小时,然后在 -40℃下搅拌2小时。
此时,反应用甲醇(15mL)终止并用二氯甲烷(200 mL)稀释。
所得反应混合物用1N HCl(2×50mL)、水和盐水洗涤。
有机层经过干燥并在真空下浓缩得到一残余物,将其通过硅胶色谱(10% EtOAc/己烷)提纯,得到5.51g(78%)的目的产品4b-1。
向4b-1(8.56g,23.3mmol)的二氯甲烷(155mL)溶液中加入PCC (10.0g,46.5mmol)。
反应物在室温下搅拌18小时,然后通过一Celite 垫过滤。
滤液在真空下浓缩得到一微红色残余物,将其通过硅胶色谱 (10%EtOAc/己烷)提纯,得到8.36g(80%)甲基酮中间体(结构未显示)。
将这里获得的中间体(8.36g,22.8mmol)溶于THF(60mL)和MeOH(30 mL)中。
向该溶液中加入7.5M KOH(15mL)。
室温下搅拌3小时之后, 除去部分溶剂。
剩余反应混合物用EtOAc/Et2O(3∶1比,350mL)稀释。
有机层用水(3×50mL)和盐水洗涤。
所得有机层经过干燥并在真空下 浓缩得到残余物,将其通过硅胶色谱(10%EtOAc/己烷)提纯,得到6.22 g(96%)的目的白色固体产品4c-1。
将甲醇4c-1(6.22g,22.0mmol)溶于THF水溶液(5.5mL水和 55mL THF)。
向该溶液中加入NMO(4.42g,33.0mmol),接着加入OsO4(280mg溶于THF,1.10mmol)。
在室温下搅拌反应过夜。
此时加入二 硫化钠(4g)。
搅拌反应2小时,然后用EtOAc(300mL)稀释。
整个 混合物用水(2×40mL)和盐水洗涤。
所得有机层经过干燥并在真空下 浓缩得到相应的三醇中间体。
将该物料溶于MeOH(200mL)和水(40mL) 中。
向该溶液中加入NaIO4(10.6g,49.5mmol)。
室温下搅拌1小时 之后,反应物通过Celite过滤并通过短柱硅胶色谱(30%EtOAc/己烷) 提纯,得到约10g(>100%)粗品β-羟基醛。
将由此获得的不纯醛溶于 叔丁醇(100mL)和环己烯(14mL)中。
室温下向该溶液中加入NaClO2(15.97g,176mmol)和KH2PO4(17.8g,132mmol)的水溶液(50mL)。
反应物在室温下搅拌6小时,然后在0℃下用5N HCl终止反应至pH=4。
反应物用3∶1 EtOAc/Et2O(3×250mL)混合溶剂萃取。
有机层用盐水 洗涤并干燥和浓缩,得到7.3g(>100%)粗品酸4d-1,将其直接用于 偶合反应。
制备假单胞菌素C-18(化合物4b-2):                    4a-2        R=Cbz                    4b-2        R=H将粗品酸4d-1(2.1g,6.99mmol)溶于无水THF(20mL)和DMF(20 mL)中。
向该溶液中加入HOBt(1.23g,9.08mmol)和EDCI(1.74g, 9.08mmol)。
室温下搅拌8小时之后,加入CBZ-保护的假单胞菌素核 (3.87g,2.80mmol)。
在室温下搅拌反应2天。
此时部分地除去溶剂。
将反应混合物加样到制备逆相HPLC系统上提纯(注射4次)。
冷冻干燥 之后,分离出550mg(12%)的CBZ-保护的C18酰基衍生物4a-2与HOBt 活化的侧链酯(1g)。
回收的侧链酯(1.0g,2.40mmol)接下来与CBZ- 保护的假单胞菌素核(1.33g,0.96mmol)在无水THF和DMF(各10mL) 中反应。
接着进行上述相同的提纯步骤之后,获得另外量的CBZ-保护 的C18衍生物4a-2(606mg,38%)。
-78℃下向CBZ-保护的C18衍生物4a-2(550mg,0.33mmol)的10% HOAc/MeOH溶液(55mL)中加入Pd/C(550mg,10%钯含量)。
反应物在 1.5大气压下氢化40分钟。
通过分析HPLC监控反应过程。
结束之后, 过滤出催化剂并在真空下将滤液于30℃浓缩。
所得残余物再次溶于1∶1 含水乙腈中并冷冻干燥,得到250mg(60%)的目的产品4b-2。
在以下每个实施例中,使用特定的假单胞菌素化合物作为原料; 然而,本领域技术人员将意识到,除了使用具有不同N-酰基的假单胞 菌素化合物开始之外,使用相同步骤就可以合成其它N-酰基衍生物。
                            实施例1 以下实施例举例说明假单胞菌素C’(n=12,R2和R3=-OH)的一 取代、二取代或三取代的酰氧基烷基氨基甲酸酯前药的制备。
向含有假单胞菌素C’(1.5g,1当量)的DMF溶液(1升)中加入1.5 当量的化合物1a-4并在室温下搅拌混合物约3天。
部分地除去溶剂并 将残余物通过逆相HPLC(WatersTM,Delta Pak C18柱)提纯获得以下产 物和产物的混合物: 86mg纯一取代的假单胞菌素C’(1-1); 87mg一取代的假单胞菌素C’的混合物(1-2); 177mg二取代的假单胞菌素C’的混合物(1-3); 132mg纯二取代的假单胞菌素C’(1-4);和 248mg三取代的假单胞菌素C’(1-5)。
就三取代的前药或二取代的前药混合物而言,没有观察到尾静脉的刺 激。
用纯一取代、一取代的混合物和纯二取代的前药样品观察到一定 的刺激。
与之比较,未取代的假单胞菌素C’和未取代的假单胞菌素B 清楚地显示了尾静脉的刺激。
除了纯二取代的前药样品之外(ED50>20 mg/kgx4),所有样品都显示了显著的体内功效。
使用上述的相同方法还制备了上面结构II的一取代、二取代或三 取代的前药样品,其中R1′、R1″和/或R1并且n=10、12和14。
化合物1-1和1-5呈现出与母体化合物假单胞菌素C’相似的体内 功效。
没有观察到化合物1-5的尾静脉刺激的迹象,并且观察到化合 物1-1的提高的尾静脉毒性。
出人意料地,没有观察到化合物1-4的 体内功效。
                          实施例2 以下实施例举例说明假单胞菌素B(n=10,R2和R3=-OH)的一 取代、二取代或三取代的酰氧基烷基氨基甲酸酯前药的制备。
向溶于500ml二甲基甲酰胺的假单胞菌素B(2.0g,1.65mmol) 溶液中加入574mg(2.47mmol)化合物1b-2。
在室温下搅拌混合物过 夜。
然后将溶液浓缩至约50ml并且产品通过HPLC使用以下梯度洗脱 方案提纯:0-30%0.1%TFA/ACN 5分钟和30-70%TFA/ACN 40分钟。
总收率59%。
对三个分离产物(一取代前药(化合物2-1),其中R1′和R1″=H且R1= -C(O)OCH2OAc,二取代前药(化合物2-2),其中R1′和R1″=-C(O)OCH2OAc且R1=H和三取代前药(化合物2-3),其中R1′、R1″和R1=-C(O)OCH2OAc)都进行测定并证实抗鼠全身性假丝酵母属的体内功效。
然而,尾静脉 毒性为阳性。
                          实施例3 使用与上述实施例2中相同的通用方法制备假单胞菌素B(n=10, R2和R3=-OH)的一取代、二取代和三取代前药,其中R1′、R1″和/或R1= -C(O)OCH2OC(O)C(CH3)3
分离出下面5个样品: 3-1一取代R13-2混合一取代的R1′和R1″3-3混合二取代的R1+R1′和R1+R1″3-4二取代的R1′+R1″3-5三取代的R1′+R1″+R1样品3-1、3-3和3-5各自表明尾静脉毒性为阴性。
所有5个样品 都显示出抗鼠全身性假丝酵母属的体内功效。
                          实施例4 使用与上述实施例2中相同的通用方法制备假单胞菌素C’(n= 12,R2和R3=-OH)的一取代、二取代和三取代的前药,其中R1′、R1″和/或R1=-C(O)OCH2OC(O)C(CH3)3
分离出下面5个样品: 4-1一取代的R14-2混合一取代的R1′和R1″4-3混合二取代的R1+R1′和R1+R1″4-4二取代的R1′+R1″4-5三取代的R1′+R1″+R1没有测定样品4-1。
样品4-3、4-4和4-5表明都是尾静脉毒性阴 性。
样品4-2、4-3、4-4和4-5都显示出抗鼠全身性假丝酵母属的体 内功效。
                          实施例5 使用与上述实施例2中相同的通用方法制备假单胞菌素B(n=10) 的一取代、二取代和三取代的前药,其中R1′、R1″和/或R1= -C(O)OCH(CH3)OC(O)CH3
仅测定了三取代的衍生物(化合物5-1)。
所述 三取代的化合物显示尾静脉毒性为阴性。
                           实施例6 使用与上述实施例2中相同的通用方法制备假单胞菌素B(n=10, R2和R3=-OH)的一取代、二取代和三取代的前药,其中R1′、R1″和/或 R1=-C(O)OCH2OC(O)CH2CH3
仅测定了三取代的衍生物(化合物6-1)。
所述三取代的化合物显示了良好的抗鼠全身性假丝酵母属的体内功 效,而没有尾静脉刺激。
                          实施例7 使用与上述实施例2中相同的通用方法制备假单胞菌素B(n=10, R2和R3=-OH)的一取代、二取代和三取代的前药,其中R1′、R1″和/或 R1=-C(O)OCH2OC(O)CH(CH3)CH3
仅测定了三取代的衍生物(化合物7- 1)。
所述三取代的化合物显示了良好的抗鼠全身性假丝酵母属的体内 功效,而没有尾静脉刺激。
                          实施例8 实施例8和9描述了由半合成的假单胞菌素化合物合成前药,其 中对假单胞菌素结构中的L-丝氨酸单元的N-酰基进行改变。
使用与上述实施例2中相同的通用方法制备假单胞菌素C-18(n= 14,R2和R3=-OH)(4b-2)的一取代、二取代和三取代的前药,其中R1′、 R1″和/或R1=-C(O)OCH2OC(O)C(CH3)3
仅测定了三取代的衍生物(化合 物8-1)。
所述三取代的化合物显示尾静脉毒性为阴性。
                         实施例9 使用与上述实施例2中相同的通用方法制备假单胞菌素C-18(n= 14,R2和R3=-OH)(4b-2)的一取代、二取代和三取代的前药,其中R1′、 R1″和/或R1=-C(O)OCH2OC(O)CH(CH3)CH3
仅测定了三取代的衍生物(化 合物9-1)。
所述三取代的化合物显示了阴性的尾静脉毒性。
                         实施例10 实施例10描述了上述前药的进一步修饰,其中将假单胞菌素环的 天冬氨酸单元的羧酸基团经修饰形成一3-单酰氨基衍生物。
化合物10-1、10-2、10-3、10-4和10-5的合成:     R1′、R1″、R1=-C(O)OCH2OC(O)C(CH3)3    R2=-NHCH2CH2N(CH3)2    R3=-OH                    10-1 向前药3-5(864mg,0.52mmol)的DMF溶液(9ml)中加入1-二甲 基氨基-2-氨基乙烷(57.9μl,0.52mmol)和TBTU(168.6mg,0.52 mmol),接着加入二异丙基乙胺(423μl)。
室温下搅拌20分钟之后, 反应混合物通过反相HPLC(ACN:0.1%TFA/水)提纯。
冷冻干燥获得295 mg(34%)的化合物10-1。
    R1′、R1″、R1=-C(O)OCH2OC(O)C(CH3)3    R2=-NH(环丙基)     R3=-OH                        10-2 化合物10-2是使用与上面的相同方法合成的,但使用0.052mmol 环丙基胺代替1-二甲基氨基-2-氨基乙烷。
    R1′、R1″、R1=-C(O)OCH2OC(O)C(CH3)3    R2=-NHCH2(CO2CH3)    R3=OH                       10-3 化合物10-3是使用与上面的相同方法合成的,但使用甘氨酸甲酯 代替1-二甲基氨基-2-氨基乙烷。
    R1′、R1″、R1=-C(O)OCH2OC(O)CH(CH3)2    R2=-NHCH2CH2N(CH3)2    R3=-OH                       10-4 化合物10-4是使用与上面的相同方法合成的,但使用0.052mmol 前药7-1代替前药3-5。
    R1′、R1″、R1=-C(O)OCH2OC(O)CH(CH3)2    R2=-NH(环丙基)     R3=-OH                       10-5 化合物10-5是使用与上面的相同方法合成的,但使用0.052mmol 前药7-1代替前药3-5并使用0.052mmol环丙基胺代替1-二甲基氨基 -2-氨基乙烷。
                        实施例11 实施例11描述了假单胞菌素化合物前药的合成,其中对假单胞菌 素环的天冬氨酸单元的羧酸基团进行修饰从而生成3-酰氨基衍生物。
合成3-单酰氨基衍生物11-1:           R1′、R1″          R2=-NH(环丙基)           R3=-OH                         11-1 向含有化合物2b-1(1当量)的DMF溶液(1升)中加入1.5当量的 化合物1a-4并在室温下搅拌混合物约3天。
部分地除去溶剂并将残余 物通过反相HPLC(WatersTM,Delta Pak C18柱)提纯,获得化合物11-1 以及其它一取代和二取代的产物。
                          实施例12 实施例12描述了前药的合成,其中对天冬氨酸和羟基天冬氨酸上 的羧酸基团进行修饰生成双酯衍生物。
双酯12-1的合成:           R1′、R1″          R2=-OCH3          R3=-OCH3                         12-1 向含有化合物3a-1(1当量)的DMF溶液(1升)中加入1.5当量的 化合物1a-4并在室温下搅拌混合物约3天。
部分地除去溶剂并将残余 物通过反相HPLC(WatersTM,Delta Pak C18柱)提纯,获得化合物12- 1以及其它一取代和二取代的产物。
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