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Reg-结合蛋白

基本信息

  • 申请号 CN00810465.4 
  • 公开号 CN1361822A 
  • 申请日 2000/06/09 
  • 公开日 2002/07/31 
  • 申请人 冈本宏  
  • 优先权日期  
  • 发明人 冈本宏  
  • 主分类号  
  • 申请人地址 日本宫城县 
  • 分类号  
  • 专利代理机构 北京市柳沈律师事务所 
  • 当前专利状态 发明专利申请公布 
  • 代理人 巫肖南 
  • 有效性 发明公开 
  • 法律状态
  •  

摘要

本发明从大鼠胰岛-衍生的cDNA中成功克隆出与Reg蛋白结合的蛋白质。
经证实,COS细胞表面表达的这种蛋白质特异性地与Reg蛋白结合。
当在RINm5Fβ细胞中表达Reg-结合蛋白时,DNA合成和细胞增殖受到刺激,受刺激的程度依赖于培养基中所加入Reg蛋白的剂量,在较高浓度时,会诱导细胞凋亡。
据认为该蛋白质作为细胞(如β细胞)表面表达的Reg受体起作用,并能调节这些细胞的增殖。
该蛋白质及其基因可用于开发新的糖尿病治疗剂。
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权利要求书


1.根据(a)至(i)中任一项的DNA, (a)编码含有SEQ ID NO:2之氨基酸序列的蛋白质的DNA, (b)含有SEQ ID NO:1之核苷酸序列的编码区的DNA, (c)编码含有将SEQ ID NO:2的氨基酸序列取代,缺失,插入和/或添加 一个或多个氨基酸后所得氨基酸序列的蛋白质的DNA,其中所述DNA编码 具有与Reg蛋白结合之活性的蛋白质, (d)与含有SEQ ID NO:1之核苷酸序列的DNA杂交的DNA,其中所述 DNA编码具有与Reg蛋白结合之活性的蛋白质, (e)编码含有SEQ ID NO:4之氨基酸序列的蛋白质的DNA, (f)含有SEQ ID NO:3之核苷酸序列的编码区的DNA, (g)编码含有将SEQ ID NO:4的氨基酸序列取代,缺失,插入和/或添加 一个或多个氨基酸后所得氨基酸序列的蛋白质的DNA,其中所述DNA编码 具有与Reg蛋白结合之活性的蛋白质, (h)与含有SEQ ID NO:3之核苷酸序列的DNA杂交的DNA,其中所述 DNA编码具有与Reg蛋白结合之活性的蛋白质, (i)编码含有SEQ ID NO:2或SEQ ID NO:4之氨基酸序列的蛋白质的部分 肽的DNA。

2.由根据权利要求1的DNA编码的蛋白质或肽。

3.插入了根据权利要求1的DNA的载体。

4.携有根据权利要求3的载体的宿主细胞。

5.生产根据权利要求2的蛋白质或肽的方法,其中所述方法包括下列步 骤: (a)培养根据权利要求4的细胞,和 (b)从经培养的细胞或培养物上清液中回收细胞所表达的重组蛋白质。

6.抗根据权利要求2的蛋白质或肽的抗体。

7.含有至少15个核苷酸的多核苷酸,其中所述多核苷酸与选自SEQ ID NO:1,SEQ ID NO:3的DNA或与其互补DNA的DNA杂交。

8.筛选能与根据权利要求2的蛋白质或肽结合的化合物的方法,其中所 述方法包括下列步骤: (a)使蛋白质或肽与受试样品接触, (b)检测受试样品与所述蛋白质或肽的结合,和 (c)选择与所述蛋白质或肽结合的化合物。

9.筛选能抑制Reg蛋白与根据权利要求2的蛋白质或肽结合的化合物的 方法,其中所述方法包括下列步骤: (a)在受试样品的存在下,使Reg蛋白与根据权利要求2的蛋白质或肽接 触, (b)检测Reg蛋白与根据权利要求2的蛋白质或肽的结合,和 (c)选择能减弱该结合的化合物。

10.通过根据权利要求9的方法分离的化合物,其中所述化合物抑制Reg 蛋白与根据权利要求2的蛋白质或肽的结合。

11.筛选能对权利要求2的蛋白质的激活所致信号转导进行促进或抑制 的化合物的方法,其中所述方法包括下列步骤: (a)在受试样品的存在下,使Reg蛋白与在细胞表面表达根据权利要求2 的蛋白质的细胞接触, (b)检测细胞在应答Reg蛋白的刺激中的改变, (c)选择与缺乏受试样品时所作的检测相比,能增强或抑制所述细胞改变 的化合物。

12.根据权利要求11的方法,其中所述细胞改变包括细胞-增殖活性或 细胞的DNA-合成活性的改变。

13.通过根据权利要求11或12的方法分离的化合物,其中所述化合物 能促进或抑制由激活根据权利要求2的蛋白质所致的信号转导。

14.一种药剂,其含有根据权利要求1的DNA,根据权利要求2的蛋 白质或肽,根据权利要求3的载体,根据权利要求6的抗体,或根据权利要 求10或权利要求13的化合物。

15.根据权利要求14的药剂,其中所述药剂选自Reg-结合剂,Reg蛋 白应答细胞的胞内信号转导的调节剂,细胞增殖调节剂,DNA合成调节剂 和细胞凋亡调节剂。

16.根据权利要求14或权利要求15的药剂,其中所述药剂是抗-糖尿病 药物。
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说明书

                       技术领域 本发明涉及一种与Reg蛋白结合的新蛋白质,其基因,以及该蛋白质和 基因的生产和用途。
                       背景技术 胰岛β细胞能产生活体中唯一的血液降血糖因子—胰岛素。
迄今为止, 人们一直认为一旦胰β细胞的数目因一些损害而减少,这些细胞不能容易地 再生和增殖。
据认为这是引起糖尿病发作的重要因素,也是无法基于病因根 治糖尿病的原因所在。
通常,通过施用胰岛素或口服磺酰脲型抗-糖尿病药物来治疗糖尿病。
然 而,施用胰岛素仅为症状疗法,仍难以维持血液胰岛素的生理浓度。
此外, 当考虑到治疗糖尿病并发症,如动脉硬化,神经病和进行性视网膜病时,该 疗法具有其局限性。
另外,长期使用口服抗-糖尿病药物可导致副作用,如冠 状动脉硬化,或者,据认为胰腺负担过重会导致其分泌胰岛素的能力降低。
本发明人以前曾阐明胰β-细胞损害的机理及其预防(H.Yamamoto等,自 然294,284(1981);Y. Uchigata等,生物化学杂志,257,6084(1982);Y. Uchigata等,糖尿病32,316(1983);H. Okamoto,生物测定法2,15(1985);H. Okamoto,分子医学杂志,77,74(1999))。
此外,本发明人已成功再生和培养出 胰β-细胞(T.Watanabe等,Proc.Natl.Acad.Sci.USA 91,3589(1994);Yonemura, Y等,(1984)糖尿病33,401-404),并分离出再生期间特异性表达的基因,即 Reg(再生基因)(H.Okamoto,分子医学杂志,77,74(1999);K.Terazono等,生 物化学杂志,263,2111(1988);K.Terazono,T.Watanabe,Y.Yonemura,胰岛分 子生物学,H.Okamoto编(剑桥大学出版社,剑桥,1990),p301-313;K Terazono等,糖尿病学33,250(1990);T.Watanabe等,Proc.Natl.Acad.Sci. USA 91,3589(1994))。
另外,本发明人阐明Reg基因的基因产物Reg蛋白是 胰β-细胞的再生增殖因子,并使用糖尿病模型动物证实了通过施用Reg蛋 白,激活Reg基因或导入Reg基因来治疗糖尿病的可能性(Watanabe,T等(1994) Proc.Natl.Acad.Sci.USA 91,3589-3592;Gross,D.J等(1998)内分泌学139, 2369-2374;Okamoto,H.(1999)分子医学杂志,77,74-79)。
从这些分析中发 现:施用Reg蛋白可诱导β-细胞的再生和增殖,从而增加β-细胞的量,并改 善90%切除胰腺的大鼠和非-肥胖型糖尿病小鼠的糖尿病。
然而,仍不知道何 种蛋白质与Reg蛋白相互作用以发挥其功能。
希望能将Reg蛋白作为胰β-细胞的增殖因子用于治疗糖尿病,以补偿施 用胰岛素的弱点。
然而,当将其用于临床时,仍存在很多技术问题,例如由 于Reg蛋白的分子量大,因此难以口服该蛋白,另外,也难以在体内靶向高 -分子量的蛋白质。
                        发明的内容 本发明的目的是提供一种与Reg蛋白结合的新蛋白质,其基因,以及所 述蛋白质和基因的生产方法和用途。
特别地,本发明的蛋白质可用于开发新 的糖尿病治疗药物。
为了分析Reg蛋白对胰β细胞-谱系细胞所起的作用,本发明人进行了实 验,其中在大鼠胰岛瘤细胞-衍生的细胞系RINm5F中加入在酵母中产生的重 组Reg蛋白。
结果揭示出加入Reg蛋白能使RINm5F细胞中5’-溴-2’-脱氧尿 苷(BrdU)的掺入显著增加,Reg蛋白促进了这些细胞的增殖。
接着,本发明 人用125I标记Reg蛋白,并将其加入RINm5F细胞中以分析结合活性。
结果, 观察到Reg蛋白与RINm5F细胞依赖于浓度的结合,据认为此结合是特异性 的,因为过量的未经标记的Reg蛋白可抑制这种结合。
这些结果表明胰β细 胞表达Reg蛋白受体,此受体与Reg蛋白的结合促进细胞增殖。
为了分离具有Reg蛋白受体功能的Reg-结合蛋白,本发明人用噬菌体载 体构建了大鼠胰岛polyA(+)RNA的表达cDNA文库,并使用经标记的Reg 蛋白,通过West-Western印迹法筛选出编码Reg-结合蛋白的基因。
结果,成 功地分离出一种新的cDNA,其编码含有364个氨基酸的蛋白质。
将该cDNA 插入哺乳动物细胞-表达载体,并在COS-7细胞中表达。
在这些细胞中加入 重组Reg蛋白,证实Reg蛋白与COS-7细胞特异性结合。
本发明人使用该cDNA为探针筛选大鼠胰岛cDNA文库,成功分离出另 一种编码Reg-结合蛋白的cDNA。
该cDNA编码含有919个氨基酸的细胞表 面蛋白。
当在哺乳动物细胞中表达该cDNA时,蛋白质表达于细胞表面,细 胞与Reg蛋白以高亲和力结合。
加入Reg蛋白能诱导BrdU掺入至被该cDNA 转染的RINm5Fβ细胞,使细胞数目增加。
由这些结果可以证实:分离的cDNA 编码的Reg-结合蛋白是Reg蛋白的受体,它能介导胰β细胞中的细胞增殖信 号。
另外,还揭示出通过加入高浓度的Reg蛋白,可在大量表达Reg-结合蛋 白的RINm5F细胞中诱导细胞凋亡。
由这些事实可以设想Reg-结合蛋白转导Reg蛋白的信号,并通过调节例 如胰β细胞的细胞增殖,来调节胰β细胞的量。
本发明的Reg-结合蛋白及其 基因可成为阐明糖尿病发病机理的有用工具,并且也可用于开发抗-糖尿病药 物。
本发明涉及Reg蛋白-结合蛋白,其基因,生产该蛋白质和基因的方法, 以及它们的用途,本发明更具体地涉及: (1)根据(a)至(i)中任一项的DNA, (a)编码含有SEQ ID NO:2之氨基酸序列的蛋白质的DNA, (b)含有SEQ ID NO:1之核苷酸序列的编码区的DNA, (c)编码含有将SEQ ID NO:2的氨基酸序列取代,缺失,插入和/或添加 一个或多个氨基酸后所得氨基酸序列的蛋白质的DNA,其中所述DNA编码 具有与Reg蛋白结合之活性的蛋白质, (d)与含有SEQ ID NO:1之核苷酸序列的DNA杂交的DNA,其中所述 DNA编码具有与Reg蛋白结合之活性的蛋白质, (e)编码含有SEQ ID NO:4之氨基酸序列的蛋白质的DNA, (f)含有SEQ ID NO:3之核苷酸序列的编码区的DNA, (g)编码含有将SEQ ID NO:4的氨基酸序列取代,缺失,插入和/或添加 一个或多个氨基酸后所得氨基酸序列的蛋白质的DNA,其中所述DNA编码 具有与Reg蛋白结合之活性的蛋白质, (h)与含有SEQ ID NO:3之核苷酸序列的DNA杂交的DNA,其中所述 DNA编码具有与Reg蛋白结合之活性的蛋白质, (i)编码含有SEQ ID NO:2或SEQ ID NO:4之氨基酸序列的蛋白质的部分 肽的DNA; (2)由根据(1)的DNA编码的蛋白质或肽; (3)插入根据(1)的DNA的载体; (4)携有根据(3)的载体的宿主细胞; (5)生产根据(2)的蛋白质或肽的方法,其中所述方法包括下列步骤: (a)培养根据(4)的细胞,和 (b)从经培养的细胞或培养物上清液中回收细胞所表达的重组蛋白质; (6)抗根据(2)的蛋白质或肽的抗体; (7)含有至少15个核苷酸的多核苷酸,其中所述多核苷酸与选自SEQ ID NO:1,SEQ ID NO:3的DNA或与其互补的DNA杂交; (8)筛选能与根据(2)的蛋白质或肽结合的化合物的方法,其中所述方法包 括下列步骤: (a)使蛋白质或肽与受试样品接触, (b)检测受试样品与蛋白质或肽的结合,和 (c)选择与蛋白质或肽结合的化合物; (9)筛选能抑制Reg蛋白与根据(2)的蛋白质或肽结合的化合物的方法, 其中所述方法包括下列步骤: (a)在受试样品的存在下,使Reg蛋白与根据(2)的蛋白质或肽接触, (b)检测Reg蛋白与根据(2)的蛋白质或肽的结合,和 (c)选择能减弱结合的化合物; (10)通过根据(9)的方法分离的化合物,其中所述化合物抑制Reg蛋白与 根据(2)的蛋白质或肽的结合; (11)筛选能对(2)的蛋白质的激活所致信号转导进行促进或抑制的化合物 的方法,其中所述方法包括下列步骤: (a)在受试样品的存在下,使Reg蛋白与在细胞表面表达根据(2)的蛋白质 的细胞接触, (b)检测细胞在应答Reg蛋白的刺激时的改变, (c)选择与缺乏受试样品时所作的检测相比,能增强或抑制所述细胞改变 的化合物; (12)根据(11)的方法,其中所述细胞改变包括细胞-增殖活性或细胞DNA- 合成活性的改变; (13)通过根据(11)或(12)的方法分离的化合物,其中所述化合物能促进或 抑制由激活根据(2)的蛋白质所致的信号转导; (14)一种药剂,其含有根据(1)的DNA,根据(2)的蛋白质或肽,根据(3) 的载体,根据(6)的抗体,或根据(10)或(13)的化合物; (15)根据(14)的药剂,其中所述药剂选自Reg-结合剂,Reg蛋白应答细 胞的胞内信号转导的调节剂,细胞增殖调节剂,DNA合成调节剂和细胞凋 亡调节剂;和 (16)根据(14)或(15)的药剂,其中所述药剂是抗-糖尿病药物。
本发明涉及一种在胰腺中表达的,与Reg蛋白结合的新蛋白质(Reg-结合 蛋白)。
分离的大鼠“Reg-结合蛋白”的cDNA的核苷酸序列和由这些cDNA 编码的氨基酸序列分别描述于SEQ ID NO:1和SEQ ID NO:3,以及SEQ ID NO:2和SEQ ID NO:4。
一种编码本发明的大鼠Reg-结合蛋白(SEQ ID NO:2)的cDNA含有开放 阅读框,其编码含有364个氨基酸残基的蛋白质(SEQ ID NO:1)。
通过使用该 cDNA为探针进行筛选,可分离出编码大鼠Reg-结合蛋白的cDNA,所述 cDNA含有开放阅读框(SEQ ID NO:3),其编码含有919个氨基酸残基的蛋白 质(SEQ ID NO:4)。
本发明的大鼠“Reg-结合蛋白”在细胞表面表达,并具有 Reg蛋白-结合活性。
如上所述,Reg蛋白是胰腺β细胞再生时特异性表达的 再生增殖因子,已有人提出应用该蛋白质及其基因治疗糖尿病的可能性。
据 认为本发明的Reg-结合蛋白涉及通过作为Reg蛋白的受体起作用来调节细胞 的生理功能,包括对胰腺β细胞进行增殖调节。
因此,本发明的Reg-结合蛋 白可用作研究的靶,来阐明导致糖尿病的机理,或者可用作工具,用于开发 针对涉及胰腺β细胞功能之疾病(如糖尿病)的治疗剂。
最近,已分离出几种Reg和Reg-相关基因,已揭示出这些基因构成一个 多基因家族,Reg家族(H.Okamoto,分子医学杂志,77,74(1999);H.Okamoto, 肝胆胰腺外科学杂志,6,254(1999);M.Unno等,生物化学杂志,268, 15974(1993);Y.Narushima等,基因185,159(1997);M.Abe等,基因246, 111(2000))。
Reg家族的所有成员都显示出6个外显子和5个内含子的保守基 因排列,和家族成员之间40-85%的氨基酸序列同源性,保守的6个半胱氨酸 残基形成3对分子内S-S键(H.Okamoto,分子医学杂志,77,74(1999);H. Okamoto,肝胆胰腺外科学杂志,6,254(1999);M.Unno等,生物化学杂志, 268,15974(1993);Y.Narushima等,基因185,159(1997);T.Itoh等,FEBS Lett, 272,85(1990);M.Abe等,基因246,111(2000))。
根据Reg蛋白的一级结构, 将该家族的成员分成3个亚类,I,II和III型(H.Okamoto,分子医学杂志,77, 74(1999);H.Okamoto,肝胆胰腺外科学杂志,6,254(1999);M.Unno等,生物 化学杂志,268,15974(1993);Y.Narushima等,基因185,159(1997);T. Watanabe等,生物化学杂志,265,7432(1990);M.Abe等,基因246, 111(2000))。
I型Reg蛋白包括本发明实施例中所用的大鼠和人Reg蛋白,它 们在再生的胰岛中表达(H. Okamoto,分子医学杂志,77,74(1999);K. Terazono等,生物化学杂志,263,2111(1988);K.Terazono,T.Watanabe,Y. Yonemura,胰岛分子生物学,H.Okamoto编(剑桥大学出版社,剑桥,1990), p301-313;K.Terazono等,糖尿病学33,250(1990);H.Okamoto,肝胆胰腺外 科学杂志,6,254(1999))。
最近,已在人结肠癌(T.Watanabe等,生物化学杂志, 265,7432(1990);M.E.Zenilman等,胃肠道外科学杂志,1,194(1997);F.R. Bernard-Perrone等,组织化学与细胞化学杂志,47,863(1999)),大鼠胃粘膜(H. Fukui等,胃肠病学115,1483(1998))和肠嗜铬样细胞(M.Asahara等,胃肠病 学111,45(1996))中发现I型Reg在病理性条件下的表达,也有人提出III型 Reg蛋白参与肠帕内特(Paneth)细胞(L.Christa等,美国生理学杂志,271, G993(1996)),肝细胞癌(L.Christa等,美国生理学杂志,271,G993(1996)),胰 腺腺泡细胞(L.Christa等,美国生理学杂志,271,G993(1996);E.M.Ortiz等, 胃肠病学114,808(1998))和施旺(Schwann)细胞(J.F.Livesey等,自然390, 614(1997))中的细胞增殖。
因此,所鉴定的Reg受体可在生理和病理条件下, 在多种组织和细胞中作为Reg家族基因产物的受体起作用。
上述发现表明:本发明的蛋白质可用于开发治疗剂,所述治疗剂不仅可 以治疗和预防糖尿病,还可以治疗和预防诸如胃肠道肿瘤(Asahara,M等,胃 肠病学111,45-55(1996);Fukui,H等,胃肠病学115,1483-1493(1998)),神经 变性病(Livesy,F.J等,自然390,614-618(1997))和胰腺炎(Christa,L等,美国 生理学杂志,271,G993-G1002(1996);Ortiz,E等,胃肠病学114,808-816 (1998))等疾病。
另外,据认为当肿瘤中出现Reg蛋白-Reg-结合蛋白紊乱,例 如过度刺激时,Reg蛋白自身可用于治疗,因为施用可溶形式的Reg-结合蛋 白可抑制过度刺激,从而抑制肿瘤增殖等。
本发明包括结构与大鼠“Reg-结合蛋白”类似的蛋白质,只要它们具有 与Reg蛋白结合的活性即可。
结构类似的蛋白质包括“Reg-结合蛋白”的突 变体和得自其它生物体的“Reg-结合蛋白”。
本领域技术人员使用例如众所周知的诱变方法可以容易地制备这些蛋 白质。
改变蛋白质中的氨基酸的已知方法包括Kunkel的方法(Kunkel,T. A(1985)Proc.Natl.Acad.Sci.USA 82,488),寡核苷酸-定向双琥珀(ODA)法 (Hashimoto-Gotoh,T等(1995)基因152,271-275),PCR-限制性酶法(Ito,W 等(1991)基因102,67-70),ODA-PCR法(Hashimoto-Gotoh,T等(1995)基因 152,271-275;Ito,W等(1991)基因102,67-70)等。
对蛋白质中所改变的氨基 酸残基数目没有限制,但是,当进行人工改变时,所改变的氨基酸残基数目 通常为50个或更少,优选为10个或更少,更优选为5个或更少。
蛋白质中的氨基酸突变可以自发发生。
本发明也包括下述蛋白质,只要 它们具有与Reg蛋白结合的活性即可,所述蛋白质具有因人工或自发地取 代,缺失,添加和/或插入氨基酸而与天然大鼠“Reg-结合蛋白”有所不同的 氨基酸序列。
优选使用与被取代的氨基酸特性类似的氨基酸进行取代。
例如,由于 Ala,Val,Leu,Ile,Pro,Met,Phe和Trp被归类为非-极性氨基酸,可以认为它们 具有类似的特性。
另外,不带电的氨基酸包括Gly,Ser,Thr,Cys,Tyr,Asn和 Gln。
另外,酸性氨基酸包括Asp和Glu,而碱性氨基酸包括Lys,Arg和His。
在本发明中,大鼠“Reg-结合蛋白”的氨基酸有缺陷的蛋白质包括仅含 有胞外结构域的蛋白质。
另外,除含有大鼠“Reg-结合蛋白”之外,还含有 其它氨基酸的蛋白质包括大鼠“Reg-结合蛋白”和另一种肽的融合蛋白。
使用已知的杂交技术(Sambrook,J等,(1989)分子克隆第2版,冷泉港实 验室出版社)和聚合酶链反应(PCR)技术(Sambrook,J等,(1989)分子克隆第2 版,冷泉港实验室出版社;Innis,M.A等,PCR方法,Academic出版社 (1990)),即可制备与大鼠“Reg-结合蛋白”结构类似,且具有与Reg蛋白结 合之活性的蛋白质。
即,本领域技术人员可常规地将大鼠“Reg-结合蛋白” cDNA(SEQ ID NO:1或3)或其部分用作探针,将与大鼠“Reg-结合蛋白” cDNA特异性杂交的寡核苷酸用作引物,从多种其它生物体中分离出与大鼠 “Reg-结合蛋白”cDNA高度同源的DNA,再由分离的DNA获得与大鼠 “Reg-结合蛋白”结构类似的蛋白质。
本发明中包括与大鼠“Reg-结合蛋白”cDNA杂交的DNA所编码的蛋 白质,只要它具有与大鼠“Reg-结合蛋白”结合的活性即可。
其它可用于分 离所述蛋白质的生物体包括例如人,猴,小鼠,兔,山羊,牛,猪,狗等, 但并不局限于此。
据认为这些生物体的胰岛β细胞是分离编码所述蛋白质的 DNA的适当来源。
得自除大鼠外的生物体的,编码“Reg-结合蛋白”的DNA通常与大鼠 “Reg-结合蛋白”的cDNA序列(SEQ ID NO:1或3)高度同源。
“高度同源” 指的是在核苷酸序列水平上具有至少60%或更高,优选80%或更高,更优选 90%或更高,甚至更优选95%或更高,最优选99%或更高的序列同一性。
通 过FASTA(用宽范围的序列相似性搜索某个序列),BLAST(用局部的高相似 性搜索某个序列)和SSEARCH(利用Smith-Waterman算法进行搜索),即可测 定序列同源性。
进入众所周知的数据库和站点,例如日本DNA数据库 (DDBJ),即可使用这些程序。
本领域技术人员可以适当选择杂交条件,用以使用大鼠“Reg-结合蛋 白”cDNA,从除大鼠外的生物体中分离出编码与“Reg-结合蛋白”功能等 同的蛋白质的cDNA。
例如,可在42℃,使用6×SSC,5×FBP,0.5%SDS, 0.2mg/ml鲑(鲱)精DNA和10%甲酰胺溶液进行杂交(低度-严紧条件)。
优选在 42℃,使用6×SSC,5×FBP,0.5%SDS,0.2mg/ml鲑(鲱)精DNA和30% 甲酰胺溶液进行杂交(中度-严紧条件)。
更优选在50℃,使用6×SSC, 5×FBP,0.5%SDS,0.2mg/ml鲑(鲱)精DNA和50%甲酰胺溶液进行杂交(高 度-严紧条件)。
在此情况下,尽管据认为包括温度,甲酰胺浓度,盐浓度等 的几个因素影响杂交的严紧度,但本领域技术人员通过适当选择这些因素可 以达到类似的严紧度。
本发明的蛋白质可被制备成天然蛋白质,或者可以利用基因重组技术将 其制备成重组蛋白质。
通过例如按下文所述,将据认为可表达“Reg-结合蛋 白”的组织(例如胰岛β细胞)提取物上样至使用抗“Reg-结合蛋白”之抗体 的亲和层析,即可制备出天然蛋白质。
另一方面,通过按下文所述,培养用 编码“Reg-结合蛋白”的DNA转化的细胞,使转化子表达该蛋白,并回收 该蛋白即可制备出重组蛋白质。
本发明包括本发明蛋白质的部分肽。
本发明蛋白质的部分肽的例子为相 当于Reg蛋白-结合位点的肽。
通过给活体施用本发明的部分肽,可将其用作 本发明蛋白质的激动剂或拮抗剂,或Reg蛋白的拮抗剂等。
这种部分肽可用 作由本发明蛋白质介导的信号转导的激活剂或抑制剂。
另外,本发明的部分 肽包括本发明蛋白质N-末端区域或C-末端区域的部分肽,这些肽可用于制 备抗体。
含有特异于本发明蛋白质的氨基酸序列的部分多肽具有至少7个, 优选为至少8个,更优选为至少9个氨基酸残基。
通过例如基因工程技术, 已知的肽合成方法,或者通过用适当的肽酶裂解本发明的蛋白质,即可制备 本发明的部分肽。
例如,可使用含有与Reg蛋白结合的结构域的部分肽来结 合Reg蛋白。
所述部分肽可用作Reg蛋白-结合剂。
本发明涉及编码本发明蛋白质的DNA。
对编码本发明蛋白质的DNA没 有特别的限制,只要它能编码本发明的蛋白质即可,所述DNA包括cDNA, 基因组DNA和合成的DNA。
本发明还包括具有基于遗传密码简并性的任何 核苷酸序列的DNA,只要它能编码本发明的蛋白质即可。
通过例如用32P等标记SEQ ID NO:1或3的cDNA或其片断,与它们互 补的RNA,或含有部分cDNA序列的合成寡核苷酸,并使它们与得自表达 本发明蛋白质的组织(如胰腺等)的cDNA文库杂交,可以筛选出编码本发明 蛋白质的cDNA。
另外,通过合成对应于cDNA核苷酸序列的寡核苷酸,并 以得自适当组织(如胰腺等)的cDNA为模板,经聚合酶链反应对上述寡核苷 酸进行扩增,也可克隆出所述cDNA。
通过例如用32P等标记SEQ ID NO:1 或3的cDNA或其区断,与它们互补的RNA,或含有部分cDNA序列的合 成寡核苷酸,并使它们与基因组DNA文库杂交,可以筛选出基因组DNA。
或者,通过合成对应于这些cDNA的核苷酸序列的寡核苷酸,并以基因组 DNA为模板,经聚合酶链反应对上述寡核苷酸进行扩增,也可克隆出基因组 DNA。
另一方面,通过例如化学合成含有SEQ ID NO:1或3的cDNA部分 序列的寡核苷酸,使它们退火以形成双链,并用DNA连接酶使它们相互连 接,即可制备合成DNA。
这些DNA可用于生产重组蛋白质。
即通过将编码本发明蛋白质的 DNA(例如SEQ ID NO:1或3)插入适当的表达载体,用该载体转化适当的细 胞,培养转化子并回收表达的蛋白质,即可将本发明的蛋白质制备成重组蛋 白质。
在哺乳动物细胞中表达本发明的蛋白质之后,可将其制备成纯化的或 粗的蛋白质,或者制备成与膜-结合的形式。
特定宿主-载体系统的例子是大肠杆菌-pGEX系统(Amer-sham Pharmacia Biotech;表达成GST-融合蛋白),大肠杆菌-pHB6系统和pVB6系统(Roche diagnostics;表达成6×His-融合蛋白),大肠杆菌-pMAL系统(New England Biolabs;表达成与麦芽糖-结合蛋白的融合蛋白),大肠杆菌-pTYB系统(New England Biolabs;表达成与内蛋白子(Intein)的融合蛋白(在DTT的存在下可消 化Intein部分,便于仅纯化目的蛋白质)),毕赤氏酵母-pPIC系统和pGAP系 统(Invitrogen),哺乳动物细胞(例如COS7)-pCI-neo系统(Promega)和pHook系 统(Invitrogen)等。
可通过以下方法将载体导入宿主,如众所周知的转化感受态细胞或电穿 孔大肠杆菌,转化用毕赤氏酵母Easy Comp试剂盒制备的感受态细胞(参见实 施例1)或电穿孔毕赤氏酵母,电穿孔或众所周知的使用阳离子脂质对哺乳动 物细胞进行脂质转染的方法等。
可通过已知方法纯化宿主细胞中表达的重组蛋白质。
通过镍柱或谷胱甘 肽Sepharose凝胶柱等可以纯化以融合蛋白的形式表达的本发明的蛋白质, 例如具有组氨酸残基标记物或N-末端结合有谷胱甘肽-S-转移酶(GST)的蛋白 质。
也可将编码本发明蛋白质的DNA用于基因治疗,以治疗由所述DNA的 突变引起的疾病。
例如,可使用病毒载体,例如痘苗病毒或逆转录病毒载体 进行基因治疗。
实际的治疗方法是:在培养条件下,使用这些重组病毒将 “Reg-结合蛋白”导入例如用于移植的胰腺或胰岛,并进行移植。
这将会通 过增殖胰腺β细胞来改善移植的治疗效果,并能有效使用移植器官。
本发明还涉及含有至少15个核苷酸的多核苷酸,所述核苷酸能与含有 SEQ ID NO:1或SEQ ID NO:3所述核苷酸序列的DNA或其互补DNA杂交。
所述多核苷酸优选与含有SEQ ID NO:1或SEQ ID NO:3所述核苷酸序列的 DNA特异性杂交,并含有至少15个核苷酸。
“特异性杂交”指的是在正常杂 交条件下,优选在上述中度-严紧杂交条件下,更优选在上述高度-严紧杂交 条件下,未观察到与编码其它蛋白质的DNA的显著交叉杂交。
可在上述条 件下进行杂交。
这些多核苷酸包括探针和引物,核苷酸或核苷酸衍生物(例如 反义寡核苷酸和核酶),它们可与编码本发明蛋白质的DNA或与该DNA互 补的DNA特异性杂交。
可使用含有编码本发明蛋白质的cDNA或其部分序列的寡核苷酸克隆编 码本发明蛋白质的基因或cDNA,或使用所述寡核苷酸通过PCR进行扩增。
另外,所述寡核苷酸还可用于检测和定量编码本发明蛋白质的RNA。
另外, 可使用所述寡核苷酸通过诸如限制性片断长度多态性(RFLP),单链构象多态 性(SSCP)的方法检测突变,多态性或疾病(如基因诊断)。
本发明的多核苷酸可用于胰腺检测,例如胰腺β细胞检测,因为本发明 的蛋白质在形成,再生和/或维持胰腺,尤其是调节胰腺β细胞的量的方面具 有重要功能。
另外,本发明的多核苷酸可用于糖尿病检测。
例如,从受试者 体内分离胰腺组织样品,通过诸如Northern杂交,RT-PCR或DNA芯片(DNA 微列阵)的方法检查这些组织中本发明蛋白质表达水平的异常。
另外,通过序 列分析,SSCP,RFLP等可检测编码本发明蛋白质的DNA或RNA中是否 存在突变或多态性。
当使用多核苷酸作为检测试剂时,可将其与无菌水,缓 冲液,盐等适当混合。
另外,本发明的蛋白质或其部分肽,编码所述蛋白质或肽的DNA,和 其中已插入该DNA的载体可用于按下述方法来筛选能抑制本发明的蛋白质 与Reg蛋白结合的化合物。
它们也可用于筛选能促进或抑制通过激活本发明 蛋白质而刺激的信号转导(例如细胞增殖活性或细胞的DNA-合成活性)的化 合物。
这些筛选可用于分析由胰腺β细胞的量或功能紊乱所导致疾病,包括 糖尿病的治疗剂或预防药物。
除糖尿病外,这些筛选也可用于分析或筛选胃 肠肿瘤,神经变性疾病,胰腺炎和其它肿瘤的治疗剂或预防药物。
另外,本发明涉及与本发明蛋白质结合的抗体。
本发明的抗体包括多克 隆和单克隆抗体。
通过使用众所周知的方法(Harlow,E和Lane,D,抗体,冷 泉港实验室(1988)等),将上述制备自生物材料(例如胰岛)的“Reg-结合蛋 白”,通过宿主-载体系统产生的重组“Reg-结合蛋白”等,或通过常规肽合 成方法合成的部分肽用作抗原,免疫兔,山羊,绵羊等,即可制备多克隆抗 体。
通过使用众所周知的方法(Harlow,E和Lane,D,抗体,冷泉港实验室 (1988)等),将上述制备自生物材料(例如胰岛)的“Reg-结合蛋白”,通过宿主 -载体系统产生的重组“Reg-结合蛋白”等,或通过常规肽合成方法合成的部 分肽用作抗原,免疫小鼠,大鼠等,并使用小鼠,大鼠等的脾细胞获得能产 生单克隆抗体的杂交瘤,即可制备单克隆抗体。
通过常规的生物化学方法,例如硫酸铵分级分离,G蛋白Sepharose柱, 或固相化抗原亲和柱,从血清中纯化多克隆抗体,从杂交瘤的培养物上清液 或接种了杂交瘤的动物的腹水中纯化单克隆抗体。
将如此制备的抗体用于亲和纯化本发明的蛋白质,或者用于检测和诊断 由本发明蛋白质的异常表达或结构异常导致的疾病,以及用于检测所述蛋白 质的表达水平等。
具体地说,例如,从组织或细胞中提取蛋白质,通过Western 印迹,免疫沉淀,ELISA等检测本发明的蛋白质,籍此检测和/或诊断表达 或结构的异常。
本发明的抗体也可用于胰腺检测,例如胰腺β细胞检测。
另 外,本发明的抗体可用于检测糖尿病。
例如,从受试者体内分离胰腺组织样 品,通过Western印迹,免疫组化,ELISA,EIA等方法检测所述组织中本 发明蛋白质表达水平或结构的异常。
当使用抗体作为检测试剂时,可将其与 无菌水,缓冲液,盐,稳定剂,防腐剂等适当混合。
另外,本发明的抗体也 可用于抗体治疗。
当使用本发明的抗体进行抗体治疗时,优选使用人源化抗 体或人抗体。
此时,使人淋巴细胞与HGPRT(次黄嘌呤鸟嘌呤磷酸核糖转移 酶)-缺陷型小鼠骨髓瘤细胞融合,使用HAT培养基选择人-小鼠异源杂交瘤。
通过众所周知的RIA或ELISA法(其中将“Reg-结合蛋白”用作抗原)选择骨 髓瘤细胞,获得能产生Reg结合蛋白的人源化单克隆抗体的克隆。
按上述进 行抗体的纯化。
本发明还涉及筛选能与本发明蛋白质结合的化合物的方法。
可通过包括 下列步骤的方法进行筛选:(a)使本发明的蛋白质或其部分肽与受试样品接 触,(b)检测受试样品与本发明的蛋白质或其部分肽的结合,和(c)选择能与本 发明的蛋白质或其部分肽结合的化合物。
可根据筛选方法,将本发明的蛋白质以纯化的蛋白质,细胞表面-表达的 形式,或细胞膜组分的形式用于筛选。
可使用的受试样品包括例如细胞提取物,基因文库的表达产物,合成的 低分子量化合物,合成肽,天然化合物等,但并不局限于此。
必要时,在使 用前可标记筛选所用的受试样品。
标记物包括例如放射性标记和荧光标记 等,但并不局限于此。
通过例如将有望表达与本发明蛋白质结合的蛋白质的细胞培养物上清 液,或细胞提取物上样于固定有本发明蛋白质的亲和柱,并通过纯化与该柱 特异性结合的蛋白质,即可筛选出与本发明蛋白质结合的蛋白质。
另外,可根据“West-Western印迹法”等进行筛选,其中由有望表达与 本发明蛋白质结合的蛋白质的组织或细胞(例如胰腺β细胞)通过噬菌载体构 建cDNA文库,然后,在琼脂糖上表达所述文库,将表达的蛋白质固定于滤 膜上,并与经标记的本发明蛋白质反应,以检测表达结合蛋白的噬斑。
另一 种方法是“双-杂种系统”,其中GAL4-DNA结合结构域和GAL4转录激活结 构域被表达成本发明蛋白与受试蛋白的融合蛋白,通过表达报道基因即可检 测本发明蛋白质与受试蛋白质的结合,所述报道基因与具有GAL4-DNA结合 蛋白之结合序列的启动子的下游相连接。
另外,使固定化的本发明蛋白质与合成的化合物,天然产物库,或随机 噬菌体肽展示文库反应从而筛选结合蛋白的方法,和通过使用高-物料流通量 系统的组合化学技术进行筛选,分离出与本发明蛋白质结合的化合物的方法 是本领域技术人员众所周知的技术。
另外,还例举了使用BIACORE(Biacore)的筛选方法,或通过使用微型生 理计(Molecular Device)等监测被强制表达本发明Reg-结合蛋白的培养细胞的 酸分泌速度变化的方法。
另外,本发明还涉及筛选能抑制本发明的蛋白质与Reg蛋白结合的化合 物的方法,可通过包括下列步骤的方法进行筛选:(a)在受试样品的存在下, 使Reg蛋白与本发明的蛋白质接触,(b)检测Reg蛋白与本发明蛋白的结合, 和(c)选择能减弱该结合的化合物。
本发明的蛋白质可以以纯化的蛋白质,细胞表面-表达的形式,或细胞膜 组分的形式用于筛选。
Reg蛋白通常以纯化蛋白质的形式用于筛选。
例如, 人REG Iα或大鼠Reg I等可用作Reg蛋白。
可将这些蛋白质制备成重组蛋白 质(参照实施例1)。
必要时,可用放射性同位素,如[125I]标记Reg蛋白。
关于受试样品,可使用细胞提取液,基因文库的表达产物,合成的低分 子量化合物,合成肽,天然化合物等,但并不局限于此。
例如,可按下述进行筛选。
在受试样品的存在下,使表达本发明蛋白质 的细胞或使用所述细胞制备的膜组分与经标记的配体(Reg蛋白)接触,测定与 本发明蛋白质结合的经标记配体的量。
选择与缺乏受试样品时相比,能减少 配体量的化合物。
使用上述BIACORE或微型生理计可测定本发明蛋白质与 Reg蛋白的结合。
如此分离得到的化合物可以是本发明蛋白质的候选拮抗剂 或激动剂。
另外,本发明还涉及筛选能对激活本发明的蛋白质所致信号转导进行促 进或抑制的化合物的方法,可通过下列步骤进行筛选:(a)在受试样品的存在 下,使Reg蛋白与在表面表达本发明蛋白质的细胞接触,(b)检测细胞应答 Reg蛋白的刺激时的改变,(c)选择与缺乏受试样品时所作的检测(对照)相比, 能增强或抑制所述细胞改变的化合物。
通过将编码本发明蛋白质的DNA插入适当表达载体,并将所述载体导 入适当宿主细胞,可以制备在其表面表达本发明蛋白质的细胞。
例如,诸如 RINm5F细胞,CHO细胞,COS-7细胞等细胞可用作宿主细胞。
关于载体, 可使用pCI-neo(Promega),pHook(Invitrogen)等。
关于受试样品,可使用例如细胞提取液,基因文库的表达产物,合成的 低分子量化合物,合成肽,天然化合物等,但并不局限于此。
另外,关于受 试样品,也可以使用按照与本发明蛋白质的结合为所指示,通过上述筛选分 离得到的化合物。
Reg蛋白通常以纯化蛋白质的形式用于筛选。
例如,人REG Iα或大鼠 Reg I等可用作Reg蛋白。
可将这些蛋白质制备成重组蛋白质(参照实施例1)。
在筛选中,检测上述细胞在受试样品的存在下,应答Reg蛋白的刺激作 出的改变。
关于细胞应答Reg蛋白刺激作出的改变包括例如:细胞增殖活性 的改变,DNA-合成活性的改变,细胞凋亡水平的改变,本发明蛋白质或蛋 白质转导信号的磷酸化,细胞中特定基因表达的改变等,但改变并不局限于 此。
例如,如实施例中所述,可通过测定5’-溴-2’-脱氧尿苷(BrdU)的掺入来 检测细胞的DNA合成。
另外,通过在细胞中添加3H-胸苷,然后测定掺入的 放射性也可进行检测。
通常使用细胞的3H-胸苷掺入试验分析对DNA合成的 促进或抑制效果。
该方法的优点是能处理相对大量的样品,且敏感性高等。
筛选能促进或抑制DNA合成的化合物时,具体操作如下:将细胞接种于多 孔板上,保温1-2天后,将培养基换成含有受试样品的培养基,保温一段时 间,如24小时。
随后,例如,加入1μCi/ml 3H胸苷。
保温后,除去培养基, 洗涤,加入10%TCA,再将细胞放在冰块上约20分钟,用冰冷的5%TCA 洗涤,然后用0.5N NaOH裂解细胞,在冰上放置10分钟,加入1/2体积的 1N HCl,小心混合,再加入40%TCA至终浓度为10%,并小心混合。
在冰 上放置20分钟后,该溶液通过Whatman GF/C滤膜等过滤以收集不溶的物 质。
用100%乙醇洗涤3次并干燥之后,使用液体闪烁计数器测定放射性。
另外,通过测定细胞数目或集落数目,或通过加入诸如MTT或Alamar 蓝等染料测定依赖于细胞数目的颜色生成,可以测定细胞增殖。
MTT法使 用MTT(3-(4,5-二甲基-2-噻唑)-2,5-二苯基溴化四唑)所致的颜色生成来测定 细胞增殖活性,由于与活细胞线粒体的呼吸链反应,形成了MTT甲瓒。
所 生成的量反映了细胞数目。
具体地说,例如,细胞在96孔板中保温,与受试 样品反应,然后加入10μl 5mg/ml MTT溶液,保温4小时。
再加入100μl 0.04N HCl/异丙醇,充分混合,静置几分钟。
然后,在参照波长为630nm,检测波 长为570nm时,使用微滴板读数仪测定颜色生成。
另外,如实施例11所述, 四唑盐4[-3-(4-碘苯基)-2-(4-硝基苯基)-2H-5-四唑并]-1,3-苯二磺酸盐(WST-1) 可用于该分析。
例如,以核的形态学改变(核的凝聚或区段化),染色体的片段化(序列梯 的形成)等为指标,可测定细胞凋亡。
具体地说,通过例如TUNEL法(Y.Gavrieli 等,细胞生物学杂志,119,493(1992))等可以检测细胞凋亡(参照实施例11)。
据认为蛋白质磷酸化出现在丝氨酸,苏氨酸或酪氨酸残基中。
通过用 Western印迹法或使用抗-磷酸丝氨酸,抗-磷酸苏氨酸或抗-磷酸酪氨酸抗体的 免疫沉淀法测定胞内蛋白质的磷酸化状态,可以测定这些磷酸化变化。
与细 胞增殖-相关的蛋白质,如MAP激酶家族,STAT家族或Fos-Jun家族蛋白质 有望被磷酸化,但并不局限于此。
已知上述蛋白质磷酸化等可诱导或抑制多种基因的转录。
使用报道基因 可检测依赖于本发明蛋白质与其配体的结合的特定基因表达的变化。
也即, 通过检测报道基因的表达可测定表达的变化,其中报道基因与所述基因启动 子的下游相连接。
另外,通过检测mRNA的Northern印迹或RT-PCR法,使 用抗体检测身为基因翻译产物的蛋白质的方法,或检测身为基因翻译产物的 蛋白质活性的方法,也可以测定特定基因表达的变化。
通过这些筛选方法分离的化合物包括例如:(1)与本发明的蛋白质结合并 促进或抑制其活性的化合物,(2)与本发明的蛋白质,或本发明蛋白质的配 体,如Reg蛋白等结合,并促进或抑制本发明的蛋白质与配体结合的化合物, (3)与本发明蛋白质的配体结合,并促进或抑制其激活的化合物,和(4)促进或 抑制本发明蛋白质所致信号转导从而表达出细胞变化的化合物。
所述化合物可用作本发明蛋白质介导的信号转导系统紊乱所致疾病(例 如由胰腺β细胞功能紊乱引起的疾病)的预防或治疗剂。
例如,这些化合物可 用作糖尿病的治疗剂。
当用作治疗剂时,本发明的DNA,本发明的蛋白质或其部分肽,含有 本发明DNA的载体,抗本发明蛋白质或其部分肽的抗体,和通过上述筛选 分离的化合物可以单独使用,或者与其它化合物联合使用。
本发明的治疗剂 中包括试剂和药物。
例如,由于本发明的蛋白质具有与Reg蛋白结合的活性,因此可使用本 发明的蛋白质或其部分肽结合Reg蛋白。
所述蛋白质或肽可用于检测Reg蛋 白,或用于亲和纯化。
通过使本发明的蛋白质或其部分肽与Reg蛋白接触, 本发明的蛋白质或其部分肽可与Reg蛋白结合。
本发明的蛋白质或其部分肽 可被纯化或表达于细胞膜表面。
它们也可与载体结合。
对所结合的Reg蛋白 的来源没有限制,可以使用小鼠,大鼠或人Reg蛋白。
另外,通过在细胞中 表达本发明的蛋白质或其部分肽,可使编码本发明蛋白质或其部分肽的 DNA,插入了所述DNA的载体用于相同的目的。
因此,本发明的蛋白质或 其部分肽,编码它们的DNA,或含有携所述DNA之载体的治疗剂可以是 Reg蛋白-结合剂。
另外,本发明的蛋白质可作为Reg蛋白的受体起作用。
因此,本发明的 蛋白质可用于调节(促进或抑制)应答Reg蛋白的胞内信号转导。
通过激活本 发明的蛋白质,可促进该信号转导,反过来,通过抑制激活,可阻断该信号 转导。
例如,通过使表达本发明蛋白质(例如SEQ ID NO:4)的细胞与本发明 蛋白质的配体,如Reg蛋白或激动剂接触,可使本发明的蛋白质被激活并将 信号转导至细胞内部。
优选细胞是胰腺β细胞谱系,上皮细胞等。
另外,可 使用与Reg蛋白结合,但不能将信号转导至细胞内部的蛋白质来阻断Reg蛋 白的信号转导。
例如,可使用含有与Reg蛋白结合的区域,但不含将信号向 下游转导的区域的蛋白质。
通过在细胞中表达这种蛋白质,或将它们添加至 胞外,可以阻断Reg蛋白的信号转导。
通过在细胞中表达本发明的蛋白质或 其部分肽,也可将编码本发明蛋白质或其部分肽的DNA,插入了所述DNA 的载体用于相同的目的。
另外,与本发明蛋白质或其部分肽结合的抗体,或 通过本发明的筛选分离出的化合物也可用于相同的目的。
因此,可以认为本 发明的蛋白质或其部分肽,编码所述蛋白质或肽的DNA,插入了所述DNA 的载体,本发明的抗体,通过本发明的筛选分离出的化合物是应答Reg蛋白 的胞内信号转导的调节剂(促进剂,抑制剂等)。
应答Reg蛋白的胞内信号转导的例子包括:促进细胞的DNA合成和调 节细胞增殖(促进或抑制)。
即这表明可使用本发明的蛋白质抑制细胞的DNA 合成,促进或抑制细胞增殖。
优选靶细胞为胰腺β细胞谱系的细胞,上皮细 胞等。
通过使表达本发明蛋白质的细胞与本发明蛋白质的配体(例如Reg蛋白) 或激动剂接触以促进DNA合成,即可促进细胞增殖(或细胞分裂)。
当在细胞 中外源表达本发明的蛋白质时,可将表达本发明蛋白质(例如SEQ ID NO:4) 的载体导入细胞。
另外,可使用与Reg蛋白结合,但不能将信号转导至细胞 内部的蛋白质来抑制DNA合成或细胞增殖。
例如,可使用含有与Reg蛋白 结合的区域,但不含将信号转导至下游的区域的蛋白质。
通过在细胞内表达 这种蛋白质,或将它们添加至胞外,可以抑制DNA合成或细胞增殖。
通过 在细胞中表达本发明的蛋白质或其部分肽,也可将编码本发明蛋白质或其部 分肽的DNA,或插入了所述DNA的载体用于相同的目的。
另外,与本发明 蛋白质或其部分肽结合的抗体,和通过本发明的筛选分离出的化合物也可用 于调节DNA合成或细胞增殖。
例如,通过给活体施用作为本发明蛋白质的 配体或激动剂起作用的抗体或化合物,可促进细胞(如胰腺β细胞)的增殖。
给 药可以在体外和体内进行。
因此,本发明的蛋白质或其部分肽,编码所述蛋 白质或肽的DNA,插入了所述DNA的载体,本发明的抗体,通过本发明的 筛选分离出的化合物可以是细胞的DNA合成或细胞增殖的调节剂(促进剂或 抑制剂)。
另外,通过激活本发明的蛋白质而引发的信号转导的例子还包括细胞凋 亡。
即本发明的蛋白质可用于调节细胞凋亡(诱导细胞凋亡或抑制该诱导作 用)。
通过在细胞中表达本发明的蛋白质或其部分肽,也可将编码本发明蛋白 质或其部分肽的DNA,或插入了所述DNA的载体用于相同的目的。
另外, 与本发明蛋白质或其部分肽结合的抗体,和通过本发明的筛选分离出的化合 物也可用于调节细胞凋亡。
优选靶细胞为胰腺β细胞谱系的细胞,上皮细胞 等。
通过使表达高浓度的本发明蛋白质的细胞与本发明蛋白质的配体(例如 Reg蛋白)接触,可以导致细胞凋亡。
与细胞接触的Reg蛋白的浓度高于 100nM,优选500nM或更高,更优选1000nM或更高。
当在细胞中外源表达 本发明的蛋白质时,可将表达本发明蛋白质(例如SEQ ID NO:4)的载体导入 细胞。
另外,可使用与Reg蛋白结合,但不能将信号转导至细胞内部的蛋白 质来抑制由Reg蛋白导致的细胞凋亡。
通过在细胞内表达这种蛋白质,或将 它们加至胞外,可以抑制细胞凋亡。
因此,本发明的蛋白质或其部分肽,编 码所述蛋白质或其部分肽的DNA,插入了所述DNA的载体,本发明的抗体, 通过本发明的筛选分离出的化合物可以是细胞凋亡的调节剂(诱导剂或抑制 剂等)。
可通过众所周知的药学方法,将本发明的蛋白质或其部分肽,编码所述 蛋白质或肽的DNA,插入了所述DNA的载体,本发明的抗体,通过本发明 的筛选分离出的化合物与蒸馏水,缓冲剂,盐,BSA,甘油,稳定剂,防腐 剂或去污剂混合,可以制备成组合物。
另外,本发明的药剂可用作上述胰腺 检查所用的试剂。
另外,它也可用作药物组合物,用于治疗或预防糖尿病, 消化道肿瘤,神经变性疾病,胰腺炎和其它肿瘤。
当将本发明的药剂用作药物时,本发明的蛋白质或其部分肽,编码所述 蛋白质或肽的DNA,插入了所述DNA的载体,本发明的抗体,通过本发明 的筛选分离出的化合物可以直接施用于患者,或者可通过众所周知的药学方 法对它们进行配制。
例如,为了进行配制,可以适当混合药物可接受的载体 或介质,具体地为无菌水,生理盐水,葡萄糖,甘油,乙醇,植物油,乳化 剂,悬浮剂,去污剂,稳定剂等,然后再施用。
本发明的药物组合物可以是 溶液,片剂,胶囊,锭剂,含片,酏剂,悬浮液或糖浆形式。
可以适当决定 活性化合物的含量。
除了动脉内,静脉内或皮下注射外,还可通过本领域技 术人员众所周知的方法进行给药,例如鼻内,经支气管,肌内或口服给药。
可以全身性或局部给药。
剂量可根据患者的体重,年龄,给药方法,症状等 而改变,本领域技术人员可适当选择适当的剂量。
可分一次或几次给药。
另 外,只要化合物是由DNA编码的物质,可通过将DNA整合至基因治疗载体 来进行基因治疗。
给药可在体外或体内进行。
可根据患者的体重,年龄,症 状等改变给药剂量,给药方法,但本领域技术人员可以适当选择给药方法。
                        附图简述 图1显示了在大鼠胰岛瘤衍生的细胞系RINm5F细胞中加入人REG蛋 白(REG Iα)之后,测定BrdU掺入的结果(实施例3)。
图2显示了在RINm5F细胞中加入经[125I]标记的大鼠Reg蛋白(Reg I) 时,测定所述Reg蛋白与细胞的结合的结果(实施例4)。
“Hot”表示仅加入 经标记的大鼠Reg蛋白时的结果,“Hot+100×Cold”表示加入经标记的大 鼠Reg蛋白和100倍量的未经标记的大鼠Reg蛋白的结果。
图3显示了在表达了分离型Reg-结合蛋白的COS-7细胞中加入经[125I] 标记的大鼠Reg蛋白(Reg I)时,测定经[125I]标记的大鼠Reg蛋白(Reg I)与所 述细胞的结合的结果(实施例6)。
“pCI-neo”和“pCI-167.1”分别表示导入 空白载体和Reg-结合蛋白表达载体的细胞的结果。
另外,(-)和(+)分别表示仅 加入经标记的大鼠Reg蛋白,和加入经标记的大鼠Reg蛋白并加入100倍量 的未经标记的大鼠Reg蛋白的结果。
图4显示了大鼠Reg结合蛋白,即Reg受体(rEXTL3)(SEQ ID NO:4), 人EXTL3/EXTR1(hEXTL3)(GenBank登录号为AF001690和AB 007042)(SEQ ID NO:5),人EXT2(hEXT2)(GenBank登录号为U64511)(SEQ ID NO:6),人 EXT1(hEXT1)(GenBank登录号为S79639)(SEQ ID NO:7),人 EXTL1(hEXTL1)(GenBank登录号为U67191)(SEQ ID NO:8)和人 EXTL2(hEXTL2)(GenBank登录号为AF000416)(SEQ ID NO:9)的推测蛋白质 氨基酸序列的比对(实施例7)。
下划线部分为跨膜结构域。
右边的数字对应于 氨基酸残基。
点表示与大鼠Reg-结合蛋白(rEXTL3)相同的残基。
连字号表示 在大鼠Reg-结合蛋白(rEXTL3)中缺乏相应的残基。
图5显示出Reg-结合蛋白的细胞分布。
泳道1,导入对照载体的COS- 7细胞的匀浆液;泳道2-6,导入Reg受体表达载体的COS-7细胞的匀浆液, 膜组分,线粒体组分,微粒体组分和胞质组分(实施例8)。
在每个泳道中电泳 10微克蛋白质,通过使用针对与Reg-结合蛋白结合的HA标记物的抗体进行 Western印迹分析其显示Reg蛋白质在细胞表面表达。
图6显示了人EXTL3/EXTR1的大鼠同系物是细胞表面型Reg-结合蛋白 (实施例9)。
该图显示了存在(+;过量100倍)或缺乏(-)未经标记的大鼠Reg 蛋白时,[125I]Reg蛋白与表达Reg受体的细胞的结合。
“pCIneo”是导入空 白载体的对照,而“pCI.rEXTL3”是在细胞中导入Reg-结合蛋白表达载 体的结果。
结果被表示为4次独立实验的平均值±S.E.M.。
图7显示了Reg受体的功能鉴定。
(A)通过大鼠Reg蛋白使BrdU掺入至 稳定表达Reg受体的CHO细胞中(实施例10)。
检测了两个表达Reg受体的 独立细胞系(RegR-#3和RegR-#22)。
结果被表示为8次独立实验的平均值 ±S.E.M.。
(B)大鼠Reg(圆形)和人REG(方形)与大鼠Reg受体的竞争结合曲 线。
结果被表示为4次独立实验的平均值±S.E.M.。
图8显示了表达Reg受体的β-细胞的增殖和细胞凋亡(实施例11)。
检测 了三个表达Reg受体的独立细胞系(#1,#6和#24)。
RIN是RINm5F对照。
果被表示为4-8次独立实验的平均值±S.E.M.。
(A)通过大鼠Reg蛋白使BrdU 掺入稳定表达Reg受体的RINm5F细胞。
(B)Reg蛋白增加了活细胞对WST- 1的裂解。
(C)通过TUNEL法定量测定Reg蛋白-诱导的RINm5F细胞凋亡。
图9显示了Reg受体mRNA的表达(实施例12)。
进行RNA酶保护试验 以测定Reg受体mRNA的表达。
309个核苷酸的带对应于Reg受体mRNA 受保护的大小。
(A)在β-细胞中表达Reg受体mRNA。
再生胰岛分离自接受 腹膜内注射0.5mg/kg/天烟酰胺达1至3个月,90%的胰腺被切除的大鼠(K. Terazono等,生物化学杂志,263,2111(1988);K.Terazono,T.Watanabe,Y. Yoneyama,胰岛分子生物学,H.Okamoto编(剑桥大学出版社,剑桥,1990), p301-313;K.Terazono等,糖尿病学33,250(1990);Y. Yonemura等,糖尿病 33,401(1984)):泳道1,正常胰岛;泳道2,部分胰腺切除术后1个月的再 生胰岛;泳道3,部分胰腺切除术后2个月的再生胰岛;泳道4,部分胰腺 切除术后3个月的再生胰岛;泳道5,RINm5F细胞;泳道6,ARIP细胞。
泳道P中仅使用探针。
(B)在大鼠组织中表达Reg受体mRNA:泳道1,正 常胰岛;泳道2,整个胰腺;泳道3,肝脏;泳道4,肾脏;泳道5,心脏; 泳道6,脾脏;泳道7,胸腺;泳道8,睾丸;泳道9,肾上腺;泳道10, 胃;泳道11,空肠;泳道12,回肠;泳道13,结肠;泳道14,脑垂体; 泳道15,脑。
图10显示了在稳定表达Reg受体的CHO细胞中,Reg蛋白增加了活 细胞对WST-1的裂解(实施例12)。
使用了两个如图7A所述的独立细胞系。
结果被表示为8次独立实验的平均值±S.E.M.。
             实施本发明的最佳模式 下文将使用实施例具体解释本发明,但本发明并不局限于此。
实施例1构建人REG蛋白(REG Iα)和大鼠Reg蛋白(Reg I)的表达载体 使用接头将人REG IαcDNA的全长蛋白质编码区(Terazono,K等,生物 化学杂志,263,2111-2114(1998))插入毕赤氏酵母表达载体pPIC3.5(Invitrogen) 的酵母醇氧化酶启动子下游的SnaBI/AvrII位点以构建表达载体。
类似地,使 用接头将大鼠Reg I cDNA的全长蛋白质编码区(Terazono,K等,文献同上)插 入pPIC3.5的SnaBI/NotI位点。
使用CsCl法纯化这两种表达载体的DNA, 并将所述DNA导入使用毕赤氏酵母Easy Comp试剂盒(Invitrogen)制备的感受 态细胞(毕赤氏酵母GS115菌株)。
通过已导入表达载体的细胞获得了在不含 组氨酸的培养基中增殖的能力这一事实,即可选择出这些细胞。
在这些细胞 中,选择当加入甲醇时,产生并分泌至培养基中的人REG蛋白或大鼠Reg 蛋白的量达到最大值的克隆。
实施例2制备人REG蛋白(REG Iα)和大鼠Reg蛋白(Reg I) 于28至30℃,在BMGY培养基(1%酵母提取物,2%聚胨,100mM磷 酸钾缓冲液(pH6.0),1.34%Yeast Nitrogen Base,0.00004%生物素,1%甘油) 中将能生产上述人REG蛋白或大鼠Reg蛋白的毕赤氏酵母(巴斯德毕赤氏酵 母)预培养16至18小时。
然后,在BMGY培养基中进行大规模培养直至OD600 为2至5。
离心收集酵母,将其重新悬浮于BMMY培养基(1%酵母提取物, 2%聚胨,100mM磷酸钾缓冲液(pH6.0),1.34% Yeast Nitrogen Base, 0.00004%生物素,0.5%甲醇)中,于28至30℃培养3至4天使OD600达到1 为止。
在培养过程中,以24小时为间隔加入甲醇至终浓度为0.5%。
收集培 养物上清液,加入乙酸而将pH调节为3.5。
将已调节pH的培养基上样于用 50mM醋酸钠(pH3.5)平衡过的STREAMLINE SP(Pharmacia),用50mM醋酸 钠(pH3.5)洗涤之后,再用50mM醋酸钠(pH3.5)/0.5M NaCl洗脱。
使用质谱法 证实所产生的蛋白质是人REG蛋白或大鼠Reg蛋白。
实施例3加入REG蛋白对大鼠胰岛瘤衍生的培养细胞RINm5F细胞的影响 在大鼠胰岛瘤衍生的培养细胞RINm5F细胞(Zenilman,M.E等,胃肠病 学110,1208-1214(1996))中加入REG蛋白,测定5’-溴-2’-脱氧尿苷(BrdU)的 掺入(细胞增殖活性)。
首先,将5×105个细胞/ml的RINm5F细胞以100μl/孔 的量接种于96孔培养板,于37℃培养2天。
然后,将培养基换成100μl/孔 下述培养基。
关于人REG Iα,使用的是实施例2中所述的人REG Iα。
培养基+1%FCS 培养基+1%FCS+人REG Iα(1nM;0.016μg/ml) 培养基+1%FCS+人REG Iα(10nM;0.16μg/ml) 培养基+1%FCS+人REG Iα(100nM;1.6μg/ml) 培养基+1%FCS+人REG Iα(1000nM;16μg/ml) 于37℃将细胞保温24小时,然后加入10μl/孔BrdU标记溶液(用培养基 将10mM BrdU原液稀释至100μM)(终浓度为10μM)。
37℃保温12小时,然 后除去培养基,加入200μl/孔FixDenat(Roche Diagnostics)。
室温下保温15分 钟,除去FixDenat溶液,然后加入100μl/孔抗-BrdU-POD抗体(原液的1/100 稀释溶液,Roche Diagnostics)。
室温下保温60分钟之后,除去抗-BrdU-POD 抗体溶液,然后用200μl/孔洗涤溶液(10x洗涤溶液,Roche Diagnostics)冲洗 3次。
加入100μl/孔底物溶液(Roche Diagnostics),室温下保温直至充分显色。
使用ELISA读数仪测定每个样品在370nm的光吸收值(参照波长:约492nm)。
结果,观察到依赖于REG蛋白浓度的细胞增殖(图1)。
实施例4检测Reg蛋白对RINm5F细胞的结合活性 首先,按下述制备经稀释的[125I]Reg I溶液。
用DMEM将[125I]大鼠Reg I 原液(50ng/μl≈3.33μM,8.6×105cpm/μl)稀释至1nM,333pM,100pM,33pM和 10pM。
另外,按类似方法制备含100倍浓度未经标记的Reg I原液 (460ng/μl≈30.6μM)的稀释溶液。
将3ml 4×105个细胞/ml RINm5F细胞接种于6 孔培养板上,37℃培养2天。
用冰冷的DMEM洗涤,然后加入3ml含有上 述[125I]大鼠Reg I(终浓度:10pM,33pM,100pM,333pM和1nM)的 DMEM。
在竞争抑制实验中,使用了含100倍量未经标记的Reg I的DMEM。
在冰上放置2小时,然后用DMEM将细胞洗涤3次,通过加入0.5至1ml/ 孔[100mM Tris-HCl(pH7.6),1mM EDTA,1%Triton X-100]进行裂解,用γ-计数 器计数[125I]放射性。
结果看出过量的未经标记的Reg蛋白抑制结合,这表明RINm5F细胞的 细胞膜上存在一种特异性结合所必需的分子(图2)。
实施例5鉴定和分离Reg-结合蛋白 使用大鼠胰岛的poly(A)+RNA为模板,用λZAP II载体构建大鼠胰岛表 达cDNA文库。
使用Bolton-Hunter试剂,用[125I]标记实施例2中制备的大鼠 Reg蛋白,通过West-Western法,从表达的cDNA文库中选择并分离与Reg 蛋白结合的噬菌体克隆。
使用得自阳性噬菌体克隆的辅助噬菌体,通过体内切除法将cDNA重组 至质粒载体(pBluescript SK(-),Stratagene)。
通过双脱氧法测定cDNA的核苷酸 序列。
核苷酸序列和预期的氨基酸序列分别示于SEQ ID NO:1和SEQ ID NO:2。
据认为由核苷酸序列估计的蛋白质是细胞膜蛋白质,其跨膜结构域含 有疏水氨基酸簇。
实施例6在COS-7细胞中表达Reg-结合蛋白 将实施例5中分离的cDNA整合至含有巨细胞病毒启动子的哺乳动物细 胞表达载体(pCI-neo)(Promega),以构建Reg-结合蛋白表达载体(pCl-167.1)。
通过电穿孔法将载体导入COS-7细胞并瞬时表达。
导入载体48小时之后, 通过类似于实施例4中所述的方法检测Reg结合活性。
具体地说,首先,使用DMEM将[125I]大鼠Reg I原液(50ng/μl≈3.33μM, 2.7×105cpm/μl)稀释至10nM。
另外,还制备一种稀释液,使该稀释液中加入 的未经标记的Reg I原液(2250ng/μl=150μM)浓度为[125I]Reg I浓度(1μM)的 100倍。
将3ml 2.5×105个细胞/ml经转染的COS细胞接种于6孔培养板上,37 ℃培养2天。
用冰冷的DMEM洗涤,然后加入3ml含有[125I]大鼠Reg I(终浓 度为10nM)的DMEM。
在竞争抑制实验中,同时存在100倍量的未经标记 的Reg I。
在冰上放置2小时,然后用DMEM将细胞洗涤3次,加入1ml/ 孔[100mM Tris-HCl(pH7.6),1mM EDTA,1%Triton X-100]以裂解细胞,用γ- 计数器计数[125I]放射性。
结果,与仅导入载体的细胞相比,在导入cDNA的细胞中,与经[125I] 标记的Reg蛋白的结合显著增加。
另外,通过加入过量未经标记的Reg蛋白 使所述结合消失(图3)。
因此,可以认为由分离的cDNA编码的蛋白质是哺乳 动物细胞膜上与Reg蛋白结合的分子,所述分子可以是对β细胞再生和Reg 蛋白的增殖活性起着重要作用的受体分子。
实施例7筛选大鼠胰岛cDNA文库 为了进一步分离编码Reg-结合蛋白的cDNA,可使用实施例5中所得的 cDNA片段为探针,通过噬斑杂交来筛选大鼠胰岛cDNA文库(5×106个克 隆),得到8个阳性克隆。
这8个克隆彼此高度重叠,并且在重叠区域具有完 全的核苷酸同一性。
所得的编码大鼠Reg-结合蛋白的cDNA序列和由该 cDNA编码的Reg-结合蛋白的氨基酸序列分别示于SEQ ID NO:3和SEQ ID NO:4。
如图4所示,该cDNA具有2760bp的开放阅读框,其编码919个氨基 酸的蛋白质,由该cDNA推定的氨基酸序列推测:该蛋白质是II型跨膜结构 域,所述结构域具有长的胞外结构域(868个氨基酸残基),跨膜结构域(残基 29-51),和位于N-末端的短的胞内区域。
实施例8表达大鼠Reg-结合蛋白 构建实施例7中分离的大鼠Reg蛋白cDNA的表达载体,并在COS-7 细胞中瞬时表达。
将大鼠Reg结合蛋白cDNA与能在N末端编码血凝素(HA) 九肽-标记物(YPYDVPDYA)的寡核苷酸连接,然后插入pCl-neo哺乳动物表 达载体(Promega)。
通过电穿孔将该载体导入COS-7细胞并表达。
保温48小 时之后,收集细胞,匀浆,并按文献所述进行分级分离(S.Takasawa等,生物 化学杂志,268,26052(1983);H.Okamoto等,酶学方法,280,306(1997))。
蛋 白质样品在12.5%(w/v)SDS-聚丙烯酰胺凝胶上电泳,并转移至Immobilon- P(Millipore)。
按S.Takasawa等,生物化学杂志,270,30257(1995);H.Okamoto 等,酶学方法,280,306(1997)所述进行Western印迹分析。
抗HA的单克隆抗 体是抗-HA 3F10(Boehringer)。
免疫印迹分析表明:由所述cDNA编码的蛋白质在细胞膜组分中优势表 达,其表观分子量为105kD(图5A),这与由推定的氨基酸序列计算出的分子 量(104,682)一致。
实施例9大鼠Reg-结合蛋白与Reg蛋白的结合 通过电穿孔将实施例8中构建的大鼠Reg-结合蛋白(也称为 EXTL3/EXTR1)表达载体或对照载体导入COS-7细胞,并瞬时表达。
按上文 所述分离稳定表达Reg受体的CHO细胞。
用RPMI 1640(Roswell Park Memorial institute 1640培养基)洗涤细胞(7.5×105个细胞),在经125I标记的大 鼠Reg蛋白(50ng/ml,1.5×105cpm/ml)的存在下,在冰上将上述细胞与含有多 种浓度未经标记的大鼠Reg或人REG蛋白和1%胎牛血清的RPMI 1640一起 保温2小时。
用RPMI 1640洗涤3次之后,用1ml 100mM Tris-HCl(pH7.6), 1mM EDTA和1% Triton X-100溶解细胞。
通过γ-计数器(Cobra,Packard)测定 裂解物的放射性。
结果,导入大鼠Reg结合蛋白表达载体的COS-7细胞与经 125I标记的大鼠Reg蛋白结合,通过加入未经标记的Reg蛋白可以减少该结 合(图6)。
在DNA和蛋白质数据库中进行同源性检索,结果表明:大鼠Reg结合 蛋白的cDNA(SEQ ID NO:3)及其推定的氨基酸序列(SEQ ID NO:4)与多发性 外生骨疣(EXT)家族基因,尤其是人EXT-样基因3(EXTL3)/EXT-相关基因 1(EXTR1)(W.Van Hui等,基因组学47,230(1998);T.Saito等,生物化学与生 物物理研究通讯,243,61(1998))的相应序列显示出显著的同源性(氨基酸同一 性超过97%),这表明所述cDNA编码人EXTL3/EXTR1的大鼠同系物。
过同源性筛选已分离出身为EXT家族基因成员的EXTL3/EXTR1基因,但尚 未阐明其生理功能和病理学意义。
据认为EXTL3/EXTR1属于EXT家族(W. Van Hui等,基因组学47,230(1998);T.Saito等,生物化学与生物物理研究 通讯,243,61(1998)),因为它与EXT2和EXT1在C-末端区域显示出同源性 (C末端的262个氨基酸与EXT2有52%同源,C末端的247个氨基酸与 EXT1有40%同源)(见图4)。
然而,EXTL3/EXTR1的N-末端区域(残基1- 656)与EXT家族基因的任何其它成员都没有同源性。
另外,EXTL3/EXTR1 的N-末端区域含有跨膜结构域,但该家族的其它成员缺乏该结构域,因此, 不认为它们是细胞表面蛋白质。
另外,起初在筛选大鼠胰岛cDNA表达文库 时作为Reg-结合蛋白被分离的1.6kbp cDNA仅含有N-末端区域(氨基酸残基 1-332)。
因此,可以合理地假定N-末端区域含有Reg结合结构域,且除 EXTL3/EXTR1外的EXT家族成员不能结合Reg蛋白。
实施例10 Reg蛋白对大鼠Reg-结合蛋白(大鼠Reg受体)表达细胞的刺激作用 将实施例8中构建的表达载体导入CHO细胞,建立几个过量表达受体 蛋白质的细胞系,测定细胞对大鼠Reg蛋白刺激作出反应而掺入的5’-溴-2’- 脱氧尿苷(BrdU)。
将具有HA-标记的大鼠受体表达载体导入CHO细胞和RINm5F细胞。
在含有10%胎牛血清(Bio Whittaker,Walersville,Maryland)和250μg/ml新霉 素(Gibco)的Roswell Park Memorial institute 1640培养基(RPMI1640)中将细 胞培养2周[S.Takasawa等,生物化学杂志,273,2497(1998)]。
通过对HA进 行免疫印迹分析,筛选出表达高水平重组蛋白质的稳定转化子,并分离这些 转化子。
在浓度渐增的大鼠Reg蛋白的存在下,在含有1%胎牛血清的 RPMI1640培养基中将表达Reg受体的稳定转化子培养24小时。
在最后的2 小时,在培养基中加入BrdU(10μM),使用比色细胞增殖ELISA试剂盒 (Boehringer)测定BrdU掺入。
当与1-300nM大鼠Reg蛋白保温时,表达EXTL3/EXTR1的细胞系(#3 和#22)中的BrdU掺入显著增加(细胞系#3的EC50=4.01nM,细胞系#22中为 1.11nM,图7A)。
对CHO-细胞系表现出增殖-刺激作用的Reg蛋白浓度与对 大鼠胰岛原代培养物的(T.Watanabe等,Proc.Natl.Acad.Sci.USA 91, 3589(1994))一致,这表明Reg蛋白刺激胰腺β-细胞增殖的作用是由EXTL3/ EXTR1的大鼠同系物介导的。
125I-标记的大鼠Reg蛋白与表达大鼠Reg受体的CHO细胞结合 (Kd=4.41nM),通过增加未经标记的大鼠Reg蛋白的浓度可以置换该结合 (Ki=1.61 nM;图7B)(参照实施例9)。
经估计,大鼠Reg蛋白的Hill系数为 nH=1.18,表明与单个匀质结合位点群的相互作用。
另外,显示出与大鼠Reg 蛋白70%氨基酸同一性的人REG蛋白(K.Terazono等,生物化学杂志,263, 2111(1988);K.Terazono,T.Watanabe,Y.Yonemura,胰岛分子生物学,H. Okamoto编(剑桥大学出版社,剑桥,1990),p301-313)也能与表达上述大鼠 Reg受体的CHO细胞结合(Kα=14.0nM)。
经放射性标记的大鼠Reg蛋白和 CHO细胞的结合虽然也能通过人REG蛋白置换,但置换需要较高的浓度 (Ki=7.41 nM;图7B)。
这些结果强烈地暗示EXTL3/EXTR1是细胞表面Reg 受体,它能与Reg蛋白结合,并能转导Reg蛋白的增殖刺激信号。
实施例11大鼠Reg受体的功能分析 Reg被认为是β-细胞增殖因子(H.Okamoto,分子医学杂志,77,74(1999); T.Watanabe等,Proc.Natl.Acad.Sci.USA 91,3589(1994);D.J.Gross等,内 分泌学139,2369(1998))。
当在大鼠胰岛瘤衍生的β细胞系RINm5F中加入 Reg蛋白时,细胞的BrdU掺入增加(1.5至2倍),这表明它可以以依赖于Reg 蛋白浓度的方式刺激细胞数目的增加。
由于刺激RINm5F细胞增殖的Reg蛋 白浓度与大鼠胰岛原代培养物中的一致,可以认为在这两种细胞中Reg蛋白 通过相同的受体反应。
接着,将实施例8中构建的表达载体导入RINm5F细 胞以建立几个过量表达Reg受体的细胞系,使用这些细胞系检测Reg蛋白的 功能。
当与0.3至300nM的大鼠Reg蛋白保温时,表达受体的细胞系(细胞系 #1,#6和#24)的BrdU掺入(参照实施例10的检测方法)显著增加(图8A)。
在多种浓度大鼠Reg蛋白的存在下,在含有1%胎牛血清的RPMI1640 培养基中将表达Reg受体的稳定转化子保温24小时之后,在培养基中加入 含有WST-1的溶液,再培养30分钟,使用细胞增殖试剂WST-1(Boehringer), 测定活细胞中由线粒体脱氢酶所致的四唑盐4[-3-(4-碘苯基)-2-(4-硝基苯 基)-2H-5-四唑并]-1,3-苯二磺酸盐(WST-1)的裂解。
RINm5F细胞对加入Reg 蛋白(0.3-100nM)作出反应使细胞数目增加,但当将细胞与高浓度的Reg蛋白 保温时,细胞数目减少(图8B)。
为了评价高浓度的Reg蛋白诱导这些细胞凋亡的可能性,在浓度渐增的 大鼠Reg蛋白的存在下,在含有1%胎牛血清的RPMI1640培养基中将表达 Reg受体的稳定转化子保温24小时。
保温之后,使用细胞凋亡筛选试剂盒 (Wako,Osaka,日本),通过TUNEL法(Y.Gavrieli,Y.Sherman,S.A.Ben-Sasson, 细胞生物学杂志,119,493(1992))检测细胞凋亡。
通过对这些细胞进行细胞凋亡检测,揭示出高浓度的Reg蛋白可诱导表 达Reg受体的RINm5F细胞凋亡(图8C)。
这些结果表明Reg受体对Reg蛋白 作出反应,介导胰腺β-细胞的增殖和细胞凋亡,从而维持稳定的β-细胞量。
实施例12 Reg受体mRNA的表达分析 通过RNA酶保护试验在各种大鼠组织和细胞中检测Reg受体mRNA的 表达。
按文献所述制备大鼠再生胰岛(K.Terazono等,生物化学杂志,263, 2111(1988);K.Terazono,T.Watanabe,Y. Yoneyama,胰岛分子生物学,H. Okamoto编(剑桥大学出版社,剑桥,1990),p301-313;Y.Yonemura等,糖尿病 33,401(1984))。
按文献所述从各种大鼠组织和细胞系中分离RNA(T.Koguma 等,Biochem.Biophys.Acta 1223,180(1994);N.Noguchi等,生物化学杂志, 272,3133(1997);H.Okamoto等,酶学方法,280,306(1997))。
将大鼠Reg受体 cDNA的PstI/BglII片断亚克隆至pBluescript SK(-)的PstI/BglII位点,用HindIII 使其线性化,并使用[α-32P]CTP,通过T3 RNA聚合酶进行体外转录。
将所 得的0.45kb cRNA用作探针。
根据厂商说明,使用RPA III试剂盒(Ambion) 进行RNA酶保护试验。
如图9A所示,正常的胰岛,再生的胰岛和RINm5F β-细胞中表达Reg 受体mRNA。
与正常的胰岛相比,再生胰岛中的Reg受体表达未增加,这表 明使β-细胞量增加的胰腺β-细胞再生和增殖主要由Reg蛋白的表达调节,而 不是由受体的表达调节。
这一假说与以下观察结果一致:Reg基因最初被鉴 定为在再生的胰岛中特异性表达的基因(K.Terazono等,生物化学杂志,263, 2111(1988);K.Terazono,T.Watanabe,Y.Yoneyama,胰岛分子生物学,H. Okamoto编(剑桥大学出版社,剑桥,1990),p301-313;K.Terazono等,糖尿病 学33,250(1990)),而且,在瞬时β-细胞增殖期,例如在处于糖尿病缓解期的 BB/Wor/Tky大鼠的胰岛(C.Ishii等,内分泌学杂志,40,269(1993)),处于糖尿 病活跃期的NOD小鼠的胰岛(N.J.Baeza等,糖尿病45,67(1996))和自身免 疫性糖尿病小鼠模型的处于分化和增殖中的胰腺导管细胞(被认为是β-细胞 的祖细胞)(E.Anastasi等,欧洲内分泌学杂志,141,644-52(1999))中,也能观 察到Reg基因表达。
据报道,表达Reg受体的胰腺导管细胞系ARIP细胞(见 图9A,泳道6)也能以依赖于Reg蛋白的方式增殖(M.E.Zenilman等,胃肠病 学110,1208(1996);M.E.Zenilman等,胰腺17,256(1998))。
在肝脏,肾脏, 胃,小肠,结肠,肾上腺,脑垂体和脑中也可检测到Reg受体mRNA的表达, 而在心脏中却检测不到这种表达(图9B),这表明在除胰腺β-细胞以外的多种 细胞类型中,Reg-Reg受体信号系统可能涉及细胞增殖和细胞凋亡的控制机 制。
实际上,表达Reg受体的CHO细胞系对Reg蛋白作出反应而增殖(图 7A)。
另外,CHO细胞数目的增加和减少(参照实施例11的检测方法)依赖于 Reg蛋白的浓度(图10)。
                        工业实用性 本发明提供了Reg-结合蛋白(Reg受体)。
Reg蛋白是胰腺β细胞的细胞 增殖因子,已知它也可在上皮细胞等中发挥细胞增殖活性。
据认为在胰腺β 细胞中,Reg-结合蛋白具有通过与Reg蛋白结合而转导细胞增殖所需信号的 功能,胰腺β细胞通过Reg蛋白与Reg-结合蛋白的结合而再生。
因此,通过 分析Reg-结合蛋白胞外结构域的结构,并寻找与该结构域结合的配体的类似 物,可以开发能诱导胰腺β细胞生理增殖的“抗-糖尿病治疗剂”。
另外,由 于Reg蛋白不会导致胰腺β细胞的过量增殖,据认为不存在由胰岛素过量而 导致低血糖的可能性。
                             序列表 <110>冈本宏(OKAMOTO,Hiroshi) <120>Reg-结合蛋白 <130>OKT-101PCT <140> <141> <150>JP 1999-164488 <151>1999-06-10 <160>9 <170>PatentIn 2.0版 <210>1 <211>1599 <212>DNA <213>大鼠(Rattus norvegicus) <220> <221>CDS <222>(168)..(1259) <400>1 tcagcgagga aaatgaaatt cccattttat ttggtgcctt gtgcagggag cacactgatc 60 cctctagaac cttgtgtgtg aaaaagaggt cgagttttgt caaacagact catggttatg 120 gcaagtgatc cgacgtgacc agagtgggca agagccacag tgaactc atg aca ggc 176                                                 Met Thr Gly                                                   1 tat acc atg ttg cgg aat ggg gga gtg ggg aac ggt ggt cag acc tgt   224 Tyr Thr Met Leu Arg Asn Gly Gly Val Gly Asn Gly Gly Gln Thr Cys   5                  10                  15 atg ctg cgc tgg tcc aac cgc atc cgg ctg acc tgg ctg agt ttc acg   272 Met Leu Arg Trp Ser Asn Arg Ile Arg Leu Thr Trp Leu Ser Phe Thr  20                  25                  30                  35 ctg ttc atc atc ctg gtc ttc ttc ccc ctc att gcc cac tat tac ctc  320 Leu Phe Ile Ile Leu Val Phe Phe Pro Leu Ile Ala His Tyr Tyr Leu              40                  45                  50 acc act ctg gat gag gca gat gag gcc ggc aag cgc atc ttt ggc ccc  368 Thr Thr Leu Asp Glu Ala Asp Glu Ala Gly Lys Arg Ile Phe Gly Pro          55                  60                  65 cgg gct ggc aac gag ctc tgt gag gta aag cac gtc cta gat ctt tgt  416 Arg Ala Gly Asn Glu Leu Cys Glu Val Lys His Val Leu Asp Leu Cys      70                  75                  80 cgg atc cgc gag tct gtg agc gaa gag ctt cta cag cta gaa gcc aag  464 Arg Ile Arg Glu Ser Val Ser Glu Glu Leu Leu Gln Leu Glu Ala Lys  85                  90                  95 cgg cag gag ctg aac agc gag att gcc aag cta aac ctc aag att gaa  512 Arg Gln Glu Leu Asn Ser Glu Ile Ala Lys Leu Asn Leu Lys Ile Glu 100                 105                 110                 115 gcc tgt aag aag agt ata gag aac gcc aag cag gac ctg ctg cag ctc  560 Ala Cys Lys Lys Ser Ile Glu Asn Ala Lys Gln Asp Leu Leu Gln Leu             120                 125                 130 aag aat gtc att agc cag aca gag cac tcc tac aag gag ctg atg gcc  608 Lys Asn Val Ile Ser Gln Thr Glu His Ser Tyr Lys Glu Leu Met Ala         135                 140                 145 cag aac cag ccc aaa ctg tca ctg ccc atc cgg ctg ctc cct gag aag  656 Gln Asn Gln Pro Lys Leu Ser Leu Pro Ile Arg Leu Leu Pro Glu Lys     150                 155                 160 gat gac gct ggc ctt cca ccc ccc aag gtc act cgg ggt tgc cgg cta   704 Asp Asp Ala Gly Leu Pro Pro Pro Lys Val Thr Arg Gly Cys Arg Leu 165                 170                 175 cac aac tgc ttc gat tac tct cgt tgc cct ctg acg tct ggc ttt cct   752 His Asn Cys Phe Asp Tyr Ser Arg Cys Pro Leu Thr Ser Gly Phe Pro 180                 185                 190                 195 gtc ttc gtc tat gac agt gac cag ttt gcc ttt ggg agc tac ctg gac   800 Val Phe Val Tyr Asp Ser Asp Gln Phe Ala Phe Gly Ser Tyr Leu Asp             200                 205                 210 cct ttg gtc aag cag gct ttt cag gct aca gtg aga gcc aac gtt tat   848 Pro Leu Val Lys Gln Ala Phe Gln Ala Thr Val Arg Ala Asn Val Tyr         215                 220                 225 gtt aca gaa aat gca gcc atc gcc tgc ctg tat gtg gtg tta gtg gga   896 Val Thr Glu Asn Ala Ala Ile Ala Cys Leu Tyr Val Val Leu Val Gly     230                 235                 240 gag ata caa gag ccc gct gtg ctg cag cct gcc gac ctt gag aag cag   944 Glu Ile Gln Glu Pro Ala Val Leu Gln Pro Ala Asp Leu Glu Lys Gln 245                 250                 255 ctg cat tct ctg cca cac tgg agg aca gac gga cac aac cat gtc atc   992 Leu His Ser Leu Pro His Trp Arg Thr Asp Gly His Asn His Val Ile 260                 265                 270                 275 atc aat ctg tcc cgg aag tca gac aca caa aat tta ctg tac aat gtc   1040 Ile Asn Leu Ser Arg Lys Ser Asp Thr Gln Asn Leu Leu Tyr Asn Val             280                 285                 290 agt aca ggt cgg gcc atg gtg gcc cag tct acc ttc tat gct gcc cag   1088 Ser Thr Gly Arg Ala Met Val Ala Gln Ser Thr Phe Tyr Ala Ala Gln         295                 300                  305 tac aga gct ggc ttt gac ttg gtt gtg tca cca ctt gtc cat gcc atg   1136 Tyr Arg Ala Gly Phe Asp Leu Val Val Ser Pro Leu Val His Ala Met     310                 315                 320 tct gaa ccc aac ttc atg gaa atc cca cgt gta act att ttt tca ctt   1184 Ser Glu Pro Asn Phe Met Glu Ile Pro Arg Val Thr Ile Phe Ser Leu 325                 330                 335 ggg aga ggt gag gaa gaa caa gag aag ctg ggg gtg tgg aga ggc aga   1232 Gly Arg Gly Glu Glu Glu Gln Glu Lys Leu Gly Val Trp Arg Gly Arg 340                 345                 350                 355 ccc ccc cca ggc tgg ggt gct ggc ccc tagactaggg tgctgacccc 1279 Pro Pro Pro Gly Trp Gly Ala Gly Pro             360 tgggctgggg tgctgcgtgc tacctcccac tgtgaaatcg atggtgctca caattgtctc 1339 ttgtaatgta tgtgattttt ttttaaggag aaaaagaaac tatttaagat tctgaaggtg 1399 ctactatttt tgttgccaca ggctttaaag aaactttctg agtgggtggg gccttgccca 1459 cttatctttc tctcctccaa atgaggagtt aaaaatgtta ctaaattgcc cgcacgtgta 1519 atccgctgaa aagaaaaaaa aaaaagaaaa aaaaaaggaa ggaaagaagg aaagaaggaa 1579 ggaaggaagg aaggaaagga 1599 <210>2 <211>364 <212>PRT <213>大鼠(Rattus norvegicus) <400>2 Met Thr Gly Tyr Thr Met Leu Arg Asn Gly Gly Val Gly Asn Gly Gly   1               5                  10                  15 Gln Thr Cys Met Leu Arg Trp Ser Asn Arg Ile Arg Leu Thr Trp Leu          20                  25                  30 Ser Phe Thr Leu Phe Ile Ile Leu Val Phe Phe Pro Leu Ile Ala His      35                  40                  45 Tyr Tyr Leu Thr Thr Leu Asp Glu Ala Asp Glu Ala Gly Lys Arg Ile  50                  55                  60 Phe Gly Pro Arg Ala Gly Asn Glu Leu Cys Glu Val Lys His Val Leu  65                  70                  75                  80 Asp Leu Cys Arg Ile Arg Glu Ser Val Ser Glu Glu Leu Leu Gln Leu              85                  90                  95 Glu Ala Lys Arg Gln Glu Leu Asn Ser Glu Ile Ala Lys Leu Asn Leu         100                 105                 110 Lys Ile Glu Ala Cys Lys Lys Ser Ile Glu Asn Ala Lys Gln Asp Leu     115                 120                 125 Leu Gln Leu Lys Asn Val Ile Ser Gln Thr Glu His Ser Tyr Lys Glu 130                 135                 140 Leu Met Ala Gln Asn Gln Pro Lys Leu Ser Leu Pro Ile Arg Leu Leu 145                 150                 155                 160 Pro Glu Lys Asp Asp Ala Gly Leu Pro Pro Pro Lys Val Thr Arg Gly             165                 170                 175 Cys Arg Leu His Asn Cys Phe Asp Tyr Ser Arg Cys Pro Leu Thr Ser         180                 185                 190 Gly Phe Pro Val Phe Val Tyr Asp Ser Asp Gln Phe Ala Phe Gly Ser     195                 200                  205 Tyr Leu Asp Pro Leu Val Lys Gln Ala Phe Gln Ala Thr Val Arg Ala 210                 215                 220 Asn Val Tyr Val Thr Glu Asn Ala Ala Ile Ala Cys Leu Tyr Val Val 225                 230                 235                 240 Leu Val Gly Glu Ile Gln Glu Pro Ala Val Leu Gln Pro Ala Asp Leu             245                 250                 255 Glu Lys Gln Leu His Ser Leu Pro His Trp Arg Thr Asp Gly His Asn         260                 265                 270 His Val Ile Ile Asn Leu Ser Arg Lys Ser Asp Thr Gln Asn Leu Leu     275                 280                 285 Tyr Asn Val Ser Thr Gly Arg Ala Met Val Ala Gln Ser Thr Phe Tyr 290                 295                 300 Ala Ala Gln Tyr Arg Ala Gly Phe Asp Leu Val Val Ser Pro Leu Val 305                 310                 315                 320 His Ala Met Ser Glu Pro Asn Phe Met Glu Ile Pro Arg Val Thr Ile             325                 330                 335 Phe Ser Leu Gly Arg Gly Glu Glu Glu Gln Glu Lys Leu Gly Val Trp         340                 345                 350 Arg Gly Arg Pro Pro Pro Gly Trp Gly Ala Gly Pro     355                 360 <210>3 <211>3198 <212>DNA <213>大鼠(Rattus norvegicus) <220> <221>CDS <222>(5)..(2761) <400>3 actc atg aca ggc tat acc atg ttg cgg aat ggg gga gtg ggg aac ggt  49   Met Thr Gly Tyr Thr Met Leu Arg Asn Gly Gly Val Gly Asn Gly     1               5                  10                  15 ggt cag acc tgt atg ctg cgc tgg tcc aac cgc atc cgg ctg acc tgg   97 Gly Gln Thr Cys Met Leu Arg Trp Ser Asn Arg Ile Arg Leu Thr Trp              20                  25                  30 ctg agt ttc acg ctg ttc atc atc ctg gtc ttc ttc ccc ctc att gcc  145 Leu Ser Phe Thr Leu Phe Ile Ile Leu Val Phe Phe Pro Leu Ile Ala          35                  40                  45 cac tat tac ctc acc act ctg gat gag gca gat gag gcc ggc aag cgc  193 His Tyr Tyr Leu Thr Thr Leu Asp Glu Ala Asp Glu Ala Gly Lys Arg      50                 55                   60 atc ttt ggc ccc cgg gct ggc aac gag ctc tgt gag gta aag cac gtc  241 Ile Phe Gly Pro Arg Ala Gly Asn Glu Leu Cys Glu Val Lys His Val  65                  70                  75 cta gat ctt tgt cgg atc cgc gag tct gtg agc gaa gag ctt cta cag  289 Leu Asp Leu Cys Arg Ile Arg Glu Ser Val Ser Glu Glu Leu Leu Gln  80                  85                  90                  95 cta gaa gcc aag cgg cag gag ctg aac agc gag att gcc aag cta aac  337 Leu Glu Ala Lys Arg Gln Glu Leu Asn Ser Glu Ile Ala Lys Leu Asn             100                 105                 110 ctc aag att gaa gcc tgt aag aag agt ata gag aac gcc aag cag gac   385 Leu Lys Ile Glu Ala Cys Lys Lys Ser Ile Glu Asn Ala Lys Gln Asp         115                 120                 125 ctg ctg cag ctc aag aat gtc att agc cag aca gag cac tcc tac aag   433 Leu Leu Gln Leu Lys Asn Val Ile Ser Gln Thr Glu His Ser Tyr Lys     130                 135                 140 gag ctg atg gcc cag aac cag ccc aaa ctg tca ctg ccc atc cgg ctg   481 Glu Leu Met Ala Gln Asn Gln Pro Lys Leu Ser Leu Pro Ile Arg Leu 145                 150                 155 ctc cct gag aag gat gac gct ggc ctt cca ccc ccc aag gtc act cgg   529 Leu Pro Glu Lys Asp Asp Ala Gly Leu Pro Pro Pro Lys Val Thr Arg 160                 165                 170                 175 ggt tgc cgg cta cac aac tgc ttc gat tac tct cgt tgc cct ctg acg   577 Gly Cys Arg Leu His Asn Cys Phe Asp Tyr Ser Arg Cys Pro Leu Thr             180                 185                 190 tct ggc ttt cct gtc ttc gtc tat gac agt gac cag ttt gcc ttt ggg   625 Ser Gly Phe Pro Val Phe Val Tyr Asp Ser Asp Gln Phe Ala Phe Gly         195                 200                 205 agc tac ctg gac cct ttg gtc aag cag gct ttt cag gct aca gtg aga   673 Ser Tyr Leu Asp Pro Leu Val Lys Gln Ala Phe Gln Ala Thr Val Arg     210                 215                 220 gcc aac gtt tat gtt aca gaa aat gca gcc atc gcc tgc ctg tat gtg   721 Ala Asn Val Tyr Val Thr Glu Asn Ala Ala Ile Ala Cys Leu Tyr Val 225                 230                 235 gtg tta gtg gga gag ata caa gag ccc gct gtg ctg cag cct gcc gac   769 Val Leu Val Gly Glu Ile Gln Glu Pro Ala Val Leu Gln Pro Ala Asp 240                 245                 250                 255 ctt gag aag cag ctg cat tct ctg cca cac tgg agg aca gac gga cac   817 Leu Glu Lys Gln Leu His Ser Leu Pro His Trp Arg Thr Asp Gly His             260                 265                 270 aac cat gtc atc atc aat ctg tcc cgg aag tca gac aca caa aat tta   865 Asn His Val Ile Ile Asn Leu Ser Arg Lys Ser Asp Thr Gln Asn Leu         275                 280                 285 ctg tac aat gtc agt aca ggt cgg gcc atg gtg gcc cag tct acc ttc   913 Leu Tyr Asn Val Ser Thr Gly Arg Ala Met Val Ala Gln Ser Thr Phe     290                 295                 300 tat gct gcc cag tac aga gct ggc ttt gac ttg gtt gtg tca cca ctt   961 Tyr Ala Ala Gln Tyr Arg Ala Gly Phe Asp Leu Val Val Ser Pro Leu 305                 310                 315 gtc cat gcc atg tct gaa ccc aac ttc atg gaa atc cca ccg cag gtg   1009 Val His Ala Met Ser Glu Pro Asn Phe Met Glu Ile Pro Pro Gln Val 320                 325                 330                 335 cca gtt aag cgg aaa tat ctc ttc act ttc cag ggt gag aag att gag   1057 Pro Val Lys Arg Lys Tyr Leu Phe Thr Phe Gln Gly Glu Lys Ile Glu            340                  345                 350 tct cta aga tct agc ctt cag gag gcc cgt tcc ttt gag gaa gaa atg   1105 Ser Leu Arg Ser Ser Leu Gln Glu Ala Arg Ser Phe Glu Glu Glu Met         355                 360                 365 gag ggt gac cct ccg gcc gac tat gat gat cga atc att gcc acc ctc   1153 Glu Gly Asp Pro Pro Ala Asp Tyr Asp Asp Arg Ile Ile Ala Thr Leu     370                 375                 380 aag gcc gta cag gac agc aag cta gat cag gtg ctg gta gaa ttt act   1201 Lys Ala Val Gln Asp Ser Lys Leu Asp Gln Val Leu Val Glu Phe Thr 385                 390                 395 tgc aaa aac cag cca aag ccc agt ctg cct act gag tgg gca ctg tgt   1249 Cys Lys Asn Gln Pro Lys Pro Ser Leu Pro Thr Glu Trp Ala Leu Cys 400                 405                 410                 415 ggg gag cgg gag gac cgg cta gag tta ctg aag ctc tcc acc ttc gcc   1297 Gly Glu Arg Glu Asp Arg Leu Glu Leu Leu Lys Leu Ser Thr Phe Ala             420             425                     430 ctc atc atc act ccc ggg gac ccg agc ctg ctt atc tca tct ggc tgt   1345 Leu Ile Ile Thr Pro Gly Asp Pro Ser Leu Leu Ile Ser Ser Gly Cys         435                 440                 445 gca aca cgg ctc ttt gaa gcc ttg gag gtg gga gct gtg cct gtt gtc   1393 Ala Thr Arg Leu Phe Glu Ala Leu Glu Val Gly Ala Val Pro Val Val     450                 455                 460 ctt ggg gag cag gtg cag ctt ccg tac cac gac atg cta caa tgg aat   1441 Leu Gly Glu Gln Val Gln Leu Pro Tyr His Asp Met Leu Gln Trp Asn 465                 470                 475 gag gcc gcc cta gtg gtg ccc aag cct cgt gtt aca gag gtt cac ttc   1489 Glu Ala Ala Leu Val Val Pro Lys Pro Arg Val Thr Glu Val His Phe 480                 485                 490                 495 ctg tta cga agt ctg tca gac agt gat ctg ttg gct atg agg cgg caa   1537 Leu Leu Arg Ser Leu Ser Asp Ser Asp Leu Leu Ala Met Arg Arg Gln             500                 505                 510 ggc cgc ttt ctc tgg gag acc tac ttc tcc acc gct gac agt att ttt   1585 Gly Arg Phe Leu Trp Glu Thr Tyr Phe Ser Thr Ala Asp Ser Ile Phe         515                 520                 525 aat acc gtg ctg gcc atg att agg act cga att cag atc cca gct gct   1633 Asn Thr Val Leu Ala Met Ile Arg Thr Arg Ile Gln Ile Pro Ala Ala     530                 535                 540 ccc atc cgg gaa gag gta gca gct gag atc ccc cat cgt tca ggc aag   1681 Pro Ile Arg Glu Glu Val Ala Ala Glu Ile Pro His Arg Ser Gly Lys 545                 550                 555 gca gct ggt act gac ccc aac atg gct gac aat ggg gac ctg gac ctg   1729 Ala Ala Gly Thr Asp Pro Asn Met Ala Asp Asn Gly Asp Leu Asp Leu 560                 565                 570                 575 ggg ccg gta gag aca gag ccg ccc tat gcc tca cct aaa tac ctc cgt   1777 Gly Pro Val Glu Thr Glu Pro Pro Tyr Ala Ser Pro Lys Tyr Leu Arg             580                 585                 590 aat ttc act ctg act gtc act gac tgt tac cgc agc tgg aac tcc gca   1825 Asn Phe Thr Leu Thr Val Thr Asp Cys Tyr Arg Ser Trp Asn Ser Ala         595                 600                 605 ccc gga cct ttc cat ctt ttt cca cac aca ccc ttt gac cct gtg ctg   1873 Pro Gly Pro Phe His Leu Phe Pro His Thr Pro Phe Asp Pro Val Leu     610                 615                 620 ccc tct gag gcc aaa ttc ctg ggc tca ggg act gga ttt cgg ccc atc   1921 Pro Ser Glu Ala Lys Phe Leu Gly Ser Gly Thr Gly Phe Arg Pro Ile 625                 630                 635 ggt ggt ggg gct ggg ggc tct ggc aag gag ttc cag gca gcg ctt gga   1969 Gly Gly Gly Ala Gly Gly Ser Gly Lys Glu Phe Gln Ala Ala Leu Gly 640                 645                 650                 655 ggc aat gtc cag cgg gag cag ttc aca gtt gtg atg ctg acc tac gag   2017 Gly Asn Val Gln Arg Glu Gln Phe Thr Val Val Met Leu Thr Tyr Glu             660                 665                 670 cgg gag gaa gtg ctc atg aac tcc ctg gag agg ctc aat ggc ctc ccc   2065 Arg Glu Glu Val Leu Met Asn Ser Leu Glu Arg Leu Asn Gly Leu Pro         675                 680                 685 tac ctg aac aag gta gtg gtg gtg tgg aac tct ccc aag ctg ccc tcg   2113 Tyr Leu Asn Lys Val Val Val Val Trp Asn Ser Pro Lys Leu Pro Ser     690                 695                 700 gag gac ctt ttg tgg cca gac att ggt gtc ccc atc atg gtt gtc cgt   2161 Glu Asp Leu Leu Trp Pro Asp Ile Gly Val Pro Ile Met Val Val Arg 705                 710                 715 act gag aag aac agt ttg aac aat cgg ttc ttg ccc tgg aat gag ata   2209 Thr Glu Lys Asn Ser Leu Asn Asn Arg Phe Leu Pro Trp Asn Glu Ile 720                 725                 730                 735 gag aca gag gca ata ttg tcc atc gat gac gat gcc cac ctc cgc cat   2257 Glu Thr Glu Ala Ile Leu Ser Ile Asp Asp Asp Ala His Leu Arg His             740                 745                 750 gat gaa atc atg ttc ggg ttt cgg gtg tgg aga gag gcg cgt gat cgc   2305 Asp Glu Ile Met Phe Gly Phe Arg Val Trp Arg Glu Ala Arg Asp Arg         755                 760                 765 att gtg ggg ttc cct ggc cgg tac cat gcg tgg gac atc cct cac cag   2353 Ile Val Gly Phe Pro Gly Arg Tyr His Ala Trp Asp Ile Pro His Gln     770                 775                 780 tcc tgg ctc tac aac tcc aac tac tcc tgt gag ctg tcc atg gtg ctg   2401 Ser Trp Leu Tyr Asn Ser Asn Tyr Ser Cys Glu Leu Ser Met Val Leu 785                 790                 795 acg ggt gct gcc ttc ttt cac aag tat tac gcc tac ctg tat tct tat   2449 Thr Gly Ala Ala Phe Phe His Lys Tyr Tyr Ala Tyr Leu Tyr Ser Tyr 800                 805                 810                 815 gtg atg ccc cag gcc atc cga gac atg gtg gat gag tat atc aac tgt   2497 Val Met Pro Gln Ala Ile Arg Asp Met Val Asp Glu Tyr Ile Asn Cys             820                 825                 830 gag gat atc gcc atg aac ttc ctt gtc tcc cac atc aca cgg aag ccc   2545 Glu Asp Ile Ala Met Asn Phe Leu Val Ser His Ile Thr Arg Lys Pro         835                 840                 845 ccc atc aag gtg aca tcg agg tgg act ttt cga tgc ccg ggg tgc cct   2593 Pro Ile Lys Val Thr Ser Arg Trp Thr Phe Arg Cys Pro Gly Cys Pro     850                 855                 860 cag gcc ctg tcc cac gat gac tct cac ttt cat gag cgg cac aag tgt   2641 Gln Ala Leu Ser His Asp Asp Ser His Phe His Glu Arg His Lys Cys 865                 870                 875 atc aac ttt ttt gtc aag gtg tac ggc tat atg cct ctc ctg tac aca   2689 Ile Asn Phe Phe Val Lys Val Tyr Gly Tyr Met Pro Leu Leu Tyr Thr 880                 885                 890                 895 cag ttt agg gtg gac tct gtg ctc ttc aag acc cgc ctg ccc cat gac   2737 Gln Phe Arg Val Asp Ser Val Leu Phe Lys Thr Arg Leu Pro His Asp             900                 905                 910 aag acc aag tgc ttc aag ttc atc tagggccttg ccagttctga ggagaagaca 2791 Lys Thr Lys Cys Phe Lys Phe Ile         915 gtgagcagag tgaggggagt cacccccaag gttcccaagg tgttgaaggt ccttggggac 2851 atcgtgggca gggcccaggc cctttgcttg gagaagagca gggagagtag aaagggatgg 2911 ctgtctttat tttgaagtca gccgcactgg gcctggaatc ctggtcagca gactcagggc 2971 accgactaat ggcgaacact gaggactgtt catgagcccg ggacagctgg ttcccggttt 3031 ttaaattcag aacagcattt actatttaaa gagagagttt cacatctgcc atccaaggct 3091 tatttatatg tgcgtatatg tacacacata tgtgtatata catgtatatg cacgcacaca 3151 cacacacaca cacacacaca cacacacaca cacacacagc ggccgcg 3198 <210>4 <211>919 <212>PRT <213>大鼠(Rattus norvegicus) <400>4 Met Thr Gly Tyr Thr Met Leu Arg Asn Gly Gly Val Gly Asn Gly Gly   1               5                  10                  15 Gln Thr Cys Met Leu Arg Trp Ser Asn Arg Ile Arg Leu Thr Trp Leu          20                  25                  30 Ser Phe Thr Leu Phe Ile Ile Leu Val Phe Phe Pro Leu Ile Ala His      35                  40                  45 Tyr Tyr Leu Thr Thr Leu Asp Glu Ala Asp Glu Ala Gly Lys Arg Ile  50                  55                  60 Phe Gly Pro Arg Ala Gly Asn Glu Leu Cys Glu Val Lys His Val Leu  65                  70                  75                  80 Asp Leu Cys Arg Ile Arg Glu Ser Val Ser Glu Glu Leu Leu Gln Leu              85                  90                  95 Glu Ala Lys Arg Gln Glu Leu Asn Ser Glu Ile Ala Lys Leu Asn Leu         100                 105                 110 Lys Ile Glu Ala Cys Lys Lys Ser Ile Glu Asn Ala Lys Gln Asp Leu     115                 120                 125 Leu Gln Leu Lys Asn Val Ile Ser Gln Thr Glu His Ser Tyr Lys Glu 130                 135                 140 Leu Met Ala Gln Asn Gln Pro Lys Leu Ser Leu Pro Ile Arg Leu Leu 145                 150                 155                 160 Pro Glu Lys Asp Asp Ala Gly Leu Pro Pro Pro Lys Val Thr Arg Gly             165                 170                 175 Cys Arg Leu His Asn Cys Phe Asp Tyr Ser Arg Cys Pro Leu Thr Ser         180                 185                 190 Gly Phe Pro Val Phe Val Tyr Asp Ser Asp Gln Phe Ala Phe Gly Ser     195                 200                 205 Tyr Leu Asp Pro Leu Val Lys Gln Ala Phe Gln Ala Thr Val Arg Ala 210                 215                 220 Asn Val Tyr Val Thr Glu Asn Ala Ala Ile Ala Cys Leu Tyr Val Val 225                 230                 235                 240 Leu Val Gly Glu Ile Gln Glu Pro Ala Val Leu Gln Pro Ala Asp Leu             245                 250                 255 Glu Lys Gln Leu His Ser Leu Pro His Trp Arg Thr Asp Gly His Asn         260                 265                 270 His Val Ile Ile Asn Leu Ser Arg Lys Ser Asp Thr Gln Asn Leu Leu     275                 280                 285 Tyr Asn Val Ser Thr Gly Arg Ala Met Val Ala Gln Ser Thr Phe Tyr 290                 295                 300 Ala Ala Gln Tyr Arg Ala Gly Phe Asp Leu Val Val Ser Pro Leu Val 305                 310                 315                 320 His Ala Met Ser Glu Pro Asn Phe Met Glu Ile Pro Pro Gln Val Pro             325                 330                 335 Val Lys Arg Lys Tyr Leu Phe Thr Phe Gln Gly Glu Lys Ile Glu Ser         340                 345                 350 Leu Arg Ser Ser Leu Gln Glu Ala Arg Ser Phe Glu Glu Glu Met Glu     355                 360                 365 Gly Asp Pro Pro Ala Asp Tyr Asp Asp Arg Ile Ile Ala Thr Leu Lys 370                 375                 380 Ala Val Gln Asp Ser Lys Leu Asp Gln Val Leu Val Glu Phe Thr Cys 385                 390                 395                 400 Lys Asn Gln Pro Lys Pro Ser Leu Pro Thr Glu Trp Ala Leu Cys Gly             405                 410                 415 Glu Arg Glu Asp Arg Leu Glu Leu Leu Lys Leu Ser Thr Phe Ala Leu         420                 425                 430 Ile Ile Thr Pro Gly Asp Pro Ser Leu Leu Ile Ser Ser Gly Cys Ala     435                 440                 445 Thr Arg Leu Phe Glu Ala Leu Glu Val Gly Ala Val Pro Val Val Leu 450                 455                 460 Gly Glu Gln Val Gln Leu Pro Tyr His Asp Met Leu Gln Trp Asn Glu 465                 470                 475                 480 Ala Ala Leu Val Val Pro Lys Pro Arg Val Thr Glu Val His Phe Leu             485                 490                 495 Leu Arg Ser Leu Ser Asp Ser Asp Leu Leu Ala Met Arg Arg Gln Gly         500                 505                 510 Arg Phe Leu Trp Glu Thr Tyr Phe Ser Thr Ala Asp Ser Ile Phe Asn     515                 520                 525 Thr Val Leu Ala Met Ile Arg Thr Arg Ile Gln Ile Pro Ala Ala Pro 530                 535                 540 Ile Arg Glu Glu Val Ala Ala Glu Ile Pro His Arg Ser Gly Lys Ala 545                 550                 555                 560 Ala Gly Thr Asp Pro Asn Met Ala Asp Asn Gly Asp Leu Asp Leu Gly             565                 570                 575 Pro Val Glu Thr Glu Pro Pro Tyr Ala Ser Pro Lys Tyr Leu Arg Asn         580                 585                 590 Phe Thr Leu Thr Val Thr Asp Cys Tyr Arg Ser Trp Asn Ser Ala Pro     595                 600                 605 Gly Pro Phe His Leu Phe Pro His Thr Pro Phe Asp Pro Val Leu Pro 610                 615                 620 Ser Glu Ala Lys Phe Leu Gly Ser Gly Thr Gly Phe Arg Pro Ile Gly 625                 630                 635                 640 Gly Gly Ala Gly Gly Ser Gly Lys Glu Phe Gln Ala Ala Leu Gly Gly             645                 650                 655 Asn Val Gln Arg Glu Gln Phe Thr Val Val Met Leu Thr Tyr Glu Arg         660                 665                 670 Glu Glu Val Leu Met Asn Ser Leu Glu Arg Leu Asn Gly Leu Pro Tyr     675                 680                 685 Leu Asn Lys Val Val Val Val Trp Asn Ser Pro Lys Leu Pro Ser Glu 690                 695                 700 Asp Leu Leu Trp Pro Asp Ile Gly Val Pro Ile Met Val Val Arg Thr 705                 710                 715                 720 Glu Lys Asn Ser Leu Asn Asn Arg Phe Leu Pro Trp Asn Glu Ile Glu             725                 730                 735 Thr Glu Ala Ile Leu Ser Ile Asp Asp Asp Ala His Leu Arg His Asp         740                 745                 750 Glu Ile Met Phe Gly Phe Arg Val Trp Arg Glu Ala Arg Asp Arg Ile     755                 760                 765 Val Gly Phe Pro Gly Arg Tyr His Ala Trp Asp Ile Pro His Gln Ser 770                 775                 780 Trp Leu Tyr Asn Ser Asn Tyr Ser Cys Glu Leu Ser Met Val Leu Thr 785                 790                 795                 800 Gly Ala Ala Phe Phe His Lys Tyr Tyr Ala Tyr Leu Tyr Ser Tyr Val             805                 810                 815 Met Pro Gln Ala Ile Arg Asp Met Val Asp Glu Tyr Ile Asn Cys Glu         820                 825                 830 Asp Ile Ala Met Asn Phe Leu Val Ser His Ile Thr Arg Lys Pro Pro     835                 840                 845 Ile Lys Val Thr Ser Arg Trp Thr Phe Arg Cys Pro Gly Cys Pro Gln 850                 855                 860 Ala Leu Ser His Asp Asp Ser His Phe His Glu Arg His Lys Cys Ile 865                 870                 875                 880 Asn Phe Phe Val Lys Val Tyr Gly Tyr Met Pro Leu Leu Tyr Thr Gln             885                 890                 895 Phe Arg Val Asp Ser Val Leu Phe Lys Thr Arg Leu Pro His Asp Lys         900                 905                 910 Thr Lys Cys Phe Lys Phe Ile     915 <210>5 <211>919 <212>PRT <213>人(Homo sapiens) <400>5 Met Thr Gly Tyr Thr Met Leu Arg Asn Gly Gly Ala Gly Asn Gly Gly   1               5                  10                  15 Gln Thr Cys Met Leu Arg Trp Ser Asn Arg Ile Arg Leu Thr Trp Leu          20                  25                  30 Ser Phe Thr Leu Phe Val Ile Leu Val Phe Phe Pro Leu Ile Ala His      35                  40                  45 Tyr Tyr Leu Thr Thr Leu Asp Glu Ala Asp Glu Ala Gly Lys Arg Ile  50                  55                  60 Phe Gly Pro Arg Val Gly Asn Glu Leu Cys Glu Val Lys His Val Leu  65                  70                  75                  80 Asp Leu Cys Arg Ile Arg Glu Ser Val Ser Glu Glu Leu Leu Gln Leu              85                  90                  95 Glu Ala Lys Arg Gln Glu Leu Asn Ser Glu Ile Ala Lys Leu Asn Leu         100                 105                 110 Lys Ile Glu Ala Cys Lys Lys Ser Ile Glu Asn Ala Lys Gln Asp Leu     115                 120                 125 Leu Gln Leu Lys Asn Val Ile Ser Gln Thr Glu His Ser Tyr Lys Glu 130                 135                 140 Leu Met Ala Gln Asn Gln Pro Lys Leu Ser Leu Pro Ile Arg Leu Leu 145                 150                 155                 160 Pro Glu Lys Asp Asp Ala Gly Leu Pro Pro Pro Lys Ala Thr Arg Gly             165                 170                 175 Cys Arg Leu His Asn Cys Phe Asp Tyr Ser Arg Cys Pro Leu Thr Ser         180                 185                 190 Gly Phe Pro Val Tyr Val Tyr Asp Ser Asp Gln Phe Val Phe Gly Ser     195                 200                 205 Tyr Leu Asp Pro Leu Val Lys Gln Ala Phe Gln Ala Thr Ala Arg Ala 210                 215                 220 Asn Val Tyr Val Thr Glu Asn Ala Asp Ile Ala Cys Leu Tyr Val Ile 225                 230                 235                 240 Leu Val Gly Glu Met Gln Glu Pro Val Val Leu Arg Pro Ala Glu Leu             245                 250                 255 Glu Lys Gln Leu Tyr Ser Leu Pro His Trp Arg Thr Asp Gly His Asn         260                 265                 270 His Val Ile Ile Asn Leu Ser Arg Lys Ser Asp Thr Gln Asn Leu Leu     275                 280                 285 Tyr Asn Val Ser Thr Gly Arg Ala Met Val Ala Gln Ser Thr Phe Tyr 290                 295                 300 Thr Val Gln Tyr Arg Pro Gly Phe Asp Leu Val Val Ser Pro Leu Val 305                 310                 315                 320 His Ala Met Ser Glu Pro Asn Phe Met Glu Ile Pro Pro Gln Val Pro             325                 330                 335 Val Lys Arg Lys Tyr Leu Phe Thr Phe Gln Gly Glu Lys Ile Glu Ser         340                 345                 350 Leu Arg Ser Ser Leu Gln Glu Ala Arg Ser Phe Glu Glu Glu Met Glu     355                 360                 365 Gly Asp Pro Pro Ala Asp Tyr Asp Asp Arg Ile Ile Ala Thr Leu Lys 370                 375                 380 Ala Val Gln Asp Ser Lys Leu Asp Gln Val Leu Val Glu Phe Thr Cys 385                 390                 395                 400 Lys Asn Gln Pro Lys Pro Ser Leu Pro Thr Glu Trp Ala Leu Cys Gly             405                 410                 415 Glu Arg Glu Asp Arg Leu Glu Leu Leu Lys Leu Ser Thr Phe Ala Leu         420                 425                 430 I1e Ile Thr Pro Gly Asp Pro Arg Leu Val Ile Ser Ser Gly Cys Ala     435                 440                 445 Thr Arg Leu Phe Glu Ala Leu Glu Val Gly Ala Val Pro Val Val Leu 450                 455                 460 Gly Glu Gln Val Gln Leu Pro Tyr Gln Asp Met Leu Gln Trp Asn Glu 465                 470                 475                 480 Ala Ala Leu Val Val Pro Lys Pro Arg Val Thr Glu Val His Phe Leu             485                 490                 495 Leu Arg Ser Leu Ser Asp Ser Asp Leu Leu Ala Met Arg Arg Gln Gly         500                 505                 510 Arg Phe Leu Trp Glu Thr Tyr Phe Ser Thr Ala Asp Ser Ile Phe Asn     515                 520                 525 Thr Val Leu Ala Met Ile Arg Thr Arg Ile Gln Ile Pro Ala Ala Pro 530                 535                 540 Ile Arg Glu Glu Ala Ala Ala Glu Ile Pro His Arg Ser Gly Lys Ala 545                 550                 555                 560 Ala Gly Thr Asp Pro Asn Met Ala Asp Asn Gly Asp Leu Asp Leu Gly             565                 570                 575 Pro Val Glu Thr Glu Pro Pro Tyr Ala Ser Pro Arg Tyr Leu Arg Asn         580                 585                 590 Phe Thr Leu Thr Val Thr Asp Phe Tyr Arg Ser Trp Asn Cys Ala Pro     595                 600                 605 Gly Pro Phe His Leu Phe Pro His Thr Pro Phe Asp Pro Val Leu Pro 610                 615                 620 Ser Glu Ala Lys Phe Leu Gly Ser Gly Thr Gly Phe Arg Pro Ile Gly 625                 630                 635                 640 Gly Gly Ala Gly Gly Ser Gly Lys Glu Phe Gln Ala Ala Leu Gly Gly             645                 650                 655 Asn Val Pro Arg Glu Gln Phe Thr Val Val Met Leu Thr Tyr Glu Arg         660                 665                 670 Glu Glu Val Leu Met Asn Ser Leu Glu Arg Leu Asn Gly Leu Pro Tyr     675                 680                 685 Leu Asn Lys Val Val Val Val Trp Asn Ser Pro Lys Leu Pro Ser Glu 690                 695                 700 Asp Leu Leu Trp Pro Asp Ile Gly Val Pro Ile Met Val Val Arg Thr 705                 710                 715                 720 Glu Lys Asn Ser Leu Asn Asn Arg Phe Leu Pro Trp Asn Glu Ile Glu             725                 730                 735 Thr Glu Ala Ile Leu Ser Ile Asp Asp Asp Ala His Leu Arg His Asp         740                 745                 750 Glu Ile Met Phe Gly Phe Arg Val Trp Arg Glu Ala Arg Asp Arg Ile     755                 760                 765 Val Gly Phe Pro Gly Arg Tyr His Ala Trp Asp Ile Pro His Gln Ser 770                 775                 780 Trp Leu Tyr Asn Ser Asn Tyr Ser Cys Glu Leu Ser Met Val Leu Thr 785                 790                 795                 800 Gly Ala Ala Phe Phe His Lys Tyr Tyr Ala Tyr Leu Tyr Ser Tyr Val             805                 810                 815 Met Pro Gln Ala Ile Arg Asp Met Val Asp Glu Tyr Ile Asn Cys Glu         820                 825                 830 Asp Ile Ala Met Asn Phe Leu Val Ser His Ile Thr Arg Lys Pro Pro     835                 840                 845 Ile Lys Val Thr Ser Arg Trp Thr Phe Arg Cys Pro Gly Cys Pro Gln 850                 855                 860 Ala Leu Ser His Asp Asp Ser His Phe His Glu Arg His Lys Cys Ile 865                 870                 875                 880 Asn Phe Phe Val Lys Val Tyr Gly Tyr Met Pro Leu Leu Tyr Thr Gln             885                 890                 895 Phe Arg Val Asp Ser Val Leu Phe Lys Thr Arg Leu Pro His Asp Lys         900                 905                 910 Thr Lys Cys Phe Lys Phe Ile     915 <210>6 <211>718 <212>PRT <213>人(Homo sapiens) <400>6 Met Cys Ala Ser Val Lys Tyr Asn Ile Arg Gly Pro Ala Leu Ile Pro   1               5                  10                  15 Arg Met Lys Thr Lys His Arg Ile Tyr Tyr Ile Thr Leu Phe Ser Ile          20                  25                  30 Val Leu Leu Gly Leu Ile Ala Thr Gly Met Phe Gln Phe Trp Pro His      35                  40                  45 Ser Ile Glu Ser Ser Asn Asp Trp Asn Val Glu Lys Arg Ser Ile Arg  50                  55                  60 Asp Val Pro Val Val Arg Leu Pro Ala Asp Ser Pro Ile Pro Glu Arg  65                  70                  75                  80 Gly Asp Leu Ser Cys Arg Met His Thr Cys Phe Asp Val Tyr Arg Cys              85                  90                  95 Gly Phe Asn Pro Lys Asn Lys Ile Lys Val Tyr Ile Tyr Ala Leu Lys         100                 105                 110 Lys Tyr Val Asp Asp Phe Gly Val Ser Val Ser Asn Thr Ile Ser Arg     115                 120                 125 Glu Tyr Asn Glu Leu Leu Met Ala Ile Ser Asp Ser Asp Tyr Tyr Thr 130                 135                 140 Asp Asp Ile Asn Arg Ala Cys Leu Phe Val Pro Ser Ile Asp Val Leu 145                 150                 155                 160 Asn Gln Asn Thr Leu Arg Ile Lys Glu Thr Ala Gln Ala Met Ala Gln             165                 170                 175 Leu Ser Arg Trp Asp Arg Gly Thr Asn His Leu Leu Phe Asn Met Leu         180                 185                 190 Pro Gly Gly Pro Pro Asp Tyr Asn Thr Ala Leu Asp Val Pro Arg Asp     195                 200                 205 Arg Ala Leu Leu Ala Gly Gly Gly Phe Ser Thr Trp Thr Tyr Arg Gln 210                 215                 220 Gly Tyr Asp Val Ser Ile Pro Val Tyr Ser Pro Leu Ser Ala Glu Val 225                 230                 235                 240 Asp Leu Pro Glu Lys Gly Pro Gly Pro Arg Gln Tyr Phe Leu Leu Ser             245                 250                 255 Ser Gln Val Gly Leu His Pro Glu Tyr Arg Glu Asp Leu Glu Ala Leu         260                 265                 270 Gln Val Lys His Gly Glu Ser Val Leu Val Leu Asp Lys Cys Thr Asn     275                 280                 285 Leu Ser Glu Gly Val Leu Ser Val Arg Lys Arg Cys His Lys His Gln 290                 295                 300 Val Phe Asp Tyr Pro Gln Val Leu Gln Glu Ala Thr Phe Cys Val Val 305                 310                 315                 320 Leu Arg Gly Ala Arg Leu Gly Gln Ala Val Leu Ser Asp Val Leu Gln             325                 330                 335 Ala Gly Cys Val Pro Val Val Ile Ala Asp Ser Tyr Ile Leu Pro Phe         340                 345                 350 Ser Glu Val Leu Asp Trp Lys Arg Ala Ser Val Val Val Pro Glu Glu     355                 360                 365 Lys Met Ser Asp Val Tyr Ser Ile Leu Gln Ser Ile Pro Gln Arg Gln 370                 375                 380 Ile Glu Glu Met Gln Arg Gln Ala Arg Trp Phe Trp Glu Ala Tyr Phe 385                 390                 395                 400 Gln Ser Ile Lys Ala Ile Ala Leu Ala Thr Leu Gln Ile Ile Asn Asp             405                 410                 415 Arg Ile Tyr Pro Tyr Ala Ala Ile Ser Tyr Glu Glu Trp Asn Asp Pro         420                 425                 430 Pro Ala Val Lys Trp Gly Ser Val Ser Asn Pro Leu Phe Leu Pro Leu     435                 440                 445 Ile Pro Pro Gln Ser Gln Gly Phe Thr Ala Ile Val Leu Thr Tyr Asp 450                 455                 460 Arg Val Glu Ser Leu Phe Arg Val Ile Thr Glu Val Ser Lys Val Pro 465                 470                 475                 480 Ser Leu Ser Lys Leu Leu Val Val Trp Asn Asn Gln Asn Lys Asn Pro             485                 490                 495 Pro Glu Asp Ser Leu Trp Pro Lys Ile Arg Val Pro Leu Lys Val Val         500                 505                 510 Arg Thr Ala Glu Asn Lys Leu Ser Asn Arg Phe Phe Pro Tyr Asp Glu     515                 520                 525 Ile Glu Thr Glu Ala Val Leu Ala Ile Asp Asp Asp Ile Ile Met Leu 530                 535                 540 Thr Ser Asp Glu Leu Gln Phe Gly Tyr Glu Val Trp Arg Glu Phe Pro 545                 550                 555                 560 Asp Arg Leu Val Gly Tyr Pro Gly Arg Leu His Leu Trp Asp His Glu             565                 570                 575 Met Asn Lys Trp Lys Tyr Glu Ser Glu Trp Thr Asn Glu Val Ser Met         580                 585                 590 Val Leu Thr Gly Ala Ala Phe Tyr His Lys Tyr Phe Asn Tyr Leu Tyr     595                 600                 605 Thr Tyr Lys Met Pro Gly Asp Ile Lys Asn Trp Val Asp Ala His Met 610                 615                 620 Asn Cys Glu Asp Ile Ala Met Asn Phe Leu Val Ala Asn Val Thr Gly 625                 630                 635                 640 Lys Ala Val Ile Lys Val Thr Pro Arg Lys Lys Phe Lys Cys Pro Glu             645                 650                 655 Cys Thr Ala Ile Asp Gly Leu Ser Leu Asp Gln Thr His Met Val Glu         660                 665                 670 Arg Ser Glu Cys Ile Asn Lys Phe Ala Ser Val Phe Gly Thr Met Pro     675                 680                 685 Leu Lys Val Val Glu His Arg Ala Asp Pro Val Leu Tyr Lys Asp Asp 690                 695                 700 Phe Pro Glu Lys Leu Lys Ser Phe Pro Asn Ile Gly Ser Leu 705                 710                 715 <210>7 <211>746 <212>PRT <213>人(Homo sapiens) <400>7 Met Gln Ala Lys Lys Arg Tyr Phe Ile Leu Leu Ser Ala Gly Ser Cys   1               5                  10                 15 Leu Ala Leu Leu Phe Tyr Phe Gly Gly Leu Gln Phe Arg Ala Ser Arg          20                  25                  30 Ser His Ser Arg Arg Glu Glu His Ser Gly Arg Asn Gly Leu His His      35                  40                  45 Pro Ser Pro Asp His Phe Trp Pro Arg Phe Pro Glu Pro Leu Arg Pro  50                  55                  60 Phe Val Pro Trp Asp Gln Leu Glu Asn Glu Asp Ser Ser Val His Ile  65                  70                  75                  80 Ser Pro Arg Gln Lys Arg Asp Ala Asn Ser Ser Ile Tyr Lys Gly Lys              85                  90                  95 Lys Cys Arg Met Glu Ser Cys Phe Asp Phe Thr Leu Cys Lys Lys Asn         100                 105                 110 Gly Phe Lys Val Tyr Val Tyr Pro Gln Gln Lys Gly Glu Lys Ile Ala     115                 120                 125 Glu Ser Tyr Gln Asn Ile Leu Ala Ala Ile Glu Gly Ser Arg Phe Tyr 130                 135                 140 Thr Ser Asp Pro Ser Gln Ala Cys Leu Phe Val Leu Ser Leu Asp Thr 145                 150                 155                 160 Leu Asp Arg Asp Gln Leu Ser Pro Gln Tyr Val His Asn Leu Arg Ser             165                 170                 175 Lys Val Gln Ser Leu His Leu Trp Asn Asn Gly Arg Asn His Leu Ile         180                 185                 190 Phe Asn Leu Tyr Ser Gly Thr Trp Pro Asp Tyr Thr Glu Asp Val Gly     195                 200                 205 Phe Asp Ile Gly Gln Ala Met Leu Ala Lys Ala Ser Ile Ser Thr Glu 210                 215                 220 Asn Phe Arg Pro Asn Phe Asp Val Ser Ile Pro Leu Phe Ser Lys Asp 225                 230                 235                 240 His Pro Arg Thr Gly Gly Glu Arg Gly Phe Leu Lys Phe Asn Thr Ile             245                 250                 255 Pro Pro Leu Arg Lys Tyr Met Leu Val Phe Lys Gly Lys Arg Tyr Leu         260                 265                 270 Thr Gly Ile Gly Ser Asp Thr Arg Asn Ala Leu Tyr His Val His Asn     275                 280                 285 Gly Glu Asp Val Val Leu Leu Thr Thr Cys Lys His Gly Lys Asp Trp 290                 295                 300 Gln Lys His Lys Asp Ser Arg Cys Asp Arg Asp Asn Thr Glu Tyr Glu 305                 310                 315                 320 Lys Tyr Asp Tyr Arg Glu Met Leu His Asn Ala Thr Phe Cys Leu Val             325                 330                 335 Pro Arg Gly Arg Arg Leu Gly Ser Phe Arg Phe Leu Glu Ala Leu Gln         340                 345                 350 Ala Ala Cys Val Pro Val Met Leu Ser Asn Gly Trp Glu Leu Pro Phe     355                 360                 365 Ser Glu Val Ile Asn Trp Asn Gln Ala Ala Val Ile Gly Asp Glu Arg 370                 375                 380 Leu Leu Leu Gln Ile Pro Ser Thr Ile Arg Ser Ile His Gln Asp Lys 385                 390                 395                 400 Ile Leu Ala Leu Arg Gln Gln Thr Gln Phe Leu Trp Glu Ala Tyr Phe             405                 410                 415 Ser Ser Val Glu Lys Ile Val Leu Thr Thr Leu Glu Ile Ile Gln Asp         420                 425                 430 Arg Ile Phe Lys His Ile Ser Arg Asn Ser Leu Ile Trp Asn Lys His     435                 440                 445 Pro Gly Gly Leu Phe Val Leu Pro Gln Tyr Ser Ser Tyr Leu Gly Asp 450                 455                 460 Phe Pro Tyr Tyr Tyr Ala Asn Leu Gly Leu Lys Pro Pro Ser Lys Phe 465                 470                 475                 480 Thr Ala Val Ile His Ala Val Thr Pro Leu Val Ser Gln Ser Gln Pro             485                 490                 495 Val Leu Lys Leu Leu Val Ala Ala Ala Lys Ser Gln Tyr Cys Ala Gln         500                 505                 510 Ile Ile Val Leu Trp Asn Cys Asp Lys Pro Leu Pro Ala Lys His Arg     515                 520                 525 Trp Pro Ala Thr Ala Val Pro Val Val Val Ile Glu Gly Glu Ser Lys 530                 535                 540 Val Met Ser Ser Arg Phe Leu Pro Tyr Asp Asn Ile Ile Thr Asp Ala 545                 550                 555                 560 Val Leu Ser Leu Asp Glu Asp Thr Val Leu Ser Thr Thr Glu Val Asp             565                 570                 575 Phe Ala Phe Thr Val Trp Gln Ser Phe Pro Glu Arg Ile Val Gly Tyr         580                 585                 590 Pro Ala Arg Ser His Phe Trp Asp Asn Ser Lys Glu Arg Trp Gly Tyr     595                 600                 605 Thr Ser Lys Trp Thr Asn Asp Tyr Ser Met Val Leu Thr Gly Ala Ala 610                 615                 620 Ile Tyr His Lys Tyr Tyr His Tyr Leu Tyr Ser His Tyr Leu Pro Ala 625                 630                 635                 640 Ser Leu Lys Asn Met Val Asp Gln Leu Ala Asn Cys Glu Asp Ile Leu             645                 650                 655 Met Asn Phe Leu Val Ser Ala Val Thr Lys Leu Pro Pro Ile Lys Val         660                 665                 670 Thr Gln Lys Lys Gln Tyr Lys Glu Thr Met Met Gly Gln Thr Ser Arg     675                 680                 685 Ala Ser Arg Trp Ala Asp Pro Asp His Phe Ala Gln Arg Gln Ser Cys 690                 695                 700 Met Asn Thr Phe Ala Ser Trp Phe Gly Tyr Met Pro Leu Ile His Ser 705                 710                 715                 720 Gln Met Arg Leu Asp Pro Val Leu Phe Lys Asp Gln Val Ser Ile Leu             725                 730                 735 Arg Lys Lys Tyr Arg Asp Ile Glu Arg Leu         740                 745 <210>8 <211>676 <212>PRT <213>人(Homo sapiens) <400>8 Met Gln Ser Trp Arg Arg Arg Lys Ser Leu Trp Leu Ala Leu Ser Ala   1               5                  10                  15 Ser Trp Leu Leu Leu Val Leu Leu Gly Gly Phe Ser Leu Leu Arg Leu          20                  25                  30 Ala Leu Pro Pro Arg Pro Arg Pro Gly Ala Ser Gln Gly Trp Pro Arg      35                  40                  45 Trp Leu Asp Ala Glu Leu Leu Gln Ser Phe Ser Gln Pro Gly Glu Leu  50                  55                  60 Pro Glu Asp Ala Val Ser Pro Pro Gln Ala Pro His Gly Gly Ser Cys  65                  70                  75                  80 Asn Trp Glu Ser Cys Phe Asp Thr Ser Lys Cys Arg Gly Asp Gly Leu              85                  90                  95 Lys Val Phe Val Tyr Pro Ala Val Gly Thr Ile Ser Glu Thr His Arg         100                 105                 110 Arg Ile Leu Ala Ser Ile Glu Gly Ser Arg Phe Tyr Thr Phe Ser Pro     115                 120                 125 Ala Gly Ala Cys Leu Leu Leu Leu Leu Ser Leu Asp Ala Gln Thr Gly 130                 135                 140 Glu Cys Ser Ser Met Pro Leu Gln Trp Asn Arg Gly Arg Asn His Leu 145                 150                 155                 160 Val Leu Arg Leu His Pro Ala Pro Cys Pro Arg Thr Phe Gln Leu Gly             165                 170                 175 Gln Ala Met Val Ala Glu Ala Ser Pro Thr Val Asp Ser Phe Arg Pro         180                 185                 190 Gly Phe Asp Val Ala Leu Pro Phe Leu Pro Glu Ala His Pro Leu Arg     195                 200                 205 Gly Gly Ala Pro Gly Gln Leu Arg Gln His Ser Pro Gln Pro Gly Val 210                 215                 220 Ala Leu Leu Ala Leu Glu Glu Glu Arg Gly Gly Trp Arg Thr Ala Asp 225                 230                 235                 240 Thr Gly Ser Ser Ala Cys Pro Trp Asp Gly Arg Cys Glu Gln Asp Pro             245                 250                 255 Gly Pro Gly Gln Thr Gln Arg Gln Glu Thr Leu Pro Asn Ala Thr Phe         260                 265                 270 Cys Leu Ile Ser Gly His Arg Pro Glu Ala Ala Ser Arg Phe Leu Gln     275                 280                 285 Ala Leu Gln Ala Gly Cys Ile Pro Val Leu Leu Ser Pro Arg Trp Glu 290                 295                 300 Leu Pro Phe Ser Glu Val Ile Asp Trp Thr Lys Ala Ala Ile Val Ala 305                 310                 315                 320 Asp Glu Arg Leu Pro Leu Gln Val Leu Ala Ala Leu Gln Glu Met Ser             325                 330                 335 Pro Ala Arg Val Leu Ala Leu Arg Gln Gln Thr Gln Phe Leu Trp Asp         340                 345                 350 Ala Tyr Phe Ser Ser Val Glu Lys Val Ile His Thr Thr Leu Glu Val     355                 360                 365 Ile Gln Asp Arg Ile Phe Gly Thr Ser Ala Asn Pro Ser Leu Leu Trp 370                 375                 380 Asn Ser Pro Pro Gly Ala Leu Leu Ala Leu Ser Thr Phe Ser Thr Ser 385                 390                 395                 400 Pro Gln Asp Phe Pro Phe Tyr Tyr Leu Gln Gln Gly Ser Arg Pro Glu             405                 410                 415 Gly Arg Phe Ser Ala Leu Ile Trp Val Gly Pro Pro Gly Gln Pro Pro         420                 425                 430 Leu Lys Leu Ile Gln Ala Val Ala Gly Ser Gln His Cys Ala Gln Ile     435                 440                 445 Leu Val Leu Trp Ser Asn Glu Arg Pro Leu Pro Ser Arg Trp Pro Glu 450                 455                 460 Thr Ala Val Pro Leu Thr Val Ile Asp Gly His Arg Lys Val Ser Asp 465                 470                 475                 480 Arg Phe Tyr Pro Tyr Ser Thr Ile Arg Thr Asp Ala Ile Leu Ser Leu             485                 490                 495 Asp Ala Arg Ser Ser Leu Ser Thr Ser Glu Val Asp Phe Ala Phe Leu         500                 505                 510 Val Trp Gln Ser Phe Pro Glu Arg Met Val Gly Phe Leu Thr Ser Ser     515                 520                 525 His Phe Trp Asp Glu Ala His Gly Gly Trp Gly Tyr Thr Ala Glu Arg 530                 535                 540 Thr Asn Glu Phe Ser Met Val Leu Thr Thr Ala Ala Phe Tyr His Arg 545                 550                 555                 560 Tyr Tyr His Thr Leu Phe Thr His Ser Leu Pro Lys Ala Leu Arg Thr             565                 570                 575 Leu Ala Asp Glu Ala Pro Thr Cys Val Asp Val Leu Met Asn Phe Ile         580                 585                 590 Val Ala Ala Val Thr Lys Leu Pro Pro Ile Lys Val Pro Tyr Gly Lys     595                 600                 605 Gln Arg Gln Glu Ala Ala Pro Leu Ala Pro Gly Gly Pro Gly Pro Arg 610                 615                 620 Pro Lys Pro Pro Ala Pro Ala Pro Asp Cys Ile Asn Gln Ile Ala Ala 625                 630                 635                 640 Ala Phe Gly His Met Pro Leu Leu Ser Ser Arg Leu Arg Leu Asp Pro             645                 650                 655 Val Leu Phe Lys Asp Pro Val Ser Val Gln Arg Lys Lys Tyr Arg Ser         660                 665                 670 Leu Glu Lys Pro     675 <210>9 <211>330 <212>PRT <213>人(Homo sapiens) <400>9 Met Arg Cys Cys His Ile Cys Lys Leu Pro Gly Arg Val Met Gly Ile   1               5                  10                  15 Arg Val Leu Arg Leu Ser Leu Val Val Ile Leu Val Leu Leu Leu Val          20                  25                  30 Ala Gly Ala Leu Thr Ala Leu Leu Pro Ser Val Lys Glu Asp Lys Met      35                  40                  45 Leu Met Leu Arg Arg Glu Ile Lys Ser Gln Gly Lys Ser Thr Met Asp  50                  55                  60 Ser Phe Thr Leu Ile Met Gln Thr Tyr Asn Arg Thr Asp Leu Leu Leu  65                  70                  75                  80 Lys Leu Leu Asn His Tyr Gln Ala Val Pro Asn Leu His Lys Val Ile              85                  90                  95 Val Val Trp Asn Asn Ile Gly Glu Lys Ala Pro Asp Glu Leu Trp Asn         100                 105                 110 Ser Leu Gly Pro His Pro Ile Pro Val Ile Phe Lys Gln Gln Thr Ala     115                 120                 125 Asn Arg Met Arg Asn Arg Leu Gln Val Phe Pro Glu Leu Glu Thr Asn 130                 135                 140 Ala Val Leu Met Val Asp Asp Asp Thr Leu Ile Ser Thr Pro Asp Leu 145                 150                 155                 160 Val Phe Ala Phe Ser Val Trp Gln Gln Phe Pro Asp Gln Ile Val GIy             165                 170                 175 Phe Val Pro Arg Lys His Val Ser Thr Ser Ser Gly Ile Tyr Ser Tyr         180                 185                 190 Gly Ser Phe Glu Met Gln Ala Pro Gly Ser Gly Asn Gly Asp Gln Tyr     195                 200                 205 Ser Met Val Leu Ile Gly Ala Ser Phe Phe Asn Ser Lys Tyr Leu Glu 210                 215                 220 Leu Phe Gln Arg Gln Pro Ala Ala Val His Ala Leu Ile Asp Asp Thr 225                 230                 235                 240 Gln Asn Cys Asp Asp Ile Ala Met Asn Phe Ile Ile Ala Lys His Ile             245                 250                 255 Gly Lys Thr Ser Gly Ile Phe Val Lys Pro Val Asn Met Asp Asn Leu         260                 265                 270 Glu Lys Glu Thr Asn Ser Gly Tyr Ser Gly Met Trp His Arg Ala Glu     275                 280                 285 His Ala Leu Gln Arg Ser Tyr Cys Ile Asn Lys Leu Val Asn Ile Tyr 290                 295                 300 Asp Ser Met Pro Leu Arg Tyr Ser Asn Ile Met Ile Ser Gln Phe Gly 305                 310                 315                 320 Phe Pro Tyr Ala Asn Tyr Lys Arg Lys Ile             325                 330 展开

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