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脂质包埋的治疗剂的制备方法

基本信息

  • 申请号 CN00810355.0 
  • 公开号 CN1361681A 
  • 申请日 2000/07/14 
  • 公开日 2002/07/31 
  • 申请人 英耐克斯药品股份有限公司  
  • 优先权日期  
  • 发明人 N·莫勒 K·F·翁 P·R·卡利斯  
  • 主分类号  
  • 申请人地址 加拿大不列颠哥伦比亚 
  • 分类号  
  • 专利代理机构 上海专利商标事务所 
  • 当前专利状态 发明专利申请公布 
  • 代理人 陈剑华 
  • 有效性 发明公开 
  • 法律状态
  •  

摘要

通过混合含有脂质微泡体的脂质组合物、带电荷的治疗剂和去稳定剂形成去稳定溶剂中的预形成的微泡体和治疗剂的混合物,从而制备带电荷的治疗剂的完全脂质包埋的治疗剂颗粒。
去稳定剂能有效使预形成的脂质微泡体的膜去稳定而没有使该微泡体破裂。
将所得的混合物培育足够时间,以使预形成的脂质微泡体包埋治疗剂。
然后去除去稳定剂,得到完全脂质包埋的治疗剂颗粒。
预形成的微泡体含有电性与带电荷的治疗剂相反的带电荷的脂质和具有用于控制聚集的空间屏障部分的修饰脂质。
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权利要求书


1.一种制备带电荷的治疗剂的完全脂质包埋的颗粒的方法,该方法包括 以下步骤: 混合含有预形成脂质微泡体的脂质组合物、带电荷的治疗剂和去稳定剂, 形成在去稳定溶剂中的预形成的微泡体和治疗剂的混合物,其中,所述去稳 定溶剂有效地使预形成的脂质微泡体的膜去稳定化而没有使该微泡体破裂, 培育该混合物足够时间,使治疗剂包埋在预形成的微泡体,和 去除去稳定剂, 其特征在于,所述预形成的微泡体包含电性与带电荷的治疗剂相反的带电荷 的脂质和具有用于控制聚集的空间屏障部分的修饰脂质,其中,所述修饰脂 质以有效延迟而非抑制预形成的微泡体聚集的量存在于预形成的微泡体中。

2.如权利要求1所述的方法,其特征在于,所述预形成脂质微泡体中的 带电荷的脂质是阳离子性脂质,所述治疗剂是阴离子性治疗剂。

3.如权利要求2所述的方法,其特征在于,所述治疗剂是聚核苷酸。

4.如权利要求2或3所述的方法,其特征在于,所述阳离子性脂质选自: 氯化二油基-N,N二甲基铵(“DODAC”); 氯化N-(2,3-二油基氧基)丙基)-N,N,N-三甲基铵(“DOTMA”); 溴化N,N-二硬脂基-N,N-二甲基铵(“DDAB”); 氯化N-(2,3-二油基氧基)丙基)-N,N,N-三甲基铵(“DOTAP”); 3β-(N-(N′,N′-二甲氨基乙烷)-氨甲酰基)胆固醇(“DC-Chol”); 溴化N-(1,2-二肉豆蔻基氧基丙-3-基)-N,N-二甲基-N-羟基乙基铵(“DMRIE”); 含有DOTMA和1,2-二油基-sn-3-磷酸乙醇氨(“DOPE”)的阳离子性脂质体; 含有三氟乙酸N-(1-(2,3-二油基氧基)丙基)-N-(2-(精胺甲酰氨基)乙基)-N,N-二 甲基铵(“DOSPA”)和DOPE的阳离子性脂质体; 含有双十八烷基酰氨基甘氨酰基羧基精胺(“DOGS”)的乙醇溶液的阳离子 性脂质体; 氯化N-(2,3-二油基氧基)丙基)-N,N-二甲基铵(“DODMA”);和 1,2-二油基-3-二甲基铵-丙烷(“DODAP”)。

5.如权利要求1-4中任一项所述的方法,其特征在于,所述脂质组合物含有 10-40摩尔%带电荷的脂质、25-40摩尔%中性脂质、35-55摩尔%甾醇和2.5-10 摩尔%修饰脂质。

6.如权利要求1-5中任一项所述的方法,其特征在于,所述去稳定剂是乙醇。

7.如权利要求6所述的方法,其特征在于,去稳定溶剂中的乙醇浓度为25- 40%。

8.如权利要求1-5中任一项所述的方法,其特征在于,所述去稳定剂是去污 剂。

9.如权利要求1-8中任一项所述的方法,其特征在于,所述去稳定溶剂还含 有25-300mM柠檬酸盐缓冲液。

10.如权利要求1-9中任一项所述的方法,其特征在于,在约40℃培育所述 混合物。

11.如权利要求1-10中任一项所述的方法,其特征在于,所述修饰脂质是 PEG-CerC14

12.如权利要求1-11中任一项所述的方法,其特征在于,所述预形成的脂质 微泡体包含: 阳离子性脂质, 选自DOPE和DSPC的中性脂质; 修饰脂质,和 胆固醇。
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说明书

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                            序列表 <110>英耐克斯药品股份有限公司(INEX Pharmaceuticals Corp.) N.莫勒(MAURER,Norbert) K.F.翁(WONG,Kim,F.) P.R.卡利斯(CULLIS,Pieter,R.) <120>脂质包埋的治疗剂的制备方法 <130>80472-7 <140> <141> <160>3 <170>PatentIn Ver.2.1 <201>1 <211>16 <212>DNA <213>人 <220> <223>c-myc <400>1 taacgttgag gggcat                                       16 <210>2 <211>20 <212>DNA <213>人 <400>2 gcccaagctg  gcatccgtca                                  20 <200>3 <211>15 <212>DNA <213>人 <220> <223>EGFR <400>3 ccgtggtcat  gctcc                                       15                             技术领域 本发明涉及一种制备脂质包埋的治疗剂颗粒、具体为可用于反义治疗或基因 治疗的脂质包埋的治疗剂核酸颗粒的新颖的方法。
                            背景技术 已有许多人考虑使用脂质颗粒作为治疗剂的载体。
配方的制造依赖于治疗剂 与脂质颗粒的外表的络合,或者治疗剂的实际包埋,虽然制造这两种类型的配方 的能力都依赖于脂质和治疗剂的性能匹配,以及用来制备该颗粒的方法。
包埋了 治疗剂的颗粒的情况下,包埋的方法可以是被动的,即在治疗剂存在下脂质颗粒 发生聚集,其中的一些治疗剂被密封;或者是主动的,即由于某些类型的诱导梯 度的作用结果,治疗剂被吸引或强迫进入脂质颗粒的内部。
虽然有许多用脂质颗 粒作为载体的努力,但是,仍存在许多可能限制脂质包埋的治疗剂的实际应用的 问题。
这些问题包括在药物/脂质基础上治疗剂掺合的水平低、捕获治疗剂的效率 低和缺少适合的大规模生产脂质包埋的治疗剂颗粒的方法。
还没能实现大规模生产完全由脂质包埋的治疗剂颗粒,其原因是在脂质和治 疗剂之间存在明显的静电相互作用。
一个根本的问题是聚集作用。
当带电荷的脂 质与带有相反电荷的治疗剂混合时,常常发生聚集作用,产生含有乳白色的絮状 物的溶液,该溶液不能用于进一步加工,更不用说用于治疗。
聚集问题阻碍了可 能具有重大用途的治疗组合物的发展。
在Bally等人的美国专利5705385(PCT申请WO96/40964;还参见美国专利 申请S.N.08/484282、08/485458、08/660025和09/140476)和Semple等人在PCT 专利申请WO98/51278(还参见美国专利申请S.N.08/856374)中叙述了用被动包埋 方法,使用阳离子脂质和阴离子核酸已成功实现了实验室规模的含有带电荷的脂 质和带相反电荷的治疗剂的制剂。
所述专利都转让给本发明的受让人,并被纳入 本文作为参考。
还可参见Wheeler等人(1999),稳定化的质粒-脂质颗粒:构建和 表征(Stabilized plasmid-lipid particles:Construction and characterization),Gen.Ther., 6:271-281。
这些技术使用一种能防止聚集的脂质,如PEG脂质或ATTA脂质(公 开于待授权的美国专利申请08/996783中,该文被纳入本文作为参考),这些脂质 有效阻止了络合聚集物的形成。
所产生的完全脂质包埋的治疗剂颗粒具有优异的 药学特性,如受控的尺度(在30-250nm的范围内)、完全的包埋(例如,由测量其 核酸酶抗性标明)和在血清中的稳定性。
WO98/51278描述了一种使用被动包埋法以实验室规模制备脂质包埋的治疗 剂颗粒的方法。
这种已知的方法有两个基本的步骤,即脂质水合和脂质体筛分。
在脂质水合步骤中,将阳离子性的脂质溶液(95%EtOH溶剂)滴加到含有聚核苷酸 治疗剂在柠檬酸盐缓冲液(pH3.8)中的溶液的搅拌液槽中,达到的最终组成是40% EtOH、9.9mg/ml脂质和2.0mg/ml聚核苷酸。
由此水合步骤得到的脂质颗粒直径 一般为400nm以上,这对一般的治疗用途来说是太大了。
因此,就需要配制后的 大量加工如高温挤压(在65℃)和可任选地冻融(从液氮到65℃的水浴),才能产生 合适尺度的脂质颗粒。
以回收的最终药物:脂质比来看,此方法的包埋效率相当 高(60-90%),但是,起始聚核苷酸掺到最终颗粒制剂中的绝对效率却不是最理想 的(25-45%)。
商业上,采用脂质体领域中使用的传统方法并不能有效地大规模生产这些颗 粒。
虽然自从AD.Bangham等人〔1965,甾体化合物和streptolysin S对磷脂结构 阳离子渗透性的作用(The action of steroids and streptolysin S on permeability of phospholipid structures to cations),J.Mol.Biol.,13,138-147〕首次描述脂质体的 制备以后出现了大量的制备脂质体/药物制剂的技术,但是上述问题仍然存在。
已知的大规模生产脂质颗粒的技术可大致分为以下几种:1)脂质膜水合(即被 动包埋);2)反相蒸发;3)高压挤出;4)溶剂注射(稀释)(参见Martin等人的美国专 利4752425和4737323)。
本领域中公开的具体的制备脂质颗粒的仪器包括: Schneider等人的美国专利5270053和5466468;U.Isele等人(1994),通过有机溶 剂的受控稀释大规模制备含单体锌酞菁的脂质体(Large-Scale Production of Liposomes Containing Monomeric Zinc Phthalocyanine by Controlled Dilution of Organic Solvents),J.Pharma.Sci.,卷83(11),1680-1616;RW.Kriftner(1992),脂 质体制备:乙醇注射技术(Liposome Production:The Ethanol Injection Technique), Bruan-Falco等人编辑,脂质体衍生物(Liposome Derivatives),Berlin,Springer- Verlag,1992,pp.91-100;Kremer等人(1997),由改进的注射方法制备的可变直 径的微泡体(Vesicles of Variable Diameter Prepared by a Modified Injection Method),Biochemistry16(17):3932-3935;S.Batzri和ED.Korn(1973),无需声处 理制备的单个双层脂质体(Single Bilayer Liposomes Prepared Without Sonication), Bioch.Biophys.Acta,298:1015-1019。
上述已知的方法或仪器没有一种适合用于扩大生产Bally等人(同上)和Semple 等人(同上)所述的具有优异的药学特性的带电荷的脂质和带相反电荷的治疗剂的 制剂。
Bally等人(同上)和Semple等人(同上)所述的生产技术仅适用于生产1-100ml 的制品,并且这种技术操作麻烦,且导致大规模生产(即20-200升的规模)的让人 无法忍受的无效。
本发明首次提供用于大规模制备完全包埋的脂质治疗剂颗粒的方法,其中脂 质和治疗剂的电性相反。
这些颗粒可用作治疗组合物和用于实验研究以及其他用 途。
本发明的目的是提供这种方法。
                          发明概要 根据本发明,通过混合包含预形成的脂质微泡体(即带电荷的治疗剂)的脂质 组合物和去稳定剂,形成预形成的微泡体和治疗剂在去稳定溶剂中的混合液而制 备带电荷的治疗剂的完全脂质包埋的治疗剂颗粒。
该去稳定溶剂有效地使预形成 的脂质微泡体的膜去稳定化而没有实该微泡体破裂。
培育所得到的混合液足够时 间,以使治疗剂被包埋在预形成脂质微泡体中。
然后去除去稳定剂,获得完全脂 质包埋的治疗剂颗粒。
预形成脂质微泡体含有带电荷的脂质和具有用于控制聚集 的空间屏障部分的修饰脂质,其中,带电荷的脂质的电性与带电荷的治疗剂的电 性相反。
在本发明的一个有效地大规模(例如20-200升)形成脂质颗粒的较佳实施 例中,用预形成脂质微泡体的25-40%乙醇水溶液混合含有核酸(例如反义寡聚脱 氧核苷酸)的治疗剂溶液。
培育此混合液约1小时,足以导致自发产生完全脂质包 埋的治疗剂颗粒。
                       附图的简短说明 图1显示本发明方法机械步骤的可能模式。
图2描述包埋效率作为含有10摩尔%PEG-Cer的用于脂质体的乙醇浓度的 函数图。
图3A描述在DSPC/Chol/PEG-CerC14/DODAP脂质体中于自猝灭浓度下被捕 获的钙黄绿素的释放作为乙醇浓度的函数(黑圈)以及用脂质组成相同的脂质体得 到的包埋效率(白圈)作为乙醇浓度的函数图。
图3B阐述采用本发明方法进行的脂质捕获核酸过程中脂质的快速交换。
图4显示捕获效率和钙黄绿素漏出数据作为温度的函数图。
图5A、B和C显示脂质缔合的寡核苷酸的NMR光谱。
图6显示捕获效率作为初始寡核苷酸/脂质比的函数图。
图7显示几种反义寡脱氧核苷酸和质粒DNA(pDNA)的包埋效率。
                        发明的详细描述 定义 虽然本申请所用术语可被解释为本领域普通技术人员所理解的普通含义,但 是,一些术语还需要明白地定义,以避免产生歧义。
因此,在本发明所用的术语 中: 带电荷的脂质指带正电荷或负电荷的脂类,或者是不是电中性的两性离子脂 类,一般需要参考含有该脂质的溶液的pH值。
去稳定化作用指脂质膜由于与溶剂相互作用而产生的性能改变。
当将膜去稳 定化时,起始脂质膜的基本形态仍被保留。
然而,低分子量溶质的漏出速率增加, 脂质能跨膜“后滚翻”并与其他脂质颗粒快速交换。
在本发明中,在如浓度为25-40 %的乙醇中可观察到脂质膜的去稳定化作用。
能使脂质微泡体去稳定化而不实该 微泡体破裂的溶剂在本文中指去稳定剂。
破裂指脂质膜的特性改变,使得起始膜的基本形态丧失。
在如浓度>60%的 乙醇中可观察到脂质膜的破裂。
完全包埋的指治疗剂包含在脂质微泡体(如脂质体)的内腔中,或者包埋在脂 质颗粒的双层中,使得治疗剂不会直接与该脂质颗粒周围的外部介质接触。
治疗 剂完全被包埋的脂质颗粒与治疗剂和颗粒的外部络合(例如通过离子性的相互作用) 的颗粒不同,或者与治疗剂部分包埋在脂质中而部分暴露在外部介质中的颗粒不 同。
可采用实可接触的治疗剂发生降解的方法测定包埋的程度。
对于聚核苷酸, 这些方法包括S1核酸酶消化、血清核酸酶、和微球菌核酸酶分析。
或者,可以 进行OliGreenTM试验。
从定量方面看,“完全包埋的”治疗剂是指在有超过90% 的游离形态的治疗剂被降解的条件下,脂质颗粒中有少于10%、较佳少于5%的 治疗剂被降解的治疗剂。
还应注意的是,别的治疗剂还可能以络合或其他方式与 脂质颗粒缔合,它们不是完全包埋的,这并不偏离本发明。
水合指形成脂质颗粒(包括脂质体)的常用的方法。
在这个方法中,脂质周围 的溶剂中的水的量从约为5%以下的浓度(在此浓度,脂质分子通常格子溶剂化)增 加到40-60%以上的浓度(在此浓度,脂质自发地形成膜、胶束或颗粒)。
脂质指一类有机化合物脂肪酸酯,其特征为在水中不溶,但溶于许多有机溶 剂中。
通常,它们至少分为3类:(1)“简单脂质”,包括脂肪和油以及蜡;(2)“复 合脂质”,包括磷脂类和糖脂类;(3)“衍生脂质”,如类固醇。
本发明可使用种 类繁多的脂质,下面描述了其中的一些。
预形成微泡体指用于本发明方法的含有脂质微泡体的原料脂质组合物。
这些 微泡体具有通常球状的或椭圆形的自我封闭结构,由一个或多个脂质层形成,并 具有含有一部分溶剂的内腔。
该微泡体可以是单层状的、寡层状的或多层状的结 构。
本文公开的发明涉及一种制备脂质包埋的治疗剂颗粒的新颖的方法,该方法 尤其可应用于大规模地生产这些电性相反的脂质和治疗剂的(如制剂中的阳离子性 脂质和阴离子性寡核苷酸)的颗粒。
本发明依赖于将预形成脂质微泡体与治疗剂溶 液混合,产生形成具有治疗有用尺度的完全脂质包埋的治疗剂颗粒这一令人惊奇 且意想不到的观察结果。
因此,根据本发明,采用具有以下步骤的方法可制备完 全脂质包埋的治疗剂颗粒;将含有预形成脂质微泡体的脂质组分与治疗剂溶液混 合;培育所得到的混合液一段时间,以使治疗剂被脂质微泡体包埋。
脂质组分还 包括有效地使脂质微泡体的膜去稳定化而不破裂该微泡体的溶剂系统。
本发明方法有几个重要的特征,使得该方法可真正应用于本领域。
首先,该 方法基于规模化,单批可制备大量的(如>100g)所述包埋的治疗剂。
第二,预形成 脂质微泡体的尺度大体上可以维持,这样,就不需要进行导入治疗剂之后以获得 治疗有用尺度的颗粒为目的的脂质颗粒加工。
第三,包埋效率高。
第四,装载到 颗粒中的治疗剂的量高。
本发明使用的脂质颗粒由几种脂质类型的组合形成,包括至少(1)带电荷的脂 质,其净电荷与治疗剂的电荷相反;(2)修饰的脂质,包括如有效限制聚集的聚乙 二醇取代基的修饰。
另外,制剂可含有中性的脂质或甾醇。
在使用上述所有提及 的组分配制脂质颗粒时,各脂质组分合适的量为:带电荷的脂质10-40摩尔%, 中性脂质25-45摩尔%,甾醇35-55摩尔%,和修饰脂质0.5-15摩尔%。
具体的 脂质组分可从下面的非限制性实施例中选择。
带电荷的脂质 种类繁多的带电荷的脂质和带相反电荷的治疗剂可用于本发明。
对于本领域 熟练技术人员,这些化合物的例子是可购得的并且是周知的。
下面所列的是阐述 性的而非限制性的例子。
在生理pH的阳离子性电电荷的脂质包括但不限于氯化N,N-二油基-N,N二甲 基铵(“DODAC”)、氯化N-(2,3-二油基氧基)丙基)-N,N,N-三甲基铵(“DOTMA”)、 溴化N,N-二硬脂基-N,N-二甲基铵(“DDAB“)、氯化N-(2,3-二油基氧基)丙基)- N,N,N-三甲基铵(“DOTAP”)、3β-(N-(N′,N′-二甲氨基乙烷)-氨甲酰基)胆固醇 (“DC-Chol”)和溴化N-(1,2-二肉豆蔻基氧基丙-3-基)-N,N-二甲基-N-羟基乙基铵 (“DMRIE”)。
另外,许多市售的阳离子性脂质也可用于本发明。
它们包括例如 LipofectionTM〔市售的含有DOTMA和1,2-二油基-sn-3-磷酸乙醇氨(“DOPE”)的 阳离子性脂质体,得自GIBCO/BRL,Grand Island,New York,USA〕、 LipofectamineTM〔市售的含有三氟乙酸N-(1-(2,3-二油基氧基)丙基)-N-(2-(精胺甲 酰氨基)乙基)-N,N-二甲基铵(“DOSPA”)和DOPE的阳离子性脂质体,购自 GIBCO/BRL〕和TransfectamTM〔市售的含有双十八烷基氨基甘氨酰基羧基精胺 (“DOGS”)的乙醇溶液的阳离子性脂质体,购自Promega公司,Madison,Wisconsin, USA〕。
一些带正电荷的脂质是可滴定的,即它们的pKa是或者接近生理pH值,这 对于本发明有重要的意义,在温和的酸性条件中它们为强阳离子性,而在生理pH 值它们则表现为弱(或者没有)阳离子性。
这些带正电荷的脂质包括但不限于氯化 N-(2,3-二油基氧基)丙基)-N,N-二甲基铵(“DODMA”)和1,2-二油基-3-二甲基铵- 丙烷(“DODAP”)。
在生理pH值带负电荷的阴离子脂质包括但不限于磷脂酰肌醇、磷脂酰丝氨 酸、磷脂酰甘油、磷脂酸、双磷脂酰甘油、聚(乙二醇)-磷脂酰乙醇胺、双肉豆蔻 酰基磷脂酰甘油、二油基磷脂酰甘油、二月桂酰基磷脂酰甘油、二棕榈酰基磷脂 酰甘油、二硬脂酰基磷脂酰甘油、双肉豆蔻酰基磷脂酸、二棕榈酰基磷脂酸、二 肉豆蔻酰基磷脂酰丝氨酸、二棕榈酰基磷脂酰丝氨酸、脑磷脂酰丝氨酸等。
一些带负电荷的脂质是可滴定的,即它们的pKa是或者接近生理pH值,这 对于本发明有重要的意义,在温和的碱性条件中它们为强阴离子性,而在生理pH 值它们则表现为弱(或者没有)阴离子性。
本领域熟练技术人员可根据本文所公开 的原理鉴定这些带负电荷的脂质。
中性脂质和甾醇 术语“中性脂质”指在生理pH值以不带电荷或中性的两性离子的形式存在 的许多脂类中的任何一种。
这些脂质包括但不限于二酰基卵磷脂、二酰基磷脂酰 乙醇胺、神经酰胺、鞘磷脂、脑磷脂、胆固醇、脑苷脂和二酰基甘油。
修饰脂质 本发明使用的某些较佳制剂包括阻止聚集的脂质,如PEG脂质或聚酰胺寡 聚物脂质(如ATTA-脂质),和其他的空间屏障的脂质或“隐秘的”脂质。
在Sears 的美国专利4320121、Choi等人的5820873、Holland等人的5885613、 WO98/51278(发明者为Semple等人)和涉及聚酰胺寡聚物的美国专利申请 S.N.09/218988中描述了这些脂质,这些文献被纳入本文作为参考。
这些脂质阻止 了含有相反电荷的脂质和治疗剂的制剂的沉淀和聚集。
这些脂质还可用于增加(制 剂)在体内的循环寿命(参见Klibanov等人(1990),FEBS Letters,268(1):235-237), 或者可选择它们在体内进行与制剂的快速交换(参见美国专利5885613)。
特别有用 的可交换的脂质是具有较短酰基链的PEG-神经酰胺(即C14或C18,本文指PEG- CerC14和PEG-CerC18)或具有C14酰基链的PEG-PE。
一些脂质颗粒制剂可使用设计用于对某靶细胞或靶组织定位的靶向分子部 分。
靶向分子可在配制过程中或配制后连接于脂质颗粒的外层双层。
这些方法在 本领域中是周知的。
另外,一些脂质颗粒制剂可使用融合聚合物(如PEAA)、血球 聚集素(hemagluttinin)、其他脂肽(参见美国专利申请S.N.08/835281和60/083294, 所有的文献都纳入本文作为参考)和其他用于体内和/或细胞内传送的物质。
可通过简单的脂质水合步骤,在乙醇或其他有机溶剂的溶液中制备预形成的 脂质微泡体。
必须选择乙醇或其他有机溶剂的百分比,以使脂质颗粒不会被拆散 或再溶解于溶剂中(通常在>60%的乙醇中),但能提供使本发明的包埋方法自发产 生的条件(大约5-50%的乙醇,更佳25-40%的乙醇)。
或者,另外的组分如去污剂 可包括在脂质微泡体溶液中,它们对膜的去稳定化起作用。
对于本发明的目的, “有机溶剂”指完全的有机溶剂(即100%乙醇)或部分的有机溶剂(如乙醇的水溶 液,即20%乙醇、40%乙醇等)。
可以使用种类繁多的可与水互溶的有机溶剂, 它们包括乙醇或其他醇类、乙腈、二甲基甲酰胺、DMSO、丙酮、其他酮类等。
在一些情况中可使用极性较大或较小的溶剂。
去污剂溶液包括β-D-葡萄糖吡喃 苷、Tween 20和那些在WO96/40964和美国专利申请S.N.09/169573所描述的(这 两篇文献都被纳入本文作为参考),以及其他任何能提供相同的溶解性能和/或能 在电性相反的脂质和治疗剂混合过程中阻止颗粒聚集的去污剂或空间屏障化合 物。
较佳的是,痕量或稍大的量的所有的有机溶剂或去污剂溶液是药学上可接受 的,使得配制方法不会妨碍向患者给药。
阴离子性治疗剂包括所有具有净负电荷的治疗剂,或者具有能与阳离子性脂 质相互作用而不被该治疗剂上的其他阳离子基团阻断的阴离子基团的治疗剂。
这 些治疗剂包括所有已知的或潜在的治疗剂,包括所有的药物和化合物,例如但不 限于寡核苷酸、核酸、修饰的核酸(包括蛋白-核酸等)、带负电荷的蛋白质和肽、 常规的药物(如带负电荷基团的植物生物碱和类似物)等。
天然没有阴离子基团的 治疗剂可以衍生成具有阴离子基团的治疗剂,以促进其在本发明中的应用。
例如, 可在紫杉醇的2′碳原子上连接聚谷氨酸而将其衍生化。
阳离子性的治疗剂包括所有具有净正电荷的治疗剂,或者具有能与带负电荷 的脂质相互作用而不被该治疗剂上的其他阴离子基团阻断的阳离子基团的治疗 剂。
这些治疗剂包括所有已知的或潜在的治疗剂,包括所有的药物和化合物,例 如但不限于连接于正电荷的修饰的核酸、具有正电荷基团的蛋白质和肽、常规的 药物(如具有正电荷基团的植物生物碱和类似物)等。
天然没有阳离子基团的治疗 剂可以衍生成具有阳离子基团的治疗剂,以促进其在本发明中的应用。
通常,带电荷的治疗剂最初以缓冲的水溶液提供,一般含有一定量的乙醇或 其他有机溶剂。
盐的浓度可强烈影响本发明采用的自聚集过程(参见美国专利申请 S.N.09/169573,本文纳入该文作为参考),因此需要小心地选择使用缓冲盐溶液。
另外,所有的缓冲液必须是药学上可接受的,由于在最终的制剂中会有痕量的残 留。
合适的缓冲液是300mM用于硫代磷硫酸酯寡聚脱氧核苷酸的柠檬酸盐缓冲 液。
对于具有较低的结合亲和力的磷酸二酯基的寡聚脱氧核苷酸和质粒DNA,低 离子强度的缓冲液是合适的。
例如,柠檬酸盐一般的浓度在25-150mM,在50mM 左右的捕获效果最大。
乙醇和其他可能包括的有机溶剂的量由治疗剂在水和有机 混合液中的溶解度控制,还由所需的治疗剂和预形成脂质微泡体的最终混合液的 特性控制。
脂质、去稳定溶剂和治疗剂的选择可协同进行,以提供完全脂质包埋的的组 合物。
因此,如果治疗剂是都阴离子的寡核苷酸,脂质组分应包括在稳定溶剂中 是阳离子性的脂质。
相反,如果治疗剂是阳离子性的,脂质组分应包括在去稳定 溶剂中是阴离子性的脂质。
这并不意味所有在脂质溶液中的脂质都必须是带电荷 的,也不意味它排除一定量的带同样电荷的脂质或两性离子脂质的掺入。
它仅仅 指脂质溶液应包括其净电荷与治疗剂的净电荷相反的脂质。
本发明方法使用脂质颗粒和治疗剂相对稀释的溶液。
通常,治疗剂溶液的浓 度为1-1000mg/ml,较佳为10-50mg/ml,所得到的最终浓度(与预形成脂质微泡体 混合后)为0.2-10mg/ml,较佳约1-2mg/ml。
使预形成脂质微泡体与治疗剂溶液混 合,这样所得到的脂质浓度(与治疗剂溶液混合后)约为1.5-30mg/ml(约2-40mM), 较佳为10mg/ml。
与寡核苷酸治疗剂混合的预形成的微泡体的较佳组成是以标准 脂质比(PEG-CerC14:DODAP:DSPC:Chol,摩尔比为5∶25∶25∶45)制备。
通过与水性缓冲液混合,例如300mM、pH4.0的柠檬酸盐缓冲液将这种在100% 乙醇中的溶液稀释为5-50%、较佳为40%的乙醇溶液。
搅拌脂质溶液和寡核苷酸溶液直到它们很好地混合,然后不搅拌或轻微地搅 拌约1-2小时培育该混合液,从而发生包埋作用。
然后透析所得溶液,去除乙醇 或其他使脂质颗粒膜去稳定化的物质。
可使用pH调节剂中和表面电荷(在带电荷 的脂质是可滴定的情况),以释放可能络合在颗粒外部的治疗剂。
在培育的终了,本发明方法产生了自发形成的完全脂质包埋的具有治疗可接 受的尺度且可在预形成脂质微泡体的起点上预计的治疗剂颗粒。
因此,加入治疗 剂后通常不需要进行本领域周知的筛分步骤。
这是一个优点,因为在掺入治疗剂 后不需要给脂质微泡体施加机械应力,因此就没有治疗剂损失或损伤的风险。
但 是,如果需要进一步筛分产物颗粒,可以采用一个任选的步骤筛分所得的脂质颗 粒。
另外,为了获得所需尺度的起始微泡体,在将治疗剂导入之前,可将筛分步 骤作为制备预形成的微泡体的一部分。
筛分脂质颗粒的方法有好几种,当筛分是本发明的一部分时,通常可采用这 些方法中的任何一种。
挤出方法是优选的脂质体筛分方法。
参见MJ Hope等人, 用挤出技术降低脂质体尺度和单层微泡体的制备(Reduction of Liposome Size and Preparation of Unilamellar Vesicles by Extrusion Technique),在Liposome Technology 中(G.Gregoriadis编辑),卷1,p123(1993)。
该方法包括通过小孔聚碳酸酯膜或不 对称陶瓷膜挤出脂质体,以将脂质体尺度减少到相对充分限定的尺度分布。
通常, 将该悬浮液循环通过膜一次或多次,直到获得所需尺度的脂质体。
可将脂质体挤 过孔越来越小的膜,以逐渐减小脂质体的尺度。
本领域中存在大量的减少脂质体的尺度的替换方法(“脂质体筛分”)。
在美 国专利4737323中描述了一种筛分方法,本文纳入该文作为参考。
通过浴超声(bath sonication)或探针超声(probe sonication)处理脂质体悬浮液,产生尺度逐渐减小到 直径小于约0.05微米的小的单层状微泡体。
均质化是另一种方法,该方法依赖于 使用剪切力将大脂质体剪切成较小的脂质体。
在一般的均质化过程中,将多层状 微泡体循环通过标准的乳化液均化器,直到观察到所选择的尺度的脂质体(一般为 约为0.1-0.5微米)。
可使用Bloomfield〔Ann.Rev.Biophys.Bioeng.,10:421- 450(1981),本纳为参考〕所述的准电光散射(QELS)测定脂质体颗粒的尺度。
可使 用超声处理所形成的脂质体,减小平均脂质体直径。
间歇性的超声循环可用QELS 评估交替进行,以指导有效的脂质体合成。
采用各种脂质体筛分方法筛分得到的脂质体,其较佳尺度在一定程度上依赖 于它的用途,但一般为25-250nm。
在下面的实施例中列出了合适尺度的具体例子。
研究本发明的脂质颗粒时,会惊奇地发现,大而空的单层状微泡体(LUV)由 所捕获的治疗剂而转变成多层状微泡体。
虽然不想被任何具体的机制限制,但是, 可以认为该过程的发生如图1所示,图中带正电荷的脂质和带负电荷的治疗剂都 是假定的。
该过程从单层状微泡体10开始,该微泡体是由阳离子性脂质包容而成, 在其双层壁的内外表面上带有正电荷。
加入阴离子性治疗剂,如反义寡聚脱氧核 苷酸11,形成中间配合物12,在该配合物中,治疗剂分子11通过离子/静电作用 与LUV表面上的相反电荷结合。
接下来似乎是聚集步骤,LUV/治疗剂配合物形成聚合体13。
此聚集步骤非 常复杂,并且明显依赖于预形成的微泡体中去稳定剂(如乙醇)和修饰脂质的量, 以及带电荷的治疗剂的介导。
本领域提供了关于这些步骤的一些有限的知识,但 是这些知识既没有预测也没有解释这个现象(这个现象是本发明的基础)。
已知阳 离子性脂质体/DNA配合物具有各种不同的结构,包括聚集脂质体的簇,其在接 触区域有扁平的双层隔膜、DNA包裹的脂质体和(聚集的)多层结构,其中DNA 被夹在脂质双层中(Gustafsson等人,1995;Lasic,1997;Lasic等人,1997;Huebner 等人,1999;Xu等人,1999)。
后一种结构可以是双层或脂质体的扁平堆积,在 它们的外表面常常具有开放的双层片段。
观察在Ca2+与带负电荷的脂质体的结合 以后也看到类似的结构(Papahadjopoulos,1975;Miller和Dahl,1982;Rand等 人,1985;Kachar等人,1986)。
发生在这些系统中的这些结构性转变是由附着力 介导的过程如双层的破裂和融合引起的(Rand等人,1985;Kachar等人,1986; Huebner等人,1999)。
首先,脂质体通过DNA或Ca2+交联而聚集。
接触区域的 快速扩展使脂质体变形,以致它们互相压扁。
这使得双层的张力增加。
如果张力(附 着力)足够大,施加在脂质膜上的应力将通过融合(增加面积/体积比)和/或破裂(体 积减少)而解除。
当面积增加约3%时,大多数的双层发生破裂(Evans和Parsegian, 1983)。
双层破裂时,微泡体坍塌,互相压扁,形成多层的堆积。
膜去稳定剂如乙 醇可调节阳离子性脂质体与DNA或寡核苷酸相互作用时的结构重排。
在本发明的方法中,在乙醇存在下由单层状微泡体形成多层状脂质体这一过 程还涉及附着力介导的过程。
但是,因为由附着力介导得到的产物是同轴的双层 骨架,该过程在某些方面与和积终止的膜的络合有所不同。
虽然形成后一种结构 需要乙醇或可比的去稳定剂,但是并不清楚去稳定剂是如何影响这些结构的重排。
这种重排与膜对较小的分子的渗透性屏障和快速的脂质交换以及脂质后滚翻(这与 乙醇浓度有关)的丧失有关。
另外,LUV的修饰脂质的交换可能是脂质微泡体重 组的一个重要因素。
在所有事件中,聚合体13通过某种机制发生重排,形成带有 夹在微泡体层和微泡体内部之间的治疗剂多层微泡体14。
这种重排不仅依赖于所 形成的聚集体的本性,还依赖于培育聚集体的温度。
一些治疗剂在多层微泡体的 外部还维持着电荷的缔合,这可通过电荷中和反应去除(例如,对于可滴定的带电 荷的脂质,可使用酸或碱中和),或通过离子交换去除。
用实验方法发现,脂质微泡体和去稳定溶剂的几种特性对最终产物的特性起 重要作用,可选择这些特性来控制多层微泡体产物的特性。
这些特性包括: (1)带电荷的脂质与带相反电荷的治疗剂在预形成脂质微泡体中的包容; (2)其量足以有效延迟聚集但不足以阻止聚集的修饰脂质的包容,对于PEG- CerC14,这个量大约为2.5-10%; (3)其量足以有效使脂质微泡体去稳定化但不导致破裂的去稳定剂(如乙醇或 去污剂)在去稳定溶剂中的包容;和 (4)在不导致聚集和捕获步骤分开的温度下进行完全脂质包埋的治疗剂颗粒的 装配,通常这需要在室温(~20℃)或以上的温度范围进行,依赖于去稳定剂和脂质 组合物的浓度。
可使用常规的混合装置实施本发明方法。
但是,对于大规模生产,理想的是 使用同时申请的题为“制备脂质微泡体的方法和装置(Methods and Apparatus for Preparation of Lipid Vesicles)”的PCT申请(还没有系列号,2000年7月14日申请, Attorney Docket No.80472-6)中所述的特别改装的装置,本文完整纳入该文作为参 考。
下面将结合下面的非限制性实施例对本发明作进一步的描述。
                            实施例 下面的实施例中将要用到的材料: 用于本研究的硫代磷酸酯反义寡聚脱氧核苷酸和质粒DNA由Inex Pharmaceuticals(Burnaby,BC,Canada)提供。
该寡聚脱氧核苷酸的mRNA靶和序 列如下: 人c-myc:5′-TAACGTTGAGGGGCAT-3′  (Seq ID No.1); 人ICAM-1:5′-GCCCAAGCTGGCATCCGTCA-3′(SEQ ID No.2);和 FITC标记的人EGFR:5′-CCGTGGTCATGCTCC-3′(SEQ ID No.3)。
从Northern Lipids(Vancouver,BC,Canada)购得1,2-二硬脂酰基-sn-丙三醇-3- 磷酸胆碱(DSPC),从Avanti Polar Lipids(Alabaster,AL)购得1,2-二油基-3-二甲基 铵丙烷(DODAP)、1,2-二油基-丙三醇-3-磷酸丝氨酸-N-(7-硝基-2-1,3-苯并噁二唑-4- 基)(NBD-PS)、1,2-二油基-sn-病三醇-3-磷酸乙醇氨(DOPE)、1,2-二油基-sn-丙三醇 -3-磷酸乙醇胺-N-(利丝胺若丹明b磺酰基)(LRh-PE)以及1,2-二油基-sn-丙三醇-3- 磷酸乙醇胺-N-(7-硝基-2-1,3-苯并噁二唑-4-基)(NBD-PE)。
从Molecular Probes(Eugene,OR)获得1-十六烷酰基-2-(1-芘葵酰基-sn-丙三醇-3-胆碱磷酸(Py- HPC)和寡核苷酸结合染料OliGreen。
由INEX Pharmaceuticals(Burnaby,BC,Canada) 提供1-O-(2′-(ω-甲氧基聚乙二醇)琥珀酰基)-2-N-肉豆蔻酰基鞘氨酸(PEG-CerC14)、 放射性标记[3H]-PEG-CerC14以及1-O-(2′-(ω-甲氧基聚乙二醇)琥珀酰基)-2-N-十二 烷酰基鞘氨酸(PEG-CerC20)。
从Sigma(Oakville,ON,Canada)获得胆固醇(chol)、 n-辛基β-D-葡萄糖吡喃苷(OGP)、Triton X-100、钙黄绿素、二氯二甲基硅烷、硫 氢化钠(连二亚硫酸盐)、2-p-甲苯胺基萘-6-磺酸酯(TNS)和聚茴香脑磺酸(PASA)。
所有用于透射式电子显微镜的材料包括四氧化锇、柠檬酸铅、马来酸、卡可基酸 钠和包埋树脂Embed 812都购自Electron Microscopy Sciences(Fort Washington, PA),低熔点(L.M.P.)琼脂糖购自Life Technologies(Burlington,Ontario)。
从Sigma Chemical Company(St.Louis,Missouri,USA)购得胆固醇(CHOL)。
PEG-神经酰胺 由Inex Pharmaceuticals Corp.的Dr.Zhao使用PCT WO 96/40964中所述的方法合 成,本文纳入该文作为参考。
[3H]或[14C]-CHE购自NEN(Boston,Massachusetts, USA)。
所有脂质的纯度都大于99%。
乙醇(95%)、甲醇、氯仿、柠檬酸、HEPES 和NaCl都由市售得到。
分析方法:WO 98/51278中阐述了确定脂质治疗剂是否“包埋”如“完全包 埋”的实验,本文纳入该文作为参考。
这些方法包括S1核酸酶消化、血清核酸 酶和微球菌核酸酶分析。
采用Oligreen分析量化装入微泡体中的寡核苷酸的量。
使用BioluminTM 960 荧光板读数器(Molecular Dynamics,Sunnyvale,California,USA)建立确定水性溶 液中单链寡核苷酸的量的荧光染料结合试验。
简言之,在HEPES缓冲盐溶液 (HBS、20mM HEPES、145mMNaCl,pH7.5)中稀释等分量的包埋寡核苷酸。
将稀 释试样的10μL等分加到100μL以1∶200稀释的OligreenTM试剂中,做两组, 一组含有0.1%Triton X-100去污剂,另一组没有。
用含与不含0.1%TritonTM X-100 在存在或不存在0.1%Triton X-100情况下作寡核苷酸标准曲线,用于确定包埋寡 核苷酸的量。
分别使用485nm和520nm的激发和发射波长测量OligreenTM-反义 配合物的荧光度。
通过比较存在或不存在去污剂时的荧光测量结果确定表面结合 的反义(配合物)。
动态光散射:使用NICOMP 370颗粒筛分器(Nicomp Particle Sizing Inc.,Santa Barbara,California)通过动态光散射确定颗粒的尺度。
整篇申请中提供的是数均 尺度,得自试验相关函数的积累拟合。
多分散性表示为单峰Gaussian尺度分步的 半高度的半宽度。
使用Ubelohde型粘度计(Cannon 50)确定乙醇/柠檬酸缓冲液的 粘度。
23℃测得的乙醇/300mM柠檬酸缓冲液(40/60(v/v))的粘度相对于相同温度 的水为2.674mPa*s。
使用Coulter光散射仪(DELSA,Coulter Electronics Inc.,FL) 通过电泳光散射确定ζ势能。
脂质后滚翻:用连二亚硫酸钠通过化学还原作用将荧光脂质(NBD-PS)还原成 非荧光化合物而测定脂质后滚翻(McIntyre和Sleight,1991;Lentz等人,1997)。
通过在1摩尔%NBD-PS中挤出20mM脂质制备脂质体。
仅有位于外单层的NBD-PS 可接触到加到外部介质中的还原剂连二亚硫酸盐。
在外膜片上的NBD-PS被还原 之后可跟踪其从内单层到外单层的重分配。
在1M TRIS中新鲜配制1M连二亚硫 酸钠溶液。
加入摩尔量为NBD 100倍的过量的连二硫酸盐,培育10分钟,还原 外单层的NBD-PS。
通过测定还原前和还原后在465nm激发的520nm连二硫酸盐 荧光度,检测还原反应是否完成。
在Sephadex G50柱上进行尺度排阻色谱法去除 过量的连二硫酸盐。
在40%乙醇存在下培育脂质体,在不同的时间点取出相应于 最终浓度为150μM的脂质等分进行测量。
渗漏试验:在不同温度测量乙醇诱导的LUV的渗透化作用,并将其作为捕 获溶质的尺度(MW)的函数。
钙黄绿素用作渗漏的低分子量标记物,FITC-葡聚糖(分 子量为19500)用作高分子量的标记物。
在自猝灭浓度捕获的钙黄绿素的渗漏,通 过监测钙黄绿素荧光的去猝灭跟踪。
使脂质膜用含有75mM钙黄绿素和5mM HEPES、加入氢氧化钠将其pH调整为7.5的水性溶液进行水合作用,接着进行5 轮冷冻/解冻循环,通过2层100nm滤器(挤10次)挤出,从而制得LUV。
DSPC/chol/PEG-CerC14/DODAP挤出的温度为60℃。
在DEAE Sepharose CL6B柱 上通过阴离子交换层析使用等渗的HBS缓冲液交换未被捕获的钙黄绿素。
在含有 不同量的于25℃、40℃或60℃预平衡过的乙醇的HBS中稀释脂质体原液至脂质 浓度为3μM。
在相应温度培育5分钟之后,用Perking Elmer LS50 Fluorimeter(Perkin Elmer)测量520nm荧光度(激发波长488nm,430nm长程(long-pass)滤波器)。
加入 10%Triton X-100至产生0.05%的最终浓度,从而测得100%渗漏值(最大去猝 灭)。
根据渗漏%=(Fs-Fb)/(FTx-Fb)*100计算钙黄绿素渗漏,其中Fs是样品的荧光 度,Fb是对应于不含乙醇时含有钙黄绿素的脂质体的背景,FTx是Triton X-100的 荧光值。
FITC-葡聚糖(MW 19500)以最终浓度为45mg/ml被捕获在掺入了0.5摩尔% LRh-PE的DSPC/PEG-CerC14/DODAP脂质体中。
将溶解在乙醇中的脂质加到FITC- 葡聚糖的HBS溶液中,接着挤出(2层100nm滤器,2次),接着透析去除乙醇, 从而实现包埋作用。
采用尺度排阻色谱法在Sepharose CL4B柱(1.5×15cm)上去除 未被捕获的FITC-葡聚糖。
在采用尺度排阻色谱法在Sepharose CL4B柱(1.5×15cm) 上去除释放的FITC-葡聚糖后,测定暴露于40%乙醇中的脂质体的FITC-葡聚糖 的损失。
测定加入乙醇前后的FITC/LRh-PE比。
分别测量在485nm激发的515nm FITC荧光度和在560nm激发的590nm LRh-PE荧光度。
脂质混合:在将探针稀释到未标记的靶膜中时,通过发生在非常靠近的供体 NBD-PE和受体LRh-PE之间的共振能转移的损失来跟踪乙醇诱导的脂质混合/交 换(Struck等人,1981)。
LUV含有都为0.75摩尔%的NBD-PE和LRh-PE。
通过 在20mM的脂质浓度挤出,在pH为7.5的HBS中制备标记的和未标记的脂质体。
在标记和未标记的脂质体中加入乙醇,使乙醇最终浓度为40%(v/v)。
接着,以摩 尔脂质比为1∶5的比例混合标记的和未标记的脂质体的乙醇分散体系,并在合适 的温度培育。
在给定的时间点取出等分试样,将其加到2ml HBS中,获得150μ M的最终脂质浓度。
将激发波长设在465nm(430nm发射长程滤波器),在505-650nm 区域中测量NBD和LRh的发射光谱。
减去背景后(脂质为150μM的未标记脂质 体),共振能的损失以NBD/LRh比的增加表示。
芘-HPC试验:芘-HPC在高浓度形成激发体,该二聚体与单体相比在不同波 长发出荧光。
激发体的形成是一个扩散控制的过程,需要两个分子走到一起形成 二聚体。
脂质混合(靶膜)以及膜中芘-HPC的横向流动性下降导致了芘激发体荧度 光的减少(Hoekstra,1990;Duportail和Lianos,1996)。
横向相分离通常导致芘激 发体荧光度增加(Duportail和Lianos,1996)。
这个实验的合理性在于它着眼于寡 核苷酸结合到脂质体膜上的效果。
将捕获寡核苷酸的脂质体的芘-HPC荧光度在去 除跨膜pH值梯度之前和之后与空的(empty)对照脂质体比较。
膜内部pH增加到7.5 导致膜结合寡核苷酸的释放。
通过将溶解在乙醇中的脂质加到pH值为4的柠檬 酸盐缓冲液中制备掺杂了芘-HPC、浓度为7摩尔%的脂质体。
取出一等分试样, 并如上述捕获寡核苷酸。
在接下来的所有步骤中,以同样的方式处理剩余的起始 脂质体(参见under entrapment)。
用醋酸铵将pH值调到7.5,去除pH值梯度。
在 适当的缓冲液(pH为7.5的HBS或pH为7.5的150mM醋酸铵)中稀释脂质体至2 μM的最终浓度。
使用在345nm激发和350nm的发射截留滤波器记录365-550nm 波长区域中的芘-HPC发射光谱。
以397nm的单体荧光度对478nm的二聚体荧光 度的强度比对起始脂质体以及对去除pH值梯度之前和之后的含有寡核苷酸的脂 质体作图。
31P NMR光谱学:使用在81MHz运行的Bruker MSL200光谱仪获得31P NMR 光谱。
使用具有3秒脉冲间延迟和在10mm探针中的2.0ml样品上光谱宽度为 20000Hz的2.8μs50°脉冲收集对应于800或2400扫描的自由感应衰变(FID)。
没有使用质子去偶(proton decoupling)。
在Fourier变换之前,对FID使用对应于25Hz 的指数倍增的谱线增宽。
化学位移以外部85%磷酸(H3PO4)为参照。
pH7.5的游离 和包埋的寡核苷酸的自旋-晶格驰豫时间(T1)基本上分别为T1free=1.7秒和T1enc.= 2.1秒。
通过转化-恢复脉冲顺序测得T1值。
50°脉冲的3秒脉冲间延迟考虑到所 有反义共振的全部驰豫。
超离心法:使用各步体积分别为3.5、3.5、2.5和1.5ml、pH值为7.5的1%、 2.5%、10%和15%(w/v)的蔗糖分步梯度的HBS溶液进行超离心,分级离心捕获 或未捕获寡核苷酸的脂质体。
使用配有SW41Ti旋转器的Beckmann L8-70超离心 机36000rpm(RCFRmax221000xg)离心样品2小时。
梯度或从顶部分级,或用注射 器刺穿试管,抽出各单独的条带。
低温透射式电子显微术(cryo-TEM):将一滴样品加在带有多孔碳质膜的(grid with)的标准电子显微镜栅格上。
用滤器吸掉过量的液体,留下薄薄的一层水覆盖 在碳质膜的孔上。
在液态乙烷中快速冷却栅格,产生包埋在无定形冰的薄膜中的 微泡体。
使用Philips CM200 FEG电子显微镜中的Gatan低温固定器(cryo-holder), 以66000倍的放大倍数和-1.5微米的散焦测定低温条件下冰中的微泡体的影像。
冷冻-破裂电子显微术:将样品投入被液氮冷冻的液态Freon22中,使其低温 下固定在25%甘油中。
使用Balzers Freeze-Etching系统BAF 400D(Bazlers, Liechtenstein)用铂单向(45°)遮蔽和用碳涂覆(90°)破裂的表面。
使用JEOL的JEM 1200 EX型电子显微镜(Soquelec,Montreal,QC,Canada)分析复制品。
透射式电子显微术(TEM):将1体积的2%四氧化锇加到0.5体积的微泡体的 HBS中,接着在4℃以17000xg离心45分钟,从而固定微泡体。
将所得颗粒与等 体积的3%琼脂糖/PBS混合,用移液管移到显微镜载玻片上,并使其冷却至4℃。
将含有微泡体的凝固的琼脂糖切成1mm的片状物,然后将该片状物转移至试管 中,以进行进一步的操作。
用pH5.2的0.05M马来酸洗涤该切片(block)3次,每 次5分钟,然后用2%乙酸双氧铀染色1小时。
用等级系列酒精(50-100%)将该组 织切片脱水,渗入比例逐渐增加的环氧树脂(Embed 812):氧化丙烯中,60℃在 Embed 812中包埋24小时。
超薄切片用2%柠檬酸铅染色,用Zeiss EM 10C透射 式电子显微镜(Oberkochen,Germany)检测。
相衬和荧光显微术:使用Plan Apochromat 63x/1.4NA油浸物镜配同1.6x奥普 托瓦透镜和XF 100滤光器装置(Omega Optical,Brattleboro,Vermont),使用475 ±20/二色性500/发射535±22.5的光学规范在Zeiss Axiovert 100显微镜上进行相 衬和荧光显微术。
使用Zeiss MC80 DX显微照相机在Kodak Ektachrome P1600彩 色反转胶片上记录影像。
用二氯二甲基硅烷硅化玻片和盖玻片,以中和可能带负 电的玻璃表面。
                         实施例1 从含有摩尔比为5∶25∶25∶45的PEG-CerC14、DODAP、DPSC和CHOL 的脂质混合物中制备空载微泡体。
将上述四种脂质溶解在100%乙醇中,使总脂 质浓度为25mg/ml(33mM)。
然后通过口径为0.25mm的注射器将该乙醇性脂质注 入含有300mM的pH4.0的柠檬酸缓冲液的容器中。
该容器和溶液处于室温中。
乙醇性脂质的总体积是6升,脂质注入的速度是200-300ml/分钟。
柠檬酸缓冲液 的总体积是9升。
所得到的15升混合物中乙醇的浓度为40%,柠檬酸缓冲液为 180mM。
产生直径中值为170±20nm的微泡体。
使用2层80nm膜在低压(100p.s.i., 以传统的500-1000p.s.i减少)下进行1-3次挤出循环(65℃),产生直径中值为90- 120nm的空载微泡体。
然后将空载微泡体汇集在容器20中,维持在40℃,直到 加入治疗剂溶液。
                         实施例2 使用实施例1的预形成的微泡体制备治疗剂为寡核苷酸INX-6295(Seq.ID No.1) 的完全脂质包埋的治疗剂颗粒。
在寡核苷酸INX-6295的蒸馏水溶液中加入100% 乙醇,稀释成不同的10、20、30、40或50mg/ml寡核苷酸在40%乙醇中的溶液。
在40℃时,在轻轻混合下将该乙醇性寡核苷酸于加到容器20的预形成的微泡体 中。
以最终药物:脂质重量比为0.1-0.25的量和体积加入乙醇性寡核苷酸。
然后 40℃培育该混合物,轻轻地和周期性地混合1小时。
培育结束后,渗滤该溶液, 以去除游离的或过量的结合寡核苷酸,去除乙醇,用pH7.4的磷酸缓冲盐溶液(PBS) 替换原缓冲液体系。
浓缩、无菌过滤和包装,完成商业产品的制备。
                         实施例3 重复实施例2的过程,不同的是,改变不同的参数,以确定哪个参数对制备 本发明完全脂质包埋的治疗剂颗粒起关键作用。
在这些实验中,以总寡核苷酸回 收(产率)、总脂质回收(产率)和包埋效率作为所得产物和本方法的质量指标。
使用 下式计算总寡核苷酸回收: 〔最终寡核苷酸浓度(mg/ml)×最终体积(ml)〕/〔起始寡核苷酸浓缩(mg/ml) ×起始体积(ml)〕×100%; 使用下式计算总脂质回收: 〔最终最终浓度(mg/ml)×最终体积(ml)〕/〔起始最终浓度(mg/ml)×起始体 积(ml)〕×100%; 使用下式计算包埋效率(E.E.): (起始寡核苷酸(mg/ml)/起始脂质(mg/ml)〕/〔最终寡核苷酸(mg/ml)/最终脂 质(mg/ml)〕×100%。
使用上述OliGreen试验确定被包埋(即掺入双层或被捕获到脂质颗粒的内部)的寡 核苷酸的百分比。
为了评估起始药物/脂质比的重要性,以两种不同的起始比例进行实验。
其结 果归纳在表1中。
在包埋寡核苷酸的过程中没有观察到微泡体尺度的变化。
                                         表1
 起始药物/
 脂质比
 寡核苷酸
 产率%
 脂质产率
 %
包埋的寡
核苷酸%
 微泡体尺
 度(nm)
 最终的药
 物/脂质比
 E.E.%

 0.1
 80-90
 7080
≥90
 106
 0.1
 100
 0.2
 60-78
 70-75
≥80
 119
 0.17-0.2
 85-100
为了评估培育温度的重要性,实验在室温和两种升高温度的条件下进行1小 时。
其结果归纳在表2中。
如表2所示,60℃的高温开始降低该方法的效率,并 导致颗粒尺度增加。
因此,优选较低温度。
                                表2
 培育温度(℃)
 寡核苷酸产率%
 包埋的寡核苷酸%
 微泡体尺度(nm)
 RT(20-22)
 73
 90
 114
 40
 84
 91
 109
 60
 52
 83
 140
为了评估培育时间的重要性,在40℃的培育温度下培育3段不同的时间。
所 得结果归纳在表3中。
如表3所示,0.5-1小时的培育时间增加了产率,但是,培 育时间超过1小时产率并没有大量地增加。
因此,在所使用的装置中的最有效的 方法是使用约1小时的培育时间。
                           表3
 培育时间(小时)
 寡核苷酸产率%
 包埋的寡核苷酸%
 0.5
 22
 92
 1
 60
 94
 2
 56
 95
为了评估寡核苷酸溶液中缓冲液的浓度的重要性,实验以0.1的起始药物/脂 质比在4种不同浓度的柠檬酸缓冲液中进行。
所得结果归纳在表4中。
                                   表4
 柠檬酸缓冲液浓度(mM)

 寡核苷酸产率%

 包埋的寡核苷酸%

 微泡体尺度
 (nm)
 50
 100
 94
 80
 100
 88
 90
 90
 200
 89
 91
 93
 300
 80-90
 92
 106
为了评估混合步骤期间起始乙醇浓度的重要性,对于两种起始药物/脂质比, 各使用3种不同的起始乙醇浓度进行。
所得结果列在表5中。
表中显示,各起始 寡核苷酸/脂质比有不同的最优选乙醇浓度。
在另一表中没有记录的实验中,对于 0.1的寡核苷酸/脂质比,使用起始浓度为50%的乙醇。
在这个实验中遇到了未知 起因的重要问题,并且没有获得产物。
                                       表5
  起始
 EiOH%
起始药物/
  脂质
寡核苷酸
 产率%
 包埋的寡
 核苷酸%
微泡体尺
 度(nm)
 最终的药
 物/脂质
    E.E.
    %
 33
 0.2
 42-47
 88
 115
 0.12
 60
 40
 0.2
 70
 82
 114
 0.15
 75
 43
 0.2
 64
 62
 105
 0.19
 95
 36
 0.1
 52-66
 85-89
 110
未测
未测
 43
 0.1
 90-100
 84-89
 116
未测
未测
 45
 0.1
 90-100
 90-92
 108
未测
未测
为了评估起始寡核苷酸浓度(以及因此为了获得相同的起始药物/脂质比的治 疗剂溶液的体积)的重要性,使用4种不同浓度的寡核苷酸原液。
所得结果列在表 6中。
如表6所示,这个参数没有显示出对采用本发明方法所得的结果的重要性。
                                            表6
 寡核苷酸原液
 mg/ml
 起始药物/脂质

 寡核苷酸产率
 %
 包埋的寡核苷酸
 %
 微泡体尺度
 (nm)
 10
 0.1
 85
 90
 106
 20
 0.1
 80
 88
 112
 30
 0.1
 87
 90
 110
 40-50
 0.1
 80-90
 88-94
 106
                           实施例4 为了证明本发明适用于较大的治疗剂,将质粒pINEX L1018,一个连接在CMV 启动子上、还带有SV 40增强子元件和AmpL基因的编码荧光素酶基因的5.5kb 质粒装入预形成脂质微泡体中。
通过将溶解在100%乙醇中的10mg脂质(20/45/25/10摩尔%的 DSPC/Chol/DODAP/PEG-CerC14)缓慢加到25mM柠檬酸缓冲液(25mM柠檬酸, 225mM蔗糖,用氢氧化钠将pH调到4)中制备预形成的微泡体。
混合前将两种溶 液预热至40℃。
乙醇的最终浓度是40%(v/v)。
室温将脂质微泡体的乙醇分散体系 挤过2层100nm厚的聚碳酸酯滤器2次。
室温下将40%乙醇中的0.25mg质粒DNA 加入脂质微泡体中,然后40℃培育该样品1小时。
起始质粒/脂质比为0.025。
随 后,用2升pH7.5、25mM的盐水(20mM HEPES,150mM NaCl)透析样品,总时 间为18-20小时。
在DEAE Sepharose CL6B柱上进行阴离子交换层析去除外部的质粒DNA后 测定捕获效率。
在通过Bilgh Dyer抽提将质粒分离后,根据Fiske和Subbarrow的 无机磷试验,使用DNA Binding System PicoGreen脂质确定质粒DNA的量。
另外, 通过在脂质微泡体中掺入0.25摩尔%荧光标记的脂质丽丝胺若丹明-PE确定最终 脂质浓度。
最终的质粒脂质比是0.022,这对应于88%的捕获。
所得的脂质包埋的治疗 剂颗粒的平均尺度为100nm,且尺度分布(的变化)非常小。
                         实施例5 脂质体制备:通过将乙醇加到挤出的脂质体中,或者将溶解在乙醇中的脂质 体加到水性缓冲液中接着挤出制备大的单层脂质体的乙醇/缓冲液溶液。
两种方法 的捕获结果相同,下面将做更详细的描述: 1.在柠檬酸盐缓冲液中(pH4)水合脂质膜,然后进行5轮冷冻/解冻循环,之 后,通过将该溶液挤过2层100nm厚的滤器(10次),产生LUV。
DODAP/DSPC/Chol/PEG-CerC14脂质体的挤出温度为60℃。
接着在快速混合的条 件下慢慢加入乙醇。
去除乙醇后,通过动态光散射确定DODAP/DSPC/Chol/PEG- CerC14系统中典型脂质体的尺度为90±20nm。
慢慢加入乙醇并快速混合是重要 的,因为一旦乙醇浓度超过某一上限,脂质体将变成不稳定和聚结成大的脂质结 构。
后者依赖于脂质的组成。
例如,如果乙醇的浓度超过50%(v/v),原来半透明 的DSPC/Chol/PEG-CerC14/DODAP脂质体分散体系将变成乳白色。
2.通过室温将溶解在乙醇(0.4ml)中的脂质慢慢加到pH4的柠檬酸缓冲液 (0.6ml)中,接着将其挤过2层100nm厚的滤器(2次)制备LUV。
在乙醇中及透析 去除乙醇后进行动态光散射测量,没有发现尺度有显著的改变,该尺度是典型的 75±18nm。
如果乙醇是在剧烈的混合下非常缓慢地加入(以避免局部的高乙醇浓 度),则挤出步骤可以省略。
包埋过程:将寡核苷酸溶液缓慢加到旋转的乙醇脂质体分散体系中,之后在 适当的温度培育所得的溶液1小时,用柠檬酸盐透析2小时,去除大部分乙醇, 再用HBS(20mM HEPES/145mM NaCl,pH7.5)透析2次。
pH值为7.5时,DODAP 变为电中性,结合于外膜表面的寡核苷酸从与其结合的阳离子脂质中释放出来。
接着在经pH7.5的HBS平衡过的DEAE-sepharoxe CL-6B柱上进行阴离子交换层 析,去除未包埋的寡核苷酸。
当使用辛基葡糖苷替换乙醇时,去污剂以30-40mM 的最终浓度加到脂质体中(1∶1 v/v)。
接下来的所有步骤如上述进行,除了延长原 来的柠檬酸盐缓冲液(pH4)的透析时间至5小时。
在下述实施例中,如果不另外提 及,使用DSPC/Chol/PEG-CerC14/DODAP脂质体(20∶45∶10∶25摩尔%)、c- myc(Seq.ID No.1)、40%(v/v)乙醇、300mM柠檬酸缓冲液,培育温度为40℃。
捕获效率的确定:在采用阴离子交换层析去除外部寡核苷酸后确定捕获效 率。
在Shimadzu UV160U分光光度计通过UV光谱学确定寡核苷酸浓度。
将在氯 仿/甲醇中的样品溶液溶解在体积比为1∶2.1∶1的氯仿/甲醇/水相(样品/HBS)中 后,测量260nm吸收值。
如果混合后溶液不彻底清澈,则加入50-100μl的甲醇。
或者,在样品溶解在100mM的辛基葡糖苷中后读取吸收值。
根据c(μg/μl〕= A260*1 OD260单位〔μg/ml〕*稀释因子〔ml/μl〕计算反义分子浓度,其中,稀释 因子为总实验体积〔ml〕/样品体积〔μl〕。
从成对的消光系数计算单个脱氧核 苷酸的OD260单位,这考虑到了最接近的邻近相互作用。
1 OD对应于30.97μg/ml c-myc(Seq.ID No.1)、33.37μg/ml h-ICAM-1(Seq.ID No.2)和34μg/ml EGFR(Seq.ID No.3)。
在进行Bligh和Dyer抽提(Bligh和Dyer,1959)从寡核苷酸中分离出脂质 后,用无机磷实验确定脂质浓度。
简言之,将525μl甲醇和250μl氯仿加到250 μl水相(样品/HBS)中,以形成澄清的单相(水相/甲醇/氯仿的体积比为1∶2.1∶1)。
如果所得溶液不澄清,加入少量的甲醇。
接着,加入250μl HBS和等体积的氯仿。
混合样品,3000rpm离心5-10分钟。
这样得到澄清的两相系统。
根据Fiske和 Subbarrow(1925)的方法检测氯仿相的磷脂含量。
如果没有另外提及,捕获效率以 寡核苷酸/脂质的重量比〔w/w〕表示。
                         实施例6 接着实施例5的步骤,将增加量的乙醇加到通过挤出制得的100nm DSPC/Chol/DODAP脂质体中(没有修饰脂质组分)。
加入寡核苷酸之后,所有的样 品立即变成乳白色,表明寡核苷酸诱导了聚集。
以ODN/脂质摩尔比为0.035、pH 值为4与反义寡核苷酸进行培育以后,去除乙醇和未被捕获的寡核苷酸。
表7列 出了由动态光散射测定的包埋效率,以及所得到的多层微泡体的最终尺度。
随着 乙醇浓度的增加,更多的反义寡核苷酸被捕获。
尺度和多分散性的相伴增加反映 了LUV逐渐重组成较大的脂质结构,标明大的多层脂质体呈现优势。
应注意的 是,由于这些系统的尺度,在用来去除外部未被捕获的寡核苷酸的阴离子交换柱 上损失了这样的一些脂质。
洗出的部分大约占50-60%的总脂质。
乙醇的浓度为40 %和更高时,初始的脂质体变为不稳定和融合成乳白色的分散体系。
                          表7
 %EtOH〔v/v〕
 %包埋
平均尺度〔nm〕
 0
 4.4
 148±56
 20
 20.5
 226±104
 30
 32.5
 470±224
 挤出后
 (没有反义寡核苷酸)
 99±22
这些结果证明,乙醇使脂质膜易于发生结构重排,其结果导致寡核苷酸在大 的多层脂质体的同心薄层中被捕获。
但是,不能容易地控制所得到的脂质体的尺 度。
                         实施例7 制备含有2.5-10摩尔%的修饰脂质(PEG-Cer)的脂质体,使用实施例5和6 的方案进行实验。
在各例子中,提高DPSC水平来补充PEG-Cer减少的浓度。
已 发现,在脂质体中掺入修饰脂质使得含有反义分子的(antisense-containing)脂质体 的尺度可被调节。
在高乙醇浓度中,脂质体在含有PEG-Cer的情况下比在不含有 PEG-Cer的情况下更稳定。
其分散体在40%乙醇中维持光学半透明,虽然在含有 2.5摩尔%的PEG-Cer的样品的情况中看到了浊度的轻微增加。
稳定性的增加还 反映为发生捕获需要较大量的乙醇(表8,图2)。
图2描述了含有10摩尔%PEG- Cer的脂质体的包埋效率作为乙醇浓度的函数图。
最大捕获在40%的乙醇获得, 发生捕获需要乙醇浓度超过25%(v/v,>4.3M)。
在不含乙醇的情况下没有发现捕 获。
表8列出了在由图2所确定的最小和最大乙醇浓度下作为PEG-Cer含量(2.5- 10摩尔%)的函数的捕获效率和通过动态光散射测得的尺度。
起始挤出的脂质体 的尺度列在括号内。
发生捕获所需的乙醇量依赖于脂质体的PEG-Cer含量。
含有 2.5摩尔%PEG-Cer的脂质体在25%乙醇中大约捕获15%的寡核苷酸,而在40% 乙醇中捕获45%。
相反,含有10摩尔%PEG-Cer的脂质体在25%乙醇中实际上 没有捕获(≤5%),而在40%乙醇中捕获60%。
在所有的情况中,起始寡核苷酸/ 脂质比是0.037(摩尔/摩尔)。
当PEG-Cer含量从2.5摩尔%增加到10摩尔%时, 在40%乙醇中的捕获水平从45%增加到60%。
脂质体尺度和多分散性从131± 40nm减小到100±26nm。
                            表8
PEG-Cer14〔摩尔%〕
 %包埋
 平均尺度〔nm〕
25%乙醇
2.5
 14.1
 125±35(108±26)
10
 5
 92±18(93±18)
40%乙醇
2.5
 45.7
 131±40(108±26)
5
 50.9
 126±36(107±22)
10
 56.5
 100±26(93±18)
                         实施例8 已大体研究了在低乙醇浓度(<15%)下与下列因素的变化相关的乙醇对脂质膜 的干扰作用:脂质水合作用、酰基链的顺序、膜对小离子的渗透性和在DPPC系 统中链交错的诱导(Slater和Huang,1988;Barchfeld和Deamer,1988;Schichtenhovel 等人,1992;Slater等人,1993;Barry和Gawrisch,1994;Vierl等人,1994;Lobbecke 和Ceve,1995;Komatsu和Okada,1996;Holye和Gawrisch,1997)。
质问脂质 体在发生捕获所需要的高乙醇浓度下是否依旧完整是合乎逻辑的。
图3A描述了 在DSPC/Chol/PEG-CerC14/DODAP脂质体中于自猝灭浓度被捕获的钙黄绿素的释 放作为乙醇浓度(黑圈)的函数和得自脂质组成相同的脂质体的包埋效率(白圈)的函 数图。
包埋和渗漏实验都在40℃进行。
钙黄绿素(一种MW为623的小分子)在 ≥30%的乙醇中开始渗漏出,在40%左右的乙醇中渗漏%达到最大。
寡核苷酸捕 获显示类似的乙醇依赖性,这表明捕获与脂质体膜渗透性屏障的去稳定作用高度 相关。
与钙黄绿素不同,FITC-葡聚糖(MW 19500)在40%乙醇中的释放少于10%。
这表明渗透性屏障的丧失是分子量依赖性的,这也与已报道的去污剂如辛基葡糖 苷一样(Almog等人,1990)。
脂质体在40%乙醇中维持它们的形态。
40%乙醇中 的大脂质体的相衬显微术也揭示了完整的脂质体结构。
脂质还能在脂质体之间和在构成脂质体的脂质双层的单层的内部和外部之间 快速交换。
如图3B所示,由NBD-PE/LRh-PE FRET实验检测到的脂质混合在40 %乙醇中是有效快速的。
没有观察到微泡体尺度增加,这表明脂质混合发生在脂 质体之间的快速脂质交换而非脂质体融合。
图3B显示的结果还证明,脂质还能 快速地从脂质体的脂质双层的一边迁移(后滚翻)到另一边,正如在用连二亚硫酸 钠进行化学还原位于外脂质单层上的NBD-PS的荧光损失所表明的。
                         实施例9 包埋时浊度的增加表明初始的聚集步骤(微聚集体的形成)在捕获之前发生。
在低温,聚集步骤和捕获可以分开。
样品在加入时或在刚加入寡核苷酸之后变成 混浊,且其浊度随着时间增加。
没有乙醇时,浊度仅增加少量,透光度保持为常 数。
与在40℃制备的样品不同,当去除于4℃培育的样品中的乙醇时,样品又便 成半透明,脂质体没有捕获寡核苷酸。
将捕获效率作为温度的函数以及钙黄绿素 渗漏数据作图于图4中。
渗漏数据表示为诱导50%钙黄绿素释放所需的乙醇浓度。
同样,在脂质体膜的去稳定化和包埋效率之间有定性的关系。
                         实施例10 可使用31P NMR检测寡核苷酸捕获。
图5A和5B显示在溶液中的c-myc(图 5A)和捕获在DODAP/DSPC/Chol/PEG-CerC14脂质体(图5B)中的31P NMR光谱。
最初,脂质体具有跨膜pH梯度,其内部pH是4,外部pH是7.5。
在这样的条件 下,被捕获的寡核苷酸与带正电荷的脂质体膜紧紧地结合。
这种固定作用化导致 NMR信号消失(增宽消失)(图5B)。
在加入醋酸铵去除这个pH梯度并调节外部pH 到7.5后,DODAP被去除质子,寡核苷酸从脂质体膜上解离。
这通过图5C中的 NMR信号的恢复得到证明。
但是,恢复是不完全的,约获得起始信号的50%。
信号衰减不是因为NMR共振饱和的缘故。
可能的原因有二:包埋的反义分子的 量超出了其溶解度,因此有部分沉淀;或者反义分子的流动性部分受到限制,如 被固定在两层接近的并列双层之间(参见图3A)。
为了证实寡核苷酸确实被包埋, 并且位于脂质体的水相内部,将5mM MnSO4加到外部溶液中(图5D)。
Mn2+是一 种不能渗透膜的顺磁线扩张剂,它将熄灭所有可接触到的磷酸盐基团、磷脂以及 寡核苷酸的信号。
但是,寡核苷酸信号保持不受影响,并且仅在用OGP溶解脂质 体之后才消失(图5E)。
当在没有Mn2+的条件下用OGP溶解(图5F)起始脂质体(图 5B)时,全部寡核苷酸信号恢复。
这些数据清楚地证明,寡核苷酸被捕获在脂质体 中,而不是简单地与外膜结合。
还应注意的是,被捕获的寡核苷酸不受寡核苷酸 结合染料OliGreen的作用。
NMR研究从寡核苷酸角度描述了寡核苷酸与脂质体之间的相互作用。
可使 用芘标记的脂质探测脂质动力学和膜组织的变化(Duportail和Lianos,1996)。
高 浓度的芘标记脂质形成激发体,与单体相比在不同的波长发荧光。
激发体的形成 的是个扩散控制的过程,需要两个分子走到一起形成二聚体。
相对于不含寡核苷 酸的对照脂质体,所有结合了寡核苷酸的脂类的横向流动性急剧减少。
膜在横向 上被压缩。
接着还可观察到芘-HPC激发体荧光度的减少。
跨膜pH梯度的去除导 致了激发体荧光度的增加和脂质流动性的恢复。
                         实施例11 捕获反义分子的脂质体的尺度以及捕获效率都依赖于初始的反义分子/脂质 比。
图6显示在高反义分子/脂质比中寡核苷酸能被有效地捕获。
将捕获效率作为 初始寡核苷酸/脂质比的函数作图。
最大捕获时的结合水平是每毫克脂质0.16mg 寡核苷酸(0.024摩尔/摩尔)。
这相应于每100nm脂质体含有约2250个寡核苷酸 分子,并证明了这个捕获方法的高效。
捕获效率约比被动包埋高3个数量级。
在增加寡核苷酸/脂质比后,样品的尺度以及多分散性稍微从70±10nm(对于 独自的脂质体)增加到110±30nm(对于初始ODN/脂质重量比是0.2的脂质体)。
冷 冻-破裂电子显微术显示随着初始寡核苷酸/脂质比的增加,较大脂质体的数量也 增加。
撇开别的不谈,还应注意的是起来半透明的脂质体分散体系的浊度随着反 义分子/脂质比的增加而增加。
                         实施例12 所期待的是,通过TEM观察多层结构能观察到PEG包覆能抑制紧密相对的 膜的形成。
因此,通过使用放射性标记的PEG-CerC14检测PEG-Cer的命运。
反义 寡核苷酸被包埋在除了含有10摩尔%未标记的PEG-CerC14和作为胆固醇标记物 的[14C]-胆固醇十六烷基醚(CHE)以外还含有痕量[3H]-PEG-CerC14的脂质体中,其 中[3H]/[14C]比为5.9。
这个比值代表了表观PEG-Cer/chol比,并将用其替换PEG- Cer/chol摩尔比。
初始的反义分子/脂质重量比是0.29。
捕获产生的最终反义分子/ 脂质比是0.16。
使用蔗糖梯度〔1%、2.5%、10%、15%(w/v)蔗糖在HBS中的溶 液)通过超离心分离游离的PEG-Cer和PEG胶束。
在2.5-10%蔗糖界面上的空的 脂质体条带的表观PEG-Cer/chol比为5.5。
此条带约占总脂质的80%。
含有反义 分子的脂质体在相同的位置显示出模糊的条带,这相应于少于9%的总脂质。
但 是,大多数脂质体反义分子向下迁移到15%蔗糖层或底部的颗粒。
在表9中列出 了该梯度的含有脂质体的格级段的完全分析。
其结果对于在高寡核苷酸/脂质比下 制得的样品具有代表性。
可以看出,相对PEG-Cer/chol比朝着梯度的底部逐渐下 降。
相对于初始脂质体(表观PEG-Cer/chol比为5.5),超过50%的PEG-Cer从底 部级段中消失。
DSPC/Chol比没有改变。
在顶部级段中可以发现27%的PEG-Cer 和6.6%的胆固醇。
在空的对照脂质体中发现其量大约相同的非脂质体结合的 PEG-Cer。
对上述梯度的各级段作进一步的分析还显示,含有反义分子的脂质体的反义 分子含量和尺度还有很大不同(表9)。
寡核苷酸/脂质比和平均尺度从顶部到底部 增加。
可确定3个主要的类别为不同的条带(表10)。
它们的相对比值依赖于初始 的寡核苷酸/脂质比(表10)。
首先,第一类为以低ODN/脂质比(0.03-0.05)捕获了反 义分子的脂质体;第二,ODN/脂质比是0.14-0.15的脂质体;最后,具有非常高 的ODN/脂质比(0.29mg/mg)的脂质体。
随着初始ODN/脂质比的下降最后一类减 少而有利于前两类。
第三类脂质体是光学混浊的,而其他两类则是半透明的。
曾 试图将所观察到的捕获量和尺度的差异和通过低温-TEM看到的形态异质性联系 起来。
反义分子在高的初始寡核苷酸/脂质比(0.28mg/mg)被捕获,在通过透析去除 蔗糖后,表10中所列的两个主要级段15和17通过低温TEM观察。
上部级段完 全由双层脂质体构成,许多具有球状结构,而底部级段则是双层和多层脂质体的 混合物。
                                        表9
 级段

    %
 PEG-Cer
  %
 Chol
  %
 DSPC
Chol/DSPC
[摩尔/摩尔]
PEG-Cer/chol
比[r.u.]
 尺度
 [nm]
 b.u.
 -
 -
 -
2.2
 5.9
 86±24
 1-10
 26.8
 6.6
 -
-
 -
  -
 11
 13.7
 9.2
 -
-
 8.6
 89±21
 12
 4.3
 3.9
 -
-
 6.4
 -
 13
 3.6
 4.1
 -
-
 5.0
 -
 14
 8.9
 11.4
 -
-
 4.5
 83±21
 15
 27.1
 36.6
 37.6
2.2
 4.2
 70±15
 16
 8.5
 12.8
 -
-
 3.8
 75±16
 17
 7.1
 15.4
 15.5
2.2
 2.6
 129±39
                                   表10
高初始ODN/脂质比
低初始ODN/脂质比
片段
 %脂质
 %ODN
 ODN/脂质
%脂质
%ODN
 ODN/脂质
b.u.
 -
 -
 0.156
 -
 -
 0.1
11
 9.2
 1.9
 0.030
 15.7
 6.7
 0.036
12
 3.9
 3.1
 0.117
 14.8
 8.9
 0.050
13
 4.1
 3.9
 0.140
 3.8
 3.4
 0.09
14
 11.4
 10.5
 0.140
 8.1
 11.2
 0.14
15
 36.6
 36.2
 0.148
 31.5
 45.9
 0.146
16
 12.8
 14.4
 0.168
 9.7
 15.4
 0.16
17
 15.4
 30.1
 0.29
 5.3
 8.5
 0.162
                         实施例13 在乙醇的存在下,将寡核苷酸加到阳离子性脂质体中可形成结构域。
必须在 脂质体粘附之后才能形成可见的多层脂质体。
但是,当不存在乙醇时,10摩尔% PEG-Cer完全抑制了粘附作用。
在乙醇的存在下,有两种因素影响对脂质体的粘 附:其一,不掺入膜的PEG-Cer的量通过快速的脂质交换而增加;其二,不含 PEG-Cer但富含反义寡核苷酸的结构域的形成。
已研究了后者的可能性。
使用巨 大的DSPC/Chol/DODAP/PEG-CerC14脂质体与FITC标记的寡核苷酸,通过相衬 和荧光显微术可看到寡核苷酸结合的效果。
所观察到的脂质体大多数是多层的, 并且具有内部结构。
不含乙醇时,巨大的脂质体在加入反义分子时分解成无规则 的形状的聚集体和较小的脂质体。
绿色的FITC的荧光揭示了寡核苷酸的位置。
存在40%乙醇时得到的是一幅完全不同的图像。
在加入寡核苷酸5-10分钟后, 原来是圆形的脂质体变成了梨形,而寡核苷酸则位于这些结构的一边的半圆中。
内膜从这个马蹄形中被挤出,分开和破裂(尤其是在增高温度后)成紧密的稍微不 规则的结构,该结构的荧光完全是绿色。
寡核苷酸的分离作用表明,乙醇能刺激 结构域的形成。
                         实施例14 本发明的包埋方法并不依赖于具体的寡核苷酸和脂质组合物,也不限制于所 使用的高柠檬酸盐浓度。
在50mM的柠檬酸缓冲液中的包埋效率最高,在更高或 较低的柠檬酸盐浓度包埋效率则下降。
在低于25mM的柠檬酸盐浓度,尺度和多 分散性大大地增加。
图7显示了除c-myc(Seq.ID No.1)外能有效被 DSPC/Chol/DODAP/PEG-CerC14脂质体捕获的其他寡核苷酸和质粒DNA。
寡核苷 酸捕获的初始寡核苷酸/脂质重量比为0.1mg/mg,使用300mM的柠檬酸缓冲液。
在50mM的柠檬酸缓冲液中进行pDNA捕获,pDNA/脂质重量比为0.03。
与硫代 磷酸酯不同,反义寡核苷酸磷酸二酯基的分子在高离子强度的缓冲液如300mM 的柠檬酸缓冲液不能被包埋。
这可能反映出在结合亲和力中的差异(Semple等人, 2000)。
与大分子的有效包埋不同,在初始ATP/脂质比为0.2mg/mg的 DSPC/Chol/DODAP/PEG-CerC14脂质体中,被捕获的ATP少于10%。
ATP捕获 在50mM柠檬酸缓冲液中进行。
表5证明了该捕获方法可扩展至其他的脂质组合 物,包括DOPE系统。
带负电荷的脂质体和带正电荷的聚合电解质(包括聚赖氨酸) 的初步结果显示,捕获是聚合电解质与带相反电荷的脂质在乙醇中相互作用的一 般特征。
                         实施例15 使用辛基葡糖苷(OGP)替换乙醇。
将该去污剂加到脂质体中(1∶1,v/v),使 得到的最终浓度为30-40mM。
接下来如实施例5进行所有的步骤,除了将最初的 用pH4的柠檬酸缓冲液进行透析的时间延长至5小时。
寡核苷酸显示被保护不能 被外加的一种荧光素-寡核苷酸结合染料OliGreen所作用。
起始寡核苷酸/脂质比 是0.23(mg/mg)。
尺度是数均尺度。
脂质体是DSPC/Chol/DODAP/PEG- CerC14(20/45/25/10摩尔%)。
所观察到的包埋水平和最终的颗粒尺度归纳在表11 中。
             表11
OGP[mM]
 %包埋
 尺度[nm]
30
 51
 65±12
35
 57
 100±22
40
 55
 145±38
使用本发明和此说明书,本领域中熟练的技术人员将能识别其他的生产完全 包埋的脂质-治疗剂颗粒的方法和工具,所有的这些都包括在下面的 中。
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