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基本信息
- 申请号 CN00810395.X
- 公开号 CN1364179A
- 申请日 2000/07/04
- 公开日 2002/08/14
- 申请人 梅蒂诺瓦医学学术研究创新有限公司
- 优先权日期
- 发明人 T·克塞尔 H·彼得森 D·费斯彻 K·古纳斯 A·范哈尔普
- 主分类号
- 申请人地址 德国马尔堡
- 分类号
- 专利代理机构 中国国际贸易促进委员会专利商标事务所
- 当前专利状态 发明专利申请公布
- 代理人 刘明海
- 有效性 发明公开
- 法律状态 无
摘要
本发明涉及式A(－X－B)n或C(－Y－D)m的阳离子嵌段共聚物,其中A代表亲水性聚合物,B为聚乙烯亚胺(PEI),X为连接体,n为1－200,C为PEI,D为聚乙二醇残基,Y为连接体和m为1－200。
本发明还涉及阳离子嵌段共聚物的制备工艺和作为表面活性剂和用于与核酸复合的用途。
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本发明还涉及阳离子嵌段共聚物的制备工艺和作为表面活性剂和用于与核酸复合的用途。
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权利要求书
1.一种公式I或II的化合物 (I)A(-X-B)n (II)C(-Y-D)m 其中 A 为一种亲水的，非离子的，线性或支化的聚合物，该聚合物具 有分子量为100到10 000 000克/摩尔； B 为一种线性或支化的聚乙烯亚胺(PEI)，其具有分子量为100 到1 000 000克/摩尔； X 为嵌段A与B的直接键或具有以下结构的连接体： -OC(O)NH(CH2)oNHC(O)NH-，其中o＝1到20， -OC(O)NH(芳基)NHC(O)NH-，其中芳基＝芳香单元 -O(CH2)pC(O)NH-，其中p＝1到10， -OC(O)NH-，或 -O(CH2)qNH-，其中q＝1到20； n为从1到200的整数； C 为线性或支化的PEI，其具有分子量为100到1 000 000克/ 摩尔； D 为下式的经O连接的聚乙二醇的残基，其 -(CH2CH2O)n’-R1其中n’为3到25 000，且R1为氢，脂肪基团或另一种OH-保护基 团或一种细胞配体； Y 为嵌段C与D的直接键或具有以下结构的连接体： -NHC(O)NH(CH2)sNHC(O)O-，其中s＝1到20， -NHC(O)NH(芳基)NHC(O)O-，其中芳基＝芳香单元， -NH(CH2)tC(O)O-，其中t＝2到10， -NHCH2CH(OH)CH2O-，或 -NH(CH2)uO-，其中u＝1到20， 且m为从1到200的整数。
2.如权利要求1所述的化合物，其中 A 为一种亲水的，非离子的，线性或支化的聚合物，该聚合物具 有分子量为1000到100 000克/摩尔； B 为一种线性或支化的聚乙烯亚胺(PEI)，其具有分子量为400 到100 000克/摩尔； X 为嵌段A与B的直接键或具有以下结构的连接体： -OC(O)NH(CH2)oNHC(O)NH-，其中o＝2到10， -OC(O)NH(芳基)NHC(O)NH-，其中芳基＝具有一种核的芳香单元， -O(CH2)pC(O)NH-，其中p＝1到3， -OCH2CH(OH)CH2NH-， -OC(O)NH-，或 -O(CH2)qNH-，其中q＝1到6， n为整数从1到50， C 为线性或支化的PEI，其具有分子量为400到100 000克/摩尔； D 为如下式的经O连接的聚乙二醇的残基， -(CH2CH2O)n’-R1其中n’为10到5000，R1为氢，脂肪基团或另一种OH-保护 基团或一种细胞配体； Y 为嵌段C与D的直接键或具有以下结构的连接体： -NHC(O)NH(CH2)sNHC(O)O-，其中s＝2到10， -NHC(O)NH(芳基)NHC(O)O-，其中芳基＝具有一种核的芳香单元， -NH(CH2)tC(O)O-，其中t＝2到3， -NHCH2CH(OH)CH2O-，或 -NH(CH2)uO-，其中u＝1到6； 且m为整数从1到100。
3.如权利要求1或2所述的化合物，其中 A 为一种亲水的，非离子的，线性或支化的聚合物，该聚合物具 有分子量为5000到50 000克/摩尔； B 为一种线性或支化的聚乙烯亚胺(PEI)，其具有分子量为400 到50 000克/摩尔； X 为嵌段A与B的直接键或具有以下结构的连接体： -OC(O)NH(CH2)oNHC(O)NH-，其中o＝4到6， -OC(O)NH(芳基)NHC(O)NH-，其中芳基＝甲苯基， -O(CH2)pC(O)NH-，其中p＝1， -OCH2CH(OH)CH2NH-， -OC(O)NH-，或 -O(CH2)qNH-，其中q＝1到3； n为整数从1到12； C 为线性或支化的PEI，其具有分子量为400到50 000克/摩尔； D 为如下式的经O连接的聚乙二醇的残基 -(CH2CH2O)n’-R1其中n’为10到1000，且R1为氢，脂肪基团或另一种OH-保 护基团或一种细胞配体； Y 为嵌段C与D的直接键或具有以下结构的连接体： -NHC(O)NH(CH2)sNHC(O)O-，其中s＝4到6， -NHC(O)NH(芳基)NHC(O)O-，其中芳基＝甲苯基， -NH(CH2)tC(O)O-，其中t＝2， -NHCH2CH(OH)CH2O-，或 -NH(CH2)uO-，其中u＝1到3； 且m为整数从1到50。
4.如权利要求1到3中任何一项所述的化合物，其具有公式I。
5.如权利要求1到3中任何一项所述的化合物，其具有公式II。
6.如权利要求1到4中任何一项所述的化合物，其中X为如式 -OC(O)NH(CH2)ONHC(O)NH-的连接体。
7.如权利要求1到3及5中任何一项所述的化合物，其中Y为如 式-NHC(O)NH(CH2)sNHC(O)O-的连接体。
8.如权利要求1到4中任何一项所述的公式I的化合物的制备工 艺，其中包括 a) 通式V的化合物 (V)A-(OH)n，其中A与n＝如公式I中 与二异氰酸酯反应，或 b) 将通式VI的化合物 (VI)A-(NH2)n(其中A与n＝如公式I所定义) 在开始聚合之前或直到聚合反应进行过程中加入到乙烯亚胺聚合 的反应混合物中，或 c) 采用通式VII的化合物 (VII)A-(OS(O)2R4)n其中A如公式I中且R4＝脂肪的或芳香的基 团，作为乙烯亚胺聚合的宏观引发剂。
9.如权利要求1到3及5中任何一项所述的公式II化合物制备 工艺，其中包括通式IX的化合物 (IX)D-OH(其中D如公式II所定义) 首先与二异氰酸酯反应，随后所得的化合物与线性或支化的聚乙 烯亚胺反应。
10.如权利要求1到7中任何一项所述的化合物的用途，是作为 表面活性剂。
11.如权利要求1到7中任何一项所述的化合物的用途，是用于 在水性体系中聚核酸的复合。
12.如权利要求1到7中任何一项所述的化合物的用途，是用于 在水性体系中DNA的复合。
13.如权利要求1到7中任何一项所述的化合物的用途，是用于 在水性体系中RNA的复合。
14.如权利要求1到7中任何一项所述的化合物的用途，是用于 在水性体系中核糖酶的复合。
15.一种组合物，其包括至少一种核酸及一种如权利要求1到7 中任何一项所述的化合物。
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说明书
WO 98/59064揭示了PEI-PEG嵌段共聚物以及它们作为运输核酸 进入到更高级的真核生物细胞中的媒介的应用。
所述的共聚物是由支 化的PEI与线性的PEG组成。
采用甲氧基-琥珀酰亚胺基-丙酸酯-PEG 将PEI进行PEG化。
S.V.Vinogradov，T.K.Bronich与A.V.Kabanov (Bioconjugate Chem.1998，9，805-812)描述了PEI-PEG与聚精胺 -PEG嵌段共聚物的制备，该制备是采用支化的PEI与支化的聚精胺与 一种用1，1’-羰基二咪唑活化的单甲氧基-PEG通过偶联反应来进行。
该共聚物用于与低聚核苷酸的复合。
L.M.Bronstein，M.Antonietti等人(Inorganica Chimica Acta 1998，280，348-354)描述了PEI-PEG嵌段共聚物及其制备，是通过 支化的PEI与具有末端酰基氯官能团的单甲氧基-PEG的偶联来进行， 并且描述了其在制备金属胶体方面的应用。
V.Toncheva等人(Biochimica et Biophysika Acta 1998， 138，354-358)涉及了由聚(L-赖氨酸)与一系列亲水聚合物，例如 PEG，葡聚糖及聚(N-(2-羟丙基)-甲基丙烯酰胺组成的嵌段共聚物， 及其制备工艺与它们作为核酸基因转移的媒介方面的用途。
这些已知的嵌段共聚物共同具有以下三点： 1.阳离子聚合物带有为亲水的，非离子聚合物侧枝。
2.在所有情况下，为此目的，亲水的，非离子聚合物的反应端基为 了与阳离子聚合物的偶联反应而被一种试剂活化，该试剂在所生成的 共聚物中表示为嵌段之间的连接体。
3.亲水的，非离子聚合物在所有情况下为线性的聚合物。
通式I与II的新型阳离子嵌段共聚物 (I)A(-X-B)n (II)C(-Y-D)m 已被发现，其中 A 为一种亲水的，非离子的，线性或支化的聚合物，该聚合物具有分 子量为100到10 000 000克/摩尔，优选1000到100 000克/摩尔且 特别为5000到50 000克/摩尔； B 为一种线性或支化的聚乙烯亚胺(PEI)，其具有分子量为100到 1 000 000克/摩尔，优选400到100 000克/摩尔且特别为400到50 000克/摩尔； X 为嵌段A与B的直接键或具有以下结构的连接体： -OC(O)NH(CH2)oNHC(O)NH-，其中o＝1到20，优选2到10，特别为4 到6， -OC(O)NH(芳基)NHC(O)NH-，其中芳基＝优选含有一个或多个芳香核的 6到14个碳原子的芳香单元，其以稠合或以聚苯基的形式连接在一起， 优选具有一个核，特别为甲苯基， -O(CH2)pC(O)NH-，其中p＝1到10，优选1到3，特别为1， -OCH2CH(OH)CH2NH-， -OC(O)NH-，或 -O(CH2)qNH-，其中q＝1到20，优选1到6，特别为1到3； n为整数从1)1到200，优选 2)1到50， 3)1到12， 4)1到8或，特别优选 5)2到8； C 为线性或支化的PEI，其具有分子量为100到1 000 000克/摩尔， 优选400到100 000克/摩尔，且特别为400到50 000克/摩尔； D 为下式的经O连接的聚乙二醇的残基 -(CH2CH2O)n’-R1其中n’为3到25 000，优选10到5000且特别为10到1000，R1为 氢，脂肪基团如(C1-C6)-烷基(甲基，乙基，叔-丁基及类似的基团) 或另一种OH-保护基团例如酰基(如任意取代的苯甲酰氧羰基)，任 意取代的苯甲基，吡啶甲基，或一种细胞配体，以便通过结合在细胞 表面的蛋白质，特别是受体，而引起核酸-共聚物复合物的特定的吸收； Y 为嵌段C与D的直接键或具有以下结构的连接体： -NHC(O)NH(CH2)sNHC(O)O-，其中s＝1到20，优选2到10，特别为4 到6， -NHC(O)NH(芳基)NHC(O)O-，其中芳基＝优选含有一个或多个芳香核的 6到14个碳原子的芳香单元，其以稠合或以聚苯基的形式连接在一起， 优选具有一个核，特别为甲苯基， -NH(CH2)tC(O)O-，其中t＝2到10，优选2到3，特别为2， -NHCH2CH(OH)CH2O-，或 -NH(CH2)uO-，其中u＝1到20，优选1到6，特别为1到3； 且m为整数，从1)1到200，优选 2)1到100，特别为 3)1到50。
本发明的阳离子嵌段共聚物在以下三个特征中的至少一个方面与 已知的嵌段共聚物不同： 1.亲水的，非离子聚合物带有阳离子聚合物侧枝。
2.连接体与那些已知的嵌段共聚物不同。
3.它们具有支化的亲水的，非离子聚合物。
A优选表示由碳与氧构成的线性或支化的聚合物，其中适当也可 含有环状的，星型的或树状的结构，例如象线性PEG残基，多侧枝的 接枝PEG，星型PEG，聚糖包括环糊精，PVA，树状醇(具有羟基端基 的树状体)，但优选线性及多侧枝的接枝及星型PEG。
后者可从Aldrich， Fluka，Sigma及Shearwater是商业途径可得的。
B与C代表线性或支化的聚乙烯亚胺残基，其具有公式III (III) -[CH2CH2N(Z+)(R2)x]y-H[A-]w其中R2为相同或不同的基团且为氢或公式IV的基团 (IV) -[CH2CH2N(Z’+)(R3)x’]y’-H[A-]w’R3为相同或不同的基团，其(回归地)如R2所定义， A-为适合，优选无机阴离子的等价体，如OH-，Cl-，Br-及类似的离子， x与x’为相同或不同且为1或2， y与y’为相同或不同且为选取的整数以便基团B与C具有组成分子量 为100到1 000 000克/摩尔，优选400到100 000克/摩尔，且特别 为400到50 000克/摩尔，y’也可能为0， z与z’为相同或不同，z＝x-1且z’＝x’-1，且 w与w’为相同或不同的整数，选取为以便平衡在公式III与IV的基团中 的正电荷。
聚乙烯亚胺可采用广为人知的方式来制备或从商业途径可得，从 BASF商品名称为Lupasol或以聚乙烯亚胺或乙烯亚胺聚合物为名称， 以不同的分子量从400到2 000 000克/摩尔(从Aldrich，Sigma， Fluka或直接从BASF)。
优选具有分子量为400到2000克/摩尔的聚 乙烯亚胺为B以及具有分子量为400到800 000克/摩尔，特别优选 400到25 000克/摩尔的聚乙烯亚胺为C。
D中所述的基团为聚乙二醇的残基，其一端被基团R1，例如象甲基 或另一种适合的保护基团保护。
然而，R1也可为一种执行特定的或非 特定的生物功能的基团，特别是对于与受体相互作用的配体，其针对 目标细胞将嵌段共聚物-活性物质复合物特定吸收到更高级的真核细 胞及其细胞核中，其中的活性物质优选为一种低聚核苷酸或一种基因 (基因打靶)。
因此，R1也可为一种针对特定的相互作用并吸收进入 目标器官组织或细胞的配体，例如蛋白质，特别为抗体或抗体碎片， 例如Fab，F(ab)2，scFv，细胞因子或淋巴因子，例如白介素(IL-2到 x)，干扰素GM-CSF，生长因子例如EGF，PDGF，FGF，EPO，整联蛋白 例如ICAM，VCAM或糖蛋白类如外源凝集素或糖基化蛋白质(见前)或 脂蛋白如LDL，HDL或转移蛋白如铁转移蛋白或肽如LH-RH，降血钙素， 催产素，胰岛素，生长激素释放抑制因子，IGF，RGD或碳水化合物如 半乳糖，甘露糖，葡萄糖，乳糖或激素如类固醇，THR或维生素如B12叶酸。
本发明也涉及公式I的化合物的制备工艺，其中包括 a) 通式V的化合物 (V)A-(OH)n，其中A与n＝如公式I中 与二异氰酸酯，优选1，6-己二异氰酸酯反应，以及由此得到的化合物 与通式III与IV中的聚乙烯亚胺反应，或 b) 将通式VI的化合物 (VI)A-(NH2)n(其中A与n＝如公式I所定义) 在开始聚合之前或直到聚合反应进行过程加入到乙烯亚胺聚合的反应 混合物中，或 c) 采用通式VII的化合物 (VII)A-(OS(O)2R4)n其中A如公式I中且R4＝脂肪的或芳香的基团， 优选对-甲苯基，氟化物，三氟甲基或甲基， 作为乙烯亚胺聚合的宏观引发剂。
公式VI的化合物以不同的分子量是商业途径可得的，例如从 Shearwater。
通式VII的化合物可通过通式V的化合物与通式VIII的化合物反 应来获得。
(VIII)Cl-S(O)2R4(R4如上所定义)。
本发明进一步涉及公式II的化合物的制备工艺，其中包括 d) 通式IX的化合物 (IX)D-OH(其中D如公式II所定义) 首先与二异氰酸酯，优选1，6-己二异氰酸酯反应，随后所得的化合物 与线性或支化的聚乙烯亚胺反应。
所引入的保护羟基用的保护基团可 以一种广为人知的方式来消除(参见，例如Büllesbach， Kontakte(Merck)1/1980，23页以及下列等等)。
由a)所述的工艺优选以这样的方法来进行，即聚合物嵌段A的每 一个端羟基采用4-或20-倍过量的二异氰酸酯，优选1，6-己二异氰酸 酯。
反应在氯仿中进行，温度从室温到溶剂的沸点，但优选在溶剂的 沸点。
所述的反应时间在2与24小时之间，但优选4小时。
在反应混 合物中的聚合物浓度在10克/升与500克/升之间，优选100克/升。
产物通过减压下除去溶剂并通过采用石油醚(沸程：40-60℃)反复萃 取以除去过量的二异氰酸酯的方法来分离。
此中间产物与起始化合物 的每一个端羟基的3-到10倍过量的PEI大分子反应。
反应在氯仿中 进行，温度从室温到溶剂的沸点，但优选在溶剂的沸点。
所选择的反 应时间在6与72小时之间，但优选12小时。
在反应混合物中的聚合 物浓度，包括那些PEI与那些已被1，6-己二异氰酸酯活化的非离子亲 水聚合物，均在10克/升与500克/升之间，优选在30-200克/升之间。
产物通过在10到30倍体积过量的乙醚中将聚合物沉淀的方法来分离。
可通过以乙醇及乙醚作为溶剂的反复再沉淀的方法从嵌段共聚物中除 去过量的PEI。
由b)所述的工艺通过将乙烯亚胺与氨基封端的亲水的非离子聚合 物在水中混合的方法来进行，在每种情况下浓度为10克/升到500克/ 升。
两种组分的摩尔比在1∶10到1∶10 000之间。
然后通过加入适 合的催化剂例如盐酸，来引发乙烯亚胺的聚合，并且将混合物升温至 40到100℃。
通过链断裂反应生成共聚物。
嵌段共聚物在适当溶剂例 如乙醇及乙醚，的辅助下反复再沉淀，和/或通过加压过滤来除去可能 成为副产物的PEI均聚物。
此制备工艺的一个变例包括刚好在30分钟 到72小时的某一反应时间之后在热的聚合混合物中加入氨基封端的 亲水的非离子聚合物。
由c)所述的工艺通过聚合物嵌段A的端羟基与通式VIII的磺酰氯 但特别是与甲苯磺酰氯的反应来进行。
此反应在水性和/或极性有机溶 剂中进行，优选在一种水/四氢呋喃混合物中，温度从-10℃到溶剂的 沸点，优选温度从0℃到25℃，且(如果需要)在催化剂存在下，例 如，象三乙胺或氢氧化钠。
产物通过减压下除去溶剂的方法来分离。
此聚合物随后用作乙烯亚胺聚合的宏观引发剂。
为此目的，通式VII 的产物与乙烯亚胺在水性或极性有机溶剂中反应，温度从0℃到溶剂 的沸点。
两个组分的摩尔比在1∶10到1∶10 000之间。
在此反应中 没有副产物产生。
最终的产物可通过在适当的溶剂，例如象乙醚中沉 淀聚合物的方法来分离。
由d)所述的工艺优选通过通式IX的化合物 与小量过量的，优选2-到10-倍过量的二异氰酸酯，优选1，6-己二异 氰酸酯的反应来进行。
反应在氯仿中进行，温度从20℃到溶剂的沸点， 但优选在溶剂的沸点。
所选的反应时间在2与24小时之间，但优选10 至14小时。
在反应混合物中的聚合物浓度在10克/升与500克/升之 间，优选30到150克/升。
产物通过减压下除去溶剂并通过采用石油 醚(沸程40-60℃)反复萃取以除去过量二异氰酸酯的方法来分离。
此中间产物与PEI大分子以摩尔比1∶1到100∶1的条件下反应。
反 应在氯仿中进行且，如需要，在温度从室温到溶剂沸点下加入二甲基 甲酰胺，但优选在60-70℃。
所选的反应时间在6与72小时之间，但 优选12小时。
在反应混合物中聚合物的浓度，那些PEI与那些以1，6- 己二异氰酸酯活化的非离子亲水的聚合物的浓度均在10克/升与500 克/升之间，优选在30到200克/升之间。
产物通过在10到30到倍体 积过量的乙醚中沉淀聚合物的方法来分离。
与PEI相比，新型化合物具有以下的特性： 在细胞毒性测试中嵌段共聚物比PEI均聚物具有更低的毒性且在 血液循环中可保持更长的时间(见“生物学实施例”部分) 嵌段共聚物根据其结构为较好或较差的表面活性物质，其可用作 表面活性剂。
另外，嵌段共聚物也可用于 · 在胶粘剂及涂层体系中作为添加剂 · 作为提高纸张强度的固定剂 · 作为聚合物复合体系例如，象多层包装膜的底漆 · 用于改性塑料(提高其可染性，可涂性，阻挡效应) · 用于将活性染料固定在棉花上 · 作为用于工业废水的细小悬浮粒子的凝结剂与分散剂 · 用于结合重金属盐 · 用于分散有机与无机的颜料 · 作为在陶瓷与水泥组份中的添加剂 · 在皮肤及头发护理及在牙齿方面的广泛的不同的功能 · 用于药用活性物质或生物活性化合物固定在表面上 · 用于从血浆中过滤出内毒素与病原体 · 用于渗透通过粘膜。
另外，在水性体系中嵌段共聚物与聚核酸如DNA与RNA，包括核糖 酶形成配合物。
此特性使得它们适于作为基因转移的运载体或媒介物 (渗透通过细胞膜及转移进入到细胞核中)。
因此它们可用在转染实 验中，在基因治疗及诊断中(见“生物学实施例”部分)。
以下实施例用于说明本发明，并未对其加以限制。
化学实施例 实施例1： PEI(PEG)n嵌段共聚物的制备 mPEG-550的活化 将10毫升氯仿加入到配有磁力搅拌棒，回流冷凝管且顶端装有干 燥管的100毫升圆底烧瓶中，并加入7毫升1，6-己二异氰酸酯(HMDI) (43.64毫摩尔，8个当量)。
将3克聚乙烯氧化物单甲醚(mPEG，Mn＝550 克/摩尔)(5.45毫摩尔，1个当量)溶解在40毫升氯仿中。
然后将 此溶液缓慢滴加到搅拌的HMDI溶液中。
加热混合物在回流下保持12 小时。
然后在减压下除去溶剂，并用石油醚(40-60)(5×50毫升) 萃取过量的HMDI。
以几乎定量的产率(3.8克，97％)得到无色可流动 的油状物。
PEI-接枝-PEG嵌段共聚物的制备 称取1.74克bPEI(Mw＝25kDa，Mn＝10kDa，0.1736毫摩尔，1个当 量)加入到配有磁力搅拌棒，回流冷凝管且顶端装有干燥管的100毫 升圆底烧瓶中，并溶解在40毫升二甲基甲酰胺(DMF)中。
将2.5克 HMDI-活化的mPEG(Mn＝720Da，3.47毫摩尔)溶解在10毫升氯仿中， 将此溶液缓慢滴加到搅拌的PEI溶液中。
混合物在60-70℃下加热12 小时。
然后将混合物滴加到500毫升乙醚中。
两小时后，沉淀出黄色 粘稠油状物。
倾析出浮在表面的混浊层，并将油状物溶解在30毫升乙 醇中。
再次将溶液滴加到500毫升乙醚中，滗析分离再次分出的油状 物。
为了过滤将产物溶解在乙醇中，并在真空烘箱中于50℃除去溶剂。
得到2.8克黄色粘稠到树脂状油(产率：45％)。
聚合物通过1H与13C NMR光谱及凝胶渗透色谱来表征。
由第一实施 例得到以下数据。
由于得到的数据是相似的，它们可代表其它的实施 例。
1H NMR(500MHz，CDCl3)：δ/ppm＝1.17(异氰酸酯CH2)，1.26(异氰 酸酯CH2)，2.30-2.72(乙烯亚胺CH2)，2.96(异氰酸酯CH2)，3.15(异 氰酸酯CH2)，3.49(乙二醇CH2)。
13C NMR(125MHz，CDCl3)：δ/ppm 14.3(异氰酸酯CH2)，26.2(异氰 酸酯CH2)，29.6(异氰酸酯CH2)，36.2(异氰酸酯CH2)，37.5(乙烯亚 胺CH2)，39.1(乙烯亚胺CH2)，41.1(异氰酸酯CH2)，47.2(乙烯亚胺 CH2)，48.9(乙烯亚胺CH2)，52.8(乙烯亚胺CH2)，54.1(乙烯亚胺CH2)， 58.7(异氰酸酯CH2)，69.3及70.2及71.6(乙二醇CH2)， 156.2(-NHC(O)O-)，161.7(-NHC(O)NH-)。
GPC(甲基丙烯酸氨基乙基酯凝胶，1％甲酸，0.5毫升/分钟，25℃， 采用Pullulan标准校正)：Mn＝8800，Mw＝1 640 000，Mp＝85 000， PD＝19.6，单一模式。
与PEI(Aldrich，25kDa)与mPEG(Aldrich，550Da)共混物对比： Mn＝69 000，Mw＝1 480 000，Mp＝99 000及1100，PD＝2.1，双模式。
第一实施例的聚合物的表面活性的研究是通过Lecomte du Nouy(环方法)的方法采用张力计在22℃下进行的。
测定了溶液对空气 的表面张力。
仪器用极纯水校正，其也用作聚合物样品的溶剂。
所测数据：бmin＝51毫牛/米，CMC＝15毫克/毫升。
以下可以同样的方式来制备：(所有起始化合物都从Aldrich获得)
将2克八侧枝的PEG(bPEG，MW＝10kDa，0.2毫摩尔，1个当 量)在20毫升氯仿中的溶液缓慢滴入搅拌的HMDI溶液中。
混合物沸腾 4小时，然后在室温下再搅拌8小时。
在减压下除去溶剂，用石油醚 (40-60)(3×50毫升)萃取过量的HMDI。
得到红色油状物，产率为 58％(1.38克)。
PEG-接枝-PEI嵌段共聚物的制备 在配有磁力搅拌棒，回流冷凝管且顶端装有干燥管的100毫升圆底 烧瓶中，将2.20克接枝PEI(bPEI，Mw＝800Da，Mn＝600Da，3.66毫 摩尔，25个当量)溶解在20毫升氯仿中。
将1.21克HMDI-活化的 bPEG(Mn＝8.5kDa，0.14毫摩尔，1个当量)在30毫升氯仿中的溶液于 室温下缓慢滴入搅拌的PEI溶液中。
混合物沸腾12小时。
然后在搅拌 过程中将溶液缓慢滴入500毫升乙醚中。
12小时后，沉淀出黄色粘稠 油状物。
倾析出浮在表面的混浊层，并将油状物溶解在50毫升乙醇中。
再次将溶液滴加到500毫升乙醚中，通过倾析的方法分离出再次分出 的油状物。
为了过滤将产物溶解在乙醇中，并在真空烘箱中于50℃除 去溶剂。
得到1.13克黄色粘稠到树脂状油(产率：59％)。
聚合物通过1H与13C NMR光谱及凝胶渗透色谱来表征。
由第27实 施例得到以下数据。
由于得到的数据是相似的，它们可代表其它的实 施例。
1H NMR(500MHz，CDCl3)：δ/ppm＝1.22(异氰酸酯CH2)，1.36(异氰 酸酯CH2)，2.40-2.70(乙烯亚胺CH2)，3.03(异氰酸酯CH2)，3.19(异 氰酸酯CH2)，3.55(乙二醇CH2)。
13C NMR(125MHz，CDCl3)：δ/ppm＝25.9(异氰酸酯CH2)，29.4(异氰 酸酯CH2)，39.2(乙烯亚胺CH2)，41.2(异氰酸酯CH2)，47.0(乙烯亚 胺CH2)，48.9(乙烯亚胺CH2)，52.0(乙烯亚胺CH2)，54.2(乙烯亚胺 CH2)，61.1(异氰酸酯CH2)，69.2及71.1及72.3(乙二醇CH2)， 156.0(-NHC(O)O-)，162.1(-NHC(O)NH-)。
GPC(甲基丙烯酸氨基乙基酯凝胶，1％甲酸，0.5毫升/分钟，25℃， 采用Pullulan标准校正)：Mn＝22 000，Mw＝43 000，Mp＝31 000，PD＝1.9， 单一模式。
与8-侧枝PEG(Shearwater，10kDa)与PEI(Aldrich，800Da) 共混物对比：Mn＝3100，Mw＝15 000，Mp＝12 000，PD＝4.91，单一模式。
第27实施例的聚合物的表面活性的研究是通过Lecomte du Nouy(环方法)的方法采用张力计在22℃下进行的。
测定了溶液对空气 的表面张力。
仪器用极纯水校正，其也用作聚合物样品的溶剂。
所测数据：бmin＝56毫牛/米，CMC＝12毫克/毫升。
以下可以同样的方式来制备：
将2毫升(39毫摩尔)乙 烯亚胺加入到此聚合物溶液中。
采用200微升(2毫摩尔)硫酸二甲 基酯作为引发剂来开始聚合，并将混合物加热到60℃持续8天。
然后 在减压下除去溶剂以便在20毫升乙醇中再溶解剩余的物质。
将溶液滴 加到250毫升乙醚中，由此分离出聚合物。
聚合物通过过滤来分离， 并在真空烘箱中于50℃烘3星期以除去剩余的溶剂。
得到1.9克浅黄 色，树脂状聚合物(产率：73％)。
以下可以同样的方式来制备：(所有氨基改性的PEG都从RAPP Polymere，Tübingen获得)
由第56实施 例得到以下数据。
由于得到的数据是相似的，它们可代表其它的实施 例。
1H NMR(500MHz，D2O)：δ/ppm＝2.60-3.00(乙烯亚胺CH2)， 3.78(乙二醇CH2)。
13C NMR(125MHz，D2O)：δ/ppm＝38.2(乙烯亚胺CH2)，39.9(乙 烯亚胺CH2)，46.2(乙烯亚胺CH2)，47.9(乙烯亚胺CH2)，51.7(乙烯 亚胺CH2)，53.4(乙烯亚胺CH2)，54.8(乙烯亚胺CH2)，70.2(乙二醇 CH2)。
GPC(甲基丙烯酸氨基乙基酯凝胶，1％甲酸，0.5毫升/分钟，25℃， 采用Pullulan标准校正)：Mn＝21 000，Mw＝40 000，Mp＝16 000，PD＝1.9 单一模式。
与CH3O-PEG-NH2(RAPP Polymere，5000Da)对比：Mn＝9100，Mw＝14 000，Mp＝16 000，PD＝1.6，单一模式。
实施例67： PEG-PEI共聚物的制备(大分子引发剂路线) 大分子引发剂的制备 称取2克(0.4毫摩尔，1个当量)单甲醚聚乙二醇(Aldrich， Mw5000)加入到配有磁力搅拌棒和回流冷凝管的50毫升圆底烧瓶中， 并溶解在25毫升已蒸馏的氯仿中。
将0.31克甲苯磺酰氯(1.6毫摩 尔，4个当量)加入搅拌的聚合物溶液中。
最后，在混合物中加入0.22 毫升三乙胺(0.16克，1.6毫摩尔；4个当量)作为催化剂。
将混合 物加热至回流18小时。
为分离及纯化聚合物，将溶液倾入500毫升乙 醚中。
过滤出沉淀的聚合物，用大量乙醚洗涤并在真空下干燥。
得到 1.90克白色片状物质(91％产率)。
PEG-PEI嵌段共聚物的制备 称取0.5克大分子引发剂(0.096毫摩尔，1个当量)加入到配有 磁力搅拌棒和回流冷凝管的25毫升圆底烧瓶中，并溶解在10毫升蒸 馏水中。
在搅拌过程中，滴加1毫升乙烯亚胺(0.832克，19.32毫摩 尔，200个当量)，并将混合物在60℃下加热24小时。
减压下除去挥 发分。
剩下白色树脂状物质并将其再溶解于10毫升水中，用200毫升 四氢呋喃沉淀。
通过倾析分离出聚合物并在真空下干燥。
得到0.95克 黄色树脂状物质(71％产率)。
以下可以同样的方式来制备：(所有单甲基-PEG都从Aldrich获 得)
由第67实施 例得到以下数据。
由于得到的数据是相似的，它们可代表其它的实施 例。
1H NMR(500MHz，D2O)：δ/ppm＝2.80-3.20(乙烯亚胺CH2)， 3.80(乙二醇CH2)。
13C NMR(125MHz，D2O)：δ/ppm＝37.9(乙烯亚胺CH2)，39.4(乙 烯亚胺CH2)，46.1(乙烯亚胺CH2)，47.2(乙烯亚胺CH2)，51.3-52.7(乙 烯亚胺CH2)，70.2(乙二醇CH2)。
GPC(甲基丙烯酸氨基乙基酯凝胶，1％甲酸，0.5毫升/分钟，25℃， 采用Pullulan标准校正)：Mn＝35 000，Mw＝90 000，Mp＝52 000，PD＝2.6， 单一模式。
与CH3O-PEG-Ts(5000Da)对比：Mn＝4800，Mw＝7600，Mp＝8600， PD＝1.6，单一模式。
缩写 bPEG 支化聚乙二醇 bPEI 支化聚乙烯亚胺 CMC 临界胶束浓度 DMF 二甲基甲酰胺 HMDI 1，6-己二异氰酸酯 LPEG 线性聚乙二醇 LPEI 线性聚乙烯亚胺 Mn 数均分子量 Mp 峰值分子量 mPEG 单甲氧基聚乙二醇 Mw 重均分子量 MW 未测的平均分子量 PD 多分散性 Ts 甲苯磺酰基 бmin 最小表面张力 生物学实施例 I.转染实验 聚合物PEI(PEG)20(实施例1)与PEG(PEI)8(实施例27)的转染特性 是在3T3细胞系上研究的。
将50 000个细胞/孔植入12孔片中保温 24小时(DMEM+2mM谷氨基酰胺+10％FCS，37℃，10％CO2)。
然后改变 介质。
每个腔中在100微升150mM盐水中的4微克pGL3质体与在100 微升150mM盐水中的适量的聚合物复合，并且在10分钟后，加入到细 胞中。
4小时后，再次更换介质并在48小时后，开始测定。
采用Promega 荧光素酶化验设备在Berthold Sirius照度计中测定荧光素酶的表达。
用改进的BCA检验法定量测定蛋白质的浓度。
在每种情况下所述数据 为三个腔的平均值±对应相应氮/磷比的标准偏差。
实施例1：[PEI(PEG)20] 所测数据： N/P 5： 0.0057±0.0036纳克/毫克蛋白质 N/P 10：0.1786±0.1522纳克/毫克蛋白质 N/P 20：0.6952±0.5498纳克/毫克蛋白质 N/P 50：5.1963±2.6863纳克/毫克蛋白质 (单质体：0.0000±0.00004纳克/毫克蛋白质) 实施例27：[PEG(PEI)8] 所测数据： N/P 5： 0.0024±0.0012纳克/毫克蛋白质 N/P 10：0.0045±0.0046纳克/毫克蛋白质 N/P 20：0.0109±0.0078纳克/毫克蛋白质 N/P 50：0.0765±0.0498纳克/毫克蛋白质 (单质体：0.0000±0.00004纳克/毫克蛋白质) 在两种情况下，在已发生的转染的基础上都有可能检测到基因表 达。
而且，PEI(PEG)20比PEG(PEI)8表现出明显更高的转染效率。
II.通过MTT检测测定体外细胞毒性： 采用MTT检测通过Mosmann的方法(J.Immunol.Methods.65： 55-63(1983))对实施例1与27的共聚物在细胞培养模式中的细胞 毒性进行研究。
8000 L929老鼠成纤维细胞/孔在96个孔中预培养24 小时并用聚合物溶液在不同浓度下处理3，12及24小时。
通过MTT染 料到三苯基甲酯的转变来测定线粒体的活性，其可通过分光光度法定 量测定。
所采用的聚合物为在DMEM以及10％FCS中的五种不同浓度的 溶液。
如果需要，将pH调节到7.4且通过过滤将样品杀菌(0.2微米)。
通过将两种单独的组分进行混合来制备共混物(减少间隔基的数量)。
为进行计算，将细胞的生存能力[％]对所用聚合物的浓度进行作图，并 测定IC50。
结果： · 自由聚合物的体外细胞毒性随聚合物浓度的升高及培养时间 的延长而增加。
· 实施例1的共聚物：单独组分PEI 25kDa与PEG 550Da的混 合物的毒性与自由PEI 25kDa的毒性相当。
通过两组分间共价键接可 明显提高其耐受性。
虽然24小时后毒性大致与单独组分的相当，并由 此与自由PEI 25kDa的相当，但是细胞毒性随培养周期的缩短而降低。
PEG涂层遮挡了聚乙烯亚胺的正电荷，并由此减弱了在细胞膜上的电荷 传递效应。
· 实施例27的共聚物：两个单独组分PEI 700Da与PEG 10kDa 的混合物在细胞生存能力方面直到10毫克/毫升没有表现出降低。
在 相同的浓度范围内，共聚物在3，12及24小时后的细胞生存能力方面 表现出其极限的提高，其可通过分子量的增大来加以解释。
· 实施例27比实施例1表现出较低的细胞毒性。
III.通过LDH检验测定体外细胞毒性： L929鼠成纤维细胞以与MTT检验相同的细胞密度植入到6-孔多层 盘中，预培养48小时并以聚合物溶液(在PBS中pH7.4)培养1，2， 3及6小时。
以标准设备(Sigma，DG-1340-K)通过光度计测定在乳 酸盐及LDH存在下NAD的衰减来定量测定细胞外的LDH部分。
为测定 100％的数值，以0.1％Triton X-100溶解细胞。
结果： LDH检验确认了MTT测试的结果。
两项检测的相互关系表明首先开 始膜的破坏，并且在延迟一段时间后，新陈代谢活性开始下降。
当培 养时间延长且聚合物浓度增大时，聚合物的膜破坏影响变得更大。
IV.通过琼脂糖凝胶电泳测定共聚物的DNA结合 采用在1％琼脂糖凝胶于80伏电泳测定实施例1与27的共聚物的 结合容量。
质体(CMV-nlacZ)在溴化乙锭染色后通过紫外在254纳米 下激发来定位。
结果： · 两种聚合物均可与质体产生静电的相互作用。
· 与共混物一致，实施例1的聚合物可从氮-PEI/磷酸化-DNA 比(N/P比)为1.7开始完全结合质体。
共混物中观察到的对溴化乙 的排斥(从N/P 5.8开始)，一种彻底的DNA凝集的标志，对于共聚 物直到N/P23.0是不完全的。
· 然而对于实施例27的共混物只从N/P4.1开始可观察到质体 的完全结合，并且观察不到完全的对溴化乙锭的排斥，共聚物从 N/P2.4开始表现出质体的结合并从N/P16.6开始表现出对染料的排 斥。
V.红细胞凝集检测 通过Parnham与Wetzig(Chem.Phys.Lipids，1993，64：263-274) 的方法从Wistar鼠血液柠檬酸盐分离出红细胞，将其植入24个孔中 并在37℃下以测试溶液培养2小时。
在显微镜下检验在聚合物影响下 的红细胞的凝集与粘合。
未处理的红细胞用于对照。
结果： · 实施例1的自由共聚物在浓度为0.27-18微克/孔下通过与共 混物及PEI 25kDa相比表现出在细胞培养盘中红血球凝集与粘合方面 的降低。
然而在低浓度下(0.27-0.7微克/孔)没有看到明显的区别， 在共聚物与共混物或PEI 25kDa之间伴随浓度的提高可觉察出显著的 区别。
凝集效应随N/P比的提高而提高。
· 实施例27的共聚物表现出相反的行为。
共混物与自由PEI的 凝集比共聚物少。
· 与自由聚合物相比通过与质体DNA复合在两种共聚物中可显 著降低红细胞的凝集。
VI.溶血作用检测 通过Parnham与Wetzig(Chem.Phys.Lipids，1993，64：263-274) 的方法，从Wistar鼠血液柠檬酸盐分离出红细胞，将其与聚合物溶液 混合并于37℃培养1小时。
通过离心将红细胞压片(10分钟，25℃， 700克)，采用测光法在表层于540纳米下测试其溶血产物。
结果： · 单独组分PEG 8-侧枝，PEG 500Da与PEI 700Da在浓度范围 为0.001-10毫克/毫升内没有表现出明显的溶血效应(所有1-3％)。
· 实施例27的共聚物在相同的浓度范围内同样没有表现出明显 的效应(＜5％)。
· 对于单独的组分PEI 25kDa及实施例1的共混物，在0.001-10 毫克/毫升其溶血活性提高(22.13％在10毫克/毫升)。
· 实施例1的共聚物直到0.5毫克/毫升时表现出直到13.30％ 的提高的细胞溶解酶活性，但在更高浓度至10毫克/毫升下其溶血效 应再次减弱(2.90％在10毫克/毫升)。
VII.老鼠中聚合物-DNA复合物的药物动力学及器官分布 实施例1与27的共聚物的药物动力学及器官分布是在balb/c鼠 中测定的。
采用125I Bolton Hunter试剂(Pharmacia Biotech)将聚合 物以放射活性示踪。
将每千克老鼠0.4或0.04或0.008毫克数量的 PEI(组分)与适量的NF-kB诱体低聚脱氧核苷酸(ODN)在5％葡萄糖 溶液中以氮/磷比N/P 3.5或N/P6总体积为80微升下复合，并在 10分钟后，通过锁骨下静脉注入到麻醉的老鼠中。
20秒，1，2，5， 15，30，60，90与120分钟后，通过与主动脉相通的导管取得血样。
通过导尿管收集尿液持续120分钟。
120分钟后，解剖老鼠取出器官 外层皮质，肾脏，肝脏，心脏，肺，脾脏及脂肪组织。
样品中聚合物 的数量是采用1277 Gammamaster自动γ计量仪(LKB Wallac)通过放 射性的测量来测定的。
对于增值快速浓注采用动态1.1程序及2-对比模式进行数据分 析。
从血液水平曲线计算体积分布(Vc)，消除常数(Kel)与AUC。
当三只动物可被分析时，以其平均值±标准偏差来说明，对于两 只动物以中值来说明，当只有一只动物时在括号中说明其数值。
复合物制备与剂量
· 所有聚合物的血浆水平可通过2-对比模式来描述。
· 共聚物比25kDa PEI具有更高的AUC及较小的体积分布。
PEI(PEG)20(实施例1)比PEG(PEI)8(实施例27)具有更大的影响。
· 消除随共聚物而降低。
· Vc与Kel未表现出可察的剂量依赖性。
·PEI 25kDa与实施例1的所计算的AUC与剂量成比例，实施例 1的共聚物的AUC/剂量曲线的斜率更大。
· 120分钟后分布的主要器官为肝脏，肾脏及脾脏。
对于6∶1 的复合物，共聚物与PEI 25kDa相比表现出在肝脏及脾脏中吸收的减 少且在肾脏中有更高的吸收。
展开
所述的共聚物是由支 化的PEI与线性的PEG组成。
采用甲氧基-琥珀酰亚胺基-丙酸酯-PEG 将PEI进行PEG化。
S.V.Vinogradov，T.K.Bronich与A.V.Kabanov (Bioconjugate Chem.1998，9，805-812)描述了PEI-PEG与聚精胺 -PEG嵌段共聚物的制备，该制备是采用支化的PEI与支化的聚精胺与 一种用1，1’-羰基二咪唑活化的单甲氧基-PEG通过偶联反应来进行。
该共聚物用于与低聚核苷酸的复合。
L.M.Bronstein，M.Antonietti等人(Inorganica Chimica Acta 1998，280，348-354)描述了PEI-PEG嵌段共聚物及其制备，是通过 支化的PEI与具有末端酰基氯官能团的单甲氧基-PEG的偶联来进行， 并且描述了其在制备金属胶体方面的应用。
V.Toncheva等人(Biochimica et Biophysika Acta 1998， 138，354-358)涉及了由聚(L-赖氨酸)与一系列亲水聚合物，例如 PEG，葡聚糖及聚(N-(2-羟丙基)-甲基丙烯酰胺组成的嵌段共聚物， 及其制备工艺与它们作为核酸基因转移的媒介方面的用途。
这些已知的嵌段共聚物共同具有以下三点： 1.阳离子聚合物带有为亲水的，非离子聚合物侧枝。
2.在所有情况下，为此目的，亲水的，非离子聚合物的反应端基为 了与阳离子聚合物的偶联反应而被一种试剂活化，该试剂在所生成的 共聚物中表示为嵌段之间的连接体。
3.亲水的，非离子聚合物在所有情况下为线性的聚合物。
通式I与II的新型阳离子嵌段共聚物 (I)A(-X-B)n (II)C(-Y-D)m 已被发现，其中 A 为一种亲水的，非离子的，线性或支化的聚合物，该聚合物具有分 子量为100到10 000 000克/摩尔，优选1000到100 000克/摩尔且 特别为5000到50 000克/摩尔； B 为一种线性或支化的聚乙烯亚胺(PEI)，其具有分子量为100到 1 000 000克/摩尔，优选400到100 000克/摩尔且特别为400到50 000克/摩尔； X 为嵌段A与B的直接键或具有以下结构的连接体： -OC(O)NH(CH2)oNHC(O)NH-，其中o＝1到20，优选2到10，特别为4 到6， -OC(O)NH(芳基)NHC(O)NH-，其中芳基＝优选含有一个或多个芳香核的 6到14个碳原子的芳香单元，其以稠合或以聚苯基的形式连接在一起， 优选具有一个核，特别为甲苯基， -O(CH2)pC(O)NH-，其中p＝1到10，优选1到3，特别为1， -OCH2CH(OH)CH2NH-， -OC(O)NH-，或 -O(CH2)qNH-，其中q＝1到20，优选1到6，特别为1到3； n为整数从1)1到200，优选 2)1到50， 3)1到12， 4)1到8或，特别优选 5)2到8； C 为线性或支化的PEI，其具有分子量为100到1 000 000克/摩尔， 优选400到100 000克/摩尔，且特别为400到50 000克/摩尔； D 为下式的经O连接的聚乙二醇的残基 -(CH2CH2O)n’-R1其中n’为3到25 000，优选10到5000且特别为10到1000，R1为 氢，脂肪基团如(C1-C6)-烷基(甲基，乙基，叔-丁基及类似的基团) 或另一种OH-保护基团例如酰基(如任意取代的苯甲酰氧羰基)，任 意取代的苯甲基，吡啶甲基，或一种细胞配体，以便通过结合在细胞 表面的蛋白质，特别是受体，而引起核酸-共聚物复合物的特定的吸收； Y 为嵌段C与D的直接键或具有以下结构的连接体： -NHC(O)NH(CH2)sNHC(O)O-，其中s＝1到20，优选2到10，特别为4 到6， -NHC(O)NH(芳基)NHC(O)O-，其中芳基＝优选含有一个或多个芳香核的 6到14个碳原子的芳香单元，其以稠合或以聚苯基的形式连接在一起， 优选具有一个核，特别为甲苯基， -NH(CH2)tC(O)O-，其中t＝2到10，优选2到3，特别为2， -NHCH2CH(OH)CH2O-，或 -NH(CH2)uO-，其中u＝1到20，优选1到6，特别为1到3； 且m为整数，从1)1到200，优选 2)1到100，特别为 3)1到50。
本发明的阳离子嵌段共聚物在以下三个特征中的至少一个方面与 已知的嵌段共聚物不同： 1.亲水的，非离子聚合物带有阳离子聚合物侧枝。
2.连接体与那些已知的嵌段共聚物不同。
3.它们具有支化的亲水的，非离子聚合物。
A优选表示由碳与氧构成的线性或支化的聚合物，其中适当也可 含有环状的，星型的或树状的结构，例如象线性PEG残基，多侧枝的 接枝PEG，星型PEG，聚糖包括环糊精，PVA，树状醇(具有羟基端基 的树状体)，但优选线性及多侧枝的接枝及星型PEG。
后者可从Aldrich， Fluka，Sigma及Shearwater是商业途径可得的。
B与C代表线性或支化的聚乙烯亚胺残基，其具有公式III (III) -[CH2CH2N(Z+)(R2)x]y-H[A-]w其中R2为相同或不同的基团且为氢或公式IV的基团 (IV) -[CH2CH2N(Z’+)(R3)x’]y’-H[A-]w’R3为相同或不同的基团，其(回归地)如R2所定义， A-为适合，优选无机阴离子的等价体，如OH-，Cl-，Br-及类似的离子， x与x’为相同或不同且为1或2， y与y’为相同或不同且为选取的整数以便基团B与C具有组成分子量 为100到1 000 000克/摩尔，优选400到100 000克/摩尔，且特别 为400到50 000克/摩尔，y’也可能为0， z与z’为相同或不同，z＝x-1且z’＝x’-1，且 w与w’为相同或不同的整数，选取为以便平衡在公式III与IV的基团中 的正电荷。
聚乙烯亚胺可采用广为人知的方式来制备或从商业途径可得，从 BASF商品名称为Lupasol或以聚乙烯亚胺或乙烯亚胺聚合物为名称， 以不同的分子量从400到2 000 000克/摩尔(从Aldrich，Sigma， Fluka或直接从BASF)。
优选具有分子量为400到2000克/摩尔的聚 乙烯亚胺为B以及具有分子量为400到800 000克/摩尔，特别优选 400到25 000克/摩尔的聚乙烯亚胺为C。
D中所述的基团为聚乙二醇的残基，其一端被基团R1，例如象甲基 或另一种适合的保护基团保护。
然而，R1也可为一种执行特定的或非 特定的生物功能的基团，特别是对于与受体相互作用的配体，其针对 目标细胞将嵌段共聚物-活性物质复合物特定吸收到更高级的真核细 胞及其细胞核中，其中的活性物质优选为一种低聚核苷酸或一种基因 (基因打靶)。
因此，R1也可为一种针对特定的相互作用并吸收进入 目标器官组织或细胞的配体，例如蛋白质，特别为抗体或抗体碎片， 例如Fab，F(ab)2，scFv，细胞因子或淋巴因子，例如白介素(IL-2到 x)，干扰素GM-CSF，生长因子例如EGF，PDGF，FGF，EPO，整联蛋白 例如ICAM，VCAM或糖蛋白类如外源凝集素或糖基化蛋白质(见前)或 脂蛋白如LDL，HDL或转移蛋白如铁转移蛋白或肽如LH-RH，降血钙素， 催产素，胰岛素，生长激素释放抑制因子，IGF，RGD或碳水化合物如 半乳糖，甘露糖，葡萄糖，乳糖或激素如类固醇，THR或维生素如B12叶酸。
本发明也涉及公式I的化合物的制备工艺，其中包括 a) 通式V的化合物 (V)A-(OH)n，其中A与n＝如公式I中 与二异氰酸酯，优选1，6-己二异氰酸酯反应，以及由此得到的化合物 与通式III与IV中的聚乙烯亚胺反应，或 b) 将通式VI的化合物 (VI)A-(NH2)n(其中A与n＝如公式I所定义) 在开始聚合之前或直到聚合反应进行过程加入到乙烯亚胺聚合的反应 混合物中，或 c) 采用通式VII的化合物 (VII)A-(OS(O)2R4)n其中A如公式I中且R4＝脂肪的或芳香的基团， 优选对-甲苯基，氟化物，三氟甲基或甲基， 作为乙烯亚胺聚合的宏观引发剂。
公式VI的化合物以不同的分子量是商业途径可得的，例如从 Shearwater。
通式VII的化合物可通过通式V的化合物与通式VIII的化合物反 应来获得。
(VIII)Cl-S(O)2R4(R4如上所定义)。
本发明进一步涉及公式II的化合物的制备工艺，其中包括 d) 通式IX的化合物 (IX)D-OH(其中D如公式II所定义) 首先与二异氰酸酯，优选1，6-己二异氰酸酯反应，随后所得的化合物 与线性或支化的聚乙烯亚胺反应。
所引入的保护羟基用的保护基团可 以一种广为人知的方式来消除(参见，例如Büllesbach， Kontakte(Merck)1/1980，23页以及下列等等)。
由a)所述的工艺优选以这样的方法来进行，即聚合物嵌段A的每 一个端羟基采用4-或20-倍过量的二异氰酸酯，优选1，6-己二异氰酸 酯。
反应在氯仿中进行，温度从室温到溶剂的沸点，但优选在溶剂的 沸点。
所述的反应时间在2与24小时之间，但优选4小时。
在反应混 合物中的聚合物浓度在10克/升与500克/升之间，优选100克/升。
产物通过减压下除去溶剂并通过采用石油醚(沸程：40-60℃)反复萃 取以除去过量的二异氰酸酯的方法来分离。
此中间产物与起始化合物 的每一个端羟基的3-到10倍过量的PEI大分子反应。
反应在氯仿中 进行，温度从室温到溶剂的沸点，但优选在溶剂的沸点。
所选择的反 应时间在6与72小时之间，但优选12小时。
在反应混合物中的聚合 物浓度，包括那些PEI与那些已被1，6-己二异氰酸酯活化的非离子亲 水聚合物，均在10克/升与500克/升之间，优选在30-200克/升之间。
产物通过在10到30倍体积过量的乙醚中将聚合物沉淀的方法来分离。
可通过以乙醇及乙醚作为溶剂的反复再沉淀的方法从嵌段共聚物中除 去过量的PEI。
由b)所述的工艺通过将乙烯亚胺与氨基封端的亲水的非离子聚合 物在水中混合的方法来进行，在每种情况下浓度为10克/升到500克/ 升。
两种组分的摩尔比在1∶10到1∶10 000之间。
然后通过加入适 合的催化剂例如盐酸，来引发乙烯亚胺的聚合，并且将混合物升温至 40到100℃。
通过链断裂反应生成共聚物。
嵌段共聚物在适当溶剂例 如乙醇及乙醚，的辅助下反复再沉淀，和/或通过加压过滤来除去可能 成为副产物的PEI均聚物。
此制备工艺的一个变例包括刚好在30分钟 到72小时的某一反应时间之后在热的聚合混合物中加入氨基封端的 亲水的非离子聚合物。
由c)所述的工艺通过聚合物嵌段A的端羟基与通式VIII的磺酰氯 但特别是与甲苯磺酰氯的反应来进行。
此反应在水性和/或极性有机溶 剂中进行，优选在一种水/四氢呋喃混合物中，温度从-10℃到溶剂的 沸点，优选温度从0℃到25℃，且(如果需要)在催化剂存在下，例 如，象三乙胺或氢氧化钠。
产物通过减压下除去溶剂的方法来分离。
此聚合物随后用作乙烯亚胺聚合的宏观引发剂。
为此目的，通式VII 的产物与乙烯亚胺在水性或极性有机溶剂中反应，温度从0℃到溶剂 的沸点。
两个组分的摩尔比在1∶10到1∶10 000之间。
在此反应中 没有副产物产生。
最终的产物可通过在适当的溶剂，例如象乙醚中沉 淀聚合物的方法来分离。
由d)所述的工艺优选通过通式IX的化合物 与小量过量的，优选2-到10-倍过量的二异氰酸酯，优选1，6-己二异 氰酸酯的反应来进行。
反应在氯仿中进行，温度从20℃到溶剂的沸点， 但优选在溶剂的沸点。
所选的反应时间在2与24小时之间，但优选10 至14小时。
在反应混合物中的聚合物浓度在10克/升与500克/升之 间，优选30到150克/升。
产物通过减压下除去溶剂并通过采用石油 醚(沸程40-60℃)反复萃取以除去过量二异氰酸酯的方法来分离。
此中间产物与PEI大分子以摩尔比1∶1到100∶1的条件下反应。
反 应在氯仿中进行且，如需要，在温度从室温到溶剂沸点下加入二甲基 甲酰胺，但优选在60-70℃。
所选的反应时间在6与72小时之间，但 优选12小时。
在反应混合物中聚合物的浓度，那些PEI与那些以1，6- 己二异氰酸酯活化的非离子亲水的聚合物的浓度均在10克/升与500 克/升之间，优选在30到200克/升之间。
产物通过在10到30到倍体 积过量的乙醚中沉淀聚合物的方法来分离。
与PEI相比，新型化合物具有以下的特性： 在细胞毒性测试中嵌段共聚物比PEI均聚物具有更低的毒性且在 血液循环中可保持更长的时间(见“生物学实施例”部分) 嵌段共聚物根据其结构为较好或较差的表面活性物质，其可用作 表面活性剂。
另外，嵌段共聚物也可用于 · 在胶粘剂及涂层体系中作为添加剂 · 作为提高纸张强度的固定剂 · 作为聚合物复合体系例如，象多层包装膜的底漆 · 用于改性塑料(提高其可染性，可涂性，阻挡效应) · 用于将活性染料固定在棉花上 · 作为用于工业废水的细小悬浮粒子的凝结剂与分散剂 · 用于结合重金属盐 · 用于分散有机与无机的颜料 · 作为在陶瓷与水泥组份中的添加剂 · 在皮肤及头发护理及在牙齿方面的广泛的不同的功能 · 用于药用活性物质或生物活性化合物固定在表面上 · 用于从血浆中过滤出内毒素与病原体 · 用于渗透通过粘膜。
另外，在水性体系中嵌段共聚物与聚核酸如DNA与RNA，包括核糖 酶形成配合物。
此特性使得它们适于作为基因转移的运载体或媒介物 (渗透通过细胞膜及转移进入到细胞核中)。
因此它们可用在转染实 验中，在基因治疗及诊断中(见“生物学实施例”部分)。
以下实施例用于说明本发明，并未对其加以限制。
化学实施例 实施例1： PEI(PEG)n嵌段共聚物的制备 mPEG-550的活化 将10毫升氯仿加入到配有磁力搅拌棒，回流冷凝管且顶端装有干 燥管的100毫升圆底烧瓶中，并加入7毫升1，6-己二异氰酸酯(HMDI) (43.64毫摩尔，8个当量)。
将3克聚乙烯氧化物单甲醚(mPEG，Mn＝550 克/摩尔)(5.45毫摩尔，1个当量)溶解在40毫升氯仿中。
然后将 此溶液缓慢滴加到搅拌的HMDI溶液中。
加热混合物在回流下保持12 小时。
然后在减压下除去溶剂，并用石油醚(40-60)(5×50毫升) 萃取过量的HMDI。
以几乎定量的产率(3.8克，97％)得到无色可流动 的油状物。
PEI-接枝-PEG嵌段共聚物的制备 称取1.74克bPEI(Mw＝25kDa，Mn＝10kDa，0.1736毫摩尔，1个当 量)加入到配有磁力搅拌棒，回流冷凝管且顶端装有干燥管的100毫 升圆底烧瓶中，并溶解在40毫升二甲基甲酰胺(DMF)中。
将2.5克 HMDI-活化的mPEG(Mn＝720Da，3.47毫摩尔)溶解在10毫升氯仿中， 将此溶液缓慢滴加到搅拌的PEI溶液中。
混合物在60-70℃下加热12 小时。
然后将混合物滴加到500毫升乙醚中。
两小时后，沉淀出黄色 粘稠油状物。
倾析出浮在表面的混浊层，并将油状物溶解在30毫升乙 醇中。
再次将溶液滴加到500毫升乙醚中，滗析分离再次分出的油状 物。
为了过滤将产物溶解在乙醇中，并在真空烘箱中于50℃除去溶剂。
得到2.8克黄色粘稠到树脂状油(产率：45％)。
聚合物通过1H与13C NMR光谱及凝胶渗透色谱来表征。
由第一实施 例得到以下数据。
由于得到的数据是相似的，它们可代表其它的实施 例。
1H NMR(500MHz，CDCl3)：δ/ppm＝1.17(异氰酸酯CH2)，1.26(异氰 酸酯CH2)，2.30-2.72(乙烯亚胺CH2)，2.96(异氰酸酯CH2)，3.15(异 氰酸酯CH2)，3.49(乙二醇CH2)。
13C NMR(125MHz，CDCl3)：δ/ppm 14.3(异氰酸酯CH2)，26.2(异氰 酸酯CH2)，29.6(异氰酸酯CH2)，36.2(异氰酸酯CH2)，37.5(乙烯亚 胺CH2)，39.1(乙烯亚胺CH2)，41.1(异氰酸酯CH2)，47.2(乙烯亚胺 CH2)，48.9(乙烯亚胺CH2)，52.8(乙烯亚胺CH2)，54.1(乙烯亚胺CH2)， 58.7(异氰酸酯CH2)，69.3及70.2及71.6(乙二醇CH2)， 156.2(-NHC(O)O-)，161.7(-NHC(O)NH-)。
GPC(甲基丙烯酸氨基乙基酯凝胶，1％甲酸，0.5毫升/分钟，25℃， 采用Pullulan标准校正)：Mn＝8800，Mw＝1 640 000，Mp＝85 000， PD＝19.6，单一模式。
与PEI(Aldrich，25kDa)与mPEG(Aldrich，550Da)共混物对比： Mn＝69 000，Mw＝1 480 000，Mp＝99 000及1100，PD＝2.1，双模式。
第一实施例的聚合物的表面活性的研究是通过Lecomte du Nouy(环方法)的方法采用张力计在22℃下进行的。
测定了溶液对空气 的表面张力。
仪器用极纯水校正，其也用作聚合物样品的溶剂。
所测数据：бmin＝51毫牛/米，CMC＝15毫克/毫升。
以下可以同样的方式来制备：(所有起始化合物都从Aldrich获得)
将2克八侧枝的PEG(bPEG，MW＝10kDa，0.2毫摩尔，1个当 量)在20毫升氯仿中的溶液缓慢滴入搅拌的HMDI溶液中。
混合物沸腾 4小时，然后在室温下再搅拌8小时。
在减压下除去溶剂，用石油醚 (40-60)(3×50毫升)萃取过量的HMDI。
得到红色油状物，产率为 58％(1.38克)。
PEG-接枝-PEI嵌段共聚物的制备 在配有磁力搅拌棒，回流冷凝管且顶端装有干燥管的100毫升圆底 烧瓶中，将2.20克接枝PEI(bPEI，Mw＝800Da，Mn＝600Da，3.66毫 摩尔，25个当量)溶解在20毫升氯仿中。
将1.21克HMDI-活化的 bPEG(Mn＝8.5kDa，0.14毫摩尔，1个当量)在30毫升氯仿中的溶液于 室温下缓慢滴入搅拌的PEI溶液中。
混合物沸腾12小时。
然后在搅拌 过程中将溶液缓慢滴入500毫升乙醚中。
12小时后，沉淀出黄色粘稠 油状物。
倾析出浮在表面的混浊层，并将油状物溶解在50毫升乙醇中。
再次将溶液滴加到500毫升乙醚中，通过倾析的方法分离出再次分出 的油状物。
为了过滤将产物溶解在乙醇中，并在真空烘箱中于50℃除 去溶剂。
得到1.13克黄色粘稠到树脂状油(产率：59％)。
聚合物通过1H与13C NMR光谱及凝胶渗透色谱来表征。
由第27实 施例得到以下数据。
由于得到的数据是相似的，它们可代表其它的实 施例。
1H NMR(500MHz，CDCl3)：δ/ppm＝1.22(异氰酸酯CH2)，1.36(异氰 酸酯CH2)，2.40-2.70(乙烯亚胺CH2)，3.03(异氰酸酯CH2)，3.19(异 氰酸酯CH2)，3.55(乙二醇CH2)。
13C NMR(125MHz，CDCl3)：δ/ppm＝25.9(异氰酸酯CH2)，29.4(异氰 酸酯CH2)，39.2(乙烯亚胺CH2)，41.2(异氰酸酯CH2)，47.0(乙烯亚 胺CH2)，48.9(乙烯亚胺CH2)，52.0(乙烯亚胺CH2)，54.2(乙烯亚胺 CH2)，61.1(异氰酸酯CH2)，69.2及71.1及72.3(乙二醇CH2)， 156.0(-NHC(O)O-)，162.1(-NHC(O)NH-)。
GPC(甲基丙烯酸氨基乙基酯凝胶，1％甲酸，0.5毫升/分钟，25℃， 采用Pullulan标准校正)：Mn＝22 000，Mw＝43 000，Mp＝31 000，PD＝1.9， 单一模式。
与8-侧枝PEG(Shearwater，10kDa)与PEI(Aldrich，800Da) 共混物对比：Mn＝3100，Mw＝15 000，Mp＝12 000，PD＝4.91，单一模式。
第27实施例的聚合物的表面活性的研究是通过Lecomte du Nouy(环方法)的方法采用张力计在22℃下进行的。
测定了溶液对空气 的表面张力。
仪器用极纯水校正，其也用作聚合物样品的溶剂。
所测数据：бmin＝56毫牛/米，CMC＝12毫克/毫升。
以下可以同样的方式来制备：
将2毫升(39毫摩尔)乙 烯亚胺加入到此聚合物溶液中。
采用200微升(2毫摩尔)硫酸二甲 基酯作为引发剂来开始聚合，并将混合物加热到60℃持续8天。
然后 在减压下除去溶剂以便在20毫升乙醇中再溶解剩余的物质。
将溶液滴 加到250毫升乙醚中，由此分离出聚合物。
聚合物通过过滤来分离， 并在真空烘箱中于50℃烘3星期以除去剩余的溶剂。
得到1.9克浅黄 色，树脂状聚合物(产率：73％)。
以下可以同样的方式来制备：(所有氨基改性的PEG都从RAPP Polymere，Tübingen获得)
由第56实施 例得到以下数据。
由于得到的数据是相似的，它们可代表其它的实施 例。
1H NMR(500MHz，D2O)：δ/ppm＝2.60-3.00(乙烯亚胺CH2)， 3.78(乙二醇CH2)。
13C NMR(125MHz，D2O)：δ/ppm＝38.2(乙烯亚胺CH2)，39.9(乙 烯亚胺CH2)，46.2(乙烯亚胺CH2)，47.9(乙烯亚胺CH2)，51.7(乙烯 亚胺CH2)，53.4(乙烯亚胺CH2)，54.8(乙烯亚胺CH2)，70.2(乙二醇 CH2)。
GPC(甲基丙烯酸氨基乙基酯凝胶，1％甲酸，0.5毫升/分钟，25℃， 采用Pullulan标准校正)：Mn＝21 000，Mw＝40 000，Mp＝16 000，PD＝1.9 单一模式。
与CH3O-PEG-NH2(RAPP Polymere，5000Da)对比：Mn＝9100，Mw＝14 000，Mp＝16 000，PD＝1.6，单一模式。
实施例67： PEG-PEI共聚物的制备(大分子引发剂路线) 大分子引发剂的制备 称取2克(0.4毫摩尔，1个当量)单甲醚聚乙二醇(Aldrich， Mw5000)加入到配有磁力搅拌棒和回流冷凝管的50毫升圆底烧瓶中， 并溶解在25毫升已蒸馏的氯仿中。
将0.31克甲苯磺酰氯(1.6毫摩 尔，4个当量)加入搅拌的聚合物溶液中。
最后，在混合物中加入0.22 毫升三乙胺(0.16克，1.6毫摩尔；4个当量)作为催化剂。
将混合 物加热至回流18小时。
为分离及纯化聚合物，将溶液倾入500毫升乙 醚中。
过滤出沉淀的聚合物，用大量乙醚洗涤并在真空下干燥。
得到 1.90克白色片状物质(91％产率)。
PEG-PEI嵌段共聚物的制备 称取0.5克大分子引发剂(0.096毫摩尔，1个当量)加入到配有 磁力搅拌棒和回流冷凝管的25毫升圆底烧瓶中，并溶解在10毫升蒸 馏水中。
在搅拌过程中，滴加1毫升乙烯亚胺(0.832克，19.32毫摩 尔，200个当量)，并将混合物在60℃下加热24小时。
减压下除去挥 发分。
剩下白色树脂状物质并将其再溶解于10毫升水中，用200毫升 四氢呋喃沉淀。
通过倾析分离出聚合物并在真空下干燥。
得到0.95克 黄色树脂状物质(71％产率)。
以下可以同样的方式来制备：(所有单甲基-PEG都从Aldrich获 得)
由第67实施 例得到以下数据。
由于得到的数据是相似的，它们可代表其它的实施 例。
1H NMR(500MHz，D2O)：δ/ppm＝2.80-3.20(乙烯亚胺CH2)， 3.80(乙二醇CH2)。
13C NMR(125MHz，D2O)：δ/ppm＝37.9(乙烯亚胺CH2)，39.4(乙 烯亚胺CH2)，46.1(乙烯亚胺CH2)，47.2(乙烯亚胺CH2)，51.3-52.7(乙 烯亚胺CH2)，70.2(乙二醇CH2)。
GPC(甲基丙烯酸氨基乙基酯凝胶，1％甲酸，0.5毫升/分钟，25℃， 采用Pullulan标准校正)：Mn＝35 000，Mw＝90 000，Mp＝52 000，PD＝2.6， 单一模式。
与CH3O-PEG-Ts(5000Da)对比：Mn＝4800，Mw＝7600，Mp＝8600， PD＝1.6，单一模式。
缩写 bPEG 支化聚乙二醇 bPEI 支化聚乙烯亚胺 CMC 临界胶束浓度 DMF 二甲基甲酰胺 HMDI 1，6-己二异氰酸酯 LPEG 线性聚乙二醇 LPEI 线性聚乙烯亚胺 Mn 数均分子量 Mp 峰值分子量 mPEG 单甲氧基聚乙二醇 Mw 重均分子量 MW 未测的平均分子量 PD 多分散性 Ts 甲苯磺酰基 бmin 最小表面张力 生物学实施例 I.转染实验 聚合物PEI(PEG)20(实施例1)与PEG(PEI)8(实施例27)的转染特性 是在3T3细胞系上研究的。
将50 000个细胞/孔植入12孔片中保温 24小时(DMEM+2mM谷氨基酰胺+10％FCS，37℃，10％CO2)。
然后改变 介质。
每个腔中在100微升150mM盐水中的4微克pGL3质体与在100 微升150mM盐水中的适量的聚合物复合，并且在10分钟后，加入到细 胞中。
4小时后，再次更换介质并在48小时后，开始测定。
采用Promega 荧光素酶化验设备在Berthold Sirius照度计中测定荧光素酶的表达。
用改进的BCA检验法定量测定蛋白质的浓度。
在每种情况下所述数据 为三个腔的平均值±对应相应氮/磷比的标准偏差。
实施例1：[PEI(PEG)20] 所测数据： N/P 5： 0.0057±0.0036纳克/毫克蛋白质 N/P 10：0.1786±0.1522纳克/毫克蛋白质 N/P 20：0.6952±0.5498纳克/毫克蛋白质 N/P 50：5.1963±2.6863纳克/毫克蛋白质 (单质体：0.0000±0.00004纳克/毫克蛋白质) 实施例27：[PEG(PEI)8] 所测数据： N/P 5： 0.0024±0.0012纳克/毫克蛋白质 N/P 10：0.0045±0.0046纳克/毫克蛋白质 N/P 20：0.0109±0.0078纳克/毫克蛋白质 N/P 50：0.0765±0.0498纳克/毫克蛋白质 (单质体：0.0000±0.00004纳克/毫克蛋白质) 在两种情况下，在已发生的转染的基础上都有可能检测到基因表 达。
而且，PEI(PEG)20比PEG(PEI)8表现出明显更高的转染效率。
II.通过MTT检测测定体外细胞毒性： 采用MTT检测通过Mosmann的方法(J.Immunol.Methods.65： 55-63(1983))对实施例1与27的共聚物在细胞培养模式中的细胞 毒性进行研究。
8000 L929老鼠成纤维细胞/孔在96个孔中预培养24 小时并用聚合物溶液在不同浓度下处理3，12及24小时。
通过MTT染 料到三苯基甲酯的转变来测定线粒体的活性，其可通过分光光度法定 量测定。
所采用的聚合物为在DMEM以及10％FCS中的五种不同浓度的 溶液。
如果需要，将pH调节到7.4且通过过滤将样品杀菌(0.2微米)。
通过将两种单独的组分进行混合来制备共混物(减少间隔基的数量)。
为进行计算，将细胞的生存能力[％]对所用聚合物的浓度进行作图，并 测定IC50。
结果： · 自由聚合物的体外细胞毒性随聚合物浓度的升高及培养时间 的延长而增加。
· 实施例1的共聚物：单独组分PEI 25kDa与PEG 550Da的混 合物的毒性与自由PEI 25kDa的毒性相当。
通过两组分间共价键接可 明显提高其耐受性。
虽然24小时后毒性大致与单独组分的相当，并由 此与自由PEI 25kDa的相当，但是细胞毒性随培养周期的缩短而降低。
PEG涂层遮挡了聚乙烯亚胺的正电荷，并由此减弱了在细胞膜上的电荷 传递效应。
· 实施例27的共聚物：两个单独组分PEI 700Da与PEG 10kDa 的混合物在细胞生存能力方面直到10毫克/毫升没有表现出降低。
在 相同的浓度范围内，共聚物在3，12及24小时后的细胞生存能力方面 表现出其极限的提高，其可通过分子量的增大来加以解释。
· 实施例27比实施例1表现出较低的细胞毒性。
III.通过LDH检验测定体外细胞毒性： L929鼠成纤维细胞以与MTT检验相同的细胞密度植入到6-孔多层 盘中，预培养48小时并以聚合物溶液(在PBS中pH7.4)培养1，2， 3及6小时。
以标准设备(Sigma，DG-1340-K)通过光度计测定在乳 酸盐及LDH存在下NAD的衰减来定量测定细胞外的LDH部分。
为测定 100％的数值，以0.1％Triton X-100溶解细胞。
结果： LDH检验确认了MTT测试的结果。
两项检测的相互关系表明首先开 始膜的破坏，并且在延迟一段时间后，新陈代谢活性开始下降。
当培 养时间延长且聚合物浓度增大时，聚合物的膜破坏影响变得更大。
IV.通过琼脂糖凝胶电泳测定共聚物的DNA结合 采用在1％琼脂糖凝胶于80伏电泳测定实施例1与27的共聚物的 结合容量。
质体(CMV-nlacZ)在溴化乙锭染色后通过紫外在254纳米 下激发来定位。
结果： · 两种聚合物均可与质体产生静电的相互作用。
· 与共混物一致，实施例1的聚合物可从氮-PEI/磷酸化-DNA 比(N/P比)为1.7开始完全结合质体。
共混物中观察到的对溴化乙 的排斥(从N/P 5.8开始)，一种彻底的DNA凝集的标志，对于共聚 物直到N/P23.0是不完全的。
· 然而对于实施例27的共混物只从N/P4.1开始可观察到质体 的完全结合，并且观察不到完全的对溴化乙锭的排斥，共聚物从 N/P2.4开始表现出质体的结合并从N/P16.6开始表现出对染料的排 斥。
V.红细胞凝集检测 通过Parnham与Wetzig(Chem.Phys.Lipids，1993，64：263-274) 的方法从Wistar鼠血液柠檬酸盐分离出红细胞，将其植入24个孔中 并在37℃下以测试溶液培养2小时。
在显微镜下检验在聚合物影响下 的红细胞的凝集与粘合。
未处理的红细胞用于对照。
结果： · 实施例1的自由共聚物在浓度为0.27-18微克/孔下通过与共 混物及PEI 25kDa相比表现出在细胞培养盘中红血球凝集与粘合方面 的降低。
然而在低浓度下(0.27-0.7微克/孔)没有看到明显的区别， 在共聚物与共混物或PEI 25kDa之间伴随浓度的提高可觉察出显著的 区别。
凝集效应随N/P比的提高而提高。
· 实施例27的共聚物表现出相反的行为。
共混物与自由PEI的 凝集比共聚物少。
· 与自由聚合物相比通过与质体DNA复合在两种共聚物中可显 著降低红细胞的凝集。
VI.溶血作用检测 通过Parnham与Wetzig(Chem.Phys.Lipids，1993，64：263-274) 的方法，从Wistar鼠血液柠檬酸盐分离出红细胞，将其与聚合物溶液 混合并于37℃培养1小时。
通过离心将红细胞压片(10分钟，25℃， 700克)，采用测光法在表层于540纳米下测试其溶血产物。
结果： · 单独组分PEG 8-侧枝，PEG 500Da与PEI 700Da在浓度范围 为0.001-10毫克/毫升内没有表现出明显的溶血效应(所有1-3％)。
· 实施例27的共聚物在相同的浓度范围内同样没有表现出明显 的效应(＜5％)。
· 对于单独的组分PEI 25kDa及实施例1的共混物，在0.001-10 毫克/毫升其溶血活性提高(22.13％在10毫克/毫升)。
· 实施例1的共聚物直到0.5毫克/毫升时表现出直到13.30％ 的提高的细胞溶解酶活性，但在更高浓度至10毫克/毫升下其溶血效 应再次减弱(2.90％在10毫克/毫升)。
VII.老鼠中聚合物-DNA复合物的药物动力学及器官分布 实施例1与27的共聚物的药物动力学及器官分布是在balb/c鼠 中测定的。
采用125I Bolton Hunter试剂(Pharmacia Biotech)将聚合 物以放射活性示踪。
将每千克老鼠0.4或0.04或0.008毫克数量的 PEI(组分)与适量的NF-kB诱体低聚脱氧核苷酸(ODN)在5％葡萄糖 溶液中以氮/磷比N/P 3.5或N/P6总体积为80微升下复合，并在 10分钟后，通过锁骨下静脉注入到麻醉的老鼠中。
20秒，1，2，5， 15，30，60，90与120分钟后，通过与主动脉相通的导管取得血样。
通过导尿管收集尿液持续120分钟。
120分钟后，解剖老鼠取出器官 外层皮质，肾脏，肝脏，心脏，肺，脾脏及脂肪组织。
样品中聚合物 的数量是采用1277 Gammamaster自动γ计量仪(LKB Wallac)通过放 射性的测量来测定的。
对于增值快速浓注采用动态1.1程序及2-对比模式进行数据分 析。
从血液水平曲线计算体积分布(Vc)，消除常数(Kel)与AUC。
当三只动物可被分析时，以其平均值±标准偏差来说明，对于两 只动物以中值来说明，当只有一只动物时在括号中说明其数值。
复合物制备与剂量
· 所有聚合物的血浆水平可通过2-对比模式来描述。
· 共聚物比25kDa PEI具有更高的AUC及较小的体积分布。
PEI(PEG)20(实施例1)比PEG(PEI)8(实施例27)具有更大的影响。
· 消除随共聚物而降低。
· Vc与Kel未表现出可察的剂量依赖性。
·PEI 25kDa与实施例1的所计算的AUC与剂量成比例，实施例 1的共聚物的AUC/剂量曲线的斜率更大。
· 120分钟后分布的主要器官为肝脏，肾脏及脾脏。
对于6∶1 的复合物，共聚物与PEI 25kDa相比表现出在肝脏及脾脏中吸收的减 少且在肾脏中有更高的吸收。
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