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NOD1在制备抑制肿瘤SRC信号通路的产品中的应用

基本信息

  • 申请号 CN201811377171.0 
  • 公开号 CN109453384A 
  • 申请日 2018/11/19 
  • 公开日 2019/03/12 
  • 申请人 山东大学  
  • 优先权日期  
  • 发明人 韩丽辉 马小敏 邱驭旻 朱礼慧 李涛 赵云雪 林月轲 马大鹏 秦振志 孙偲瑜 沈雪城  
  • 主分类号 A61K45/00 
  • 申请人地址 250012 山东省济南市文化西路44号 
  • 分类号 A61K45/00;A61K31/7088;A61P35/00;A61P1/16 
  • 专利代理机构 济南圣达知识产权代理有限公司 37221 
  • 当前专利状态 发明专利申请公布 
  • 代理人 王志坤 
  • 有效性 审查中-实审 
  • 法律状态 审查中-实审
  •  

摘要

本发明属于生物医药领域,具体涉及NOD1在制备抑制MAPK信号通路的产品中的应用。
所述产品的功能为如下A1)至A7)中的至少一种:A1)与SRC结合;A2)抑制p‑SRC表达;A3)抑制MAPK信号通路;A4)抑制p‑ERK表达;A5)抑制p‑CyclinD表达;A6)抑制p‑CyclinE表达;A7)促进p21表达。
本发明首次发现NOD1通过靶向结合SRC,抑制p‑SRC,进一步抑制MAPK信号通路;这一发现为筛选治疗与MAPK信号通路异常有关疾病的药物提供了新的靶点。
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权利要求书


1.NOD1在制备产品中的应用;所述产品的功能为如下A1)至A7)中的至少一种:A1)与SRC结合;A2)抑制p-SRC表达;A3)抑制MAPK信号通路;A4)抑制p-ERK表达;A5)抑制p-CyclinD表达;A6)抑制p-CyclinE表达;A7)促进p21表达。
2.根据权利要求1所述的应用,其特征在于,所述A1)中,所述“与SRC结合”为与细胞中SRC结合;所述细胞为肝癌细胞;所述A2)中,所述“抑制p-SRC表达”为抑制细胞中p-SRC表达;所述细胞为肝癌细胞;所述A3)中,所述“抑制MAPK信号通路”为抑制细胞中MAPK信号通路;所述细胞为肝癌细胞;所述A4)中,所述“抑制p-ERK表达”为抑制细胞中p-ERK表达;所述细胞为肝癌细胞;所述A5)中,所述“抑制p-CyclinD表达”为抑制细胞中p-CyclinD表达;所述细胞为肝癌细胞;所述A6)中,所述“抑制p-CyclinE表达”为抑制细胞中p-CyclinE表达;所述细胞为肝癌细胞;所述A7)中所述“促进p21表达”为促进细胞中p21表达;所述细胞为肝癌细胞。
3.抑制NOD1表达量和/或蛋白活性的物质在制备产品中的应用;所述产品的功能为B1)至B7)中的至少一种:B1)抑制与SRC结合;B2)促进p-SRC表达;B3)激活MAPK信号通路;B4)促进p-ERK;B5)促进p-CyclinD;B6)促进p-CyclinE;B7)抑制p21表达。
4.根据权利要求3所述的应用,其特征在于,所述B1)中,所述“抑制与SRC结合”为抑制与细胞中SRC结合;所述细胞为肝癌细胞;所述B2)中,所述“促进p-SRC表达”为促进细胞中p-SRC表达;所述细胞为肝癌细胞;所述B3)中,所述“激活MAPK信号通路”为激活细胞中MAPK信号通路;所述细胞为肝癌细胞;所述B4)中,所述“促进p-ERK表达”为促进细胞中p-ERK表达;所述细胞为肝癌细胞;所述B5)中,所述“促进p-CyclinD表达”为促进细胞中p-CyclinD表达;所述细胞为肝癌细胞;所述B6)中,所述“促进p-CyclinE表达”为促进细胞中p-CyclinE表达;所述细胞为肝癌细胞;所述B7)中所述“抑制p21表达”为抑制细胞中p21表达;所述细胞为肝癌细胞。
5.根据权利要求3所述的应用,其特征在于,所述抑制NOD1表达量和/或蛋白活性的物质可为c1)或c2):c1)寡聚核苷酸siRNA1;所述寡聚核苷酸siRNA如SEQ ID NO.2、SEQ ID NO.3所示;c2)以所述寡聚核苷酸siRNA1为靶点,由shRNA表达系统合成的shRNA。
6.权利要求2或4所述的应用,其特征在于,所述肝癌细胞可为肝癌细胞系BEL7402、肝癌细胞系SMMC7721、肝癌细胞系HepG2或肝癌细胞系HUH7。
7.一种产品,其特征在于,所述产品含有NOD1;所述产品的功能如下A1)至A7)中的至少一种:A1)与细胞SRC结合;A2)抑制细胞p-SRC表达;A3)抑制MAPK信号通路;A4)抑制细胞p-ERK;A5)抑制细胞p-CyclinD;A6)抑制细胞p-CyclinE;A7)促进细胞p21表达。
8.一种产品,其特征在于,所述产品含有抑制NOD1表达量和/或蛋白活性的物质;所述产品的功能为B1)至B7)中的至少一种:B1)抑制与细胞SRC结合;B2)促进细胞p-SRC表达;B3)激活MAPK信号通路;B4)促进细胞p-ERK;B5)促进细胞p-CyclinD;B6)促进细胞p-CyclinE;B7)抑制细胞p21表达。
9.增加NOD1表达量的物质在制备治疗肝癌药物中的应用。
10.根据权利要求9所述的应用,其特征在于,通过增加NOD1表达量,抑制p-SRC的活化从而抑制MAPK信号通路的活化,进而抑制肝癌细胞。
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说明书

技术领域
本发明属于生物医药领域,具体涉及NOD1在制备抑制肿瘤SRC信号通路的产品中的应用。
背景技术
肝细胞肝癌(Hepatocellular carcinoma,HCC)是世界范围内第五大常见癌症,其致死率居第三位,全球每年约70万人死于肝细胞肝癌。
我国作为HCC大国,占世界肝癌患者40%左右,HCC是我国第2位致死性肿瘤。
目前针对HCC的治疗主要是以手术切除肿瘤病灶为主,尽管手术延长了部分病人的寿命,但是肝细胞肝癌仍呈现较高的术后复发率和转移率,同时伴有预后不良。
肝癌转移的复发率较高是造成HCC高死亡率的主要原因。
目前,临床对肝癌复发转移采取的主要措施包括栓塞化疗和生物化疗等,但效果不佳。
治疗HCC的关键在于明确其发病和复发转移的分子机制,以此制定有效的治疗方案。
随着分子生物学技术的发展,分子靶向治疗被认为是控制肿瘤的有效措施。
因此,深入研究和阐明肝细胞肝癌发病的分子机制将为探索新的HCC治疗策略奠定基础,并为肝癌的分子靶向治疗提供新的靶点。
目前,已有诸多文献报道许多分子参与肝细胞肝癌的演进过程,其中包括部分固有免疫分子,如TIPE2分子抑制HCC的生长和转移,IL-17可以促进HCC的恶性进展等。
NOD1(Nucleotide-binding oligomerization domain-containing protein 1,NOD1)是固有免疫系统的重要分子,而近期的研究显示NOD1也参与调控肿瘤的发生与进展,然而NOD1对肝癌的作用效应尚不明确。
NOD1作为细胞内的NLR(NOD like receptor)家族的模式识别受体,是哺乳动物天然免疫识别系统的重要组成部分。
它主要通过识别细菌菌体成分,在机体的抗感染免疫中发挥重要作用。
NOD1广泛表达于多种细胞类型包括上皮细胞、基质细胞以及内皮细胞等。
肠道内皮细胞NOD1活化分子模式的激活可以诱导体内驱化因子的产生以及炎性介质的释放。
NOD1可以诱发由多种革兰氏阴性菌包括福氏志贺菌及幽门螺旋杆菌导致的肠道内皮细胞的炎性反应。
此外,NOD1在感知肠道入侵的大肠杆菌、绿脓杆菌、弯曲杆菌、巴斯德杆菌NI1060以及其他革兰氏阳性菌中也发挥重要的作用。
新近研究显示,NOD1具有多种生物学功能,可参与调控自噬、凋亡、增殖、炎症反应等多种生物学过程,并参与了结肠炎、移植排斥反应、肝损伤、冠心病等多种疾病的发生过程。
NOD1在肿瘤中的作用近年来逐渐引起关注,而现有的研究主要集中于NOD1的基因多态性与恶性肿瘤的发生之间的关系。
而对于NOD1在肿瘤治疗中的应用,却鲜有报道。
发明内容
针对以上所述问题,本发明提供NOD1在制备抑制肿瘤SRC信号通路的产品中的应用。
本发明采用以下技术方案:本发明第一个方面,提供NOD1在制备产品中的应用;所述产品的功能为如下A1)至A7)中的至少一种:A1)与SRC结合;A2)抑制p-SRC表达;A3)抑制MAPK信号通路;A4)抑制p-ERK表达;A5)抑制p-CyclinD表达;A6)抑制p-CyclinE表达;A7)促进p21表达。
进一步的,所述A1)中,所述“与SRC结合”为与细胞中SRC结合;所述细胞为肝癌细胞;所述A2)中,所述“抑制p-SRC表达”为抑制细胞中p-SRC表达;所述细胞为肝癌细胞;所述A3)中,所述“抑制MAPK信号通路”为抑制细胞中MAPK信号通路;所述细胞为肝癌细胞;所述A4)中,所述“抑制p-ERK表达”为抑制细胞中p-ERK表达;所述细胞为肝癌细胞;所述A5)中,所述“抑制p-CyclinD表达”为抑制细胞中p-CyclinD表达;所述细胞为肝癌细胞;所述A6)中,所述“抑制p-CyclinE表达”为抑制细胞中p-CyclinE表达;所述细胞为肝癌细胞;所述A7)中所述“促进p21表达”为促进细胞中p21表达;所述细胞为肝癌细胞。
本发明第二个方面,提供抑制NOD1表达量和/或蛋白活性的物质在制备产品中的应用;所述产品的功能为B1)至B7)中的至少一种:B1)抑制与SRC结合;B2)促进p-SRC表达;B3)激活MAPK信号通路;B4)促进p-ERK;B5)促进p-CyclinD;B6)促进p-CyclinE;B7)抑制p21表达。
进一步的,所述B1)中,所述“抑制与SRC结合”为抑制与细胞中SRC结合;所述细胞为肝癌细胞;所述B2)中,所述“促进p-SRC表达”为促进细胞中p-SRC表达;所述细胞为肝癌细胞;所述B3)中,所述“激活MAPK信号通路”为激活细胞中MAPK信号通路;所述细胞为肝癌细胞;所述B4)中,所述“促进p-ERK表达”为促进细胞中p-ERK表达;所述细胞为肝癌细胞;所述B5)中,所述“促进p-CyclinD表达”为促进细胞中p-CyclinD表达;所述细胞为肝癌细胞;所述B6)中,所述“促进p-CyclinE表达”为促进细胞中p-CyclinE表达;所述细胞为肝癌细胞;所述B7)中所述“抑制p-21表达”为抑制细胞中p21表达;所述细胞为肝癌细胞。
进一步的,所述抑制NOD1表达量和/或蛋白活性的物质可为c1)或c2):c1)寡聚核苷酸siRNA1;所述寡聚核苷酸siRNA如SEQ ID NO.2、SEQ ID NO.3所示;c2)以所述寡聚核苷酸siRNA1为靶点,由shRNA表达系统合成的shRNA。
进一步的,以上所述肝癌细胞可为肝癌细胞系BEL7402、肝癌细胞系SMMC7721、肝癌细胞系HepG2或肝癌细胞系HUH7。
本发明第三个方面,提供一种产品,所述产品含有NOD1;所述产品的功能如下A1)至A7)中的至少一种:A1)与细胞SRC结合;A2)抑制细胞p-SRC表达;A3)抑制MAPK信号通路;A4)抑制细胞p-ERK;A5)抑制细胞p-CyclinD;A6)抑制细胞p-CyclinE;A7)促进细胞p21表达。
本发明第四个方面,提供一种产品,所述产品含有抑制NOD1表达量和/或蛋白活性的物质;所述产品的功能为B1)至B7)中的至少一种:B1)抑制与细胞SRC结合;B2)促进细胞p-SRC表达;B3)激活MAPK信号通路;B4)促进细胞p-ERK;B5)促进细胞p-CyclinD;B6)促进细胞p-CyclinE;B7)抑制细胞p21表达。
本发明第五个方面,提供增加NOD1表达量的物质在制备治疗肝癌药物中的应用。
进一步的,通过增加NOD1表达量,抑制p-SRC的活化从而抑制MAPK信号通路的活化,进而抑制肝癌细胞。
本发明取得的有益效果本发明首次发现NOD1通过靶向结合SRC,抑制p-SRC,进一步抑制MAPK信号通路;这一发现为筛选治疗与MAPK信号通路异常有关疾病的药物提供了新的靶点。
附图说明
构成本发明的一部分的说明书附图用来提供对本发明的进一步理解,本发明的示意性实施例及其说明用于解释本发明,并不构成对本发明的不当限定。
图1.NOD1的表达缺失促进肝癌细胞的增殖活力。
图1A,Western blot的方法验证SiRNA对NOD1的干扰效率。
图1B,CCK-8的方法检测干扰NOD1后,BEL7402和SMMC7721细胞活力的改变。
图1C,检测干扰NOD1表达后,肝癌细胞克隆形成能力的改变。
图1D,检测干扰NOD1的表达后,肝癌细胞系BEL7402和SMMC7721细胞周期的改变。
图2.外源性过表达NOD1显著抑制肝癌细胞的增殖活力。
图2A,Western blot验证myc-NOD1在肝癌细胞系HepG2和HUH7的表达是否成功。
图2B,CCK-8的方法检测在肝癌细胞过表达NOD1后,肝癌细胞增殖活力的改变。
图2C,检测过表达NOD1后,肝癌细胞克隆形成能力的改变。
图2D,BRDU的方法检测过表达NOD1后,肝癌细胞系S期的变化。
图2E,PI染色检测过表达NOD1后肝癌细胞细胞周期的改变。
图3.NOD1通过抑制MAPK信号通路促进肝癌细胞发生周期阻滞。
图3A,在肝癌细胞系BEL7402和SMMC7721中干扰NOD1的表达后检测P21、p-Cyclin D的表达变化。
图3B,在肝癌细胞系BEL7402和SMMC7721中过干扰NOD1后,检测P21、p-CyclinD、p-CyclinE等的表达变化。
图3C,在肝癌细胞系HepG2和HUH7中过表达NOD1的表达后检测MAPK信号通路相关分子(p-ERK,p-JNK及p-P38)的磷酸化水平的变化。
图3D,在肝癌细胞系BEL7402和SMMC7721中干扰NOD1后,检测MAPK信号通路相关分子的磷酸化水平的变化。
图3E,在肝癌细胞系BEL7402中干扰NOD1的表达并用U0126抑制p-ERK的活化,检测p-ERK及P21的蛋白表达变化。
图3F在肝癌细胞系BEL7402中干扰NOD1的表达并用U0126抑制p-ERK的活化,检测肝癌细胞克隆形成能力的改变。
图4NOD1在肝癌细胞系中直接靶向结合SRC.图4A,在肝癌细胞系HepG2和HUH7中外源性转染myc-NOD1和HA-SRC,免疫共沉淀的方法检测NOD1与SRC的结合。
图4B,收集肝癌细胞系BEL7402蛋白裂解液,实验组分别加入NOD1或SRC的抗体,对照组加入IgG,免疫共沉淀的方法检测NOD1与SRC的内源性结合。
图4C在肝癌细胞系HepG2外源性共转myc-NOD1和HA-SRC的表达质粒,24h后进行免疫荧光染色,激光共聚焦的方法检测NOD1与SRC的共定位。
图4D应用体外翻译试剂盒翻译出蛋白NOD1和SRC,进一步用免疫共沉淀的方法验证NOD1与SRC的直接结合作用。
图4E,应用点突变试剂盒构建SRC的截断体突变,免疫共沉淀的方法检测SRC通过其SRC结构域与NOD1发生结合。
图4F应用点突变试剂盒构建NOD1的截断体突变,免疫共沉淀的方法检测NOD1通过其CARD结构域与NOD1结合。
图5.NOD1通过抑制p-SRC发挥其对肝细胞肝癌的抑制效应。
图5A,在肝癌细胞系HUH7中过表达NOD1,24h后收集蛋白,Western blot检测SRC及p-SRC的变化。
图5B,在肝癌细胞系BEL7402中干扰NOD1的表达,48h后收集蛋白,Western blot检测SRC及p-SRC的表达变化。
图5C,在肝癌细胞系BEL7402中干扰NOD1的表达,同时抑制SRC的表达,Western blot检测NOD1、SRC、p-SRC及p-ERK的表达变化。
图5D,在肝癌细胞系BEL7402中干扰NOD1的表达,同时应用SRC抑制剂处理细胞,18h后检测p-SRC、P21、p-CyclinD及p-CyclinE的表达变化。
图5E,在肝癌细胞系BEL7402中干扰NOD1的表达,同时应用SRC抑制剂处理细胞,检测肝癌细胞克隆形成能力的改变。
图6.NOD1抑制裸鼠异位肿瘤的生长。
应用4周左右雄性裸鼠10只,将肝癌细胞系BEL7402(1*10^7)皮下注射入裸鼠左右腋内侧。
肉眼可见肿瘤出现后,开始给与左侧瘤内注射myc-NOD1质粒(20ug),同时,右侧给与等量myc-vector(20ug),隔天注射一次,开始注射质粒28天后处死裸鼠,剥离瘤组织。
图6A,剥离出的NOD1组和Mock组肿瘤图片。
图6B-C,NOD1组与Mock组肿瘤的质量(6B)和体积(6C)比较。
图6D,提取裸鼠肿瘤组织中的蛋白,Western blot检测p-SRC、p-ERK、p-JNK、p-P38等蛋白的变化。
图7.检测NOD1在肝癌临床标本中的表达水平。
图7A-B,免疫组织化学染色法检测NOD1在肝癌组织及其配对的非癌肝组织中的表达量。
图7C-D,检测NOD1在肝癌组织及其配对非癌肝组织中蛋白的相对表达量。
具体实施方式
应该指出,以下详细说明都是示例性的,旨在对本发明提供进一步的说明。
除非另有指明,本文使用的所有技术和科学术语具有与本发明所属技术领域的普通技术人员通常理解的相同含义。
需要注意的是,这里所使用的术语仅是为了描述具体实施方式,而非意图限制根据本发明的示例性实施方式。
如在这里所使用的,除非上下文另外明确指出,否则单数形式也意图包括复数形式,此外,还应当理解的是,当在本说明书中使用术语“包含”和/或“包括”时,其指明存在特征、步骤、操作和/或它们的组合。
为了使得本领域技术人员能够更加清楚地了解本发明的技术方案,以下将结合具体的实施例详细说明本发明的技术方案。
实验材料:96孔板、24孔板、6孔板、6cm培养皿、细胞培养瓶、移液管、Transwell板。
试剂:DMEM高糖培养基和1640培养基购于美国康宁公司,lipo2000转染试剂购于美国Life公司旗下Invitrogen品牌,Agarose珠子购于美国Santa Cruse公司,CCK-8盒子购于日本同仁化工公司,胎牛血清购于中国四季青公司,SiRNA(Sigma)购于德国Merk公司旗下的Sigma-Aldrich品牌,一抗(NOD1,p-ERK,p-SRC、p-JNK、p-P38、p-CyclinD、p-CyclinE,P21等)购于美国Cell Signaling Technology公司,二抗(山羊抗兔抗体,山羊抗鼠抗体)购于中国广州中山金桥公司。
CCK-8法检测细胞的增殖活力SMMC7721和BEL7402肝癌细胞以1x10^5细胞/ml的密度接种于96孔板,每孔加入100μl细胞悬液,培养过夜。
转染Si-NOD1,以Si-NC转染组作为对照。
转染后6h换液,并作为0h;分别在转染后0h、12h、24h、36h、48h和72h时加入CCK-8试剂,37℃孵箱孵育1h,酶标仪于450nm处检测OD值。
HUH7和HepG2肝癌细胞以1x105/ml的密度接种于96孔板中,每孔加入100μl细胞悬液,培养过夜。
转染NOD1表达质粒,并以空载体转染组作为对照。
转染后6h换液,并作为0h;分别在转染后0h、12h、24h、36h、48h和72h时加入CCK-8试剂,37℃孵箱孵育1h,酶标仪于450nm处检测OD值。
克隆形成实验SMMC7721和BEL7402肝癌细胞以3x105/ml的密度接种于6孔板中,每孔加入2ml细胞悬液,过夜培养。
细胞密度为60%-80%时,向肝癌细胞转染Si-NOD1,以Si-NC转染组作为对照,另设空白对照组。
继续培养24h后胰酶消化,制成单细胞悬液,细胞计数,将各组细胞密度调整至1000个细胞/ml,向六孔板加入2ml细胞悬液,置于37℃,5%CO2孵箱孵育7-10天。
对细胞克隆进行结晶紫染色,拍照,计数并分析细胞数>50的克隆。
HUH7和HepG2肝癌细胞以2x105/ml的密度接种于6孔板中,每孔加入2ml细胞悬液,过夜培养。
细胞密度为60%-80%时,向肝癌细胞转染NOD1表达质粒,以空载体转染组作为对照,另设空白对照组。
继续培养24h后胰酶消化,制成单细胞悬液,细胞计数,将各组细胞密度调整至1000个细胞/ml。
向六孔板加入2ml细胞悬液,37℃,5%CO2孵箱孵育7-10天。
对细胞克隆进行结晶紫染色,拍照,计数并分析细胞数>50的克隆。
NOD1核苷酸序列如SEQ ID NO.1所示。
实施例1 NOD1表达对肝癌的影响(1)SMMC7721和BEL7402肝癌细胞以3x105/ml的密度接种于6孔板中,每孔加入2ml细胞悬液,过夜培养。
细胞密度为60%-80%时,向肝癌细胞转染Si-NOD1,以Si-NC转染组作为对照,另设空白对照组。
Si-NOD1序列:Sense:5’-CCAGCUCGUUCAGAGCAAATT-3’,如SEQ ID NO.2所示;Anti-sense:5’-UUUGCUCUGAACGAGCUGGTT-3’,如SEQ ID NO.3所示。
Si-NC序列:Sense:5’-UUCUCCGAACGUGUCACGUTT,如SEQ ID NO.4所示;Anti-sense:ACGUGACACGUUCGGAGAATT,如SEQ ID NO.5所示。
在肝癌细胞系BEL7402和SMMC7721中成功干扰NOD1的表达(图1A),CCK-8的方法检测到肝癌细胞的增殖活力显著提高(图1B);抑制NOD1的表达后,肝癌细胞的克隆形成能力显著提高(图1C)。
进一步的检测发现,NOD1的表达缺失可以促进细胞周期由S期向G2/M期转变(图1D)。
以上研究表明,NOD1的表达缺失可以显著促进肝癌细胞的增殖活力。
(2)HUH7和HepG2肝癌细胞以2x105/ml的密度接种于6孔板中,每孔加入2ml细胞悬液,过夜培养。
细胞密度为60%-80%时,向肝癌细胞转染Myc-NOD1表达质粒,以Myc-vector质粒转染组作为对照,另设空白对照组。
质粒载体为pCDNA3.0。
为进一步明确NOD1对肝癌细胞的抑制效应,本发明发现,在肝癌细胞系HepG2和HUH7成功外源性过表达NOD1(图2A)后,CCK-8的方法检测到NOD1可以显著抑制肝癌细胞的增殖活力(图2B);过表达NOD1后,肝癌细胞的克隆形成能力显著下调(图2C)。
进一步的检测发现,过表达NOD1可以显著抑制肝癌细胞进入S期(图2D)并使肝癌细胞发生周期阻滞(图2E)。
以上研究进一步表明,NOD1通过诱导肝癌细胞发生周期阻滞抑制肝癌细胞的增殖活力。
所述Myc-NOD1表达质粒、Myc-vector质粒受赠于Dr.Sung Ouk Kim(University of Western Ontario);重组表达质粒的构建相关文献:Liu M,Haenssler E,Uehara T,et al.The Legionella pneumophila EnhC protein interferes with immunostimulatory muramyl peptide production to evade innate immunity[J].Cell Host&Microbe,2012,12(2):166-176.为验证NOD1的表达缺失促进肝癌的恶性进展。
本发明收集收集120例临床肝癌患者肝癌组织及配对非癌肝组织标本,石蜡包埋,制备组织芯片,免疫组织化学染色的方法检测NOD1的表达,检测发现NOD1在肝癌组织中的表达显著下调(图7A-B);为进一步明确NOD1在临床肝癌组织中的表达情况,收集64例临床肝癌患者肝癌组织及配对非癌肝组织并提取蛋白,应用westernblot的方法检测NOD1的表达情况,检测发现NOD1在肝癌组织中的蛋白(图7C-D)的表达水平均显著下调。
以上临床检测进一步明确NOD1的表达缺失促进肝细胞肝癌的恶性进展。
实施例2 NOD1抑制MAPK信号通路在肝癌细胞系BEL7402和SMMC7721中干扰NOD1的表达后,检测到细胞周期负调蛋白P21的表达显著被抑制,而细胞周期活化蛋白p-CyclinD、p-CyclinE及p-CDC2的表达水平显著上调;反之,在肝癌细胞系HUH7和HepG2中,外源性过表达NOD1可以显著提高P21的表达,同时细胞周期活化蛋白p-CylinD、p-CyclinE的表达水平则显著下调;以上结果进一步明确了NOD1可以负向调控肝癌细胞的细胞周期。
本发明的进一步研究发现,在肝癌细胞系干扰NOD1的表达可以显著活化MAPK信号通路,反之,过表达NOD1则显著抑制MAPK信号通路的活化。
为明确NOD1通过抑制MAPK信号抑制肝癌细胞的增殖,在肝癌细胞BEL7402中干扰NOD1的表达,同时加入MAPK信号通路的抑制剂U0126处理细胞,继而检测到抑制MAPK信号通路的活化,检测发现干扰NOD1后对p-ERK的活化作用显著抑制,同时干扰NOD1的表达对P21的抑制作用被有效逆转(图3D),进一步的研究发现,干扰NOD1的表达后抑制p-ERK的活化可以有效逆转NOD1表达缺失对肝癌细胞增殖的促进效应(图3E)。
综合以上结果表明,NOD1通过抑制MAPK信号通路的活化诱导肝癌细胞发生周期阻滞最终抑制肝癌细胞的增殖。
实施例3 NOD1在肝癌细胞中发挥抑癌效应的分子靶点的筛选免疫共沉淀的方法检测到NOD1与SRC存在内源性及外源性的结合(图4A-B)。
免疫荧光染色的方法证明NOD1与SRC存在胞浆内的共定位(图4C);体外蛋白翻译,免疫共沉淀的方法证明NOD1与SRC存在直接结合效应(图4D)。
本发明在进一步的研究中分别构建了NOD1和SRC的截断体突变,并通过免疫共沉淀的方法证明NOD1通过其CARD结构域与SRC的SH3结构域发生结合。
本发明通过在肝癌细胞BEL7402中干扰NOD1的表达,检测发现抑制NOD1的表达可以显著提高p-SRC的表达水平而不影响SRC的表达(图5A);反之,在肝癌细胞系HUH7中过表达NOD1则显著抑制p-SRC的表达水平亦不影响SRC的表达(图5B)。
在BEL7402细胞系中,干扰NOD1的同时抑制SRC的表达,检测表明NOD1表达缺失对p-SRC的活化作用被有效的逆转,同时NOD1表达缺失对p-ERK的活化作用被有效逆转(图5C)。
以上研究结果表明,NOD1通过抑制p-SRC的活化抑制MAPK信号通路的活化。
本发明进一步在干扰NOD1的表达后,加入SRC的抑制剂PP2可以有效逆转NOD1表达缺失对肝癌细胞克隆形成能力的促进效应(图5D)。
综合以上结果表明,NOD1通过抑制p-SRC的激活发挥其对肝癌细胞的增殖效应。
本发明的体外实验表明,NOD1在肝细胞肝癌的恶性进展中发挥抑癌效应,接下来本发明在裸鼠异位肿瘤模型中进一步验证NOD1在肝细胞肝癌中发挥的肿瘤抑制效应。
应用4周左右雄性裸鼠10只,将肝癌细胞系BEL7402(1*10^7)皮下注射入裸鼠左右腋内侧。
肉眼可见肿瘤出现后,开始给与左侧瘤内注射myc-NOD1质粒(20ug),同时,右侧给与等量myc-vector(20ug),隔天注射一次,开始注射质粒28天后处死裸鼠,剥离瘤组织。
分析发现,NOD1注射组肿瘤的大小、体积、重量显著低于对照组(图6A-C)。
Western blot验证了NOD1组相对于Mock组肿瘤内NOD1的成功过表达(图6D)。
本发明进一步提取肿瘤组织蛋白,并用Western blot的方法验证了NOD1通过抑制p-SRC-MAPK信号轴发挥其对肝细胞肝癌的抑制效应(图6D)。
上述实施例为本发明较佳的实施方式,但本发明的实施方式并不受上述实施例的限制,其他的任何未背离本发明的精神实质与原理下所作的改变、修饰、替代、组合、简化,均应为等效的置换方式,都包含在本发明的保护范围之内。
SEQUENCE LISTING<110> 山东大学<120> NOD1在制备抑制肿瘤SRC信号通路的产品中的应用<130><160> 5<170> PatentIn version 3.3<210> 1<211> 2859<212> DNA<213> 人工序列<400> 1atggaagagc agggccacag tgagatggaa ataatcccat cagagtctca cccccacatt 60caattactga aaagcaatcg ggaacttctg gtcactcaca tccgcaatac tcagtgtctg 120gtggacaact tgctgaagaa tgactacttc tcggccgaag atgcggagat tgtgtgtgcc 180tgccccaccc agcctgacaa ggtccgcaaa attctggacc tggtacagag caagggcgag 240gaggtgtccg agttcttcct ctacttgctc cagcaactcg cagatgccta cgtggacctc 300aggccttggc tgctggagat cggcttctcc ccttccctgc tcactcagag caaagtcgtg 360gtcaacactg acccagtgag caggtatacc cagcagctgc gacaccatct gggccgtgac 420tccaagttcg tgctgtgcta tgcccagaag gaggagctgc tgctggagga gatctacatg 480gacaccatca tggagctggt tggcttcagc aatgagagcc tgggcagcct gaacagcctg 540gcctgcctcc tggaccacac caccggcatc ctcaatgagc agggtgagac catcttcatc 600ctgggtgatg ctggggtggg caagtccatg ctgctacagc ggctgcagag cctctgggcc 660acgggccggc tagacgcagg ggtcaaattc ttcttccact ttcgctgccg catgttcagc 720tgcttcaagg aaagtgacag gctgtgtctg caggacctgc tcttcaagca ctactgctac 780ccagagcggg accccaagga ggtgtttgcc ttcctgctgc gcttccccca cgtggccctc 840ttcaccttcg atggcctgga cgagctgcac tcggacttgg acctgagccg tgtgcctgac 900agctcctgcc cctgggagcc tgcccacccc ctggtcttgc tggccaacct gctcagtggg 960aagctgctca agggggctag caagctgctc acagcccgca caggcatcga ggtcccgcgc 1020cagttcctgc ggaagaaggt gcttctccgg ggcttctccc ccagccacct gcgcgcctat 1080gccaggagga tgttccccga gcgggccctg caggaccgcc tgctgagcca gctggaggcc 1140aaccccaacc tctgcagcct gtgctctgtg cccctcttct gctggatcat cttccggtgc 1200ttccagcact tccgtgctgc ctttgaaggc tcaccacagc tgcccgactg cacgatgacc 1260ctgacagatg tcttcctcct ggtcactgag gtccatctga acaggatgca gcccagcagc 1320ctggtgcagc ggaacacaca cagcccagtg gagaccctcc acgccggccg ggacactctg 1380tgctcgctgg ggcaggtggc ccaccggggc atggagaaga gcctctttgt cttcacccag 1440gaggaggtgc aggcctccgg gctgcaggag agagacatgc agctgggctt cctgcgggct 1500ttgccggagc tgggccccgg gggtgaccag cagtcctatg agtttttcca cctcaccctc 1560caggccttct ttacagcctt cttcctcgtg ctggacgaca gggtgggcac tcaggagctg 1620ctcaggttct tccaggagtg gatgccccct gcgggggcag cgaccacgtc ctgctatcct 1680cccttcctcc cgttccagtg cctgcagggc agtggtccgg cgcgggaaga cctcttcaag 1740aacaaggatc acttccagtt caccaacctc ttcctgtgcg ggctgttgtc caaagccaaa 1800cagaaactcc tgcggcatct ggtgcccgcg gcagccctga ggagaaagcg caaggccctg 1860tgggcacacc tgttttccag cctgcggggc tacctgaaga gcctgccccg cgttcaggtc 1920gaaagcttca accaggtgca ggccatgccc acgttcatct ggatgctgcg ctgcatctac 1980gagacacaga gccagaaggt ggggcagctg gcggccaggg gcatctgcgc caactacctc 2040aagctgacct actgcaacgc ctgctcggcc gactgcagcg ccctctcctt cgtcctgcat 2100cacttcccca agcggctggc cctagaccta gacaacaaca atctcaacga ctacggcgtg 2160cgggagctgc agccctgctt cagccgcctc actgttctca gactcagcgt aaaccagatc 2220actgacggtg gggtaaaggt gctaagcgaa gagctgacca aatacaaaat tgtgacctat 2280ttgggtttat acaacaacca gatcaccgat gtcggagcca ggtacgtcac caaaatcctg 2340gatgaatgca aaggcctcac gcatcttaaa ctgggaaaaa acaaaataac aagtgaagga 2400gggaagtatc tcgccctggc tgtgaagaac agcaaatcaa tctctgaggt tgggatgtgg 2460ggcaatcaag ttggggatga aggagcaaaa gccttcgcag aggctctgcg gaaccacccc 2520agcttgacca ccctgagtct tgcgtccaac ggcatctcca cagaaggagg aaagagcctt 2580gcgagggccc tgcagcagaa cacgtctcta gaaatactgt ggctgaccca aaatgaactc 2640aacgatgaag tggcagagag tttggcagaa atgttgaaag tcaaccagac gttaaagcat 2700ttatggctta tccagaatca gatcacagct aaggggactg cccagctggc agatgcgtta 2760cagagcaaca ctggcataac agagatttgc ctaaatggaa acctgataaa accagaggag 2820gccaaagtct atgaagatga gaagcggatt atctgtttc 2859<210> 2<211> 21<212> DNA<213> 人工序列<400> 2ccagcucguu cagagcaaat t 21<210> 3<211> 21<212> DNA<213> 人工序列<400> 3uuugcucuga acgagcuggt t 21<210> 4<211> 21<212> DNA<213> 人工序列<400> 4uucuccgaac gugucacgut t 21<210> 5<211> 21<212> DNA<213> 人工序列<400> 5acgugacacg uucggagaat t 21展开

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