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复合糖的生产

基本信息

  • 申请号 CN00810362.3 
  • 公开号 CN1402786A 
  • 申请日 2000/05/18 
  • 公开日 2003/03/12 
  • 申请人 衣阿华研究基金大学 加州大学评议会  
  • 优先权日期  
  • 发明人 M·A·阿皮塞拉 B·W·吉布森 N·J·菲利普斯  
  • 主分类号  
  • 申请人地址 美国衣阿华州 
  • 分类号  
  • 专利代理机构 中国专利代理(香港)有限公司 
  • 当前专利状态 发明专利申请公布 
  • 代理人 郭广迅 
  • 有效性 发明公开 
  • 法律状态
  •  

摘要

公开了用于在细菌生产细胞中制备复合糖的组合物和方法。
能制备的复合糖包括起源于细菌或起源于哺乳动物的寡糖和多糖。
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权利要求书


1.一种用于生产复合糖的方法,所述方法包括下列的步骤: (a)把经转化的生产细胞接种到一种能够支持所述生产细胞生长的 培养基中,其中通过转化细菌,将编码合成复合糖的糖基转移酶的分离的 DNA序列插入到所述细菌中而产生经转化的生产细胞,从而制备所述生 产细胞;所述细菌包括(i)一种含有末端庚糖分子的核心脂质结构、以及(ii) 能够添加一种受体分子到所述庚糖分子上的一种酶; (b)让所述经转化的生产细胞生长; (c)从所述培养物中回收所述复合糖。

2.权利要求1的经转化的生产细胞。

3.权利要求2的经转化的生产细胞,所述生产细胞包括一种革兰氏 阴性细菌,所述革兰氏阴性细菌在kdo核心上具有一个末端庚糖,且所述 革兰氏阴性细菌已插入了一种编码催化流感嗜血菌(Haemophilus influenzae)的一种寡糖合成的糖基转移酶的分离的DNA序列。

4.权利要求3的经转化的生产细胞,所述生产细胞包括大肠杆菌 (Escherichua coli)K-12菌株JM 109。

5.权利要求1的方法,其中所述细菌为革兰氏阴性细菌。

6.权利要求1的方法,其中所述细菌为大肠杆菌K-12菌株JM 109。

7.权利要求1的方法,其中所述受体分子为[N-乙酰]半乳糖。

8.权利要求1的方法,其中所述分离的DNA序列编码功能性流感 嗜血菌糖基转移酶。

9.权利要求1的方法,其中所述分离的DNA序列编码功能性淋病 奈瑟氏球菌(Neisseria gonorrhoeae)糖基转移酶。

10.按照权利要求1的方法制造的复合糖。

11.一种用于生产寡糖的方法,所述方法包括下列的步骤: (a)转化革兰氏阴性细菌,所述细菌包括(i)一种含有末端庚糖的核心 脂质结构、以及(ii)添加一个半乳糖分子到所述庚糖上的一种酶,其中通过 构建一种包含编码合成寡糖的糖基转移酶的分离DNA序列的载体而制备 所述经转化的革兰氏阴性细菌; (b)将所述经转化的革兰氏阴性细菌接种到一种能够支持所述经转 化的细菌生长的培养基中; (c)让所述接种的革兰氏阴性细菌生长;以及 (d)从该培养物中回收所述寡糖。

12.权利要求11的方法,其中,所述经转化的细菌是用一种来自流 感嗜血菌的分离的DNA序列转化的大肠杆菌K-12。

13.用权利要求11的方法制造的寡糖。

14.权利要求11的方法,其中,所述经转化的细菌是用一种来自淋 病奈瑟氏球菌的分离的DNA序列转化的大肠杆菌K-12。

15.用权利要求14的方法制造的寡糖。

16.  一种用于生产复合糖的方法,所述方法包括:培养包含一种编 码糖基转移酶的嵌合DNA序列的生产细胞,以便产生具有改变了的复合 糖水平的生产细胞,其中,所述生产细胞为包含一种含有末端庚糖分子的 核心脂质结构、并编码一种能够添加受体分子到所述庚糖分子上的酶的细 菌。

17.权利要求16的方法,所述方法还包括回收所述复合糖。
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说明书

                        优先权的要求 根据35 U.S.C.119(e),本申请要求1999年3月18日提交的、顺序号为 60/134,756的美国临时申请的优先权,通过引用将该申请结合到本文中。
                        政府的权利 美国政府保留本发明中的某些权利。
国立变态反应和传染病研究所(the National Institute of Allergy and infectious Diseases)提供财政资助,拨款号为 A124016,且国立卫生研究院的国家研究资源中心(the NIH National Center for Research Resources)提供财政资助,拨款号为RR01614和RR04112。
                         发明领域 本发明涉及一种在革兰氏阴性细菌中在脂多糖(LPS)骨架结构上产生复 合糖的方法。
                         发明背景 复合糖存在于自然界中,且与范围广阔的一系列生物学功能有关;所述 的生物学功能包括:病毒、细菌以及真菌的发病机理,细胞与细胞的识别及 细胞内的识别,激素和病原体与细胞表面受体的结合以及抗原-抗体识别。
术 语“复合糖”包括范围广阔的一系列具有通式(CH2O)n的化合物,在所述通式 里,该单体单位选自许许多多天然存在的单体或合成的单体的任何一种;所 述单体包括但不限于:葡萄糖、半乳糖、甘露糖、岩藻糖以及唾液酸。
除了 碳-氢-氧核心外,糖类可以有诸如氨基、硫酸酯基或磷酸酯基之类的附加成 分。
把由二至十个糖单位组成的聚合物称为寡糖(OS),且将由多于十个糖单 位组成的聚合物称为多糖(PS)。
可以以至少10种不同的方式连接 这些单糖结构单元,从而导致天文学数值的不同组合与排列。
人们发现:种 内的菌株在复合糖结构方面是不同的;且甚至在一种生物内的组织,在复合 糖结构方面也不同。
天然存在的复合糖的这种高度的变异性、高度特异性组 成以及宽广范围的生物学作用,使得这些化合物特别重要。
革兰氏阴性细菌有含复合糖,这些复合糖被连接到脂质上,从而形成 脂寡糖(LOS)和脂多糖(LPS)。
LOS和LPS的免疫源性存在于糖类部分,而 致病性存在于脂质部分。
为此,OS和PS可用作抗革兰氏阴性病原体的疫 苗,且OS和PS可用于革兰氏阴性细菌的鉴定。
美国专利申请5,736,533公开了可用作抗呼吸感染病原体的治疗剂的寡 糖。
人们认为:致病菌能通过结合组织表面的糖类而在组织中建群,且提供 过量的特定可溶性寡糖可导致对细菌建群的竞争性抑制。
通过在培养物中培养特定的细菌病原体,可以由LOS和LPS生产OS 和PS,随后切割去脂质部分且纯化。
但是,大多数致病菌在其生长要求方 面是苛求的,且生长缓慢;从而使这种生产方式不切实际。
例如,已知流感 嗜血菌(Haemophilus influenzae)需要二氧化碳环境和脑/心提取物以进行生 长。
幽门螺杆菌(Helicobacter pylori)在OS和PS生产所需要的肉汤培养物中 生长得非常差。
另外,这些细菌病原体中的许多菌(例如脑膜炎奈瑟氏球菌 (Neisseria meningitidis))以大体积的方式生长可能是危险的,因为有气溶胶和 可能的传染病传播的危险。
在诸如大肠杆菌(Escherichia coli)和明尼苏达沙 门氏菌(Salmonella minnesota)之类的快速生长至高密度的细菌菌株中,生产 苛求菌病原体之OS和PS结构的能力则提供一种由苛求菌病原体生产这些 OS和PS的快速方式。
真核生物的蛋白和肽通常在其表面具有糖类部分,所述糖类部分作为 激素的特异性结合位点而起作用;所述激素同样是糖基化了的,即具有连接 到所述肽结构的复合糖。
而且,除了所述的识别作用外,对于多肽正确地三 维折叠成有功能的糖蛋白,糖类是必需的。
细菌不能有效地肽和蛋白糖基 化,或不以等同于真核生物糖基化的方式使肽和蛋白糖基化。
为此,虽然广 泛地将细菌用作产生真核生物肽和蛋白的生产细胞,但这样有用的人糖肽、 例如红细胞生成素在哺乳动物细胞中生产。
美国专利申请4,703,008号公开 了一种用于生产红细胞生成素的方法,在该方法中,用编码该激素的DNA 转染诸如中国仓鼠卵巢细胞之类的细胞,且在二氧化碳环境下于完全培养基 中培养所述的细胞。
所产生的激素与天然存在的激素足够相似,以致可有效 地作为一种人用治疗剂。
分离出的细胞特异性糖类的另外一种效用是对疾病因子的竞争性抑 制,在所述的疾病因子方面,感染依赖于糖基化蛋白的表面识别。
例如,已 知人免疫缺陷病毒与T-4淋巴细胞上的表面受体结合。
如果过量的游离T-4 受体糖类存在于患者的体液中,则该病毒将与游离的糖类结合,从而有效地 阻止该病毒感染T-4淋巴细胞。
在治疗诸如红斑狼疮、多发性硬化以及类风湿性关节炎之类的自身免 疫疾病方面,通过给予识别细胞之分子而竞争性抑制抗体与细胞表面结合可 具有治疗的潜能。
这样的分子可结合到细胞受体上,从而阻断在这样的疾病 状态中引起所看到之变性的自身免疫抗体的结合。
第4,745,051号美国专利公开了在一种昆虫细胞中表达DNA的方法, 即对于糖基化肽和糖基化蛋白的生产具有实际用途的一种方法。
然而,所产 生的糖基化是该昆虫天然的糖基化;与哺乳动物细胞的典型糖基化产物相 比,该昆虫细胞的糖基化产物含有较高含量的甘露糖。
在细菌生产细胞中的肽和多肽的实际生产已经很好地建立了。
在本领 域中,使肽及蛋白糖基化的化学法和酶法是众所周知的。
例如,美国专利 5,370,872公开了一种将PS通过羧基或羟基偶联到蛋白上的方法。
长期以来 已经知道复合糖的传统有机合成,但是它们的实际应用则有限。
除了在糖聚 合物分子的复杂性方面所固有的困难外,许多糖苷键是不稳定的,且在化学 合成期间必须保护与去保护,从而增加合成的困难及减少产物的收率。
因为有机合成的这些缺点,所以设计了酶促合成。
人们知道:由于像 糖基转移酶(glycotransferases)那样酶的作用,通过逐步地添加单体而进行糖 基化作用。
可以用裂合酶、乙酰基转移酶、硫酸酯酶、磷酸化酶、激酶、差 向异构酶、甲基化酶、转移酶等等来进一步修饰所述反应的产物。
美国专利 5,308,460号公开了在一种固定化基质上的这样的分步合成。
仍然需要一种效率更高且更实用的复合糖以及含有物种或组织特异性 的复合糖之糖蛋白与糖肽的生产方法。
                        发明概述 本发明涉及在一种生产细胞中生产复合糖。
本文公开了例如大肠杆菌 菌株K-12的某些细菌有一种具有一种末端庚糖的核心脂糖 (liposaccharide)。
一种合适的生产细胞也包含一种酶,该酶催化到受体分子 (例如N-乙酰葡糖胺)末端庚糖的转移,从而形成一种“支架”;糖基转移酶 在所述的“支架”上添加其它的糖类单体而形成复合糖。
如果另外一种合适 的生产细胞没有这样的一种酶,则可以将编码流感嗜血菌之基因rfe(UDP- GlcNAc:十一萜醇GlcNAc-1磷酸转移酶)的DNA插入到该生产细胞中。
最 好是由于存在基因lsgG的基因产物而提高rfe的产量。
通过将编码糖基转移 酶的基因插入到所述的生产细胞中去,而生产细菌特异性的复合糖;所述的 细菌例如流感嗜血菌、种名未定的奈瑟氏球菌(Neisseria spp)、种名未定的 沙门氏菌(Saimonella spp)以及大肠杆菌。
同样,可以生产哺乳动物的复合 糖,例如多聚唾液酸(polysialyl)。
因此,本发明提供一种用于生产复合糖的方法,所述方法包括下列步 骤,即:(a)把经转化的生产细胞接种到一种能够支持所述生产细胞生长的 培养基中;其中通过转化细菌,将一种分离出的、编码合成复合糖的糖基转 移酶的DNA序列插入到所述细菌中而产生经转化的生产细胞,从而制备所 述的生产细胞;所述的细菌包含(i)一种含有末端庚糖的核心脂质结构、以及 (ii)能够添加一种受体分子到所述庚糖分子上的一种酶;(b)让所述经转化的 生产细胞生长;以及(c)从所述培养物中回收所述复合糖。
本发明也提供一种用于生产寡糖的方法,所述方法包括下列步骤,即: (a)转化革兰氏阴性细菌,所述细菌包括(i)一种含有末端庚糖的核心脂质结 构、以及(ii)添加一个半乳糖分子到所述庚糖上的一种酶;其中通过构建一 种包含一种编码合成寡糖的糖基转移酶的分离的DNA序列的载体,而制备 所述经转化的革兰氏阴性细菌;(b)将所述经转化的革兰氏阴性细菌接种到 一种能够支持所述经转化的细菌生长的培养基中;(c)让所述接种的革兰氏 阴性细菌生长;以及(d)从该培养物中回收所述寡糖。
使用在本申请中公开的方法,可以鉴定出适合于其它复合糖之实用生 产的生产细胞。
这样一种合适的生产细胞将具有一种待合成糖类特异性的受 体分子,或者将具有可被修饰以加上这样一种特异性受体分子的位点。
所述 生产细胞将含有起始的IsgG或IsgF,从而形成合适的受体。
然后,可以将 编码其它物种、菌株、组织、激素、受体或其它细胞表面糖类的糖基转移酶 的DNA插入到这样一种生产细胞中,导致生产所述物种、菌株、组织、激 素、受体或其它细胞表面糖类特异性的寡糖或多糖。
基因rfc和lsG的核苷 酸序列存在于流感嗜血菌Rd之数据库里的文件中,所述流感嗜血菌Rd之 数据库可得自TIGR(Bethesda,MD)。
糖基转移酶的序列可得自本文公开的 参考文献。
同样,提供用于分离及纯化该产物的方法。
本发明也提供一种用于生产复合糖的方法,所述方法包括:培养包含 一种嵌合DNA序列的生产细胞,所述嵌合DNA序列编码一种糖基转移酶; 以便产生具有水平改变的复合糖的生产细胞;其中,所述生产细胞为细菌, 所述细菌包含一种含有末端庚糖分子的核心脂质结构、并编码一种能够添加 一种受体分子到所述庚糖分子上的酶。
本发明也提供一种方法,该方法进一 步包括回收所述复合糖。
                      附图简述 图1:流感嗜血菌DNA的lsg区。
(A)八个可读框(orf)的图解。
(B)m-Tn3(Cm)插入位点的位置(6)。
(C)修饰大肠杆菌JM 109之LPS的EMBLOS-1亚克隆的限制性图谱。
图2:来自大肠杆菌菌株JM 109(指定为pGEM)的LPS与来自三种嵌 合菌株即pGEMLOS-7、pGEMLOS-5以及pGEMLOS-4的LPS的SDS- PAGE。
所述LPS的分子量范围从~3.3kDa至5.5kDa。
图3:所提出的嵌合寡糖结构。
只有在寡糖分支末端包含一个第四庚 糖的大肠杆菌K-12的完整核心结构,才经历修饰。
使另外的糖类(指定为R) 添加到所述庚糖的7位上,从而形成所述嵌合寡糖。
                         发明详述 本发明提供一种方法,用该方法,可以修饰包含基因rfe(UDP-GlcNAc: 十一萜醇GlcNAc-1磷酸转移酶)(Alexander等(1994)J.Bacteriol.,176- 7079-7084)的任何革兰氏细菌菌种的所述核心结构的末端庚糖,以便作为寡 糖合成的受体。
rfe基因编码一种蛋白,该蛋白催化N-乙酰葡糖胺 (GlcNAc,一种“受体分子”)转移到载体脂质十一萜醇磷酸上。
可以用一 种在流感嗜血菌中鉴定的调节基因lsgG来控制该基因的调节。
由lsgG引起 的rfe表达的增加,介导GlcNAc残基附着到来自各种各样革兰氏阴性细菌 物种的LPS和LOS之末端庚糖上,所述革兰氏阴性细菌物种包括大肠杆 菌、明尼苏达沙门氏菌和流感嗜血菌。
已发现这种GlcNAc作为受体分子而 起作用,从而形成用于在糖基转移酶的指导下相继添加糖类单体的支架。
例 如,半乳糖基转移酶基因lsgF导致一个半乳糖添加到该GlcNAc上。
已将 流感嗜血菌的编码lsg糖基转移酶的基因序列插入到大肠杆菌K-12菌株生 产细胞中,导致在大肠杆菌中产生流感嗜血菌特异性的LOS表位。
包含类似于rfe的起始酶的任何生产细胞,都可以添加一种合适的受体 而形成所述支架。
所述生产最好也将包含所述调节基因lsgG。
然后,可以 将编码其它物种、菌株、组织、激素、受体或其它细胞表面糖类的糖基转移 酶的DNA插入到这样一种生产细胞中,导致产生所述物种、菌株、组织、 激素、受体或其它细胞表面糖类特异性的寡糖或多糖。
定义: 复合糖:即式(CH2O)n的任何聚合物,其中n至少等于三个单体单位, 包括具有额外取代基的聚合物以及连接到脂质、肽及蛋白的上述聚合物;所 述额外取代基包括但不限于SO4、PO4、CO4、CH3、NH4
生产细胞:可用于本发明的生产细胞定义为:包含以一种终止的LPS 或LOS-糖类内部核心、且包含能够添加受体分子到所述终端分子上从而作 为一种延伸的支架的一种酶、并且可以用编码糖基转移酶的外源DNA转化 的任何细菌。
如果用诸如rfe和lsgG之类的基因共转化在其它方面合适、但 没有合适受体分子的细胞,从而适当地将LPS或LOS修饰,以作为形成支 架的受体分子;则可以将这样的细胞用作生产细胞。
Hib生产细胞:生产流感嗜血菌B型特异性OS的优选细胞最好为一种 革兰氏阴性细菌,最优选的是大肠杆菌K-12菌株JM 109。
合成的基因:即编码合成所需复合糖的一种或多种酶的DNA。
这些基 因包括编码糖基转移酶、裂合酶、乙酰基转移酶、硫酸酯酶、磷酸化酶、激 酶、差向异构酶、甲基化酶等等的基因。
实施例1 Hib生产细胞的选择流感嗜血菌b型(Hib)的荚膜菌株引起人类中各种各样的、包括脑膜炎 和肺炎的侵袭性感染和菌血症感染。
人们知道Hib的表面脂寡糖(LOS)在微 生物的毒力和发病机理方面是重要的因素。
对来自野生型菌株和突变型菌株 的Hib LOS的结构研究已显示:该LOS包含一个保守的庚三糖核心,所述 庚三糖核心可以在每个庚糖上用其它糖进行延伸。
近来报道了大肠杆菌K- 12核心区域的一种修改了的结构,所述结构也包含一种庚三糖的内部核心 以及存在于该寡糖主要分支末端上的一个第四庚糖:               Galα1        Hepα1                 ↓            ↓                 6             7 Hepα1→6Glcα1→2Glcα1→-3Glcα1→3Hepα1→3Hepα1→5Kdo。
先前的工作表明:通过在流感嗜血菌基因的指导下添加糖类单体,能 使用合成酶基因转化的大肠杆菌的所述核心区域延长,从而产生一种大约被 延长了五个单体单位的、修饰了的大肠杆菌LPS。
有人认为:在每个所述 庚糖上添加所述单体。
(Kwaik等,Molecular Microbiology,5:2475-2480 (1990)。
)因此,已努力用流感嗜血菌的合成基因来转化一种被称为JM 109 的大肠杆菌菌株,尝试确定是否能产生一种和流感嗜血菌的脂寡糖基基本上 相同的LOS。
在37℃,用LB琼脂或肉汤,加上合适的抗生素,常规地培养大肠杆 菌菌株。
先前描述了在这些研究中所用的载体。
(Kwaik等(1990))。
根据 Darveau和Hancock的提取方法(Darveau等,J.Bacteriol.155(2),831-838 (1983).),制备来自大肠杆菌JM 109的LPS。
在含有15%丙烯酰胺的分离凝 胶中,通过SDS-PAGE分离所述LPS,并通过银染显现。
为了测定这种嵌合LPS的结构,在37℃用无水肼处理来自每个样品几 毫克LPS达20分钟,然后用冷丙酮将其沉淀。
如在下面实施例6中所描述的,为了确定大肠杆菌的所述核心的化学 结构以及确定大肠杆菌受体的残基,运用组成分析、键合分析、及质谱法, 部分地鉴定出了来自大肠杆菌菌株JM 109的LPS的特征。
2.来自Hib的LOS合成基因的分离最初从一位患有脑膜炎的儿童的脊髓液中分离出Hib菌株A-2。
Hib A-2在35℃、5%CO2的环境中,在补充氨基酸和维生素的巧克力琼脂上、 或在补充4%的Fildes试剂(Difco Laboratories,Detroit)的脑心浸液琼脂上生 长。
先前克隆了来自Hib菌株A-2的包含LOS合成基因(lsg)的一个基因 簇。
(Kwaik等,(1990))。
所述lsg基因座被包含在一种7.4Kb的DNA片段 内,且这样的lsg基因座由7个完整的可读框(orf)组成。
该区域是也发现于 与脂多糖(LPS)生物合成有关的Hib菌株Rd基因组序列中的几个特殊基因座 中的一个。
用来自Hib菌株A-2的lsg区域的DNA在λ噬菌体EMBL3中构建了 基因组文库(Kwaik等,(1990))。
制备出了26个在大肠杆菌菌株LE392中表 达Hib LOS寡糖表位的噬菌体克隆。
指定为EMBLOS-I的噬菌体转化子产 生一种嵌合LPS,该嵌合LPS具有加到大肠杆菌LE392的4.1kDa LPS上 的1.4kDa的寡糖。
识别Hib A2 LOS混合物中的两种组分的单克隆抗体 (MAb)6E4也识别所述嵌合LPS中的这种新的5.5kDa组分,这表明了与 Hib LOS有某些免疫化学相似性。
实施例3 所述Hib生产细胞的转化用EMBLOS-I的限制性片段来制备一系列的质粒,所述质粒修饰大肠 杆菌菌株JM 109,而得到产生一系列所提出的嵌合的、较高质量种类的LPS 的克隆。
称为pGEMLOS-4、pGEMLOS-5、及pGEMLOS-7的转化子相应 地各产生5.5kDa、5.1kDa、4.5kDa之修饰的或嵌合的LPS。
显然,所 有的三种质粒产物都修饰来自大肠杆菌的4.1kDa种类的LPS,尽管只有 来自pGEMLOS-4的LPS表达出所述6E4表位。
已发现来自菌株 pGEMLOS-5的LPS与Mab 3F 11的反应呈阳性,这暗示着末端N-乙酰乳 糖胺的存在。
由MAb 6E4识别的表位不仅也存在于流感嗜血菌不可定型 (nontypable)菌株2019的LOS中,而且也存在于来自明尼苏达沙门菌Re突 变株的LPS中。
可以用Kdo以及来自明尼苏达沙门菌之Re突变株的Kdo 三糖来抑制这种单克隆抗体与流感嗜血菌LOS的结合。
因为所述6E4表位 与嗜血菌LOS的核心相关,所以最初提出:在大肠杆菌中表达的嵌合结构 可能起因于流感嗜血菌的核心结构添加到了大肠杆菌4.1kDa种类的LPS 的受体残基上。
用已经连接有来自流感嗜血菌菌株A-2的lsg基因座的不同限制性 DNA片段的质粒pGEM3Zf+转化所述Hib生产细胞(参见表1和图1)。
质粒 pGEMLOS-4包含一种7.4Kb的bamhl-pstl的DNA片段,所述DNA片段包 含构成lsg基因座的全部7个可读框(A-G)。
质粒pGEMLOS-5包含一种5.5 Kb的hindlll-pstl的DNA片段,所述DNA片段包含所述lsg的5个可读框 (C-G)。
质粒pGEMLOS-7包含一种2.8Kb的sphl-pstl的DNA片段,所述 DNA片段包括所述lsg基因座的2个可读框(F-G)。
同样,将不含插入片段 的质粒pGEM3zf+转化到菌株JM 109中。
把这个菌株和从它分离的LPS称 为PGEM。
实施例4 寡糖的分离与纯化在100℃,用1%的醋酸水解来自PGEM(31mg)、pGEMLOS-4(25 mg)、pGEMLOS-5(15mg)、及pGEMLOS-7(4.4mg)的LPS(2mg LPS/ml) 达2小时。
在4℃以5000g离心所述水解产物达20分钟,并除去上清液。
用2ml水洗涤沉淀且再次离心(5000g、20分钟、4℃)。
合并所述上清液 和洗涤液,并冻干,得到寡糖级分。
作为标准,以同样的方式处理10mg 来自鼠伤寒沙门氏菌(Salmonella typhimurium)TV 119 Ra突变株(Sigma,St. Louis)的LPS。
为了制备脱盐寡糖的合并物供ESI-MS分析,在两根串联连接的Bio- Select SEC 125-5 HPLC柱(Bio-Rad,Richmond,CA)上,以1ml/分钟的流速, 用0.05M的乙酸吡啶鎓(pH 5.2),将粗制寡糖级分的小量等分试样(<2mg) 层析。
用一台折射率检测器来监测柱的流出物,且记录层析谱,并用一台积 分仪存储。
至于大规模分离,将来自PGEM(10.2mg)、pGEMLOS-4(9.3mg)、及 pGEMLOS-5(7.0mg)的寡糖级分溶解于0.3ml的0.05M乙酸吡啶鎓缓冲液 (pH 5.2)中,并通过0.45gm Nylon-66膜将其离心过滤。
将PGEM和 pGEMLOS-4的样品加到一根Bio-Gel P-4柱(1.6×84cm,<400目;Bio-Rad) 上,且将pGEMLOS-5的样品加到两根串联连接的Bio-Gel P-4柱(1.6×79cm 和1.6×76.5cm)上。
所述柱配有保持在30℃的水夹套。
用一台P-1蠕动泵 (Pharmacia,Piscataway)以10ml/小时的流速完成向上洗脱。
用折射率来监测 流出物,并以10分钟的间隔收集级分,且在浓缩器中蒸发至干。
实施例5 寡糖的去磷酸化将寡糖级分放置在1.5ml的聚丙烯管中,并用冷的、48%的HF水溶 液将其处理,从而制备5-10μg/ml的溶液。
将样品保持在4℃达18小时, 然后,蒸发HF水溶液。
接着,再次在两根串联连接的Bio-Select SEC 125- 5 HPLC柱上,用0.05M的乙酸吡啶鎓(pH 5.2),将去磷酸化的样品层析。
实施例6 产物的特征鉴定正如在实施例2中所表明的,产物与针对天然存在的Hib LOS产生的 单克隆抗体的反应性表明:所述产物具有如同天然存在的Hib LOS一样的 免疫化学功能。
为了确定与所需复合糖的结构同一性,用不同的技术进一步 地分析了所述样品。
a.单糖组成的分析将去磷酸化的寡糖级分溶解于400μl 2M的三氟乙酸中,并在100℃加 热4小时。
在一台Speed-Vac浓缩器中将所述水解产物蒸发至干,并将其重 新溶解于20μl水中,且再次干燥。
用一根CarboPac PA1柱,通过高效阴离 子交换层析,并用Dionex BioLC系统(Dionex,Sunnyvale,CA)的脉冲电流检 测,来分析水解产物。
b.甲基化的分析用经修改以与粉状NaOH一起使用的微量法,对去磷酸化的寡糖级分 进行键合分析。
在一台质谱仪上,以E1和C1方式,用GC/MS来分析部分 甲基化的糖醇乙酸酯。
c.液态二次离子质谱法(LSIMS)用一台具有铯离子源的质谱仪进行LSIMS分析。
将寡糖样品(在1μl 水中)加到在不锈钢探头尖端上的1μl甘油/硫甘油(1∶1)中。
使用一种能量为 10keV的铯离子(Cs+)初级粒子束,且将二次样品离子加速到8keV。
以负 离子模式,以300s/十倍程(decade)进行扫描,并用一台静电记录器记录。
用Ultramark 1621(PCR Research Chemicals,Inc.,Gainesville,FL),将各个谱 人工地标定质量到好于±0.2Da的精度。
d.电喷雾电离质谱法(ESI-MS)在一台具有以负离子方式工作的电喷雾离子源的质谱仪上,分析寡糖 和O-去酰基LPS。
将寡糖样品溶解于与流动(running)溶剂混合的水(4μl溶 剂中1μl)中,并将其注射到流速大约为20μl/分钟、包含1%乙酸的水/乙腈 (1/1,v/v)流中。
用CsI以负离子方式进行质量标定。
在某些情况下,用一台具有在ESI条件下以负离子方式工作的阵列 (array)检测器的、扇形正交(sector-orthogonal)飞行时间(TOF)仪器,以较高的 分辨力(M/ΔM=2000)分析所挑选的寡糖级分。
假使这样的话,对于这种四 极ESI实验,所述溶剂体系和流速基本上与上面描述的相同。
在500至3000 的m/z范围内,对所有的样品,都使用5秒/十倍程的扫描速度,加速电压 为4kV,ESI针电压在3.5-4kV之间。
采用由在液态二次离子质谱法条件 下所用的CsI构成的外标进行质量标定;继之以负离子ES-MS方式,对来 自鼠伤寒沙门氏菌Ra突变株LPS的寡糖的双电荷去质子化分子离子进行单 点校正((M-2H)2-准确质量(exact)=973.2)。
e.基质辅助激光(I.a.qer)脱吸电离(MALDI)质谱法在安装有一个氮激光器(337nM)的一台Voyager或一台Elite MALDI- TOF仪器(PerSeptive Biosystems,Framingham,MA)上,分析O-去酰基LPS样 品。
用在别处详细描述的延迟提取条件,以负离子方式记录所有的质谱。
(Gibson等J.Amer.Soc.Mass Spec.8:645-658(1997))。
将样品溶解于水中(大 约250 pmol/μl),并将其与基质溶液(一种溶于丙酮的2,5-二羟基苯甲酸的饱 和溶液)以1∶1混合;且让其在室温下于一块镀金MALDI板上干燥。
对于每 个样品,记录下大约100次激光发射,并将其平均;然后,用一种作为外标 的质量标定物(calibrant)进行质量标定,所述质量标定物由高凝乳酶底物十 四肽、氧化型胰岛素B链、以及牛胰岛素(全部来自Sigma)构成。
对于在这 些条件下的外标标定,得到了0.1%的质量精度。
为了比较的目的,用预期 的脂质A片段离子,对来自PGEM的O-去酰基LPS之质谱进行了单点校正 ((M-H)平均值=952.009);然后,用这种脂质A碎片离子和一种存在于所 有四种样品中的、来自PGEM(m/z 2835.7)的另外一种离子,重新校准了三 种嵌合菌株之质谱。
f.用四极-TOF(qTOF)的串联质谱法(MS/MS)在安装有一个纳级喷射(nanospray)离子源的一台质谱仪上,以阳离子方 式分析去磷酸化寡糖。
该分析仪包括:一个高压RF-only离子导向装置再加 上一个四极滤质器。
一个高压四极碰撞室接着第一个滤质器。
该TOF质量 分析器包括一个有效飞行路程为2.5米的反射区(reflection)。
将样品溶于包 含1%乙酸的水/乙腈(1/1,v/v)中,并分别将2μl每种样品注射到一个纳级喷 射针里。
该纳级喷射针的电压一般为800-1000V。
一次样品上样通常给出 30-40分钟的分析时间,这允许在选择几种用于CID MS/MS的个别离子之 前可获得常规的质谱。
在MS方式中,高分辨能力(8,000FWHM)允许明确 确定每种离子的电荷状态。
对于CID-MS/MS的操作,使用所述具有I m/z 单位的质量窗的四极质量分析器,来.挑选用于破碎的前体离子;所述前体离 子在大多数情况下是带双电荷的(M+2H)2+
在碰撞室里,用空气作为碰撞气 体,使所挑选的离子碎裂;且在以20kV的加速电压下操作的正交TOF里, 进行分析。
在计算机的控制下存储碎片离子谱达10秒和1分钟之间的时间。
基于外标校准的质量测定一般是在50ppm的单种同位素计算值范围以内, 而内标校准则给出精确到+5ppm的质量。
g.LPS的SDS-PAGE分析我们先前报道了用一系列包含来自流感嗜血菌b型菌株A-2的lsg区域 (Kwaik等,1990)的重叠限制性DNA片段的质粒转化大肠杆菌菌株JM 109 (一种产生没有O-侧链的粗糙(rough)LPS(rLPS)的K-12菌株)。
产生出部分 LOS片段。
正如在图1中用图解法表示的,pGEMLOS-4克隆包含所述lsg 区域中所有的完整可读框(可读框A-G),而pGEMLOS-5包含可读框C-G, pGEMLOS-7包含可读框F-G。
通过SDS-PAGE表明:克隆pGEMLOS-4、 pGEMLOS-5和pGEMLOS-7产生所述大肠杆菌4.1kDa核心上分别添加了 1.4kDa部分、1.0kDa部分和0.4kDa部分的修饰的LPS结构(图2)。
h.用MALDI-TOF分析O-去酰基LPS对于用质谱仪LPS的分子量和不均一性进行的初步筛分,用无水肼处 理来自PGEM、pGEMLOS-4、pGEMLOS-5、以及pGEMLOS-7的LPS 的小量等分试样,从而从所述脂质A部分除去O-联脂肪酸。
所述PGEM的 O-去酰基LPS样品包含几个在2738-3172Da范围内代表主要的所述大肠杆 菌核心结构的种类。
当所观测到的种类符合所提出的组成时,发现所观测到 的种类在庚糖(Hep)、己糖(Hex)、3-脱氧-D-甘露辛酮糖酸(Kdo)、磷酸(Phos) 以及磷酸乙醇胺(PEA)方面显示出不均一性(表2)。
具体地讲,观测到或者包 含3个Hex和3个Hep(加上2或3个Kdo)、或者包含4个Hex和4个Hep (加上2个Kdo)的两种主要的核心类型,且在两者中具有可变量的磷酸基和 PEA。
pGEMLOS-7的O-去酰基LPS混合物除了包含(M-H)-为3334.5和 3456.8的两种主要新种类之外,也包含许多上述这些种类。
m/z为3334.5 的种类显然是己糖(Hex)和N-乙酰己糖胺(HexNAc)加到了包含4个Hex、4 个Hep、2个Kdo、2个Phos和1个O-脱酰基去磷酸化脂质A(O-DPLA) 部分的PGEM核心结构上的结果。
进一步地加上1个PEA部分则产生m/z 为3456.8的种类。
这些数据表明:产生pGEMLOS-7的转化导致一种Hex- HexNAc部分加到所述大肠杆菌的LPS上。
同样地,发现在pGEMLOS-5的 O-脱酰基LPS中的主要种类(m/z 3700.6和3823.6)是2个Hex加2个HexNAc 添加到了包含4个Hex、4个Hep、2个Kdo、2个Phos、1个O-DPLA、 以及0或1个PEA的PGEM核心结构上的结果(参见表2)。
在pGEMLOS- 4的O-脱酰基LPS中,除了发现新种类之外,也发现这些结构;所述新种 类是进一步添加或者另一个Hex(m/z 4083.2和4206.4)、或者HexNAc(m/z 4124.5和4246.8)到PGEM核心结构上的结果,在这种情况下,所述PGEM 核心结构包含4个Hex、4个Hep、3个Kdo、2个Phos、1个O-DPLA、 以及0或1个PEA(参见表2)。
在所述嵌合LPS结构中,只有这些高分子量 的pGEMLOS-4组分才包含第三个Kdo部分。
i.用ESI-MS和LSIMS分析寡糖使来自PGEM、pGEMLOS-4、pGEMLOS-5、及pGEMLOS-7的LPS 受到温和的酸水解,以释放出游离的寡糖。
一开始,通过尺寸排阻HPLC 使所述寡糖级分的小量等分试样脱盐,并用负离子ESI-MS,分析作为混合 物的寡糖级分。
所述ESI-MS谱包含占优势的双电荷离子即(M-2H)2-。
总的 来讲,这些数据与来自O-脱酰基LPS的MALDI-TOF分析的结果一致。
已 发现PGEM样品包含7种主要的寡糖及几种次要的种类,分子量范围从 1459.3Da至2016.7Da。
正如在表3中所显示的,确定不同种类的所提出 的组成,表明所述结构由两种主要核心类型组成;一种类型包含3个Hex、 3个Hep和1个Kdo,而另一种类型包含4个Hex、4个Hep和1个Kdo。
在磷酸基及PEA基团之数目方面的变异性导致了在所述混合物中存在许多 的种类。
除了较大分子量的寡糖外,pGEMLOS-4、pGEMLOS-5、以及 pGEMLOS-7的样品包含许多发现于PGEM样品中的种类(表3)。
在 pGEMLOS-7的样品中,观测到Mr为2177.7和2302.5的新的LPS糖形 (glycororm);这与添加一个Hex和HexNAc残基到包含4个Hex、4个Hep、 1个Kdo、2个Phos、以及0或1个PEA的PGEM核心结构上一致。
pGEMLOS-5样品的高分子量组分(Mr为2543.9和2666.5)暗示还进一步添加 了另一个Hex-HexNAc单位;而pGEMLOS-7样品包含分子量甚至更高的物 质(范围从Mr 2706.1到Mr 2870.0),这与再添加一个Hex或HexNAc部分一 致。
为了帮助确定所提出的这些种类的组成,通过尺寸排阻色谱法来分离 来自PGEM、pGEMLOS-4、pGEMLOS-5、以及pGEMLOS-7之样品的 寡糖;并用LSIMS和/或ESI-MS分析各级分。
然后,合并所挑选的、代表 两种主要的PGEM核心类型以及各种各样的嵌合结构的级分;用HF水溶液 将其去磷酸化,用尺寸排阻HPLC将其再次层析,且再用负离子LSIMS或 ESI-MS分析。
在表4中列举了所提出的、在HF处理后观测到的分子离子 之组成。
在除去磷酸和PEA部分后,存在于pGEMLOS-7样品中的主要的 高质量种类为一种Mr(平均值)2020.3的寡糖(1个HexNAc、5个Hex、4 个Hep以及1个Kdo)。
pGEMLOS-5样品包含一种Mr(平均值)2386.3的寡 糖,该寡糖由于进一步添加1个Hex和1个HexNAc到pGEMLOS-7的LPS (2个HexNAc、6个Hex、4个Hep以及1个Kdo)上而产生。
除了包含另 外一个Hex(Mr(平均值)2548.4)或HexNAc(Mr(平均值)2589.5)的、较高分 子量的结构外,这个种类也存在于pGEMLOS-4的样品中。
j.单糖组成和键合的分析来自PGEM、pGEMLOS-4、pGEMLOS-5、以及pGEMLOS-7的游 离寡糖之质谱分析表明:不同的嵌合结构是化学计量量的己糖和HexNAc 残基添加到磷酸化可变的PGEM核心结构上的结果;所述PGEM核心结构 包含4个Hex、4个Hep以及1个Kdo。
没有观测到包含3个Hex、3个 Hep以及1个Kdo核心的嵌合结构。
为了进行比较的,用2N的三氟乙酸水解去磷酸化寡糖级分,所述寡糖 级分包含两种PGEM核心类型和来自pGEMLOS-4、pGEMLOS-5、以及 pGEMLOS-7的主要嵌合结构;以测定它们的单糖组成、以及因此测定Hex 和HexNAc残基的特性(identity)。
当用高pH阴离子交换层析法和脉冲电流 检测一起进行分析时,发现该PGEM水解产物仅包含半乳糖、葡萄糖以及 L-甘油-D-甘露-庚糖(表5)。
(在以上所述水解条件下不能回收Kdo残基。
)所 述两种核心类型被鉴定为GalGlc2Hep3和GalGlc3Hep4
pGEMLOS-7的样 品包含GlcNH2Gal2Glc3Hep4(表5),暗示着通过添加一个Gal和一个N-乙酰 葡糖胺(GlcNAc)残基而修饰较大的PGEM核心。
同样地,pGEMLOS-5样 品的组成暗示:仅用Gal和GlcNAc残基使较大的PGEM核心进一步糖基 化。
来自pGEMLOS-4、包含和pGEMLOS-5一样种类的级分2产生类似的 结果,且来自pGEMLOS-4、包含三种主要种类的级分1(参见表4),包含 的GlcNH2稍微多些。
取用于单糖组成分析的上述六种去磷酸化寡糖级分的等分试样,用于 甲基化分析,以确定糖的键合位置。
在表6中列举了通过GC/MS观测到的 部分甲基化糖醇乙酸酯。
另一方面,通过比较所述两种PGEM核心类型, 相对明确地发现:在所有所述嵌合结构中,较大的PGEM核心的第二个末 端庚糖被转变成1,7-连接的庚糖;且因此必定会有用于新的糖基化的连接位 点。
因为没有观测到具有Hep3核心的嵌合结构,所以很可能近来在K-12核 心结构的寡糖分支上鉴别的非还原末端庚糖为修饰的末端庚糖。
另外,从所 述嵌合寡糖中没获得新的三联糖,暗示着所述糖最大可能全部添加到一条直 链中。
k.用MS/MS的嵌合寡糖的测序为了确证为所述大肠杆菌LPS核心和所述新的寡糖部分之间键合位点 的特性,且为了确定所添加之糖的序列,对所述去磷酸化寡糖进行MS/MS 分析。
对于这些实验,以阳离子方式探究样品,且挑选双电荷分子离子 (M+2H)2+用于碰撞诱导解离(CID)。
在所述谱中存在各种还原末端(Y-型)和 非还原末端(B-型)序列的离子。
对于PGEM寡糖,所述Y离子系列包括: Y(m/z 732.2(2+))、Yα5(m/z 651.2(2+))和Y(m/z 1139.3)的碎片离子,且 相应的B离子系列包括:B(m/z 517.2)、B(m/z 841.3)、B5(m/z 1225.4) 和B6(m/z 1417.4)的碎片离子;这支持已公开的、在最大的寡糖分支的非还 原末端具有第四个庚糖的结构。
除了这些序列的离子之外,存在于所述谱中 的几种离子显然是内部裂解的结果,所述裂解可以在高能CID条件下发生。
在pGEMLOS-5寡糖之谱中,两种类似的Y和B型离子系列清楚地限定了 所添加四糖的顺序和键合位点。
在m/z 366.1(B2α’’)和731.3(B4α’)的强B离 子是两个Hex-HexNAc部分序贯裂解的结果。
这些离子的丧失也由相应的 Y9α’’(m/z 2020.6)和7α’(m/z 1655.5)碎片离子显示出来。
在m/z 923.3(B5α’)0 和m/z 1463.4(Y6α’)的碎片离子确证所述Hex-HexNAc-Hex-HexNAc部分被 连接到一个庚糖上,且进一步沿着最大的寡糖分支的另外的裂解证实所述新 的四糖被连接到所述PGEM核心结构的最大分支上。
在来自pGEMLOS-7和pGEMLOS-4的嵌合寡糖之MS/MS谱中,强B 离子也清楚地限定所添加糖部分的结构。
在pGEMLOS-7的寡糖(Mr2019.7)中,一种在m/z 366.1的B离子对应于单个的Hex-HexNAc双糖部分。
pGEMLOS-4的Mr为2587.9的寡糖(HexNAc3Hex6Hep4Kdo)失去了一个 HexNAc-Hex-HexNAc碎片(m/z 569.2)和一个HexNAc-Hex-HexNAc-Hex- HexNAc碎片(m/z 934.3),而Mr为2546.8的pGEMLOS-4的寡糖 (HexNAc2Hex7Hep4→do)失去了一个Hex-Hex-HexNAc(m/z 528.2)和一个 Hex-Hex-HexNAc-Hex-HexNAc(m/z 893.3)碎片。
除了那些B型离子之外, 后一谱也包含在m/z 366.1和731.3的大离子,在这种情况下所述大离子显 然作为内部碎片而产生。
假定所述寡糖是按顺序构成的,即从pGEMLOS-7到pGEMLOS-5到 pGEMLOS-4;则所述MS/MS数据与我们的甲基化分析结果结合提供了在 图3中显示的所推导嵌合寡糖的部分结构。
所述结构数据支持这样的预测,即用包含来自流感嗜血菌的涉及LOS 生物合成的八个基因区段部分的质粒转化的大肠杆菌K-12制造嵌合的 LPS,所述嵌合的LPS可被修饰而产生和流感嗜血菌之寡糖基本上相同的 寡糖。
而且,我们已证明所述嵌合LPS是被分隔的杂种型结构,其中首先 合成大肠杆菌R-LPS的核心结构,然后,该核心结构作为一种支架,以供 流感嗜血菌LOS生物合成酶添加第二套独立的、在所述大肠杆菌亲株中没 发现的糖。
因此,该生物合成途径似乎是顺序的(分开的)而不是交杂的。
在进行本发明之前,尚不了解大肠杆菌R-LPS中的分支末端庚糖作为 寡糖延伸受体的作用或者需要一种有功能的起始酶。
所述公开的、大肠杆菌 K-12完整核心的结构,不包含第二个末端庚糖;而是具有这第四个庚糖作 为该内部核心区域的一部分。
认为该寡糖分支以葡萄糖终止,且已提出该葡 萄糖是O-抗原和其它取代基的受体位点。
所述起始酶的作用是未知的。
显 而易见的是:在质粒转化的嵌合菌株中,只有包含这第四个庚糖的大肠杆菌 R-LPS结构(即完整的核心结构)才经历延伸;且因此只有那些具有这种组成 的大肠杆菌,才可用作流感嗜血菌生产的生产细胞。
在所述嵌合结构中, GlcNAc是添加到这庚糖7位的第一个糖。
对于在延伸序列方面的这决定性 的第一步,有两种可能的解释。
第一种解释是:一种来自嗜血菌的、在可读 框f或可读框g中编码的N-乙酰葡糖胺特异性的糖基转移酶,或者具有这 种精确的特异性、或者是不加选择的,从而足以允许这种反应发生。
第二种 解释是:某些类似的大肠杆菌糖基转移酶基因正被一种嗜血菌属调节基因活 化,因为在该质粒中包含的7个基因的序列比较暗示:既存在糖基转移酶基 因,又存在调节基因,所以两种解释都是可能的。
然而,已在某些其它大肠 杆菌K-12菌株中发现了非化学计量量的末端GlcNAc及1,7-联庚糖的事实 暗示:由大肠杆菌的酶来完成将这种糖添加到所述寡糖分支末端上。
近来报 道了当大肠杆菌K-12中引起粗造表型的突变被互补时,所述互补的菌株产 生一种O-抗原,所述O-抗原在重复单位之还原末端具有GlcNAc。
不管该 PGEM核心延伸中的第一关键步骤的机制是何种机制,似乎这种GlcNAc的 添加是限速的;因为大百分比的未修饰PGEM核心R-LPS保留在所述嵌合 混合物中。
此外,几乎没有观测到或没观测到作为从pGEMLOS-7到 pGEMLOS-5及pGEMLOS-4发展的中间体结构;这暗示一旦添加这第一个 GlcNAc,则与嗜血菌相关的其它糖的添加迅速地进行,直至所限定的终点。
如果所述嵌合LPS生物合成中的其它步骤和这第一个GlcNAc添加一样,是 不完全的;则人们会预期发现这些其它的中间体结构;然而,没有观测到任 何中间体。
因此,很可能在所述嵌合结构中,来自大肠杆菌的一种由可读框 f或可读框g之产物调节的N-乙酰葡糖胺基转移酶添加这第一个关键糖。
只 包含可读框g的一种嵌合构建体的初步数据显示了203Da(HexNAc)的质量 变化;这暗示可读框g编码这种调节基因。
所述嵌合LPS的生物合成中的第二步是:将半乳糖添加到所述末端 GlcNAc的3位上。
所产生的双糖Gal13GlcNAc是在pGEMLOS-7中观测到 的结构部分,当所述转化质粒包含来自嗜血菌的可读框F-G时,所述双糖 结构部分就出现。
检查所述基因产物的预测氨基酸序列则表明:可读框f与 来自解淀粉欧文氏菌(Erwinia amylovora)的一种半乳糖基转移酶(asmE)有着 高度的同源性(66%同一性);这暗示可读框f可能在嗜血菌中编码一种半乳 糖基转移酶。
可读框G和已知的寡糖生物合成基因不显示出任何同源性, 但与一种在大肠杆菌中编码ModE蛋白的基因是同源的(64%同一性);这种 蛋白与钼的转运和转录的调节有关,这暗示可读框G可能编码一种起源于 嗜血菌的调节蛋白(在所述嵌合菌株中该调节蛋白可能调节一种来自大肠杆 菌的N-乙酰葡糖胺基转移酶基因)。
在pGEMLOS-5菌株中,在所述转化质粒中包含一组附加的三个基因 (可读框C-G);且在所产生的LPS中,观测到附加的GlcNAc和Gal。
现在, 这些糖限定了四糖Gal1-4GlcNAc-3Gal13GlcNAc。
来自这种转化子的LPS 对3F 11 MAb呈反应性;这暗示这种新双糖被β连接而形成末端三糖 Gal14GlcNAc1-3Gal。
在这种质粒中包含的所有新可读框与已知的糖基转移 酶基因有着某些同源性:可读框C与来自解淀粉欧文氏菌的asmD有着同源 性(26%同一性),asmD编码一种用于外多糖(exopolysaccharide)合成的糖基 转移酶;且可读框C与来自小肠结肠炎耶尔森氏菌(Yersina entercolitica)的 TrsD有着同源性(38%同一性),TrsD为一种与LPS内部核心合成有关的基 因;可读框D和来自淋病奈瑟氏球菌(Neisseria gonorrhoeae)的唾液酸转移 酶基因(lst)有同源性(27%同一性);以及可读框E与来自种名未定的放线杆 菌(Actinobacillus sp.)的一种推定的糖基转移酶基因有着同源性(77%同一 性),并与来自解淀粉欧文氏菌的半乳糖基转移酶基因amsB有着同源性(27% 同一性)。
在该转化质粒中的这三种附加的可读框显然导致仅再将两种糖添 加到生长中的寡糖链上,这一事实可以表明:在该嵌合LPS中,不存在所 述糖基转移酶中的一种酶的受体。
当在该转化质粒中再添加两种可读框(可读框A-G)从而形成 pGEMLOS-4嵌合菌株时,我们观测到3F 11表位消失,且该表位的末端Gal 残基或者被加上一个第二Gal部分或者被戴上一个第二GlcNAc部分的帽 子;所述Gal或GlcNAc显然连接到该Gal的6位。
也观测到存在于 pGEMLOS-4的LPS群体中的这些新种类包含一个第三Kdo部分;所述Kdo 部分推测在LPS的核心区域的某处。
虽然在野生型大肠杆菌K-12的LPS群 体中发现的某些不完整的核心结构也包含一个第三Kdo,但在所述嵌合结 构中,发现只有pGEMLOS-4特有的结构包含一个第三Kdo。
这种嵌合菌 株也被识别一种内部核心的MAb 6E4识别,所述内部核心即流感嗜血菌中 与Kdo有关的表位;这暗示这种第三Kdo形成一种与在野生型大肠杆菌LPS 核心结构中发现的表位不同的表位。
因此,将可读框A和B添加到构建 (fon-ned)菌株pGEMLOS-4的转化质粒中,似乎对所述嵌合LPS结构有多 种影响。
可读框B与来自淋病奈瑟氏球菌的唾液酸转移酶基因是同源的 (46%同一性)。
可读框A既与来自大肠杆菌的Rfb X基因产物同源(22%同一 性),又与小肠结肠炎耶尔森氏菌的TrsA同源(24%同一性)。
这些是推定的 O-抗原转运蛋白(36,37);这暗示可读框A可能编码一种翻转酶(flippase)。
虽然包含唾液酸-N-乙酰乳糖胺的结构是野生型流感嗜血菌b型菌株 A2的LOS群体中仅有的次要组分,但我们先前已发现lsg基因与这种表位 的合成有关。
可读框D的转座子诱变产生突变株281.25,该突变株丧失了 将半乳糖添加到Hib LOS糖形上的所有能力。
这种菌株不能制造、比含有 四个葡萄糖及三个庚糖的主要种类大的野生型LOS结构中的任一种。
可读 框E(可读框E在可读框D的下游)的突变产生菌株276.4;除了一个重要的 差异之外,菌株276.4具有基本上相同的缺陷;该重要的差异即:菌株276.4 保留了制造唾液酸-N-乙酰乳糖胺表位的能力。
这些结果暗示:在所述转座 子突变株中,可读框D的剔除对可读框E有极性效应;这可能暗示可读框 E的基因产物是在其葡萄糖双糖分支上包含末端半乳糖的分子量较高的野 生型结构之合成所需要的一种半乳糖基转移酶,而可读框D的基因产物很 可能是唾液酸-N-乙酰乳糖胺表位的合成所需要的一种N-乙酰葡糖胺基转移 酶。
在上面表明的同源性(可读框E与一种半乳糖基转移酶基因是同源的) 的基础上,以及在276.4突变株和281.25突变株中观测到的LOS糖形的基 础上,作出了这些定位。
因为在276.4的LOS群体中没发现唾液酸-N-乙酰 乳糖胺结构的截短形式(即没有缺少唾液酸或者唾液酸加半乳糖的种类),所 以,看来大概可读框D基因编码添加GlcNAc到所述寡糖分支上的糖基转移 酶。
这也和下述的观测一致,下述的观测即:可读框C-E的基因中的一个 基因,显然添加GlcNAc到pGEMLOS-7 LPS结构中末端Gal的3位负责。
这种嵌合糖类的表达系统提供了与阐明这些lsg基因功能有关的资 料,且具有另外的优点,即可在没有正常内源遗传背景的情况下在流感嗜血 菌上进行的优点。
实际上,虽然已完成流感嗜血菌中某些lsg基因的基因剔 除,但下游基因或调节基因的作用常常能使它们的功能分析变得复杂。
在这 种大肠杆菌的表达系统中,所产生的嵌合LPS的结构分析显示了合成以一 种连续(非平行)合成的方式进行,即在大肠杆菌的R-LPS形成之后,添加所 述嵌合LPS的所述新成分。
这种合成是序贯的(而不是例如和R-LPS合成交 错对插),这一事实便于更容易地根据所述嵌合寡糖的结构而描绘这些流感 嗜血菌基因产物的功能。
此外,用单克隆抗体筛选嵌合的LPS产物,使我 们能够探索所述质粒DNA起源的嗜血菌菌株特有的末端糖序列(表位)的形 成。
通过引用,将所引证的所有出版物及专利结合到本文中,就如同完整 叙述一样。
已根据特定的实施例和实施方案描述了本发明。
然而,不言而喻, 本领域技术熟练人员可以在本发明精神和范围内进行各种变化或修改。
               表1    细菌菌株、脂多糖及载体 菌株/质粒        有关的特征                             参考文献/来源大肠杆菌                                                (40) JM 109           recA,supE,hsR.Δ(lac-pro) 流感嗜血菌                                              (10) A2               亲株 质粒pGEM3Zf+         ApR                                   Promega Biotech pGEMLOS-4        ApR,包含感嗜血菌lsg基因座的7.4kb     本研究              bamHI-pstI DNA pGEMLOS-5        ApR,包含流感嗜血菌lsg基因座的5.5kb   本研究              hindIII-pstI DNA pGEMLOS-7        ApR,包含流感嗜血菌lsg基因座的2.8kb   本研究              sphI-pstI DNA 脂多糖pGEM             分离自用pGEM3zf+转化的菌株JM 109       本研究 pGEMLOS-4        分离自用质粒pGEMLOS-4转化的            本研究              菌株JM 109 pGEMLOS-5        分离自用质粒pGEMLOS-5转化的            本研究              菌株JM 109 pGEMLOS-7        分离自用质粒pGEMLOS-7转化的            本研究              菌株JM 109                        表2  来自pGEM、pGEMLOS-7、pGEMLOS-5、以及pGEMLOS-4的O-脱酰基                                        脂多糖的分子量(Mr)和所提出的组成a   pGEM
  pGEMLOS-7
  pGEMLOS-5
  pGEMLOS-4
 Mr计算值
                  所提出的组成














3172.7(43)
3093.2(97)
3050.4(67)
2970.1(100)
2958.5(90)

2836.7(87)

2738.4(40)













3457.8(41)
3335.5(43)

3093.5(74)

2970.6(100)
2958.8(76)

2836.7(68)

2738.8(41)






3947.4(38)
3904.4(25)
3824.6(100)
3701.6(90)
3603.8(31)




3094.0(42)

2970.8(68)
2959.5(87)
2941.9(56)
2836.7(90)
2819.2(70)
2739.0(62)
2616.5(39)
4247.8(40)
4207.4(26)
4125.5(46)
4084.2(27)


3824.4(40)
3701.3(100)
3603.6(26)








2960.2(60)

2836.7(99)
2818.8(49)
2738.7(54)
2616.2(39)
  4247.6
  4206.6
  4124.6
  4083.6
  3947.3
  3904.3
  3824.3
  3701.2
  3604.1
  3458.9
  3335.9
  3173.6
  3093.6
  3050.6
  2970.6
  2959.5
  2942.3
  2836.4
  2819.3
  2739.3
  2616.2
 3HexNAc  6Hex 4Hep 2Phos  1PEA 3Kdo  1O-DPLA
 2HexNAc  7Hex 4Hep 2Phos  1PEA 3Kdo  1O-DPLA
 3HexNAc  6Hex 4Hep 2Phos       3Kdo  1O-DPLA
 2HexNAc  7Hex 4Hep 2Phos       3Kdo  1O-DPLA
 2HexNAc  6Hex 4Hep 2Phos  2PEA 2Kdo  1O-DPLA
 2HexNAc  6Hex 4Hep 2Phos  1PEA 2Kdo  1O-DPLA
 2HexNAc  6Hex 4Hep 2Phos  1PEA 2Kdo  1O-DPLA
 2HexNAc  6Hex 4Hep 2Phos       2Kdo  1O-DPLA
 2HexNAc  6Hex 4Hep 2Phos  1PEA 1Kdo  1O-DPLA
 1HexNAc  5Hex 4Hep 2Phos  1PEA 2Kdo  1O-DPLA
 1HexNAc  5Hex 4Hep 2Phos       2Kdo  1O-DPLA
          4Hex 4Hep 3Phos  1PEA 2Kdo  1O-DPLA
          4Hex 4Hep 2Phos  1PEA 2Kdo  1O-DPLA
          4Hex 4Hep 3Phos       2Kdo  1O-DPLA
          4Hex 4Hep 2Phos       2Kdo  1O-DPLA
          3Hex 3Hep 2Phos  1PEA 3Kdo  1O-DPLA
          3Hex 3Hep 3Phos  2PEA 2Kdo  1O-DPLA
          3Hex 3Hep 2Phos       3Kdo  1O-DPLA
          3Hex 3Hep 3Phos  1PEA 2Kdo  1O-DPLA
          3Hex 3Hep 2Phos  1PEA 2Kdo  1O-DPLA
          3Hex 3Hep 2Phos       2Kdo  1O-DPLA
a在圆括号中给出相对的离子丰度。
在短划线上面的种类为嵌合结构。
                            表3  来自pGEM、pGEMLOS-7、pGEMLOS-5、                                以及pGEMLOS-4的寡糖的分子量(Mr)和组成a   pGEM
 pGEMLOS-7
 pGEMLOS-5
pGEM LOS-4
 Mr计算值
               所提出的组成












2016.7(13)
1937.2(50)
1893.5(51)
1814.0(100)



1582.9(49)
1539.2(51)
1459.3(78)








2302.5(30)
2177.7(45)
2058.6(23)

1937.1(52)

1814.0(54)
1743.9(19)
1705.8(24)
1622.4(15)
1582.8(100)

1459.9(50)





 2666.5(20)
 2543.9(58)





1937.1(15)

1814.0(19)

1705.9(11)
1622.5(14)
1582.8(53)
1539.3(16)
1459.9(100)
2870.0(12)
2828.6(10)
2747.8(13)
2706.1(12)
2666.7(13)
2544.0(31)










1705.8(14)

1582.9(68)
1539.3(19)
1459.8(100)
  2870.8
  2827.8
  2747.8
  2706.8
  2667.7
  2544.7
  2302.6
  2179.6
  2060.5
  2017.4
  1937.5
  1894.4
  1814.4
  1745.4
  1706.4
  1622.4
  1583.4
  1540.3
  1460.3
 3HexNAc  6Hex  4Hep  2Phos  1PEA 1Kdo
 3HexNAc  6Hex  4Hep  3Phos       1Kdo
 3HexNAc  6Hex  4Hep  2Phos       1Kdo
 2HexNAc  7Hex  4Hep  2Phos       1Kdo
 2HexNAc  6Hex  4Hep  2Phos  1PEA 1Kdo
 2HexNAc  6Hex  4Hep  2Phos       1Kdo
 1HexNAc  5Hex  4Hep  2Phos  1PEA 1Kdo
 1HexNAc  5Hex  4Hep  2Phos       1Kdo
          4Hex  4Hep  2Phos  2PEA 1Kdo
          4Hex  4Hep  3Phos  1PEA 1Kdo
          4Hex  4Hep  2Phos  1PEA 1Kdo
          4Hex  4Hep  3Phos       1Kdo
          4Hex  4Hep  2Phos       1Kdo
          4Hex  3Hep  2Phos  1PEA 1Kdo
          3Hex  3Hep  2Phos  2PEA 1Kdo
          4Hex  3Hep  2Phos       1Kdo
          3Hex  3Hep  2Phos  1PEA 1Kdo
          3Hex  3Hep  3Phos       1Kdo
          3Hex  3Hep  2Phos       1Kdo
a相对的离子丰度(在圆括号中给出的)表示特定种类的单种同位素分子离子峰和脱水峰之和(参见图4)。
在短划线上面列举 的组分为嵌合结构。
表4  来自pGEM、pGEMLOS-7、pGEMLOS-5、以及 pGEMLOS-4的去磷酸化寡糖的分子量(Mr)和所提出的组成a   级分

  Mr观测
    值
 (平均值)
      Mr计算值

          所提出的组成

(平均值)
(精确的)
pGEM(级分2)
pGEM(级分1)
pGEMLOS-7
pGEMLOS-5
pGEMLOS-4
(级分2)
pGEMLOS-4
(级分1)


  1300.8
  1655.3
  2020.3
  2386.3
  2386.3

  2386.1

  2548.4
  2589.5
 1301.1
 1655.4
 2020.8
 2386.1
 2386.1

 2386.1

 2548.2
 2389.3
 1300.4
 1654.5
 2019.7
 2384.8
 2384.8

 2384.8

 2546.8
 2587.9
          3Hex  3Hep  1Kdo
          4Hex  4Hep  1Kdo
 1HexNAc  5Hex  4Hep  1Kdo
 2HexNAc  6Hex  4Hep  1Kdo
 2HexNAc  6Hex  4Hep  1Kdo

 2HexNAc  6Hex  4Hep  1Kdo

 2HexNAc  7Hex  4Hep  1Kdo
 3HexNAc  6Hex  4Hep  1Kdo
a以平均质量值的形式报道分子量观测值。
           表5  所述去磷酸化寡糖级分的单糖组成a    pGEM
  (级分2)

   pGEM
  (级分1)

   pGEM-
   LOS-7

   pGEM-
   LOS-5

   pGEM-
   LOS-4
  (级分2)
   pGEM-
   LOS-4
  (级分1)
  GlcN
    1.0
    2.7
    2.4
    3.3
  Gal
    0.9
    1.1
    1.7
    3.0
    2.8
    3.1
  Glc
    2.2
    3.2
    3.2
    3.4
    3.4
    3.4
  Hep
    3.0
    4.0
    4.0
    4.0
    4.0
    4.0
a根据与鼠伤寒沙门氏菌Ra的已知组成之寡糖的水解产物比较而得到摩尔比,然后, 在每个级分中,按照或者3.0个庚糖、或者4.0个庚糖,将那些值归一化。
               表6  所述去磷酸化寡糖级分的甲基化分析a    pGEM
  (级分2)

   pGEM
  (级分1)

   pGEM-
   LOS-7

   pGEM-
   LOS-5

   pGEM-
   LOS-4
  (级分2)
   pGEM-
   LOS-4
  (级分1)
 T-Glc
    0.5
    0.2
 T-Gal
    0.6
    0.5
    1.2
    0.9
    0.7
    0.7
 1,2-Glc
    0.2
    0.7
    1.0
    0.8
    0.8
    0.7
 1,3-Gal
    0.4
    0.5
    0.6
 1,6-Glc
    0.4
    1.1
    1.6
    1.5
    1.3
    1.3
 1,6-Gal
    0.3
    0.6
 1,3,6-Glc
    1.0
    1.0
    1.0
    1.0
    1.0
    1.0
 T-Hep
    0.3
    0.6
    0.6
    0.3
    0.3
    0.2
 1,3-Hep
    0.3
    0.3
    0.3
    0.4
    0.6
    0.4
 1,7-Hep
    0.4
    0.6
    0.5
    0.6
 1,3,7-Hep
    0.4
    0.4
    0.2
    0.3
    0.5
    0.5
 T-GlcNAc
    0.1
    0.2
    0.2
    0.3
 1,4-GlcNAc
    0.9
    1.1
    1.0
 1,3-GlcNAc
    0.3
    0.7
    0.7
    1.0
a测量来自GC/MS EI的总离子层析谱的峰面积,并按照所述1,3,6-葡萄糖残基将数值 归一化。
pGEMLOS-7的数据是两次试验的平均值。
                                                基因同源性表 Lsg   同源基因/蛋白                参考  蛋白的         蛋白功能                     所提出的嗜血菌                                文献  同源性                                      基因产物的功能 LsgA  来自大肠杆菌的Wzx             (1)  22%同一性     推定的O-抗原转运蛋白         翻转酶?a                                     44%阳性   来自小肠结肠炎耶尔森氏菌的    (2)  24%同一性     推定的O-抗原转运蛋白   TrsA 44%阳性   来自脆弱拟杆菌(Bacteroides    (3)  20%同一性     推定的O-抗原翻转酶   fragilis)的Wzx                     36%阳性 LsgB  来自脑膜炎奈瑟氏球菌的唾液酸  (4)  27%同一性     α-2,3-唾液酸转移酶         唾液酸转移酶或其它的   转移酶基因                         46%阳性                                    葡萄糖基转移酶bLsgC  来自解淀粉欧文氏菌(Erwinia    (5)  26%同一性     半乳糖基转移酶               1,4-半乳糖基转移酶   amylovora)的AsmD                   47%阳性   来自小肠结肠炎耶尔森氏菌的    (6)  38%同一性     与脂多糖内部核心的合成有关   TrsD                               52%阳性 Lsg   同源基因/蛋白                参考   蛋白的       蛋白功能                             所提出的嗜血菌                                文献   同源性                                            基因产物的功能 LsgD  来自淋病奈瑟氏球菌的LgtE      (7)   22%同一性    乳-N-新丁糖(lacto-N-neotetraose)葡  1,3-N-乙酰葡糖胺基转移酶c                                      40%阳性      萄糖基转移酶   来自淋病奈瑟氏球菌和脑膜炎奈  (8)   24%同一性    乳-N-新丁糖葡萄糖基转移酶   瑟氏球菌的LgtB                      41%阳性 LsgE  来自种名未定之放线杆菌的推定  (9)   77%同一性    推定的葡萄糖基转移酶    半乳糖基转移酶d  的葡萄糖基转移酶基因                84%阳性   来自解淀粉欧文氏菌的AsmB      (5)   27%同一性    半乳糖基转移酶                                       49%阳性   来自普氏立克次体(Rickettsia   (10)  23%同一性    葡萄糖基转移酶   rowazekii)的LgtD                    47%阳性 LsgF  来自解淀粉欧文氏菌的AsmD      (5)   45%同一性    半乳糖基转移酶          1,3-半乳糖基转移酶                                       66%阳性   来自种名未定之放线杆菌的推定  (11)  83%同一性    葡萄糖基转移酶     的脱氧-L-talan合成基因              90%阳性   来自大肠杆菌的GDP-甘露糖生物  (12)  37%同一性    葡萄糖基转移酶   合成的基因                          54%阳性 LsgG  来自大肠杆菌的ModE            (13)  47%同一性    钼转运以及转录的调节    大肠杆菌wecA基因的调节或                                       64%阳性                              调整,这导致GlcNAc添加到                                                                             所述分支庚糖上   来自荚膜红细菌(Rhodobacter    (14)  32%同一性    钼-蝶呤-结合蛋白   capsulatus)的MopB                   51%阳性 a当lsgA和lsgB两者都存在时,可以用一个6-联半乳糖或GlcNAc延伸该pGEMLOS-5的四糖结构,从而形成在pGEMLOS-4的LPS 中发现的结构;所述结构也包含一个第三Kdo部分,该Kdo部分可能是被MAb 6E4识别的表位。
因此,嗜血菌的这两种可读框的功能 仍不清楚。
b近来关于lst和lsgB双基因剔除的研究暗示:lsgB也可能编码一种唾液酸转移酶,lst是一种与杜氏嗜血菌(Haemophilus ducreyi)(15) 中的唾液酸转移酶有着高度同源性的基因。
cpGEMLOS-5 LPS的结构暗示:三个可读框C、D或E中的一个编码一种1,3-N-乙酰葡糖胺基转移酶,且另一个编码一种1,4-半乳糖 基转移酶。
基于我们先前对当分别在突变株281.25和276.4中剔除lsgD或lsgE时所形成的LOS的研究(16),我们可以推断出:lsgD 可能编码一种1,3-N-乙酰葡糖胺基转移酶,lsgC和lsgE两者可能都编码半乳糖基转移酶。
d在剔除lsgE时(16)所形成的LOS暗示:lsgE编码一种半乳糖基转移酶,该酶的受体在所述嵌合LPS中可能不存在。
                   基因同源性表的参考文献 1.  Yao,Z.和Valvano,M.A., J.Bacteriol.176,4144-4156(1994)。
2.  Zhang,L.,Radziejewska-Lebrecht,J.Krajewska-Pietrasik,D.,Toivanen, P.和Skumik,M., Mol.Microbiol.23,(1),63-76(1997)。
3.  Comstock,L.E.,Coyne,M.J.,Tzianabos,A.O.,Pantosti,A., Onderdonk,A.B.和Kasper,D.L., Infect.Immun.67(7),3525-3532 (1999)。
4.  Gilbert,M.,Watson,D.C.,Cunningham,A.M.,Jennings,M.P.,Young, N.M.和Wakarchuk,W.W., J.Biol.Chem.271,(45),28271-28276 (1996)。
5.  Bugert,P.和Geider,K., Mol.Microbiol.15(5),917-933(1995)。
6.  Skurnik,M.,Venho,R.,Toivanen,P.和al-Hendy,A., Mol.Microbiol.17(3),575-594(1995)。
7.  Gotshlich,E.C., J.Exp.Med.180(6),2181-2190(1994)。
8.  Jennings,M.P.,Hood,D.W.,Peak,I.R.,Virji,M.和Moxon,E.R., Mol.Microbiol.18(4),729-740(1995)。
9.  Yoshida,Y.,Nakano,Y.,Yamashita,Y.和Koga,T., Infect.Immun.66, 107-114(1998)。
10. Andersson,S.G.,Zomorodipour,A.,Andersson,J.O.,Sicheritz-Ponten, T.,Alsmark,U.C.,Podowski,R.M.,Naslund,A.K.,Eriksson,A.S., Winkler,H.H.和Kurland,C.G., Nature396(6707),133-140(1998)。
11. Nakano,Y.,Yoshida,Y.,Yamashita,Y.和Koga,T., Biochim.Biophys.Acta1442(2-3),409-414(1998)。
12. Marolda,C.L.和Valvano,M.A., J.Bacteriol.177(19),5539-5546 (1995)。
13. Grunden,A.M.,Ray,R.M.,Rosentel,J.K.,Healy,R.G.和 Shanmugam,K.T., J.Bacteriol.178(3),735-744(1996)。
14. Wang,G.,Angermuller,S.和Klipp,W., J.Bacteriol.175(10),3031- 3042(1993)。
15. Bozue,J.A.,Tulius,M.V.,Wang,J.,Gibson,B.W.和Munson,R.S., Jr., J.Biol.Chem.274.(7),4106-4114(1999)。
16. Phillips,N.J.,McLaughlin,R.,Miller,T.J.,Apicella,M.A.和Gibson, B.W., Biochemistry35,5937-5947(1996)。
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