八月瓜首页 > 专利查询 > >正文

抑制细胞基质金属蛋白酶的矢车菊苷配质低聚体和以此为有效成分的药物

基本信息

  • 申请号 CN00810429.8 
  • 公开号 CN1364082A 
  • 申请日 2000/07/14 
  • 公开日 2002/08/14 
  • 申请人 LG生活健康株式会社  
  • 优先权日期  
  • 发明人 金祥年 安浩井 朴相奇 金文武 金正勳 李鹤模 朴炯国 赵惠星 郑胜永  
  • 主分类号  
  • 申请人地址 大韩民国汉城永登蒲区 
  • 分类号  
  • 专利代理机构 上海市华诚律师事务所 
  • 当前专利状态 发明专利申请公布 
  • 代理人 徐申民 
  • 有效性 发明公开 
  • 法律状态
  •  

摘要

本发明公开了与细胞基质金属蛋白酶(MMP)相比较具有显著生物活性的矢车菊苷配质低聚体。
所述矢车菊苷配质低聚体能从榆树属和其他植物中分离出来,并包含具有黄烷-3-醇单体结构的十二个矢车菊苷配质低聚体构成的三聚体。
本发明还公开了矢车菊苷配质低聚体在治疗肿瘤转移或入侵,类风湿性关节炎,糖尿病,角膜溃疡,表皮溃疡,和胃溃疡,皮肤皱纹,牙周炎,骨质疏松症的应用;并促进受伤伤口和烧伤伤口的愈合,及促进其他相关病症的恢复,在这些疾病中不能控制的高水平的MMP被认为是在致病过程中起了重要作用。
展开

权利要求书


1.一种抑制细胞基质金属蛋白酶(MMP)的矢车菊苷配质低聚体。

2.如权利要求1所述的矢车菊苷配质低聚体,其中,细胞基质金属蛋白酶选自 溶胶原蛋白酶,MMP-1,MMP-8,MMP-2和MMP-9的胶原酶IV型,和细 菌分泌的胶原酶。

3.如权利要求1所述的矢车菊苷配质低聚体,其中,矢车菊苷配质低聚体是初 级提取物经溶剂分馏后制备得到的正丁醇部分,所述初级提取物是从榆树皮 质中,即榆树属植物的根或树皮中用极性溶剂提取的。

4.如权利要求1所述的矢车菊苷配质低聚体,其中,矢车菊苷配质低聚体是经 甲醇浓度递增过程中连续洗脱得到正丁醇部分的浓缩的制备物,当正丁醇部 分是通过极性分配从榆树皮质中,即榆树属植物的根或树皮中用极性溶剂得 到的提取物来制备得到时,则结合以薄层层析为基础的洗脱液,通过水-甲醇 混合液展开进一步的葡聚糖凝胶Sephadex LH-20柱层析。

5.如权利要求1所述的矢车菊苷配质低聚体,其中,矢车菊苷配质低聚体是通 过在100%甲醇中连续洗脱正丁醇部分浓缩得到的制备物,当正丁醇部分是 通过溶剂分配(solvent-partitioning)从榆树皮质中,即榆树属植物的根或树 皮中用极性溶剂得到的提取物来制备得到时,则结合以薄层层析为基础的洗 脱液,通过100%甲醇展开进一步的葡聚糖凝胶Sephadex LH-20柱层析。

6.如权利要求1所述的矢车菊苷配质低聚体,其中,矢车菊苷配质低聚体是以 单键连接,并以黄烷-3-醇为主轴的3-12个单体构成。

7.用于预防和/或治疗由细胞基质金属蛋白酶(MMP)活性引起的疾病的药物组合 物,包括以矢车菊苷配质低聚体作为活性组分的药物组合物。

8.如权利要求7所述的药物组合物,其中,所述疾病选自下列一组疾病,包括 癌症转移,类风湿性关节炎,糖尿病,炎症,角膜溃疡,表皮溃疡,胃溃疡, 皮肤皱纹和老化,牙周炎,骨质疏松症,痤疮,受伤和烧伤,和甲状腺机能 亢进。

9.如权利要求7所述的药物组合物,其中,细胞基质金属蛋白酶(MMP)选自下 列一组,包括溶胶原蛋白酶,MMP-1,MMP-8,MMP-2和MMP-9的胶原酶 IV型,和细菌分泌的胶原酶。

10.如权利要求7所述的药物组合物,其中,所述药物组合物可以以片剂,胶 囊,粉末,软膏,溶液,凝胶,糊剂,补片或粒剂。

11.如权利要求7所述的药物组合物,其中,所述矢车菊苷配质低聚体的含量 为0.0001-5%(重量比)。

12.如权利要求7所述的药物组合物,其中,所述矢车菊苷配质低聚体是通过 溶剂分馏(solvent-fractionating)提取制备得到的正丁醇部分,所述提取物是 从榆树皮质中,即榆树属植物的根或树皮中用极性溶剂提取的。

13.如权利要求7所述的药物组合物,其中,矢车菊苷配质低聚体是经甲醇浓 度递增过程中连续洗脱得到正丁醇部分的浓缩的制备物,当正丁醇部分是通 过溶剂分配(solvent-partitioning)从榆树皮质中,即榆树属植物的根或树皮 中用极性溶剂得到的提取物来制备得到时,则结合以薄层层析为基础的洗脱 液,通过水-甲醇混合液展开进一步的葡聚糖凝胶Sephadex LH-20柱层析。

14.如权利要求7所述的矢车菊苷配质低聚体,其中,矢车菊苷配质低聚体是 通过在100%甲醇中连续洗脱正丁醇部分浓缩得到的制备物,当正丁醇部分 是通过溶剂分配(solvent-partitioning)从榆树皮质中,即榆树属植物的根或 树皮中用极性溶剂得到的提取物来制备得到时,则结合以薄层层析为基础的 洗脱液,通过100%甲醇展开进一步的葡聚糖凝胶Sephadex LH-20柱层析。

15.如权利要求7所述的矢车菊苷配质低聚体,其中,矢车菊苷配质低聚体是 以单键连接,并有以黄烷-3-醇为主轴的3-12个单体构成。
展开

说明书

本申请是以1999年7月16日向韩国工业产权局提交的申请号为10-1999- 0028877的专利申请为基础,该专利申请的内容已包含在下文中。
技术领域 本发明涉及矢车菊苷配质低聚体,尤其涉及矢车菊苷配质低聚体的抑制细 胞基质金属蛋白酶(MMP)的活性,该MMP能分解相连组织的胞外基质和底膜。
所述矢车菊苷配质低聚体从榆树属和其他植物的榆树皮质中提取的,由3-12个 基本单体黄烷-3-醇构成。
所述矢车菊苷配质低聚体能用于预防和治疗癌症转 移,牙科疾病,类风湿性关节炎,糖尿病,角膜溃疡,表皮溃疡,胃溃疡,皮 肤皱纹和老化,牙周炎,骨质疏松症,受伤,烧伤,和MMP起重要作用的其 他相关疾病。
背景技术 细胞基质金属蛋白酶(MMP)是一个含钙的并依赖锌的肽链内切酶,它是从 细胞如多形核嗜中性白细胞,巨噬细胞,成纤维细胞和骨细胞中分泌出来,在 中性pH中起作用,并以各种胞外基质作为基质。
细胞基质金属蛋白酶不仅与 许多生理过程如胚胎形成,组织形成,唾腺形成和牙齿有关,而且与病理过程 和多种疾病如伤口,癌症转移,牙科疾病,类风湿性关节炎,炎症,糖尿病, 角膜溃疡,骨质疏松症,胃溃疡,外伤,皮肤皱纹和老化,受伤,烧伤。
特别是,胶原酶IV的MMP(MMP-2和MMP-9),即72-kD和92-kD胶原 酶是癌细胞渗透和转移中最重要的酶,因为它们分解胶原酶IV,该胶原酶IV 是基膜的主要结构构成,该基膜是阻止癌转移的第一道防线。
在牙科疾病中MMP 引起从成纤维细胞,多形核白细胞,上皮细胞,巨噬细胞中分泌胶原酶,以及 从牙周细菌分泌出胶原酶以分解作为牙周组织基质的胶原,形成牙龈退化,并 继续发展成牙周疾病。
更进一步的是,近来发现MMP与皮肤衰老,光引起的 皮肤老化,及皱纹形成有密切的关系(Br.J.Dermatoal.,2000;142,267-273,ARCH Dermatol.Res,2000;292,27-31,Free Radical Biol.Med.,1999;27,729-737)。
因此,胶原酶抑制剂作为药物的功能是有用于预防和治疗癌症渗透和转移, 胶原相连组织的分解引起的疾病,如牙周疾病,类风湿性关节炎,炎症,皮肤 皱纹和老化,糖尿病,角膜溃疡,表皮溃疡,胃溃疡,骨质疏松症,外伤,和 烧伤,癌症渗透和转移,胶原相连组织的分解。
已发现的能抑制MMP活性的药物包括四环素类药物如四环素,二甲胺四 环素和强力霉素,和肽衍生物。
肽衍生物与胶原酶很相似,酶抑制剂包括抑制用羟肟酸,硫醇,和能螯合 在胶原酶活性部位的锌离子的羧基烷基基团(Pharmacol.Ther.,1997;75,69-75, U.S.Patent Nos.4996358,5183900,5300674,5861436,等)。
例如,在美国专利 5514677已经公开类风湿性关节炎,炎症,皮肤疾病,骨质疏松疾病,癌症转 移,和伤口等能通过用羟肟酸抑制胶原酶来治疗。
更进一步的是,美国专利 4666897公开了胶原酶的过高活性能用四环素,二甲胺四环素,强力霉素来抑 制。
下列化学式1所代表的矢车菊苷配质是一个低聚体和多聚体的通式,或更 多具有以儿茶精(catechin),表儿茶精(epicatechin),儿茶精没食子酸盐(catechin gallate),表儿茶精没食子酸盐(epicatechin gallate),没食子酸盐儿茶精 (gallocatechin gallate),或表没食子儿茶精没食子酸盐(epigallocatechin gallate)为 主轴的二聚体体,这是一个在大多数植物体中都有的非水解性丹宁。
这样的矢 车菊苷配质具有一个结合蛋白的能力,特别是二聚体具有抗炎症能力。
儿茶精 (catechin)被认为是绿茶丹宁,被报道为具有显著的抗癌能力。
(化学式1) 其中,当矢车菊苷配质是儿茶精(catechin),则R1=OH,R2,R3=H;当它是 表儿茶精(epicatechin)时,则R1=H,R2=OH,R3=H;当它是表儿茶精-3-O-没食 子酸盐(epicatechin-3-O-gallate),则R1=H,R2=O-galloyl,R3=;当它是表儿 茶精没食子酸盐(epigallocatechin),则R1=H,R2,R3=OH;当它是表儿茶精-3- O-没食子酸盐(epigallocatechin-3-O-gallate),则R1=H,R2=O-galloyl,R3=OH。
更进一步的是,多聚体是通过单聚体(4-8或4-6)之间键连接形成。
在美国专利5494661,5877206,5646178,4797421和国际申请专利(公开 号WO93/24106)等中均已公开了与抗氧化影响和抗病毒的有关技术,防止矢车 菊苷配质影响的细菌粘连。
另,用矢车菊苷配质作药物的相关技术(欧洲专利公 开号812592,日本专利Laid-open公开号Sho 61-83958,等),用矢车菊苷配质 作化妆品的相关技术(欧洲专利公开号694305,日本专利Laid-open公开号Sho 63-36420,等),用矢车菊苷配质作食物添加剂的相关技术(日本专利Laid-open 公开号Hei 10-004923,Hei 7-49333等),及矢车菊苷配质的制备方法(日本专利 Laid-open公开号Sho 63-3267774,南非专利公开号8205023等)均已得到公开。
更进一步的是,与用绿茶成分抑制细胞基质金属蛋白酶有关的各种研究均 已有报道。
例如,绿茶成分,表儿茶精没食子酸盐,表没食子儿茶精没食子酸 盐(epigallocatechin gallate),微生物和牙龈裂缝溶液中溶胶原的抑制活性(J Periodontal.,1993;64,630-636);表儿茶精没食子酸盐,表没食子儿茶精没食子酸 盐,茶黄素抑制癌细胞渗透入胶膜(J.Agric.Food Chem.1999;47,2350-2354); 已表明绿茶的表儿茶精没食子酸盐和表没食子儿茶精没食子酸盐有作用于 MMP-2,MMP-9,MMP-12的影响(Biochem.Biophys.Acta,2000;1478,51-60); 已表明绿茶和红茶的儿茶精和茶黄素有抑制肺癌细胞株的MMP-2和MMP-9怕 活性(Biosci Biotech Biochem.,1997;61,1504-1506),等。
然而,所有这些发现表 明儿茶精或儿茶精没食子酸盐衍生物具有较低的分子量,而用本发明的矢车菊 苷配质低聚体混合液抑制MMP酶却是未知的,该混合液是以3-12个黄烷-3-醇 单体多聚连接成的。
另一方面,榆树皮质,即榆树属的榆树macrocarpa,Pumila,Daviciana, Americana的根和茎的树皮被传统地用于炎症,胃溃疡等。
近来,美国专利 6045800报道榆树皮质具有抑制与牙周疾病有关的胶原酶的显著活性,与炎症 抑制评估有关的结果已被公开(J.Ethanopharm,1998;62,129-135)。
发明目的 调查研究结果表明,榆树皮质的成分具有显著的胶原酶抑制活性,本发明 人发现矢车菊苷配质低聚体是个主要成分。
因此,本发明的一个目的是提供一个抑制细胞基质金属蛋白酶(MMP)活性 的矢车菊苷配质低聚体。
本发明的另一个目的是提供一个包含天然成分,矢车菊苷配质低聚体和天 然的表没食子儿茶精没食子酸盐的药物组合物。
其中,矢车菊苷配质低聚体与 合成的细胞基质金属蛋白酶抑制剂(如传统的强力霉素等)相比较则更高效,更 安全。
其中,表没食子儿茶精没食子酸盐作为活性成分。
附图的简要说明 本发明的详细说明书结合下列附图,可以更好地理解本发明及其优点。
图1表明用HPLC/ESI质谱仪(高效液相色谱层析/电子喷雾电离),Finnigan LCQ分析硅乙基乙酸部分的结果。
结果表明,矢车菊苷的分子量为290(9.1 minutes),两种矢车菊苷配质二聚体的分子量578(17.08minutes,18.33minutes), 和分子量为422(13.34minutes,13.75minutes)的不明确物质。
图2表明检测馏分4主要成分(矢车菊苷配质低聚体)的分子量中加入钠 后的[M+钠]+质量的结果,以氰-4-羟基肉桂酸作为基质,并用MALDI- TOF(Matrix-assisted laser desorption/ionization time-of-flight)。
图3表明用HPLC/ESI质谱仪跟踪五聚物的质量为1441的[M-H]和质量 为1555的[M+TFA-]-的结果。
图4表明用HPLC/ESI质谱仪的结果,可以预测馏分4中检测到的三聚体和 十二聚体的矢车菊苷配质低聚体的峰值,具可预测质量的离子分配从馏分4色 谱分析的较早期向较晚期转变,多聚程度则从3开始增加。
图5表明在色谱仪上检测的保留时间区段扫描得到的质峰,与用HPLC/ESI 质谱仪的指定质峰相邻近,如果为四聚体设置保留时段时,当主峰为 1153([M-H]-)和1267([M+TFA-]-),则表明馏分4的主要成分是矢车菊苷 配质低聚体;如果为五聚体设置保留时段时,当主峰为1441([M-H]-)和 1555([M+TFA-]-),则表明馏分4的主要成分是矢车菊苷配质低聚体;和 图6表示矢车菊苷配质低聚体与从牙龈韧带细胞上通过信号识别蛋白体受 体分泌的胶原酶IV型MMP上的强力霉素的抑制效果的比较,表明矢车菊苷配 质低聚体的抑制效果约是强力霉素的10倍。
在图6,数字1是矢车菊苷配质低 聚体的抑制效果,数字2是强力霉素的抑制效果。
发明内容 在以下的详细说明中,通过对发明人在实施发明中预期的最佳模式来解释 阐明本发明的最佳实施例。
本发明可以在各种明显情况下作多种变化,只要不 脱离本发明。
因而,本说明书被认为是解释而不是限制本发明。
为达到以上所述的目的,本发明提供了一种抑制细胞基质金属蛋白酶(MMP) 活性的矢车菊苷配质低聚体。
本发明还提供了一种用于预防和/或治疗由细胞基质金属蛋白酶(MMP)活性 引起的疾病的药物组合物,包括以矢车菊苷配质低聚体作为活性组分的药物组 合物。
现在更详细地解释本发明。
本发明人已研究了美国专利6045800公开的榆树皮质中的活性成分,该成 分被传统地认为使用在伤口,癌症转移,牙科疾病,类风湿性关节炎,炎症, 类风湿性关节炎,炎症,角膜溃疡,骨质疏松症,胃溃疡,外伤,皮肤皱纹, 痤疮和烧伤等上是有效的,是为了发现在人体内更安全更具有活性的MMP活 性抑制剂。
本发明人确定了矢车菊苷配质低聚体(3-12个基本单体黄烷-3-醇多聚 连接而成)是榆树皮质中的主要活性成分,其对MMP的抑制效力高于传统的强 力霉素或表没食子儿茶精没食子酸盐,并完成了本发明。
矢车菊苷配质低聚体宜用作MMP活性抑制剂。
MMP选自溶胶原蛋白酶, MMP-1,MMP-8,和MMP-2和MMP-9的胶原酶IV。
矢车菊苷配质低聚体宜制成片剂,胶囊,粉末,软膏,溶液,凝胶,糊剂, 补片或粒剂等,制备物中矢车菊苷配质低聚体的含量宜为0.0001-5wt%。
矢车菊苷配质低聚体是从正丁醇部分分离得到的,而初级提取物是从榆树 属植物的榆树皮质中,用极性溶剂经n-己烷、二氯甲烷、乙基乙酸和正丁醇溶 剂分馏后提取的。
正丁醇部分进行葡聚糖凝胶LH-20柱层析,分离该部分浓缩 得到矢车菊苷配质低聚体。
例如,正丁醇部分经水-甲醇混合液(甲醇浓度由 80%-100%递增)进行逐级洗脱,或用其他办法,用100%甲醇连续洗脱成不同部 分,以薄层层析为基础,结合浓缩得到矢车菊苷配质低聚体。
矢车菊苷配质低聚体是一种三聚体至十二聚体的混合物,其中有3至12个 黄烷-3-醇单体连接构成,其分子量为1518,平均聚合度为5.3,它可以从许多 与榆树皮质成分相同的葡萄子(grapestone)、大黄、多边多花根(polygoni multiflori radix)、樟树、肉桂树皮、中国香柏、茶属籽、高粱、荞麦、橡胶树等植物中提 取。
它也可以从榆树皮质中提取。
结合以下的实验、实施例、对照实施例,对本发明进行更详尽的解释。
然 而,这些只是阐明而不是限制本发明。
实施例 实施例1:分离活性成分矢车菊苷配质低聚体并确定其结构 从榆树皮质提取物中分离出矢车菊苷配质低聚体,并确定其结构。
然而, 矢车菊苷配质也能从例如葡萄子、大黄、多边多花根、樟树、桂皮、中国柏、 茶树种子、高粱、荞麦、橡树等植物中提取和纯化,因为,通常认为它们大量 存在于植物中。
实施例1-1:粗提取制备物和胶原酶活性抑制 初级提取物是通过将榆树皮质压碎成10-200目(mesh)的粉末,在压碎 的植物粉末中加入提取溶剂,室温下冷浸混合物72小时,过滤生成物,再浓缩 过滤提取物得到的。
提取溶剂适宜从包括纯化水、甲醇、乙醇、丙醇、丁醇、 甘油、乙烯乙二醇、丙烯乙二醇、1,3-丁烯乙二醇、乙烷基醋酸、丙酮及其混 合物中选择。
将初级提取物悬浮于水,再利用正己烷、二氯甲烷、乙酸乙酯和正丁醇进 行依次的溶剂分馏来得到馏分。
溶剂分馏后残存的过滤物作为是水馏分。
MMP 的一种胶原酶的活性抑制是用得到的五种馏分进行检测。
因此,正己烷或二氯甲烷部分没有显示出酶活性抑制效果,而乙酸乙酯和 正丁醇部分显示出活性抑制效果。
进行以下实验是为了阐明显示出酶活性抑制效果的正己烷或二氯甲烷部分 的活性成分。
在得到的乙酸乙酯馏分上用硅凝胶柱层析法。
硅氯仿,硅乙酸乙酯,硅丙酮和硅甲醇部分是通过用氯仿、乙酸乙酯、丙 酮、甲醇洗脱液依次洗脱来分别得到的。
尽管作为测试胶原酶这些馏分抑制效 果的结果,抑制效果显示在硅乙酸乙酯馏分,但是它们并不优于榆树皮质初级 提取物和强力霉素(见下面的实施例2)。
硅乙酸乙酯馏分是利用HPLC/ESL质谱仪,Finnigan LCQ和薄层层析来获 得图1的结果,其显示出具有低分子量的矢车菊苷配质单聚体、两种矢车菊苷 配质二聚体和未确定的物质存在。
就象硅乙酸乙酯部分的结果一样,对每个成分胶原酶活性抑制测试的结果 与通常作为药物的那些强力霉素和榆树皮质初级提取物相比较,没有显示出更 好的效果。
另一方面,利用溶剂分馏初级提取物得到的正丁醇馏分进行葡萄糖凝胶 LH-20柱层析。
初级提取物依次用100wt%甲醇洗脱,通过层析法分馏和重新组 合来指定它们为馏分1,2,3和4。
以20wt%甲醇、50wt%甲醇、80wt%甲醇和100wt%甲醇作为洗脱液,用不同 的方法,来洗脱初级提取物后,分别得到20%甲醇馏分、50%甲醇馏分、80%甲 醇馏分和100%甲醇馏分。
对获得的馏分1,2,3,4以及甲醇馏分进行胶原酶活性的抑制测试,馏 分1,2和3以及20wt%甲醇馏分和50wt%甲醇馏分没有显示任何效果,而馏分 4,80wt%甲醇馏分和100wt%甲醇馏分则显示出了效果。
尤其是,馏分4和100wt% 的甲醇馏分显示出了极好的效果,显示出比通常的强力霉素和表没食子儿茶精 没食子酸盐药物更高的酶抑制活性。
当加入10%FeCl3溶液时,观察到所得馏分4和100wt%甲醇馏分的颜色变 为海军蓝,可证实矢车菊苷配质的存在。
在下文中,也指矢车菊苷配质低聚体。
实施例1-2(分析馏分4的结构:(MALDI-TOF)质谱仪) 将钠加入到[M+sodium]+中,用PF生物航行系统4095(PF Biosystems Voyager System 4095,Perkin Elmer),并用氰基-4-羟基苯乙烯酸(cyano-4- hydroxycinnamic acid)作为基质来检测矢车菊苷配质低聚体的分子量。
从如图2所示的显示出质量从288增长到889(m/z)离子峰值的馏分4的 MALDI-TOF质谱分析结果中,可以估计馏分4是儿茶精或表儿茶精单体通过单 键连接成的矢车菊苷配质低聚体。
889m/z的离子峰值与三聚体相对应,该三聚 体中加入钠原子量23至分子量866。
如果以同样的方法计算其余峰值,可以看 出峰值与3-12个矢车菊苷配质单体聚合成的各种矢车菊苷配质低聚体相对应。
事实上,未检测到预料中的二聚体峰值(601m/z峰值),而馏分中的三至十二 聚体则具有极好的效果。
这些结果与在可可和巧克力中含有的矢车菊苷配质的分配非常相似 (J.Agric.Food Chem.,1999,47,490-496,U.S.Patent No.5,877,206)。
这个质 谱分析方法被应用于计算分子分配度和聚合度,因为它既不会产生矢车菊苷配 质低聚体分子的馏分,也不会产生多重电荷(Phytochemistry 2000;54;173- 181,and Rapid Comm.Mass Spectrometry 1997;11;31-36)。
通过分析馏分4的 峰高比率和分子量,如下面的表1所示。
从表1可以看出平均分子量是1,518, 平均聚合度是5.3。
[表1] 聚合体
  (分子量+Na+)
分子量
峰高比率
三聚体
889
 866
 16.5
四聚体
1177
 1154
 28.3
五聚体
1465
 1442
 22.6
六聚体
1754
 1730
 12.3
七聚体
2042
 2018
 8.8
八聚体
2331
 2306
 6.2
九聚体
2619
 2594
 2.1
十聚体
2908
 2882
 1.6
十一聚体
3193
 3170
 0.8
十二聚体
3481
 3458
 0.8
实施例1-3(馏分4结构的分析:HPLC/ESI质谱仪,Finnigan LCQ) 为获得补充MALDI-TOF质谱分析结果的结构信息,用HPLC/ESI质谱分析来 检测未完全电离合成物的分子量,如矢车菊苷配质低聚体(Phytochemistry 1997;44;351-357,J.Agric.Food Chem.,1999,47,3693-3710),并产生大量电 荷。
用HP1100系列HPLC(Hewlett-Palo Alto,U.S.A)来层析仪。
硅(ZoRBOX Sil,4.6×250mm,5um)被用做层析柱,溶剂条件设置为:溶剂1 (CH2Cl2∶CH3OH∶H2O∶CH3COOH=82∶14∶2∶2)与溶剂2(CH3OH∶H2O∶CH3COOH=96∶2∶2) 的比率从开始时的100∶0至50分钟时的12∶88,流率是1m/min。
矢车菊苷配 质低聚体的280毫微米的吸收值用DAD探测器测出。
利用与DAD探测器结合的 质谱分光计获得的结果与利用MALDI-TOF质谱分光计得到的结果进行比较。
在 一个选择质谱跟踪模式中,[M-H]-是从矢车菊苷配质低聚体的分子量中去掉 氢,[M+TFA-]-是在矢车菊苷配质低聚体的分子量中加入三氟醋酸(TFA),[M- H+TFA-]-2和[M+2TFA-]-2的质峰的电荷数是2。
例如,如图3所示,五聚体通过 指定的[M-H]-质量1441和[M+TFA-]-质量1555来追踪,三聚体至六聚体以同样 方法通过指定它们的质量来追踪。
因为七聚体至十二聚体有2个而不是1个电 荷数(J.Agric.Food Chem.,1999,47,490-496),相关的质量,例如七聚体中 [M-H+TFA-]-2的1065峰值和[M+2TFA-]-2的1122峰值被追踪。
八至十二聚体以同 样方法被追踪。
如图4所示,三聚体至十二聚体的矢车菊苷配质低聚体的期望峰值在活性 馏分4中被检测出,可以看出当聚合度从3开始起增加时,具有预期质量的离 子的分配从馏分4的层析初始部位移动到后部。
下面的表2显示出利用电子喷射电离质谱分光计检测出的馏分4中的预期 矢车菊苷配质离子质量和离子类型,空白部分表示它们没有被检测到。
[表2] 聚合体
[M-H]-
[M+TFA-]-
[M-H+TFA-]-2
[M+2TFA-]-2
分子量
三聚体
865
 979
 866
四聚体
1153
 1267
 1154
五聚体
1441
 1555
 834
 1442
六聚体
1729
 1843
 921
 978
 1730
七聚体
1065
 1122
 2018
八聚体
1209
 1266
 2306
九聚体
1353
 1410
 2594
十聚体
1497
 1554
 2882
十一聚体
1641
 1698
 3170
十二聚体
1785
 1842
 3458
图5显示出利用HPLC/ESI质谱仪在扫描模式下,保持时间区域内对层析 图检测出接近质量峰值的结果。
显示出馏分4的主要成分是矢车菊苷配质低聚 体,因为如果对四聚体设置时间区域,主要质量峰值是1153([M-H]-)和1267 ([M+TFA-]-),如果对五聚体设置时间区域,主要质量峰值是1141([M-H]-)和 1555([M+TFA-]-),因此,可以看出馏分4的主要成分是矢车菊苷配质低聚体。
参考基质辅助激光解吸附/离子化飞行时间(MALDI-TOF)质谱分析仪和高 性能液体色谱/电子喷射电离质谱分光计(HPLC/ESI)的结果,馏分4的组分有 极好MMP抑制效果,是通过单键连接的3至12的黄烷-3-醇单体构成的矢车菊 苷配质低聚体混合物,其分子量为1,518,平均聚合度为5.3。
实施例1-4(分析构成矢车菊苷配质低聚体的单体) 用间苯三酚酸解(phloroglucinol acidolysis)来分析馏分中构成矢车菊 苷配质低聚体的单体(J.Chromatogr.,1992;594,117-123)。
当聚合体和间苯三 酚在酸性条件下反应时,间苯三酚酸解是一个用间苯三酚分离聚合体中单体间 的联结来引发一个副反应的反应,并产生单体间苯三酚化合物作为反应产物。
利用HPLC对间苯三酚和馏分4在酸性环境下反应后的产物进行分离和比较,结 果表明表儿茶精的间苯三酚派生物、儿茶精没食子酸盐、表儿茶精没食子酸盐、 没食子儿茶精没食子酸盐,表儿茶精没食子酸盐没有被检测出焦儿茶酸间苯三 酚的估计峰值。
用ESI质谱仪分析纯化的儿茶精-间苯三酚来确定期望的分子 量414。
碳和氢原子核磁共振方法(13C、1HNMR)被用来从表儿茶精中区分出儿茶 精。
依据化学变化,儿茶精和表儿茶精间的2号碳元素的化学反应不同,即与 结合在杂环4号碳元素的间苯三酚的阵列(J.Chem.Soc.Perkin,Trans.,l 1980;2278-2286,J.Chem.Soc.Perkin,Trans.,l 1983;1535-1543,and J.C.S. Perkin l 1982,1217-1221),可以看出间苯三酚派生物的2号碳元素的化学变 化是与儿茶精-4-间苯三酚对应的83.4ppm。
因此,可以看出本发明的矢车菊苷配质低聚体的第一单体是儿茶精。
参考MALDI-TOF和HPLC/ESI质谱分光计和NMR质谱分光计的效果,馏分4 有极好MMP抑制效果的成分是3至12个黄烷-3-醇单体通过单键连接的矢车菊 苷配质低聚体,具平均分子量1,518,平均聚合度5.3,与低效的硅乙酸乙酯 不同。
实施例2 (利用Azocoll的红色胶原质基质,对矢车菊苷配质低聚体对MMP活性抑 制效果的估计(Anal.Biochem.,1984,136;446-450))。
矢车菊苷配质低聚体对溶胶的蛋白酶(得自堪察加半岛螃蟹,买自Sigma公 司)、MMP-1(纤维原细胞胶原酶)、MMP-8(分叶核的白细胞胶原酶)的抑制效 果可以用下面的方法计算。
100μl2%红色胶原质基质Azocoll的溶液被加入到每一个1.5ml微管中。
一个微管作为空白对照。
将Sigma溶胶原酶标准溶液分别加入三个微管中,使 微管含有10、100、200ppm的溶液,来绘制酶标准活性曲线。
每个100μl溶胶 原酶标准溶液被加入其他微管中,加入榆树皮质初级提取物、硅乙酸乙酯馏分、 矢车菊苷配质低聚体馏分,四环素、二甲胺四环素和强力霉素,和表没食子儿 茶精没食子酸盐使其浓度分别为0.0001,0.001,0.005和0.01%(重量百分比)。
一种缓冲溶液(0.05M Tris-HCL,1nMCaCl2,PH7.8)被加入到每个试管 中以使总反应溶液达到500μl,它们在37℃的温度下在培养器中反应18小时。
接下来,微管在10,000g下离心5分钟以沉淀分解的胶原质。
然后,提取包含 未分解的胶原质的上清液,其中在540nm测量吸收度以绘制标准活性曲线,酶 活性从标准曲线中折算出来,来比较和估计测试组和对照组的酶活性。
用上述 同样的方法检测试MMP-1和MMP-8的抑制效果。
每种酶标准溶液都买自 Calbiochem。
检测数据如下。
各种试剂作用于溶胶原活性的抑制结果如表2所示,其中,酶抑制率利用 下面的公式1计算: 公式1 酶抑制率(%)=100-(检测组酶活性×100÷对照组酶活性) 表2 测试组(酶抑制率%)
0.0001%
0.001%
0.005%
0.01%
四环素
二甲胺四环素
强力霉素
表没食子儿茶精没食子酸盐
矢车菊苷配质低聚体馏分
硅乙酸乙酯馏分
榆树皮质初级提取物
 0
 0
 0
 0
 20
 0
 0
 0
 0
 0
 29
 63
 0
 10
 0
 24
 64
 60
 86
 49
 68
 32
 43
 66
 80
 100
 45
 68
而且,矢车菊苷配质低聚体馏分对MMP-1(纤维原细胞胶原酶)活性的抑 制效果的计算结果如表3所示,其中酶抑制率用公式1计算。
表3 测量组份
  (酶抑制率%)
0.0001%

0.001%

0.005%

0.01%

四环素
二甲胺四环素
强力霉素

表没食子儿茶精没食子
酸盐

矢车菊苷配质低聚体馏分
二氧化硅乙酸乙酯
馏分
榆属皮质原生提取物
 0
 0
 0
 10


 25

 0

 0
 0
 0
 0
 10


 68

 0

 0
 0
 25
 47
 69


 86

 37

 50
 24
 55
 83
 90


 100

 70

 90
此外,矢车菊苷配质低聚体馏分对MMP-8(分叶核的白细胞胶原酶)活性 的抑制作用的测量结果如下表4,其中,酶抑制率按公式1计算。
表4 测量组份
  (酶抑制率%)
0.0001%

0.001%

0.005%

0.01%

四环素
二甲胺四环素
强力霉素
表没食子儿茶精没食子
酸盐
矢车菊苷配质低聚体馏

二氧化硅乙酸乙酯馏分
榆属皮质原生提取物
 0
 0
 0
 22
 45

 0

 0
 0
 0
 0
 49
 80

 0

 30
 10
 23
 32
 80
 89

 37

 69
 70
 50
 81
 100
 100

 70

 95
基于上述所有结果,矢车菊苷配质低聚体馏分对溶胶原酶、MMP-1和 MMP-8显示出比对表没食子儿茶精没食子酸盐、绿茶成分和我们已经了解的强 力霉素要高的抑制作用,同时还显示出比榆属皮质原生提取物和二氧化硅乙酸 乙酯馏分高的抑制作用。
因此,可以判断,矢车菊苷配质低聚体馏分是榆属皮 质的MMP酶抑制作用的主要的活性成分。
实验3 (用胶原体试剂(CLN-100,日本Cosmobio),检测矢车菊苷配质低聚体馏分 对MMP活性的抑制作用) 本测试方法基于的事实是,当与荧光物质fluorosceiniso硫代氰酸盐(FITC) 共轭的胶原质I型用作胶原酶时,仅有已分解的胶原质在35℃下变性和被乙醇 萃取。
本实验中,反应物溶液被离心机分离,上清液的荧光强度(FI)在520nm (EM)/495(EX)下用荧光光谱测量仪测量,(《炎症》,1994,18;613-623)。
200μl,0.05%的FITC胶原质分别加入到1.5ml微管中。
一个微管作空白对照, 购自Calbiochem的MMP-1标准酶溶液分别加入到三个微管中,为了画出酶的标 准活性曲线,相应地,溶液浓度分别为10、100、200ppm。
100μl酶标准溶液相 应的被加入到其他试管中,并且,分别加入矢车菊苷配质低聚体馏分、二氧化 硅乙酸乙酯馏分、四环素、二甲胺四环素和强力霉素,相应地,溶度为0.001、 0.01、0.03、和0.05%(重量比)。
每个试管分别加入缓冲溶液(0.05M三氨基 甲烷盐酸缓冲液(tris-HCI),1Mm CaCL2,PH7.8)使每一反应物溶液总量为 500μl,37℃下,在恒温箱中反应18小时。
加入10μl溶解在50%(重量比)的 乙醇的80mM的邻二氮杂菲作为反应终止溶液,继续在37℃下,在恒温箱中反 应18小时,并冷却。
在冷却的微管中分别加入0.5μl,70%(重量比)的乙醇, 再以3000rpm的速度离心分离10分钟。
离心分离后,从每个试管中提取500μl 的上清液,在520nm(EM)/495(EX)下,用荧光光谱测量仪进行荧光强度 (FI)的测量,然后作出对应酶活性的标准曲线。
将酶活性浓度从标准曲线转 换成测量组份和对照组份的对比酶活性。
对MMP-8的活性抑制测试采用与上面 同样的方法。
测试结果如下。
矢车菊苷配质低聚体馏分对MMP-1活性的抑制作用的测量结果列在表5 中,其中,酶抑制率按公式1计算。
表5 测量组份
  (酶抑制率%)
  0.001%

 0.01%

 0.03%

 0.05%

四环素
二甲胺四环素

强力霉素
矢车菊苷配质低聚

体馏分
二氧化硅乙酸乙酯
馏分
0
0
0


45

0

 23
 36
 69


 89

 38

 44
 55
 68


 100

 35

 65
 79
 95


 100

 59

此外,矢车菊苷配质低聚体馏分对MMP-8活性的抑制作用的测量列在下 表6中,其中,酶抑制率是按公式1计算的。
表6 测量组份
  (酶抑制作用,%)
 0.001%

 0.01%

 0.03%

 0.05%

四环素
二甲胺四环素

强力霉素
矢车菊苷配质低聚体

部分
二氧化硅乙酸乙酯
部分
 0
 0
 0


 63

 0

 20
 40
 65


 92

 56

 55
 68
 64


 95

 50

 64
 85
 90


 100

 63

基于上面的测量结果,矢车菊苷配质低聚体馏分也表明,对MMP-8活性的 抑制作用高于四环素,也表现出对两种酶,即浓度为0.03重量%的MMP-1和 MMP-8,几乎是100%的抑制作用。
可以看出,由黄烷-3-醇或酚单体,二种二 聚体,某些三聚体和不确定物质组成的二氧化硅乙酸乙酯馏分的抑制作用显然 小于本发明中的那些矢车菊苷配质低聚体。
除四环素外,强力霉素表现出最高 的抑制作用,浓度为0.05%的MMP-1和MMP-8都表现为90%的抑制作用,四 环素和二甲胺四环素表现出较低的酶活性抑制作用。
实验4 (使用信号识别蛋白体的受体测量矢车菊苷配质低聚体馏分对胶原酶IV型 (MMP-2和MMP-9)的抑制作用) 购自Calbiochem的MMP-2和MMP-9酶标准溶液混合有缓冲溶液(2.5% SDS (十二烷基硫酸钠盐)50mM三氨基甲烷盐酸缓冲液(tris-HCI),PH6.8,10% 丙三醇,0.005%溴酚蓝,3%蔗糖),然后,在含有2%的凝胶物质胶原酶IV型(8% SDS-聚丙烯酰胺凝胶)的凝胶极板上电泳。
电泳完成后,用50mM含有2.5%三 氯乙腈X-100的三氨基甲烷盐酸缓冲液(tris-HCI)(PH7.5)洗涤凝胶两次30 分钟,去掉SDS。
将凝胶纵向切成数片,放入反应缓冲液中,在37℃下反应18 小时,其中缓冲液中包含酶标准溶液和各种浓度为0.0001、0.001、0.005和0.01% 的矢车菊苷配质低聚体馏分、四环素、二甲胺四环素、和强力霉素。
然后,用0.1%的考马斯亮蓝对凝胶染色并漂白,以便用比重计测量凝胶的 分解性能从而画出标准活性曲线。
然后,将测量组份和对照组份的酶活性与从 标准曲线计算值进行比较。
对胶原酶IV型,即MMP-9的活性抑制测试采用与 上面描述相同的测量方法,结果如下。
矢车菊苷配质低聚体馏分对MMP-2活性的抑制作用的测量结果如下表7, 其中,酶抑制率按等式1计算。
表7 测量组份
  (酶抑制作用,%)
 0.001%

 0.01%

 0.03%

 0.05%

四环素
二甲胺四环素

强力霉素
矢车菊苷配质低聚体

部分
二氧化硅乙酸乙酯
部分
 0
 0
 0


 21

 0

 0
 0
 12


 59

 0

 19
 26
 45


 87

 30

 45
 46
 82


 100

 36

此外,矢车菊苷配质低聚体馏分对MMP-9活性的抑制作用的测量结果列 在下表8中,其中,酶抑制率按公式1计算。
表8 测量组份
  (酶抑制作用,%)
 0.001%

 0.01%

 0.03%

 0.05%

四环素
二甲胺四环素
强力霉素
矢车菊苷配质低聚体
馏分
二氧化硅乙酸乙酯
馏分
 0
 0
 0
 30

 0

 0
 0
 0
 45

 0

 15
 30
 45
 89

 43

 68
 43
 89
 100

 56

基于上述所有的结果,矢车菊苷配质低聚体馏分显示出对胶原酶IV型MMP- 2和MMP-9的酶活性的抑制作用高于四环素,并且在MMP-2和MMP-9的浓度 为0.01%时具有100%的抑制作用。
除四环素外,强力霉素表现出最高的抑制作 用,而二甲胺四环素和四环素的抑制作用较低。
基于由黄烷-3-醇或酚单体,两 种二聚体,某些三聚体和不确定物质组成的二氧化硅乙酸乙酯馏分的抑制作用 显然低于本发明中的那些矢车菊苷配质低聚体这一事实,可以看到,榆属的初 级提取物滴定主要用于本发明中的矢车菊苷配质低聚体。
     实验5 (牙周韧带细胞分泌的MMP的抑制测试) 用解剖刀刮下选取的牙齿表面上的牙周韧带组织,并在介质中培养。
用的 是从组织往外生长的第六到第八代细胞。
本测试中用将牙周韧带组织的上清液作为实验3中的酶原进行操作。
牙周 韧带分泌的MMP看上去象胶原酶IV型,因为它的分子重量,它的滴定率完全 被EDTA抑制,并且它不被其他蛋白酶抑制剂所抑制的事实,如PMSF(基于 蛋白酶抑制剂的丝氨酸)和抑胃肽。
如图6所示,矢车菊苷配质低聚体的作用高出那些强力霉素10倍。
实验6 (对二氯苯细菌胶原酶的作用) 为了从两种外部病原菌(periopathogenic bacteria)(真菌属gingivalis密螺旋 体denticola)的培养提取物中测试胶原酶活性的抑制作用,标有胶原基质的放 射性物质(3H-胶原胶原4型(N-丙酸盐-2,3-3H-丙酸盐,mCi/ml:荷兰国家 标准生命科学产品,波士顿,马萨诸塞州))与各种浓度的药剂混合并培养18 小时。
未分解的胶原用0.05%的丹宁酸和三氯乙酸沉淀,然后,测量残余在上 清液中的放射性与药剂的抑制作用进行对比。
也可以发现,本发明中的矢车菊苷配质低聚体高于二氧化硅乙酸乙酯馏分 和强力霉素10倍或更多倍。
实验7 (矢车菊苷配质低聚体对酶抑制作用的选择性) 为了知道矢车菊苷配质是否是一种由普通蛋白质缠结成的非特定酶抑制 剂,这里用实验2中的Azocoll矢车菊苷配质的胶原酶的抑制作用和弹性蛋白 酶抑制作用与那些强力霉素进行比较。
将含有刚果红的弹性蛋白(弹性蛋白-刚果红,Sigma)与带有各种药剂浓 度(10Mm TES缓冲,PH7.0)的反应物溶液混合。
将弹性蛋白酶(Sigma E-150) 加入到混合液中培养18小时。
然后,将未分解的弹性蛋白沉淀并且在495nm 下测量其上清液的吸光率。
相关反应抑制作用程度列在下表9中,以%抑制活 性表示,控制酶活性使得仅存在酶而不存在药剂,也就是说分解被充分进行至 100%,即0%的抑制作用。
酶抑制率按公式1计算。
表9 分类(酶抑制率,
%)
对比

0.001%

0.003%

0.007%

0.01%

0.03%

0.07%

0.1%

溶胶
原酶

强力霉素
0
 0
 24
 64
 60
 85
 93
 100
矢车菊苷配
质低聚体
0

 63

 86

 89

 100

 100

 100

 100

弹性
蛋白

强力霉素
0
 10
 40
 100
 100
 100
 100
 100
矢车菊苷配
质低聚体
0

 0

 0

 10

 20

 40

 60

 100

从上面的结果,可以看出,矢车菊苷配质不是一种由普通蛋白缠结成的非 特定酶抑制剂,因为矢车菊苷配质对溶胶原酶的抑制作用高于那些强力霉素, 但其对弹性蛋白酶的抑制作用则低于那些强力霉素。
实施例 在下面的实施例中,对本发明实验1-8中软膏对溶胶原酶活性的作用进行 评测。
本发明中的矢车菊苷配质低聚体馏分能被制备成任何形式用于抑制MMP 的活性,如溶胶原酶。
这里的形式可能包括片剂、胶囊、粉剂、软膏、溶液、 凝胶、浆糊、块体、颗粒等。
但是,本发明中测试的是软膏。
矢车菊苷配质低聚体馏分的含量是0.0001到5%(重量比),尤其是0.01到 1%(重量比)。
当其中的含量少于0.0001%(重量比)时,酶活性抑制作用 或者效率不能得到实现,当含量超过5%(重量比)时,矢车菊苷配质低聚体馏 分的颜色过度地变成棕色,使得很难利用它们。
下面实施例和对比实施例中使用的软膏合成物采用下面的方法制备。
软膏合成物的制备是通过分解由下列物质构成的混合物得到的:矢车菊苷 配质低聚体馏分、聚丙二醇与环氧乙烷的加聚物、低浓度酒精、丙三醇、凝胶、 胶质、羧甲基纤维素、泊洛沙姆(泊洛沙姆407)、甘油一酸酯(myverol 18-19)、 聚丙二醇或聚乙二醇、甲醇和缓冲溶液中的防腐剂和已分解的混合物的胶质。
在对比实施例中,软膏合成物的制备除了用强力霉素替代矢车菊苷配质低聚体 馏分外,其他都相同。
0-20%(重量比)的乙醇、异丙醇或他们的混合物可以用来作低纯度酒精, 5-30%(重量比)的聚丙二醇与环氧乙烷的加聚物F-127或F-108能用作用来增 强软膏稳定性的聚丙二醇与环氧乙烷的加聚物的衍生物。
湿润剂用来获得合成 物的含潮量并防止干燥,他可从由下猎物质构成的足种选择:丙三醇、山梨糖 醇、聚乙二醇、聚丙二醇、泊洛沙姆(Poloxamer 407)、甘油一酸酯(myverol 18-19) 和他们的混合物,用量为5-30%(重量比)。
特别地,聚乙二醇包括有聚乙二醇 200,聚乙二醇400,聚乙二醇600和聚乙二醇1000。
此外,1-20%(重量比)的凝胶或胶质或他们的混合物被用作是将药物的 活性成分释放到皮肤组织的系统。
调节软膏合成物PH值的缓冲剂包括邻-碱金 属磷酸盐、特别是一价磷酸钠盐、二价磷酸钠盐、三价磷酸钠盐,柠檬酸和柠 檬酸钠盐、磷酸、盐酸、氢氧化钠或焦磷酸钠,焦磷酸盐等。
实施例中的软膏 合成物中,是一价磷酸盐,二价磷酸盐,和三价磷酸盐中的两种适当混合,使 用前将混合物的PH值调节在5-8。
另外,偏亚硫酸氢钠盐用来防止矢车菊苷配质低聚体馏分被漂白,并且其 用量为软膏合成物重量的0.05-1%(重量比)。
天然香料、薄荷油和荷兰薄荷油 都用作香料,并且其用量为软膏合成物重量的0.1-1%(重量比)。
此外,为了 防止在制备和使用软膏合成物的过程中发生的微生物污染,使用甲基对羟基苯 甲酸盐、丙基对羟基苯甲酸盐、安息香酸、苯(甲)酸钠、水杨酸、通常可用于 食品和药物中的物质或他们的混合物,其用量为0.01-0.5%(重量比)。
实施例1-8和对照实施例1-8 每个实施例和对照实施例的软膏组成成分如下表10-13所示。
[表10]   分类(wt%)
    组分
  样品1
  样品2
对照样品1
对照样品2
    润湿剂

(Wetting agent)





    甘油

    聚乙二醇
    羧甲基纤维素

    Poloxamer 407
    甘油酸酯
    (Myverol 18-99)
    5

    -
    -

    0.1
    10

    -

    5
    -

    -
    15

    5

    -
    -

    0.1
    10

    -

    5
    -

    -
    15

药物有效释放系统
    (Medicinal
efficacy delivery
    system)
    凝胶
    胶质


    5
    5


    5
    5


    5
    5


    5
    5


  表面活性剂
  (Surfactant)
    多聚醇F-127
    多聚醇F-108
    20
    -
    -
    20
    20
    -
    -
    20
    低醇
  (Lower alcohol)
    乙醇
    异丙醇
    5
    -
    -
    5
    5
    -
    -
    5
    防腐剂

  (Preservative)



  甲烷基对氧苯甲酸酯
    (Methyl
  paraoxybenzoate)
  丙基对氧苯甲酸酯
    (Propyl
  paraoxybenzoate)
   0.1


   0.05


    0.1


    0.05


    0.1


    0.05


    0.1


    0.05


    抗退色剂
(Antidiscoloring
    agent)
    焦亚硫酸钠


   0.1


    0.2


    0.1


    0.2


    缓冲液
(Buffer solution)
    原磷酸钠
    三级磷酸钠
    0.1
    0.05
    0.2
    0.05
    0.1
    0.05
    0.2
    0.05
    药物组合物
    (Medicinal
  composition)
矢车菊苷配质低聚体馏分
    强力霉素

  0.0001
    -

   0.001
     -

    -
    0.0001

    -
    0.001

    香料
    (Flavor)
    0.75

    0.75

    0.75

    0.75

    食用色素
(Edible pigment)
  0.0002

    -

    0.0002

    -

    纯化水
(Purified water)
  平衡

  平衡

    平衡

  平衡

[表11] 分类(wt%)
组分
样品1
样品2
对照样品1
对照样品2
 润湿剂
(Wetting

agent)





甘油
聚乙二醇

羧甲基纤维素

Poloxamer 407

甘油酸酯
(Myverol 18-99)
10
-
0.5
-


10


  -
  5
  0.1
  -


  20


  10
  -
  0.5
  -


10


  -
  5
  0.1
  -


  20


  药物有效释放系
  统(Medicinal
  efficacy
  delivery
  system)
  凝胶
  胶质



  3
  3



  2
  2



  3
  3



  2
  2



  表面活性剂

  (Surfactant)
多聚醇F-127

多聚醇F-108
  15

  -
  -

  15
  15

  -
  -

  15
  低醇
(Lower
alcohol)
乙醇
异丙醇

  5
  -

  -
  5

  5
  -

  -
  5

  防腐剂
(Preservative
 )



甲烷基对氧苯甲酸酯
(Methyl
 paraoxybenzoate)

丙基对氧苯甲酸酯
(Propyl paraoxybenzoate)
 0.1


 0.05


 0.1


 0.05


 0.1


 0.05


 0.1


 0.05


抗退色剂
(Antidiscolorin
g agent)
焦亚硫酸钠


 0.1


 0.2


 0.1


 0.2


缓冲液
(Buffer
 solution)
原磷酸钠
三级磷酸钠

 0.1
 0.05

 0.2
 0.05

 0.1
 0.05

 0.2
 0.05

药物组合物
(Medicinal
composition)
矢车菊苷配质低聚体馏分
强力霉素

 0.005
 -

 0.01
 -

 -
 0.005

 -
 0.01

香料
(Flavor)
 0.75

 0.75

 0.75

 0.75

食用色素
(Edible pigment)
0.0002

 -

 0.0002

 -

纯化水
(Purified water)
平衡

平衡

平衡

平衡

[表12]   分类(wt%)
    组分
  样品1
  样品2
 对照样品1
对照样品2
    润湿剂

    (Wetting
    agent)





    甘油

    聚乙二醇
    羧甲基纤维素

    Poloxamer 407

    甘油酸酯
    (Myverol 18-99)
    15

    -
    -
    0.5

    5


    -

    5
    -
    1

    5


    15

    -
    -
    0.5

    5


    -

    5
    -
    1

    5


药物有效释放系
统(Medicinal
    efficacy
    delivery
    system)
    凝胶
    胶质



    1
    1



    10
    5



    1
    1



    10
    5



  表面活性剂

  (Surfactant)
    多聚醇F-127

    多聚醇F-108
    10

    -
    -

    10
    10

    -
    -

    10
    低醇
    (Lower
    alcohol)
    乙醇
    异丙醇

    5
    -

    -
    5

    5
    -

    -
    5

    防腐剂
  (Preservative




  甲烷基对氧苯甲酸酯
    (Methyl
    paraoxybenzoate)

    丙基对氧苯甲酸酯
(Propyl paraoxybenzoate)
    0.1


    0.05


    0.1


    0.05


    0.1


    0.05


    0.1


    0.05


    抗退色剂
(Antidiscolorin
    g agent)
    焦亚硫酸钠


    0.1


    0.2


    0.1


    0.2


    缓冲液
    (Buffer
    solution)
    原磷酸钠
    三级磷酸钠

    0.1
    0.05

    0.2
    0.05

    0.1
    0.05

    0.2
    0.05

  药物组合物

  (Medicinal
 composition)
矢车菊苷配质低聚体馏分

    强力霉素

    0.05

    -

    0.1

    -

    -

    0.05

    -

    0.1

    香料
    (Flavor)
    0.75

    0.75

    0.75

    0.75

    食用色素
(Edible pigment)
   0.0002

     -

    0.0002

    -

    纯化水
(Purified water)
  平衡

  平衡

    平衡

    平衡

[表13]   分类(wt%)
    组分
  样品1
  样品2
对照样品1
对照样品2
    润湿剂
    (Wetting
    agent)




    甘油
    聚乙二醇
    羧甲基纤维素
    Poloxamer 407

    甘油酸酯
    (Myverol 18-99)
    20
    -
    -
    -
    10


    -
    5
    -
    -
    20


    20
    -
    -
    -
    10


    -
    5
    -
    -
    20


药物有效释放系
统(Medicinal
    efficacy
    delivery
    system)
    凝胶
    胶质



    5
    5



    20
    2



    5
    5



    20
    5



  表面活性剂
  (Sufactant)
    多聚醇F-127
    多聚醇F-108
    5
    -
    -
    5
    5
    -
    -
    5
    低醇

    (Lower
    alcohol)
    乙醇

    异丙醇

    10

    -

    -

    10

    10

    -

    -

    10

    防腐剂
  (Preservative
   )


  甲烷基对氧苯甲酸酯
    (Methyl
  paraoxybenzoate)
  丙基对氧苯甲酸酯
(Propyl paraoxybenzoate)
    0.1


    0.05

    0.1


    0.05

    0.1


    0.05

    0.1


    0.05

    抗退色剂
(Antidiscolorin
    g agent)
    焦亚硫酸钠


    0.1


    0.2


    0.1


    0.2


    缓冲液
    (Buffer
    solution)
    原磷酸钠
    三级磷酸钠

    0.1
    0.05

    0.2
    0.05

    0.1
    0.05

    0.2
    0.05

  药物组合物

  (Medicinal
  composition)
  矢车菊苷配质低聚体馏分

    强力霉素

    1

    -

    5

    -

    -

    1

    -

    5

    香料
    (Flavor)
    0.75

    0.75

    0.75

    0.75

    食用色素
(Edible pigment)
   0.0002

    -

   0.0002

    -

    纯化水
(Purified water)
    平衡

    平衡

    平衡

    平衡

每个软膏对溶胶原蛋白酶起抑制作用的检测步骤和结果,如下所示。
100μl的2% Azocoll溶液作为红的胶原蛋白基质分别加入到20个1.5ml微 量离心管(Eppendorf tube)。
以一个微管作为空白对照,溶胶原酶蛋白酶标准溶 液(Sigma)分别加入三管,使其每管浓度分别至10ppm,100ppm,200ppm,以 便画出酶的标准活性曲线。
每个检测组中,实施例1-8的软膏和对照实施例1-8 的对照软膏,用蒸馏水以1∶2混合并摇匀,经离心得到上清液10μl,离心条件 为5000g,10min,然后将100μl酶标准溶液分别加入到剩余的16个微管。
将 缓冲液(0.05M Tris-HCL,1mMCaCL2,pH7.8)加入每管,使每管的反应溶液总 量为500μl,在37℃恒温箱中反应18小时,然后将微管离心(10,000g,5min) 使未分解的胶原沉淀下来。
提取含有分解的胶原的上清液,在540nm处测吸收 值,绘制标准活性曲线,比较测试组和对照组,根据标准曲线折算酶活性浓度 来估算酶活性。
根据公式1计算的酶抑制率得到下列结果。
[表14] 分类
酶抑制率(%)
样品1
 0
样品2
 0
样品3
 48
样品4
 80
样品5
 100
样品6
 100
样品7
 100
样品8
 100
对照组样品1
 0
对照组样品2
 0
对照组样品3
 5
对照组样品4
 43
对照组样品5
 80
对照组样品6
 100
对照组样品7
 100
对照组样品8
 100
如上述的测试结果,表明了如本发明所示,在矢车菊苷配质浓度为0.05%或 更低时,含有样品的矢车菊苷配质低聚体部分的组合物与含有强力霉素的对照 组样品比较,对溶胶原蛋白酶活性有较高抑制活性。
因而是,含有以本发明的矢车菊苷配质低聚体作为活性成分的药物能用于 预防和治疗与MMP活性有关疾病,如癌症转移,类风湿性关节炎,糖尿病, 炎症,角膜溃疡,表皮溃疡,胃溃疡,皮肤皱纹和老化,牙周炎,骨质疏松症, 痤疮,受伤和烧伤,和甲状腺机能亢进。
本发明可以参考上述的优选实施例进行更详细的解释,本领域的技术人员 在不脱离本发明权利要求的精神和范围的情况下,可以进行各种修改和补充。
展开

查看更多专利详情信息请先登录或注册会员

相关专利类别推荐

获取手机验证码,即可注册成为会员

专利详情咨询

咨询内容

姓名

手机

验证码

用户登录

手机号

手机验证码

提示

不能再减了!!!

提交成功

八月瓜客服中心已经收到您的信息,正在为您派遣知识产权顾问。知识产权顾问会携带贴心的服务以闪电搬的速度与您联系。

扫一扫关注八月瓜微信 创业一手掌握