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作为整合蛋白α

基本信息

  • 申请号 CN00810415.8 
  • 公开号 CN1361792A 
  • 申请日 2000/07/03 
  • 公开日 2002/07/31 
  • 申请人 默克专利股份公司  
  • 优先权日期  
  • 发明人 A·约恩茨克 B·蒂芬巴赫 S·古德曼 U·格罗斯 G·茨辛斯基  
  • 主分类号  
  • 申请人地址 德国达姆施塔特 
  • 分类号  
  • 专利代理机构 中国专利代理(香港)有限公司 
  • 当前专利状态 发明专利申请公布 
  • 代理人 罗宏 
  • 有效性 发明公开 
  • 法律状态
  •  

摘要

本发明涉及式I的新的肽衍生物:环(Arg-X展开

权利要求书


1.式I的多肽衍生物和它们在生理上能被接受的盐和溶剂化物 环(Arg-X1-Asp-X2-X3-X4-X5-X6-R1)       I 其中: X1  是Ser,Gly或Thr X2  是Leu,IIe,Nle,Val或Phe X3  是Asp,Glu,Lys或Phe X4  是Gly,Ala或Ser X5  是Leu,Ile,Nle,Val或Phe X6  是Arg,Har或Lys R1  表示空缺或一个或多个ω-氨基羧酸残基,这个ω-氨基羧酸残基 长度为:500~2500pm, 上述这些氨基酸还可以衍生化, 包括具有旋光活性的D型和L型氨基酸残基。

2.据权利要求1的式I的多肽衍生物和它们在生理上能被接受 的盐类 环(Arg-X1-Asp-X2-X3-X4-X5-X6-R1)      I 其中: X1  是Ser,Gly或Thr X2  是Leu,Ile,Nle,Val或Phe X3  是Asp,Glu,Lys或Phe X4  是Gly,Ala或Ser X5  是Leu,Ile,Nle,Val或Phe X6  是Arg,Har或Lys R1  表示空缺或选自下述群体中的1-10个氨基酸,这个群体含有                           Ala,Asn,Asp, Arg,Cys,Gln,Glu,Hcy,His,Hse,Ile,Leu, Lys,Met,Pen,Phe,Pro,Ser,Thr,Trp,Tyr, Val和 H2N-(CH2CH2O)m-(CH2)m-COOH, 其中m,n在任一种情况下是彼此相互独立的,可取0,1,2,3,4,5, 6,7,8,9,10,11或12,前提是m+n>0; 上述提到的氨基酸仍能衍生化, 包括D型和L型的光学活性的氨基酸残基。

3.据权利要求1和权利要求2的选自下面群体中的多肽化合物 和它们在生理上能被接受的盐和溶剂化物 这个群体含有: 环(Arg-Gly-Asp-Leu-Asp-Ala-Leu-Arg-Gly-Gly- Gly), 环(Arg-Gly-Asp-Leu-Asp-Gly-Leu-Arg-Gly-Gly- Gly), 环(Arg-Gly-Asp-Leu-D-Ala-Ala-Leu-Arg-Gly-Gly- Gly), 环(Arg-Thr-Asp-Leu-D-Asp-Ala-Leu-Arg-Gly-Gly- Gly), 环(Arg-Gly-Asp-Leu-D-Asp-Ala-Leu-Arg-Abu-Abu), 环(Arg-Gly-Asp-Leu-D-Asp-Ala-Leu-Arg-Aha-Aha), 环(Arg-Gly-Asp-Leu-D-Asp-Ala-Leu-Arg-Aha), 环(Arg-Gly-Asp-Leu-D-Asp-Ala-Leu-Arg-Aee), 环(Arg-Thr-Asp-Leu-D-Asp-Ala-Leu-Arg-Abu-Abu), 环(Arg-Thr-Asp-Leu-D-Asp-Ala-Leu-Arg-β-Ala), 环(Arg-Gly-Asp-Leu-D-Asp-Ala-Leu-Arg-β-Ala),
4.能用作药剂的权利要求1和权利要求2的式I的多肽化合物 和权利要求3的化合物,和它们在生理上能被接受的盐类和溶剂化 物。

5.据权利要求4的药剂,其用作一种抑制剂用来控制基于αvβ6整合蛋白受体的表达和病理学功能的病症。

6.据权利要求5的药剂用来控制血栓形成,心肌梗塞,冠状心 脏疾病,动脉硬化,肿瘤,骨质疏松症,纤维化,炎症,感染,牛皮 癣和影响伤口愈合过程。

7.药物制剂,至少含有据权利要求5和6之一的一种药剂;如 果恰当的话,和载体和/或赋形剂;如果恰当的话,和其它活性化合 物。

8.权利要求1到3的多肽化合物和/或它们在生理上可被接受的 盐类在生产用来控制基于αvβ6整合蛋白受体的表达和病理学功能的 病症的一种药剂中的用途。

9.权利要求8的用途,其中生产一种药剂用于控制血栓形成, 心肌梗塞,冠状心脏疾病,动脉硬化,肿瘤,骨质疏松症,纤维化, 炎症,感染,牛皮癣和影响伤口愈合过程。
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说明书

本发明涉及如式I所示的新的多肽衍生物,及其在生理上能被接 受的盐类和溶剂化物, 环(Arg-X1-Asp-X2-X3-X4-X5-X6-R1)         I 其中: X1  是Ser,Gly或Thr X2  是Leu,Ile,Nle,Val或Phe X3  是Asp,Glu,Lys或Phe X4  是Gly,Ala或Ser X5  是Leu,Ile,Nle,Val或Phe X6  是Arg,Har或Lys R1  表示空缺或一个或多个ω-氨基羧酸残基,这个ω-氨基羧酸残基 长度为:500~2500pm。
上述这些氨基酸还可以衍生化,包括具有旋光活性的D型和L型 氨基酸残基。
本发明是基于发现新的具有好的价值属性化合物为目的,特别是 它们可以用作医药的生产。
已经发现根据本发明的化合物和它们的盐类有很高价值的药理 属性和好的耐受性。
根据本发明的多肽能够用作整合蛋白αvβ6受体的有效抑制剂, 因而能作为多种疾病和病理状态的治疗手段。
整合蛋白αvβ6的其它抑制剂在DE 19858857中被S.Kraft et al.在J.Biol.Chem.274,1979-85(1999).所描述。
根据本发明 的化合物被认为是所提到申请中的一种。
整合蛋白属于类型I——跨膜受体中的异源二倍体家族,这些跨 膜受体在许多细胞—基质或细胞—细胞的连接过程中起着重要作用 (Tuckwell et al.,1996,Symp.Soc.Exp.Biol.47)。
整合蛋 白大致可以分为三类:β1整合蛋白,胞外基质的受体;β2整合蛋白, 在白细胞中可被激活并在炎症反应中被引发;βv整合蛋白,影响在伤 口愈合与其它病理过程中细胞的反应(Marshall and Hart,1996, Semin.Cancer Biol.7,191)。
整合蛋白α5β1,αIIbβ3,α8β1,αvβ3,αvβ5,αvβ8,αvβ6都是 与天然配体如纤连蛋白或玻连蛋白中的“精氨酸-甘氨酸-天门冬氨 酸”(RGD)多肽序列结合,含有RGD序列的可溶性多肽能够阻止这 些整合蛋白与其相应的天然配体的相互作用。
αvβ6是相对较少见的 整合蛋白(Busk et al.,1992 J.Biol.Chem.267(9),5790), 它在上皮组织的修复反应中含量增高,并优先结合天然基质分子纤连 蛋白和肌腱蛋白(Wang et al.,1996,Am.J.Respir.Cell Mol.Biol. 15(5),664)。
αvβ6的生理和病理学功能还没有被精确阐明,然而据 猜测,这个整合蛋白在涉及上皮细胞生理反应与病症(如:炎症反应、 伤口愈合、肿瘤)中起着重要作用。
因此αvβ6在伤口的角质形成细 胞中表达(Haapasalmi et al.,1996,J.Invest,Dermatol.106(1), 42),以此可以断定除了伤口愈合反应和炎症,皮肤的其它生理性事 件例如牛皮癣也能被所述的整合蛋白的激动剂或拮抗剂所影响。
而 且,αvβ6在呼吸道上皮细胞中也起作用(Weinacker et al.,1995, Am.J.Respir.Cell Mol.Biol.12(5),547),因此这个整合蛋 白合适的激动剂/拮抗剂能够用于呼吸道失调症中,例如:支气管炎、 哮喘、肺纤维化和呼吸道肿瘤。
最后,已知αvβ6在肠道上皮组织中 也起作用,因此整合蛋白合适的激动剂/拮抗剂能用于胃/肠道的炎 症、肿瘤和胃/肠道伤口的治疗上。
P.C.Brooks,R.A.Clark and D.A.Cheresh在Science 264,569-71(1994)中描述了血管生成对血管整合蛋白与胞外基质蛋 白之间相互作用的依赖性。
针对先前所提到的天然高分子量配体和抗体在治疗和诊断上的 困难性,因而本发明目的是找到αvβ6潜在的、特异的和具有选择性 的低分子量配体,优选多肽,它不仅能够用于上述提及的治疗领域, 还可以作为诊断剂和试剂。
已经发现根据本发明的多肽化合物及其盐类作为可溶性分子对 携带有所述受体的细胞发挥作用,或者,如果它们结合于表面,就是 αvβ6调节细胞粘着中的人工配体。
首要的是,它们作为αvβ6整合蛋 白的抑制剂,尤其抑制这个受体与其它配体的结合,例如纤连蛋白的 粘附,这个反应可以被检测出来,其方法可参见:J.W.Smith et al., 1990,J.Biol.Chem.265,12267-12271。
更进一步发现了这种新物质有很好的药理活性和好的耐受性,可 以用作药剂。
在下面将详细的说明。
根据本发明的多肽化合物,如果运用现有技术,加上合适的标记 物(如:生物素基团),就能用作体内和体外的诊断试剂。
这些诊断 试剂是用作上皮系统的生理状况的检测和定位。
本发明还包括了与至少一种其它活性化合物的组合;和/或与其 它活性化合物如细胞毒性化合物的缀合物;还有与用于X-射线治疗和 PET诊断的放射性标记的缀合物;而且还包括融合蛋白,这些融合蛋 白或者带有标记蛋白如GFP或抗体,或者带有治疗蛋白如IL-2。
尤其有活性的化合物是式I中的那些化合物,它们的八肽序列, 环(Arg-X1-Asp-X2-X3-X4-X5-X6)被R1所扩展,其中这些基团 X1,X2,X3,X4,X5和X6有指定的意思。
以环(Arg-Gly-Asp-Leu-D-Asp- Ala-Leu-Arg)[EMD 271588]作为一个例子,其环扩展所带来的影响 如图I所示。
而Ac-Arg-Thr-Asp-Leu-Asp-Ser-Leu-Arg-NH2[EMD 271293]则起着对照化合物的作用。
一些如环(Arg-Gly-Asp-Leu-D- Asp-Ala-Leu-Arg-R1)所示的多肽,从R1处算起的距离(估算)、Q 值(IC50[substance]/IC50[EMD 271293])和-logQ在下表中给出。
                              表I  R1
 距离[pm]
 Q
-log Q
 0
 0
 47
-1.672
 Gly
 370
 2.1
-0.322
 Abu
 617
 0.028
 1.553
 Gly-Gly
 740
 0.05
 1.301
 Aha
 870
 0.036
 1.444
 Aee
 1078
 0.038
 1.420
 Gly-Gly-Gly
 1110
 0.03
 1.523
 Abu-Abu
 1235
 0.03
 1.523
 Gly-Gly-Gly-Gly
 1480
 0.033
 1.481
 Aha-Aha
 1740
 0.036
 1.444
 Gly-Gly-Gly-Gly-Gly
 1850
 0.046
 1.337
 Gly-(Gly)4-Gly
 2220
 0.05
 1.301
从表I上可以看出图表所表示的意思。
即使间隔区(spacer)R1长度约有500pm处也能得到尤其有活性 的化合物。
式I中特别优选的化合物是那些R1是一个或多个ω-氨基羧酸残 基,这个ω-氨基羧酸残基长度为:600~2500pm,非常优选的间隔区 长度是:600~2000pm。
ω-氨基羧酸残基可被理解为任何一种ω-氨基羧酸,其中优选下 面群体中的氨基酸,这个群体包括: Ala,Asn,Asp,Arg,Cys,Gln,Glu,Hcy,His,Hse,Ile, Leu,Lys,Met,Pen,Phe,Pro,Ser,Thr,Trp,Tyr,Val 和H2N-(CH2CH2O)m-(CH2)n-COOH, 其中m,n在任一种情况下是彼此相互独立的,可取0,1,2,3,4,5, 6,7,8,9,10,11或12,只要保证m+n>0; 因此本发明优先涉及据权利要求I的式I中多肽衍生物及其生理 可接受的盐。
在式I 环(Arg-X1-Asp-X2-X3-X4-X5-X6-R1)             I 其中: X1  是Ser,Gly或Thr X2  是Leu,Ile,Nle,Val或Phe X3  是Asp,Glu,Lys或Phe X4  是Gly,Ala或Ser X5  是Leu,Ile,Nle,Val或Phe X6  是Arg,Har或Lys R1  表示空缺或选自下述群体中的1-10个氨基酸,这个群体含有                 Ala,Asn,Asp,Arg,Cys,Gln, Glu,Hcy,His,Hse,Ile,Leu,Lys,Met,Pen,Phe, Pro,Ser,Thr,Trp,Tyr,Val和 H2N-(CH2CH2O)m-(CH2)n-COOH, 其中m,n在任一种情况下是彼此相互独立的,可取0,1,2,3,4,5, 6,7,8,9,10,11或12,只要保证m+n>0; 上述提到的氨基酸仍能衍变,包括D型和L型的光学活性的氨基 酸残基。
化合物及其盐的一些优选基团能够被下述子式IA到Ih所表述,而 这些子式与式I相适应,而那些在子式中没有更详细表明的基团具有 在式I中指示的意思, a)  X1    是Gly或Thr; b)  X1    是Gly或Thr     X2    是Leu; c)  X1    是Gly或Thr     X2    是Leu     X3    是Asp或D-Asp; d)  X1    是Gly或Thr     X2    是Leu     X3    是Asp或D-Asp     X4    是Gly或Ala; e)  X1    是Gly或Thr     X2    是Leu     X3    是Asp或D-Asp     X4    是Gly或Ala     X5    是Leu; f)  X1    是Gly或Thr     X2    是Leu     X3    是Asp或D-Asp     X4    是Gly或Ala或Ser     X5    是Leu     X6    是Arg; g)  X1    是Gly或Thr     X2    是Leu     X3    是Asp或D-Asp     X4    是Gly或Ala或Ser     X5    是Leu     X6    是Arg     R1    是选自下述群体中的1-10个氨基酸,这个群体含有                     Ala,Asn,Asp,Arg, Cys,Gln,Glu,Hcy,His,Hse,Ile,Leu, Lys,Met,Pen,Phe,Pro,Ser,Thr,Trp, Tyr,Val和H2N-(CH2CH2O)m-(CH2)n-COOH, 其中m,n在任一种情况下是彼此相互独立的,可取0,1,2,3,4,5, 6,7,8,9,10,11或12,只要保证m+n>0; h)  X1    是Gly或Thr     X2    是Leu     X3    是Asp或D-Asp     X4    是Gly Ala或Ser     X5    是Leu     X6    是Arg R1  选自Gly,β-Ala,Abu或Aha中的1-6个氨基酸。
本发明特别涉及选自下面群体中的多肽化合物,这个群体由下面 环状多肽及其它们的在生理上能被接受的盐类组成。
环(Arg-Gly-Asp-Leu-Asp-Ala-Leu-Arg-Gly-Gly-Gly), 环(Arg-Gly-Asp-Leu-Asp-Gly-Leu-Arg-Gly-Gly-Gly), 环(Arg-Gly-Asp-Leu-D-Ala-Ala-Leu-Arg-Gly-Gly-Gly), 环(Arg-Thr-Asp-Leu-D-Asp-Ala-Leu-Arg-Gly-Gly-Gly), 环(Arg-Gly-Asp-Leu-D-Asp-Ala-Leu-Arg-Abu-Abu), 环(Arg-Gly-Asp-Leu-D-Asp-Ala-Leu-Arg-Aha-Aha), 环(Arg-Gly-Asp-Leu-D-Asp-Ala-Leu-Arg-Aha), 环(Arg-Gly-Asp-Leu-D-Asp-Ala-Leu-Arg-Aee), 环(Arg-Thr-Asp-Leu-D-Asp-Ala-Leu-Arg-Abu-Abu), 环(Arg-Thr-Asp-Leu-D-Asp-Ala-Leu-Arg-β-Ala), 环(Arg-Gly-Asp-Leu-D-Asp-Ala-Leu-Arg-β-Ala), 上文和下面涉及的氨基酸残基的缩写词代表了下述的氨基酸。
Abu  4-氨基丁酸 Aee H2N-(CH2CH2O)2-CH2COOHAha  6-氨基己酸 Aib  α-氨基异丁酸 Ala  丙氨酸 Asn  天门冬酰胺 Asp  天门冬氨酸 Arg  精氨酸 Bgl  Cα-叔丁基氨酸 Cys  半胱氨酸 Dab  2,4-二氨基丁酸 Dap  2,3-二氨基丙酸 Gln  谷氨酰胺 Glp  焦谷氨酸 Glu  谷氨酸 Gly  甘氨酸 Har  高精氨酸 Hcy    高半胱氨酸 His    组氨酸 Homo-Phe    高苯丙氨酸 Hse    高丝氨酸 Ile    异亮氨酸 Leu    亮氨酸 Lys    赖氨酸 Met    甲硫氨酸 Nal    萘-2-基丙氢酸 Nle    正亮氨酸 Orn    鸟氨酸 Pen    青霉胺 Phe    苯丙氨酸 Phg    苯基甘氨酸 4-Hal-Phe  4-卤代苯丙氨酸 Pro    脯氨酸 Ser    丝氨酸 Thr    苏氨酸 TIS    三异丙基硅烷 Trp    色氨酸 Tyr    酪氨酸 Val    缬氨酸 另外,随后的缩写词代表了下面的意思。
Ac    乙酰基 BOC   叔丁氧羰基 BSA   牛血清白蛋白 CBZ或Z苄氧羰基 DCCl   二环乙基碳二亚胺 DCM    二氯甲烷 DIEA   二异丙基乙胺 DMF    甲基甲酰胺 EDCl    N-乙基-N,N’-(二甲胺基丙基)-碳二亚胺 Et    乙基 FCA   羧酸荧光素 FITC  异硫氰酸荧光素 Fmoc  9-芴甲氧羰酸 FTH   硫脲荧光素 HOBt  1-羟基苯并三唑 Me    甲基 MBHA  4-甲基二苯甲基胺4-methylbenzhydrylamine Mtr   4-甲氧基-2,3,6-三甲苯磺酰基 HONSu N-氢氧基丁二酰亚胺 OBut  叔丁酯 Oct   辛酰基 Ome   甲酯 Oet   乙酯 Pbf   2,2,4,6,7-五甲基苯并二氢呋喃-5-磺酰基 Pmc   2,2,5,7,8-五甲基苯并二氢吡喃-6-磺酰基 POA   苯氧乙酰基 Sal   水杨酰 TBS++ 二价Tris缓冲盐溶液 TBSA  TBS+BSA TBTU  四氟硼酸2-(1H-苯并三唑-1-基)-1,1,3-四甲基脲鎓 TFA   三氟乙酸 Trt   三苯甲基 如果上文所提到的氨基酸能够出现一种或多种对映异构体,那么 它们所有这些构型和它们的混合物(如DL构型)都被包括在上文和 下面中。
另外,能够给这些氨基酸提供本质上已知的合适的保护基 团。
本发明还涉及水合物和溶剂化物,例如这些化合物中的醇化物。
所谓的前体药物衍生物包括在据本发明的化合物中,这些衍生物 是通过修饰而成的,而用于修饰的基团有烷基、酰基、糖基或寡肽, 它们在体内会迅速断裂释放出根据本发明的活性化合物。
这些还包括 了据本发明的化合物中生物可降解的多聚高分子衍生物,这在Int.J. Pharm.115,61-67(1996)中作了介绍。
所述的氨基酸和氨基酸残基例如NH功能团和末端酰基功能团也 能够衍变,优选N-甲基、N-乙基、N-苯基或Ca-甲基的衍生物;另外 优选的衍生物是那些Asp和Glu,尤其是侧链羰基上甲基、乙基、苯 基、丁基、叔丁基、新戊基或苯酯基的衍生物;此外,精氨酸衍生物 能够在-NH-(C=NH)-NH2基团上被乙酰基、苯酰基、甲氧羰基或乙氧羰 基所取代。
据本发明的化合物以多肽的形式通过α-氨基和α-羰基(头-尾 相连)将彼此连接在一起,那些环状化合物也包括例如在功能性侧链 如SH基存在下通过下述方式连接: 侧-侧               例如:S-S(二硫键) 头-侧 侧-尾 此外,附加在据本发明的化合物中的衍生物是那些包括据本发明 的实际多肽和标记化合物,而这些化合物使之很容易就能检测这些多 肽,这种衍生物的例子包括有放射性标记、生物素标记或荧光标记的 多肽。
荧光染色的基团优选7-己酰氧基香豆素-3-基,荧光素-5-(和/ 或6-)基,2’,7’-二氯荧光素-5-(和/或6-)基,二氢四甲基-rosamin- 基,四甲基罗丹明-5-(和6-)基,4,4-二氟-5,7-二甲基-4-硼-3a,4a- 二氮-s-indacene-3乙基或4,4-二氟-5,7-二苯基-4-硼-3a,4a-二氮 -s-indacene-3乙基。
适宜的功能性荧光染色基团能作为制备据本发明的式I化合物的 试剂,这在“Handbook of Fluorescent probes and Research Chemicals,5th Edition,1992-1994,by R.P.Haughland, Molecular Probes,Inc.”中有描述。
本发明不仅包括了所述的多肽,而且还包括了混合物和制剂,这 些制剂除了包括据本发明的这些化合物外,还包括了其它有药物活性 的物质或能够通过期望的方式来影响据本发明的多肽一级药理学反 应的佐剂。
据本发明的化合物和制备它们的起始物质通过在本质上已经很 清楚和经常运用的方法分别去制备。
这些方法在著作(如:in the standard works such as Houbenweyl,Methoden der orfanischen Chemie(Methods of Organic Chemistry),Georg-Thieme Verlag, Stuttgart)中有所描述。
即是在已知并适合所述反应的条件下进行。
这些方法还可以用于本身已知的各种变体上。
据本发明的化合物优选用固相合成法制备和接下来的分离和纯 化。
Jinczyk und Meienhofer(Peptides,Proc.8th Am.Pept.Symmp. Eds.V.Hruby and D.H.Rich,Pierce Comp.III,pp.73-77,1983, 或Angew.Chem.104,1992,375)中有所描述或参见Merrified (J.Am.Chem.Soc.94,1972,3102)。
据本发明的多肽能在固相(手工或自动合成仪)上制备,通过Fmoc 策略运用酸不稳定的侧链保护基团和RP-HPLC的纯化方法。
峰均质性 能通过RP-HPLC检测,而物质的鉴定则可用FAB-MS。
另外,这些多肽能通过通常的氨基酸和多肽合成方法制备,例如 从Novabiochem-1999 Catalog & Peptide Synthesis Handbook of Calbichem-Novabiochem GmbH,D-65796 Bad Soden;从许多标准 的工作和已公布的专利申请上,这些方法早已被熟知。
接下来可利用逐步耦联和片断缩合,使用不同的N-端、C-端和侧 链保护基团,而它们是优选用于正交清除的,可以使用不同缩合剂保 证耦联步骤得以实施,这些缩合剂有碳二亚胺、碳二亚胺咪唑、脲鎓 类如:TBTU,混合酸酐法,酰基卤或活性酯法。
活性酯可以在原位方 便地形成,例如通过添加HOBt或N-羟基丁二酰亚胺。
含有侧链保护基团的线性前体分子的环化同样可以用这样的缩 合反应来实施。
例如在DE 43 10 643或在Houben-Weyl,1.c., Volume 15/II,1到806页(1974)有描述。
不同的树脂和鎓功能团能应用于固相多肽的合成中,树脂可以聚 苯乙烯或聚丙烯酰胺为基础;而鎓功能团如王氏树脂(Wang),O-三 氯苯甲基能用于肽酸的制备,而aminoxanthenoxy  用于肽酰胺的制 备。
生物素或荧光标记多肽/蛋白也同样可以用标准的方法进行制 备。
(如:E.A.Bayer and M.Wilchek,Methods of Biochemical Aanlysis Vol.26,The Use of the Avidin-Biotin Complex as a Tool in Molecular Biology;和Handbook of Fluorescent Probes and Research Chemicals,6 Editiion,1996,by R.P.Haugland, Molecular Probes,Inc.;或者见:WO 97/14716)。
当然据本发明的多肽也能通过溶剂解而从它们的功能性衍生物 上解离下来,特别是通过水解作用或氢解作用。
优选的用于溶剂解或 氢解的起始物质是那些取代了一个或多个游离氨基和/或羟基而含有 相应被保护的氨基和/或羟基,尤其是那些取代了与N原子相连的H原子而带上一个氨基保护基团或者取代了羟基上的H原子而带上了一 个羟基保护基团。
同样,可以通过一个保护基团如酯来取代羧酸 “CO-OH”的羟基功能团,从而保护了羧酸。
通常都知道,氨基保护基团是指那些能通过化学反应恰当的保护 (或封闭)某一氨基,而且这些基团可以在分子内的其它位置经过特 定的化学反应而被轻易的除去。
羟基保护基团是同样的意思,即是指 那些能通过化学反应恰当的保护某一羧基,而且这些基团可以在分子 内的其它位置经过特定的化学反应而被轻易的除去。
这些化合物从它 们功能性衍生物上解离下来依靠于保护基团,例如利用各种强酸,很 方便的应用TFA或高氯酸,也可利用其它的无机强酸,如:盐酸或硫 酸;有机强羧酸如:三氯乙酸(TCA)或磺酸如苯或对甲苯磺酸。
氢 解可以除去的保护基团(如CBZ或苯基)例如能在一种催化剂(如在 惰性金属催化剂如钯,方便的支持剂如碳)存在下,用氢进行处理而 除掉。
N端和侧位氨基典型的保护基团是苄氧羰基(Z)、叔丁基羰基 (BOC)、Fmoc、而那些C端或Asp/Glu侧链的保护基团是O-prim-烷 基(如:OMe或OEt)、O-叔烷基(如:OBut)或O苄基。
例如Z,BOC, NO2,Mtr,Pmc或Pdf对Arg的胍基是适合的。
醇基能用苯基、三烷 基或三苯甲基来保护。
用在二氯甲烷中的三氟乙酸(TFA)或在15~30°的dioxane中用 约3~5N HCl,BOC,OBut和Mtr能优先除去,而在15~30°的二甲基 甲酰胺(DMF)中用约5~50%的二甲基胺、二乙基胺或哌啶能优选的 除去FMOC基团。
三苯甲基能用来保护组氨酸、天门冬酰胺、谷氨酰胺和半胱氨 酸。
去除反应依据最终产物的不同而进行实施。
用三氟乙酸(TFA) /10%苯硫酚,三苯甲基能从上述所有氨基酸上除去,而当用三氟乙 酸(TFA)/茴香醚或三氟乙酸(TFA)/硫代茴香醚,只有His,Asn 和Gln上的三苯甲基被除去,而Cys侧链上的保留下来。
氢解可去除的保护基团(如:CBZ或苯基)例如能在一种催化剂 (如在惰性金属催化剂如钯,方便的支持剂如碳)存在下,用氢进行 处理而除掉。
其中合适的溶剂是上面所提到的,特别是醇类如:甲醇、 乙醇或者酰胺类如DMF。
作为一种常规,氢解在约0~100°、约1~ 200bar下进行,优选20~30°、1~10bar。
例如CBZ基团的氢解能在 甲醇溶液中的5~10% Pd/C上很容易的进行,或者应用甲酸铵(代替 氢)在20~30°的甲醇/DMF中的Pd/C上进行。
如早已所述,根据本发明的多肽包括它们生理上可被接受的盐 类,这些盐类也同样可以用标准的方法进行制备。
因此,根据本发明 的化合物的一个碱基能转变成为结合酸的加成盐,例如在惰性溶剂中 混合等量的碱和酸进行反应,这些溶剂如:甲醇及其接下来的汽化。
适合这个反应的酸类尤其是那些能产生在生理上可被接受的盐类的 无机酸可以被应用,例如:硫酸、硝酸、氢卤酸如盐酸或氢溴酸、磷 酸如[正]磷酸、氨基磺酸;还可以是有机酸,特别是:脂肪酸、脂环 酸、araliphatic、芳香酸或杂环单或多元羧酸、磺酸或硫酸,如甲 酸、乙酸、丙酸、新戊酸、二乙基乙酸、丙二酸、丁二酸、庚二酸、 反丁烯二酸、顺丁烯二酸、乳酸、酒石酸、苹果酸、柠檬酸、葡糖酸、 抗坏血酸、烟酸、异烟酸、甲基或乙基磺酸、乙基二磺酸、2-羟基乙 基磺酸、苯磺酸、对甲苯亚磺酸、萘单和萘双磺酸、十二烷基硫酸。
生理上不可被接受酸的盐类,如:苦味酸盐能用于根据本发明的化合 物的分离和/或纯化,另一方面,根据本发明的化合物的酸类能通过 和一种碱反应而转变成生理上可被接受的金属盐或胺盐。
既然如此, 可能的盐类特别是钠、钾、镁、钙和胺盐,此外还有取代胺盐,如: 二甲基、二乙基或二异丙基铵盐,单乙醇、二乙醇或二乙醇异丙基铵 盐,环己基或二环己基铵盐、二苄基1,2-乙二铵盐,另外还有与精 氨酸或赖氨酸形成的盐类。
如上所述,据本发明的多肽化合物能够用作人药和兽药中的药物 活性物质,特别是在涉及上皮细胞功能失调的预防和/或治疗上。
在 此文尤其要强调的是皮肤、呼吸道组织、胃和肠部位功能失调、炎症 或伤口愈合过程。
例如:中风、心绞痛、肿瘤、溶骨性疾病如骨质 疏松症、病理性血管生成症如炎症纤维化、特别是肺的纤维化, opthalmological,糖尿病性视网膜病,视网膜黄斑变性,近视,眼 网状内皮细胞真菌病,风湿病样的关节炎,骨关节炎,风疹性青光眼, 溃疡性结膜炎,节段性回肠炎,动脉粥样硬化,牛皮癣,在急性肾功 能失调、肾炎、微生物感染和脑脊髓多发性硬化中血管成形述后的再 狭窄。
本发明相应的涉及上文和下面定义式中的多肽化合物和权利要 求所包括它们生理上可被接受作为药剂、诊断剂和试剂的盐类。
本发明尤其涉及了作为抑制剂的合适药剂,这些抑制剂能控制那 些直接或间接地基于表达αvβ6整合蛋白受体的功能失调症。
因此特 别是在生理性血管生成失调症,血栓形成,心肌梗塞,冠状心脏疾病, 动脉硬化,肿瘤,骨质疏松症,炎症、感染和影响伤口愈合过程。
还涉及合适的药学制剂,它们至少包含式I中的一种药剂,如果 可能的话,和载体和/或赋形剂。
另外,本发明还涉及权利要求书和说明书的多肽化合物的应用和 /或其生理上可被接受的盐类在生产用于控制那些直接或间接地基于 表达αvβ6整合蛋白受体的功能失调症药物中的应用,尤其是在生理 性血管生成失调症,血栓形成,心肌梗塞,冠状心脏疾病,动脉硬化, 肿瘤,骨质疏松症,炎症、感染和影响伤口愈合过程。
据本发明的药 物或包含它们的药物组合物能用作人药和兽药。
可用的载体是那些无 机或有机物质,这些物质适于在肠道或非肠道中给药,或局部应用或 通过吸入喷雾的形式给药而不与其它新物质发生反应。
这些物质例 如:水、植物油、苯甲醇、烷撑二醇、聚乙二醇、乙二醇三醋酸酯、 明胶、碳水化物如乳糖或淀粉、硬脂酸镁、滑石粉、凡士林。
尤其是 片剂、丸剂、外包片剂、胶囊、粉剂、粒剂、糖浆剂、用于口服的汁 或滴剂、肠道给药的栓剂、溶液、特别是油性或水溶性溶液,另外, 混悬液、乳剂或植入片被用作肠胃外给药,软膏、乳膏和粉剂被用于 局部。
此新颖的化合物还可以被冷冻而且得到的冻粉还可以被利用, 例如用于注射试剂的生产。
这些指定的制剂能够被固定化和/或包含 有赋形剂如润滑剂、防腐剂、稳定剂和/或湿润剂、乳化剂、影响渗 透压的盐类、缓冲剂、着色剂、调味料和/或更具活性的物质如:一 种或多种维他命。
作为一种喷雾吸入给药,这些喷雾剂可以以溶解或使其悬浮在推 进剂或推进剂混合物(如:CO2或氟氯碳氢化合物)的方式包含活性物 质。
既然这样,这些活性物质很方便的以微粒体的形式使用,其中可 以添加一种或多种生理上能被接受的溶剂化物如:乙醇。
可吸入溶液 能在通常的吸入器的助推下给药。
通常,据本发明的物质可以其它已知、商业上可得的多肽的类似 方式(参见:US-A-4 472 305)进行施药,特别是剂量在0.05~500mg。
更优选0.5~100mg每剂量单位。
优选的每天剂量约为:0.01~20mg 每公斤体重。
然而,每个病人的特定剂量受各种因素影响,如:特定 药物的药效、年龄、体重、整体健康状况、性别、节食、服药时间和 给药途径,排泄速率、诊断所涉及对特定病症的药物间复合反应和病 症的严重性。
优选非肠道给药。
此外,据式I的新化合物能用于分析生物学和分子生物学。
据式I的新化合物,其中X是一种荧光染色基团,通过-CONH-, -COO-,-NH-C(=S)-NH-,-NH-C(=O)-NH-,-SO2NH-或-NHCO-相连, 它们能用作荧光活化细胞分选技术(FACS)和荧光显微镜中的诊断标 记。
标记化合物应用在荧光显微镜中的例子可参见:Y.-L.Wang ang D.L.Taylor,Fluorescence Microscopy of Living Cells in Culture,parts A+B,Academic Press,Inc.1989。
据本发明的新化合物也能够作为整合蛋白的配体用来制备纯化 的整合蛋白的亲和层析拄。
亲和素衍化的支持物复合体如:琼脂糖和 此新化合物能够用已知的方法进行制备(例如:E.A.Bayer and M. Wilchek,Methods of Biochemical Analysis Vol 26,The Use of the Avidin-Biotin Complex as a Tool in Molecular Biology)。
这儿合适的多聚支持物是那些多聚固相物质,它们具有优先亲水性和 目前已知多肽化学性质,例如交连多糖如:纤维素、琼脂糖凝胶或 Sephadex,丙烯酰胺,基于聚乙二醇或Tentakel Polymers的多聚 物。
最后本发明还包括了编码多肽区的重组DNA序列,这个多肽区含 有据本发明的多肽的结构基元。
这种类型的DNA能够以微粒体的形式转进细胞内,参见:Ch. Andree et al.Proc.Natl.Acad.Sci.91,12188-12192(1994), 或这个转移能够被其它的赋形剂如脂质体所提高(A.I.Aronsohn and J.A.Hughes J.Drug Tragrting,5,163-169(1997))。
这种类型的DNA的转移通过杆状病毒能够相应的用在酵母中,或 者在哺乳动物细胞中生产据本发明的多肽物质。
如果动物或人体感染了这种类型的重组DNA,本发明的多肽能在 这些被感染的细胞中最终形成并能够迅速地结合于如肿瘤细胞的αvβ6整合蛋白受体上,并阻断它。
相应的重组DNA能通过已知和常规 的技术进行制备,然而也能够以包含有病毒外壳蛋白编码序列片断的 病毒DNA形式存在。
通过以重组优选非致病的这种类型病毒感染寄主 组织,那些表达整合蛋白αvβ6的寄主细胞能被优先受到攻击(寻 靶)。
合适的病毒如腺病毒已经许多次被用作向哺乳动物细胞转移外 源基因的载体。
一系列特性确保它们成为基因治疗的良好候选者。
可参见:S.J.Watkins et al.Gene Therapy 4,1004-1012(1997); (或另见:J.Engelhardr et al.Hum.Gene Ther.4,759- 769(1993))。
从(A.Fasbender et al.J.Clin.Invest.102,184- 193(1998))中可以看出,通过病毒和非病毒载体进行基因治疗中的 一个共同问题是基因转移效率的限制性。
通过在腺病毒的外壳蛋白上 外加上述αvβ6整合蛋白的配体序列,提高了转移效率,如已成功地 提高了胆囊纤维化跨膜蛋白质电导调节剂(CFTR)cDNA的转移效率。
同T.Tanaka et al.(Cancer Research 58,3362-3369(1998)) 的工作相似,只是代替了血管抑制素的DNA,据本发明的序列的DNA 也能通过逆转录病毒或腺病毒载体应用于细胞转染中。
据本发明的多肽还能够用于用以细胞培养物的传染的含有脂/多 肽/DNA的脂质体复合物和用在人体基因治疗含有脂/DNA(无多肽)的 脂质体复合物中。
含有脂/多肽/DNA的脂质复合体的制备参见:Hart S.L.et al.1998:Lipid-mediated Enhancement of Transfection by a Non-Viral Integrin-Trargeting Vector.Human Gene Therapy 9,575-585。
脂/多肽/DNA的脂质复合体的制备可利用下述的贮存液:1μg/μl 脂转染试剂(DOTMA(N-[1-(2,3-二油氧)丙基]-N,N,N-三甲基氯化铵) 和DOPE(二油基磷酯酰乙醇胺)的等量混合物),10μg/ml质粒DNA 和100 μg/ml多肽。
为此,DNA和多肽都是溶解在细胞培养基中。
这个脂质复合体是通过混合特定重量比(例如:脂∶多肽∶DNA= 0.75∶1∶4)的这三种而制备的。
用于人类基因治疗的脂质体DNA复合 物已经有所描述,见(Caplen N.J.et al.1995:Liposome-mediated CFTR gene transfer to the nasal epithelium of patients with cystic fibrosis,Nature Medicine 1,39-46)。
因此,本发明还涉及利用基因释放系统中相应修饰过的重组 DNA,优选是病毒DNA,用于控制那些基于直接或间接地表达αvβ6整 合蛋白受体的各种疾病。
因此尤其是病理性血管生成失调症、血栓形 成、心肌梗塞、冠状心脏失调症、动脉硬化、肿瘤、骨质疏松症、炎 症、感染和影响伤口愈合的过程。
上文和下面的所有温度都是指摄氏度。
HPLC分析(保留时间Rt)通过下述系统实施: 5um LichroSpher 60 RP-Select B(250-4)拄,在水/0.3%三氟 乙酸中50分钟0~80%的2-丙醇的浓度梯度,以1ml/min的流速和 在215nm进行检测。
质谱(MS):EI(电子碰撞电离)M+          FAB(快原子轰击)(M+H)+实施例1 制备和纯化据本发明的多肽 通常,制备和纯化可用Fmoc策略通过在酸不稳定树脂上对酸不 稳定侧链的保护,应用商购“连续流动”多肽合成仪,可参见:Haubner et al.(J.Am.Chem,Soc.118,1996,17703)。
环(Arg-Thr-Asp-Leu-D-Asp-Ala-Leu-Arg-Abu-Abu) [EMD 272914] 2.7gFmoc-Abu-OH(Bachem B-1910)悬浮在150ml二氯甲烷中, 加10mlDMF直到它们完全溶解至清亮。
加入5.6ml二异丙基乙胺,此 溶液浇注12.0g O-氯三苯甲基聚苯乙烯树脂(1.14mmol/g, Bachem D-196512),并在室温进行摇动。
5小时后,树脂通过抽吸滤干,并分别用300ml的 DCM/MeOH/DIEA=17/2/1,DCM,DMF,DCM和MeOH清洗。
除去各种溶 剂后,得到了14.55g的Fmoc氨基树脂。
平均,三份Fmoc测定表明 能负载(loading)541umol/g的Fmoc-Avu-O-oClTrt-树脂。
0.7g Fmoc-Abu-O-oClTrt-聚苯乙烯树脂连续两次经受了在商业 合成仪中4.1ml的DMF中溶有0.30gTBTU,0.315ml乙基二异丙胺和 Fmoc氨基酸的双偶联技术中的偶联步骤,其典型的程序可参见 (Milligen 9050 Pep SynthesizerTM合成仪和手册,1987),每种 条件下都是30min。
洗脱在DMF中持续10分钟,裂解在哌啶/DMF(1∶ 4体积比)中,5分钟,N-端乙酰化(盖帽)用乙酰酐/哌啶/DMF(2∶3∶15 体积比),15分钟。
首先是氨基酸Fmoc-Arg(Pmc),接着Fmoc-Leu,接着Fmoc-Ala, 接着Fmoc-D-Asp(Obut),接着Fmoc-Leu,接着Fmoc-Asp(OBut), 接着Fmoc-Arg(Pmc),最后是Fmoc-Abu。
从Fmoc-Abu-Arg(Pmc)- Thr(But)-Asp(OBut)-Leu-D-Asp(OBut)-Ala-Leu-Arg(Pmc)- Abu-O-oClTrt-聚苯乙烯树脂上去掉Fmoc保护基团后,用DMF和异丙 醇洗,室温真空干燥后就得到了0.9g的Abu-Arg(Pmc)-Thr(But)- Asp(Obut)-Leu-D-Asp(OBut)-Ala-Leu-Arg(Pmc)-Abu-O-oClTrt-聚 苯乙烯树脂。
在室温下用20ml三氟乙醇/二氯甲烷/醋酸(2∶6∶2体积比) 处理这个肽基树脂2小时,过滤,真空浓缩,研磨得到了0.19g的侧 链被保护的多肽Abu-Arg(Pmc)-Thr(But)-Asp(OBut)-Leu-D-Asp (OBut)-Ala-Leu-Arg(Pmc)-Abu-OH。
在30分钟内滴加此产物的DMF溶液(100mg多肽/15mlDMF)到 已经搅拌好的50mlDMF/100mg多肽的TBTU/HOBt/DIPEA(10∶10∶11当 量)的调和溶液中,进一步搅拌1小时,就得到了环化物。
经过用水 浓缩和析出,得到了0.15g的粗制的环状多肽,环[Arg(Pmc)-Thr(But) -Asp(OBut)-Leu-D-Asp(OBut)-Ala-Leu-Arg(Pmc)-Abu-Abu]。
室温用三氟乙酸/水/TIS(94∶3∶3体积比)处理2小时,真空浓缩 和在二乙酯醚研磨得到了85mg的环[Arg-Thr-Asp-Leu-D-Asp- Ala-Leu-Arg-Abu-Abu]沉淀物。
在0.3%的三氟乙酸用4%到24%的2-丙醇梯度溶液通过RP- HPLC(Lichrosorb RP 18(250-25,7um,Merck KGaA))以10ml/min 的流速持续一个小时来纯化此产物,流出物的评估应用紫外流通式光 度计在215和254nm处进行,得到51mg的产物,FAB 1067;Rt19.0。
下面的物质式通过相似的方法制备的: 编码
(EMD)
序列

MW
(g/mol)
FAB

Rt

271312
环(RTDLDSLR)
957.1
958
15.10
271578
环(RTDLdSLR)
957.1
957
17.51
 编码
 (EMD)
序列

MW
(g/mol)
FAB

Rt

 271579
  环  (RTDLdALR)
941.1
941
16.64
 271586
  环  (RGDLDSLR)
913.0
913
17.95
 271587
  环  (RGDLdsLR)
913.0
913
17.24
 271588
  环  (RGDLdALR)
897.0
897
19.60
 271589
  环  (RGDLdGLR)
882.9
883
16.68
 271590
  环  (RGDLd-β-Ala-LR)
897.0
897
15.47
 27159l
  环  (RGDLdALRG)
954.1
 954
16.79
 271592
  环  (RGDLdALRGG)
1011.1
1011
17.83
 271593
  环  (RGDLdALRGGG)
1068.2
1068
17.79
 271594
  环  (RGDLdALRGGGGGG)
1239.3
1239
17.30
 272914
  环  (RGDLdALR-Abu-Abu)
1067.2
1067
19.00
 272966
  环  (RTDLdALRGGG)
1112.2
1113
17.14
 272967
  环  (RTDLdGLRGGG)
1098.2
1099
19.00
 272968
  环  (RTDLDALRGGG)
1112.2
1113
17.39
 272969
  环  (RTDLDGLRGGG)
1098.2
1099
16.88
 272970
  环  (RGDLDALRG)
954.1
 955
17.32
 272971
  环  (RaDLdALRGGG)
1082.2
1083
18.26
 272972
  环  (RGDLaALRGGG)
1082.2
1083
18.23
 272958
  环  (RGDLdALR-Aha-Aha)
1123.3
1123
19.38
 272959
  环  (RGDLdALR-Aha)
1010.2
1010
20.63
 272960
  环  (RGDLdALR-Aee)
1042.2
1042
18.92
 27296l
  环  (RGDLdALRGGGG)
1125.2
1125
17.56
 272962
  环  (RGDLdALRGGGGG)
1182.3
1182
17.52
 272963
  环  (RGDLdGLRGGG)
1054.1
1054
15.59
 272964
  环  (RGDLDALRGGG)
1068.2
1069
16.84
 272965
  环  (RGDLDGLRGGG)
1054.1
1055
16.03
 273028
  环  (RTDLdALR-Aha)
1072.2
n.d.
19.30
 273033
  环  (RTDLdALR-Abu)
1044.2
n.d.
16.72
 273035
  环  (RGDLdALR-Abu)
1000.1
n.d.
16.96
 273038
  环  (RTDLdALR-Aha-Aha)
1185.4
n.d.
20.46
 273040

  环  (RTDLdALR-Abu-Abu)
× 2 TFA
1111.3

n.d.

18.75

 304219
  环  (RTDLdALR-βAla)
1012.1
1012
19.4
 304218
  环  (RGDLdALR-βAla)
968.1
 968
18.7
 329400
  环  (RGDLdALR)
811.9
 812
21.15
 编码
 (EMD)
序列

MW
(g/mol)
FAB

Rt

 329412
环  (RTDLdALR-Abu-Abu)
1111.3
1112
20.31
 329402
环  (RGDLdALAGGG)
983.1
 984
20.48
 329399

环  (NMeArg-
GDLaALRGGG)
1038.2

1039

19.66

 329398

环  (R-NMeGly-
DLaALRGGG)
1038.2

1039

19.76

 326397

环  (RGD-NMeLeu-
aALRGGG)
1038.2

1039

20.22

 329396

环  (RGDL-[D-NMeAla]-
ALRGGG)
1038.2

1039

20.55

 329395

环  (RGDLa-NMeAla-
LRGGG)
1038.2

1039

21.35

 329394

环  (RGDLaA-NMeLeu-
RGGG)
1038.2

1039

18.87

 329393

环  (RGDLaAL-NMeArg-
GGG)
1038.2

1039

20.64

环  (RGDLdAAR)
环  (RGDLdAARGGG)
氨基酸的命名原则是参考了Eur.J.Biochem.138,9-37(1984) 小写字母表示D型氨基酸 n.d.表示不确定 实施例2 αvβ6/纤连蛋白受体结合实验: 已制备好的本发明的多肽和在溶液中竞争性起作用的纤连蛋白 一起结合到固定化的αvβ6受体上,Q值被作为这种多肽对αvβ6结合 选择性的一种检测手段。
这儿的Q值是用被测多肽的IC50值与标准多 肽IC50值的商来计算的。
标准多肽是线性分子:Ac-RTDLDSLR-NH2(代 码  EMD 271293)(参见专利,Pytela et al.Science 231, 1559,(1986))。
结合实验的细节如下所述: 可溶性αvβ6受体在微滴定平皿上的固定通过下列步骤完成,可 将此蛋白质溶液稀释在TBS++中,并在4℃温育过夜(100μl/孔)。
非特异的结合位点被用TBS++中3%的牛血清白蛋白(200ul/孔)通 过温育(37℃,2小时)所阻断。
过量的牛血清白蛋白用TBSA++洗三 次而去除。
多肽在TBSA++中被连续稀释(1∶10)并和生物素化的纤 连蛋白一起与固定化的整合蛋白温育(每孔50ul的多肽+50ul的配 体;37℃;2小时)。
未结合上的纤连蛋白和多肽用TBSA++洗三次而 除去。
结合上的纤连蛋白用碱性磷酸酶耦联的抗生物素抗体 (Biorad)37℃温育1小时来检测(TBSA++中,1∶20,000;100ul/ 孔)。
用TBSA++洗三次后,通过与底物溶液(5mg磷酸硝基苯,1ml 乙醇胺,4ml水;100μl/孔)的温育(25℃,黑暗中,10-15min)用 比色法进行检测。
此酶反应可以通过添加0.4M NaOH(100ul/孔)而 终止。
色彩强度可由ELISA检测装置在405nm处决定,并与零值比较。
那些没有被受体包被的孔定为零值。
Ac-RTDLDSLR-NH2被用作一个标 准。
被测多肽的IC50值可从图上读出,用这个值加之标准多肽的IC50值就可以决定据本发明的多肽的Q值。
Q值=被测多肽的IC50值/标准多肽的IC50值 通过重复实验来计算Q值。
所述实验的结果总结在下面的表1中: 表1 αvβ6/纤连蛋白受体结合实验的结果  编码(EMD)


  序列


  Q值=被测多肽的
  IC50/EMD 271293
  的IC50
 271293
  Ac-RTDLDSLR-NH2
  1.00(=75nM)
 271586
  环  (RGDLDSLR)
  26
 271587
  环  (RGDLdSLR)
  88
 271588
  环  (RGDLdALR)
  47
 271589
  环  (RGDLdGLR)
  19
 272970
  环  (RGDLDALRG)
  6.7
 272964
  环  (RGDLDALRGGG)
  0.037
 272965
  环  (RGDLDGLRGGG)
  0.16
 272972
  环  (RGDLaALRGGG)
  0.05
 271593
  环  (RGDLdALRGGG)
  0.03
 272963
  环  (RGDLdGLRGGG)
  0.084
 271590
  环  (RGDLd-βAla-LR)
  233
 271591
  环  (RGDLdALRG)
  2.1
 271592
  环  (RGDLdALRGG)
  0.05
 271594
  环  (RGDLdALRGGGGGG)
  0.05
 272914
  环  (RGDLdALR-Abu-Abu)
  0.03
 272958
  环  (RGDLdALR-Aha-Aha)
  0.036
 272959
  环  (RGDLdALR-Aha)
  0.036
 272960
  环  (RGDLdALR-Aee)
  0.038
 272961
  环  (RGDLdALRGGGG)
  0.033
 272962
  环  (RGDLdALRGGGGG)
  0.046
 273035
  环  (RGDLdALR-Abu)
  0.028
 271312
  环  (RTDLDSLR)
  8
 271578
  环  (RTDLdSLR)
  104
 271579
  环  (RTDLdALR)
  12
 272966
  环  (RTDLdALR-GGG)
  0.05
 272967
  环  (RTDLdGLR-GGG)
  0.15
 272968
  环  (RTDLDALR-GGG)
  0.14
 272969
  环  (RTDLDGLR-GGG)
  0.18
编码(EMD)


  序列


Q值=被测多肽的
IC50/EMD 271293
的IC50
 273028
  环(RTDLdALR-Aha)
0.015
 273033
  环(RTDLdALR-Abu)
0.043
 273038
  环(RTDLdALR-Aha-Aha)
0.015
 273040
  环(RTDLdALR-Abu-Abu)
0.014
 272971
  环(RaDLdALR-GGG)
8.2
下面的例子涉及药剂制备: 实施例A:注射剂小瓶 100g的环(Arg-Thr-Asp-Leu-D-Asp-Ala-Leu-Arg-Abu-Abu)和 5g的磷酸氢二钠溶解在3升的双蒸水中,用2N的盐酸调节pH值至 6.5,无菌过滤,分装到注射用的小瓶中,无菌条件下冻干和封口。
每个小瓶含有5mg的活性化合物。
实施例B:栓剂 20g的环(Arg-Thr-Asp-Leu-D-Asp-Ala-Leu-Arg-Abu-Abu)混 合物与100g的大豆卵磷脂和1400g的椰子油融合,浇注模子至其冷 却。
每个栓包含20mg的活性化合物 实施例C:溶液 一种溶液由1g环(Arg-Thr-Asp-Leu-D-Asp-Ala-Leu-Arg- Abu-Abu)和9.38g NaH2PO4·2H2O,28.48g NaH2PO4·12H2O和0.1g 洁而灭溶解在940ml的双蒸水中,调节pH值至6.8,补足至1升, 并辐射灭菌。
这种溶液能用作眼药水。
实施例D:软膏 500mg的环(Arg-Thr-Asp-Leu-D-Asp-Ala-Leu-Arg-Abu-Abu) 和99.5g凡士林在无菌条件下混和。
实施例E:片剂 1kg的环(Arg-Thr-Asp-Leu-D-Asp-Ala-Leu-Arg-Abu-Abu), 4kg乳糖,1.2kg马铃薯淀粉,0.2kg滑石粉和0.1kg硬脂酸镁的混 合物通过常规的方法压缩成片剂,利用这种方法,每片含有10mg活 性化合物。
实施例F:包被片剂 与实施例E相似,片剂被压制随后用常规的方法包上一层蔗糖、 马铃薯淀粉、滑石粉、黄茋胶和色剂。
实施例G:胶囊 用常规的方法将2kg的环(Arg-Thr-Asp-Leu-D-Asp-Ala-Leu- Arg-Abu-Abu)分配到硬明胶胶囊中使每个胶囊中含有20mg的活性化 合物。
实施例H:安瓿 1kg的环(Arg-Thr-Asp-Leu-D-Asp-Ala-Leu-Arg-Abu-Abu)溶 解在60升双蒸水中,无菌过滤,分装到安瓿中,无菌冻干和封口。
每安瓿含有10mg的活性化合物。
实施例I:吸入式喷雾剂 14g的环(Arg-Thr-Asp-Leu-D-Asp-Ala-Leu-Arg-Abu-Abu)溶 解在10升NaCl等渗溶液中,并把它分装到商业上可得的雾剂容器 中,这个雾剂容器要有一个泵的装置。
一次的喷雾量(约为0.1ml) 大约相当于0.14mg的剂量。
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