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一种利用热休克法选育雌性三倍体斑马鱼的方法

基本信息

  • 申请号 CN201811377264.3 
  • 公开号 CN109548712A 
  • 申请日 2018/11/19 
  • 公开日 2019/04/02 
  • 申请人 湖南师范大学  
  • 优先权日期  
  • 发明人 肖亚梅 彭亮跃 符文 刘少军 刘文彬 刘锦辉  
  • 主分类号 A01K61/10 
  • 申请人地址 410000 湖南省长沙市麓山路36号湖南师范大学生命科学学院 
  • 分类号 A01K61/10 
  • 专利代理机构 长沙朕扬知识产权代理事务所(普通合伙) 43213 
  • 当前专利状态 发明专利申请公布 
  • 代理人 杨斌 
  • 有效性 审查中-实审 
  • 法律状态 审查中-实审
  •  

摘要

本发明公开了一种利用热休克法选育雌性三倍体斑马鱼的方法,包括如下步骤:以野生型AB品系斑马鱼作为亲鱼,进行人工催产、人工授精,将得到的受精卵置于培养皿中在28℃‑29℃条件下静水培养,然后转入40.5℃‑41.5℃的水中热休克处理2min,再置于28℃‑29℃的水中静水孵化,待鱼苗全部孵出后,将鱼苗转入22℃‑26℃的水中进行恒温培养,鱼苗孵出3‑5天后开始投喂草履虫,15‑20天后改投喂丰年虫,鱼苗孵出2个月后,通过生物学方法进行检测筛分,获得雌性三倍体斑马鱼个体。
该方法打破了通过热休克方法得到的三倍体斑马鱼均为雄性的认知,具有重要的科学价值,也为斑马鱼性别决定研究提供了一个很好的材料。
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权利要求书


1.一种利用热休克法选育雌性三倍体斑马鱼的方法,包括如下步骤:以野生型AB品系斑马鱼作为亲鱼,对所述亲鱼进行人工催产、人工授精,将得到的受精卵置于培养皿中在28℃-29℃条件下静水培养2-3min,然后将受精卵转入40.5℃-41.5℃的水中热休克处理2min,再置于28℃-29℃的水中静水孵化,待鱼苗全部孵出后,将鱼苗转入22℃-26℃的水中进行恒温培养,鱼苗孵出满3-5天后开始投喂草履虫,鱼苗孵出满15-20天后改投喂丰年虫,鱼苗孵出满2个月后,通过生物学方法进行检测筛分,获得雌性三倍体斑马鱼个体。
2.根据权利要求1所述的方法,其特征在于,所述亲鱼的选择标准是选择性成熟、无病无伤、体征良好以及身体健壮的野生型AB品系斑马鱼。
3.根据权利要求1所述的方法,其特征在于,所述人工催产的具体操作包括如下步骤:将所述亲鱼按照雄性与雌性2:1的数量比例放入孵化盒中,暗处理10-14h,然后光照20-30min,完成人工催产。
4.根据权利要求1所述的方法,其特征在于,所述人工授精的具体操作包括如下步骤:取所述人工催产后得到的雄性斑马鱼,挤出精液用Hank’s液按体积比1:100稀释,置于冰上备用;取所述人工催产后得到的顺利产卵的雌性斑马鱼,挤出卵子,用含有精液的Hank’s液覆盖在卵子上,搅动混匀后加水,完成人工授精。
5.根据权利要求1-4中任一项所述的方法,其特征在于,所述通过生物学方法进行检测筛分的具体操作包括如下步骤:鱼苗孵出满2个月后,剪取其尾鳍离散成细胞悬液,通过流式细胞仪检测,筛选出三倍体斑马鱼;然后将筛选出的三倍体斑马鱼置于28℃-29℃的水中继续培养至性成熟,根据外形特征筛选出雌性三倍体斑马鱼,并取其性腺进行组织学鉴定。
6.根据权利要求5所述的方法,其特征在于,所述通过流式细胞仪检测的具体操作包括如下步骤:往所述细胞悬液中加入400-500uL的DNA荧光染料4',6-二脒基-2-苯基吲哚,在黑暗环境下染色8-10min,然后用孔径为30μm的筛子过滤后用流式细胞仪上机检测,根据检测结果筛选出三倍体斑马鱼。
7.根据权利要求5所述的方法,其特征在于,所述雌性三倍体斑马鱼的筛选标准是筛选体型肥大,腹膨大明显的三倍体斑马鱼。
8.根据权利要求5所述的方法,其特征在于,所述进行组织学鉴定的具体操作包括如下步骤:取筛选出的雌性三倍体斑马鱼的性腺,用波恩氏液固定,进行石蜡切片,对切片进行HE染色,用光学显微镜观察性腺结构并拍照,进行鉴定。
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说明书

技术领域
本发明属于生物技术领域,尤其涉及一种利用热休克法选育雌性三倍体斑马鱼的方法。
背景技术
在鱼类技术领域中,热休克技术是指通过抑制第二极体排出诱导三倍体,抑制第一次卵裂诱导四倍体的技术,是一项广泛被用来进行人工诱导多倍体鱼类的方法,具有成本低、简单又实用的优点。
在斑马鱼中,1990年Kavumpurath和Pandian第一次报道热休克诱导三倍体斑马鱼,然而通过该方法得到的三倍体个体均为雄性。
在2004年和2007年先后有科学家报道诱导得到的三倍体斑马鱼,但也都为雄性个体。
2018年3月TADelomas在杂志Molecular Reproduction and Development上发表“Why are triploid zebrafish all male?”的综述报道中进一步证实,目前通过热休克抑制第二极体诱导得到的三倍体斑马鱼通过常规温度(28.5℃)培育至性成熟的三倍体斑马鱼基本为雄性。
因此,如何利用热休克法诱导并选育出雌性三倍体斑马鱼是本技术领域亟待解决的问题。
发明内容
本发明所要解决的技术问题是,克服以上背景技术中提到的不足和缺陷,提供一种利用热休克法选育雌性三倍体斑马鱼的方法。
为解决上述技术问题,本发明提出的技术方案为提供一种利用热休克法选育雌性三倍体斑马鱼的方法,包括如下步骤:以野生型AB品系斑马鱼作为亲鱼,对所述亲鱼进行人工催产、人工授精,将得到的受精卵置于培养皿中在28℃-29℃(斑马鱼胚胎发育最适温度)条件下静水培养2-3min,然后将受精卵转入40.5℃-41.5℃(热休克效果最好的温度)的水中热休克处理2min,再置于28℃-29℃(斑马鱼胚胎发育最适温度)的水中静水孵化,待鱼苗全部孵出后,将鱼苗转入22℃-26℃的水中进行恒温培养(利用该低温培养来影响三倍体斑马鱼性别分化),鱼苗孵出满3-5天后开始投喂草履虫,鱼苗孵出满15-20天后改投喂丰年虫,鱼苗孵出满2个月后,通过生物学方法进行检测筛分,获得雌性三倍体斑马鱼个体。
采用的野生型AB品系斑马鱼来源于中国科学院水生生物研究所国家斑马鱼资源中心。
斑马鱼是一种热带鱼类,它的最适宜培育温度是28.5℃,热休克温度为40.5℃-41.5℃。
热休克处理是利用高温破坏胚胎的减数第二次分裂,抑制第二极体排出,从而达到染色体加倍的效果,在40.5℃-41.5℃温度下进行热休克处理2min,三倍化效率可高达90%-95%。
常规方法培育热休克诱导的三倍体斑马鱼不能得到雌性,主要是因为斑马鱼是一种受环境影响性别的模式生物,孵化后的培养温度可以影响性别分化,通过常规温度(28.5℃)培育至性成熟的三倍体斑马鱼基本为雄性。
而本发明在对热休克抑制第二极体排出诱导得到的三倍体斑马鱼通过22℃-26℃恒温培育两个月,利用该温度影响三倍体斑马鱼的性别分化,得到雌性三倍体斑马鱼,雌性三倍体斑马鱼比例超过10%。
选择22℃-26℃是因为温度过低斑马鱼不能生存,而温度过于接近最适宜温度则不会对三倍体斑马鱼性别分化有明显的影响,22℃-26℃是影响三倍体斑马鱼性别分化为雌性的最佳温度。
经鉴定,本发明获得的雌性三倍体斑马鱼性腺发育良好,3月龄即可达到性成熟,且可产出正常卵子。
上述的选育方法,优选的,所述亲鱼的选择标准是选择性成熟、无病无伤、体征良好以及身体健壮的野生型AB品系斑马鱼。
优选的,所述人工催产的具体操作包括如下步骤:所述人工催产的具体操作包括如下步骤:将所述亲鱼按照雄性与雌性2:1的数量比例放入孵化盒中,暗处理10-14h,然后光照20-30min,完成人工催产。
因为斑马鱼个体较小,对于药物注射量难以把握,并且注射对斑马鱼创口相对较大,容易造成斑马鱼伤口发炎,稍有不慎会导致斑马鱼死亡;本发明采用的催产方法是最适合斑马鱼的催产方法,光处理可以刺激斑马鱼排精产卵,此方法不仅高效,而且不会对斑马鱼有损伤,能做到高效安全。
优选的,所述人工授精的具体操作包括如下步骤:取所述人工催产后得到的雄性斑马鱼,挤出精液用Hank’s液按体积比1:100(精液与Hank’s液的体积比)稀释,置于冰上备用;取所述人工催产后得到的顺利产卵的雌性斑马鱼,挤出卵子,用含有精液的Hank’s液覆盖在卵子上,搅动混匀后加水,完成人工授精。
人工受精时需要足够体积量的精液稀释液去覆盖全部的卵子,如果Hank’s液含量过低就需要更多的原精液,需要更多的雄鱼;Hank’s液含量过高使得精子浓度太小,影响受精率;而用按照精液与Hank’s液的体积比1:100进行稀释,需要的雄鱼个体数量相对合适,也不影响正常受精率。
优选的,所述通过生物学方法进行检测筛分的具体操作包括如下步骤:鱼苗孵出满2个月后,剪取其尾鳍离散成细胞悬液,通过流式细胞仪检测,筛选出三倍体斑马鱼;然后将筛选出的三倍体斑马鱼置于28℃-29℃的水中继续培养至性成熟,根据外形特征筛选出雌性三倍体斑马鱼,并取其性腺进行组织学鉴定。
优选的,所述通过流式细胞仪检测的具体操作包括如下步骤:往所述细胞悬液中加入400-500uL的DNA荧光染料4',6-二脒基-2-苯基吲哚,在黑暗环境下染色8-10min,然后用孔径为30μm的筛子过滤后用流式细胞仪上机检测,根据检测结果筛选出三倍体斑马鱼。
优选的,所述雌性三倍体斑马鱼的筛选标准是筛选体型肥大,腹膨大明显的三倍体斑马鱼。
优选的,所述进行组织学鉴定的具体操作包括如下步骤:取筛选出的雌性三倍体斑马鱼的性腺,用波恩氏液固定,进行石蜡切片,对切片进行HE染色,用光学显微镜观察性腺结构并拍照,进行鉴定。
与现有技术相比,本发明的有益效果为:本发明的方法,在通过热休克技术得到三倍体斑马鱼的基础上,成功地利用低温(22℃-26℃)持续诱导的方法得到了雌性三倍体斑马鱼,打破了通过热休克方法得到的三倍体斑马鱼均为雄性的认知,具有重要的科学价值,也为斑马鱼性别决定研究提供了一个很好的材料。
附图说明
为了更清楚地说明本发明实施例或现有技术中的技术方案,下面将对实施例或现有技术描述中所需要使用的附图作简单地介绍,显而易见地,下面描述中的附图是本发明的一些实施例,对于本领域普通技术人员来讲,在不付出创造性劳动的前提下,还可以根据这些附图获得其他的附图。
图1是二倍体斑马鱼DNA含量图;图2是三倍体斑马鱼(♀)DNA含量图;图3是三倍体斑马鱼染色体图;图4是三倍体斑马鱼(♀)卵巢石蜡切片图;图5是二倍体斑马鱼(♀)卵子图;图6是三倍体斑马鱼(♀)卵子图;图7是三倍体斑马鱼(♀)外形图;图8是二倍体斑马鱼(♀)解剖图;图9是三倍体斑马鱼(♀)解剖图。
具体实施方式
为了便于理解本发明,下文将结合说明书附图和较佳的实施例对本发明做更全面、细致地描述,但本发明的保护范围并不限于以下具体实施例。
除非另有定义,下文中所使用的所有专业术语与本领域技术人员通常理解含义相同。
本文中所使用的专业术语只是为了描述具体实施例的目的,并不是旨在限制本发明的保护范围。
除非另有特别说明,本发明中用到的各种原材料、试剂、仪器和设备等均可通过市场购买得到或者可通过现有方法制备得到。
实施例:一种本发明的利用热休克法选育雌性三倍体斑马鱼的方法,包括如下步骤:(1)亲鱼的挑选:选择性成熟、无病无伤、体征良好以及身体健壮的野生型AB品系斑马鱼作为亲鱼;野生型AB品系斑马鱼来源于中国科学院水生生物研究所国家斑马鱼资源中心;(2)亲鱼的催产:将挑选的亲鱼按照雄性与雌性2:1的数量比例放入孵化盒中,进行暗处理12h,然后光照25min,完成人工催产;(3)人工授精:取人工催产后得到的雄性斑马鱼,挤出精液,按精液与Hank’s液体积比1:100的比例稀释,置于冰上备用;取所述人工催产后得到的顺利产卵的雌性斑马鱼,挤出卵子,用含有精液的Hank’s液覆盖在卵子上,加水搅动混匀,完成人工授精;(4)热休克诱导三倍体斑马鱼:将得到的受精卵置于培养皿中在28.5℃下静水培养2min,然后将受精卵转入41℃的水中热休克处理2min,将得到的胚胎取出,再置于28.5℃的水中静水孵化,得到鱼苗;(5)持续低温诱导:待鱼苗脱膜全部孵出后,得到的鱼苗转入24℃的水中进行恒温培养;(6)鱼苗饲养:鱼苗孵出后满3天后开始投喂草履虫,一天投喂4次;鱼苗孵出15天后开始投喂丰年虫,每天3次;(7)流式细胞仪筛选:鱼苗孵出后满2个月后得到2月龄的小鱼,同时以二倍体斑马鱼作为对照,剪取其尾鳍,置于EP管中,向EP管中加入75ul的生理盐水,用体积浓度为70%的酒精清洗后的剪刀将尾鳍剪碎,制成细胞悬液;往细胞悬液中加入450ul的DNA荧光染料4',6-二脒基-2-苯基吲哚(DAPI)在黑暗环境下染色9min,然后用孔径为30μm的筛子过滤后用流式细胞仪上机检测(见图1-3),根据检测结果筛选出三倍体斑马鱼;(8)常温饲养:将筛选出2月龄的三倍体斑马鱼转入28.5℃的水中继续培养至性成熟;(9)性腺石蜡切片:根据外形特征筛选外形像雌性的三倍体斑马鱼,雌性的三倍体斑马鱼的体型肥大、腹膨大明显,反之,身体细长、鳍大、体色偏黄的三倍体斑马鱼为雄性,取雌性三倍体斑马鱼的性腺做石蜡切片,用波恩氏液固定,对切片进行HE染色,观察性腺组织学结构并拍照(见图4-6)。
经鉴定,获得的雌性三倍体斑马鱼性腺发育良好,3月龄即可达到性成熟,且可产生正常卵子,即获得10-15%数量的雌性三倍体斑马鱼个体(见图7-9)。
本发明通过反复实验,多次成功制备雌性三倍体斑马鱼。
目前制备雌性三倍体斑马鱼的方法还未见报道,本发明的方法,在通过热休克技术得到三倍体斑马鱼的基础上,成功地利用低温(22℃-26℃)持续诱导的方法得到了雌性三倍体斑马鱼,打破了通过热休克方法得到的三倍体斑马鱼均为雄性的认知,具有重要的科学价值,也为斑马鱼性别决定研究提供了一个很好的材料。
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