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一种能够显著降低PD-L1表达水平的中药

基本信息

  • 申请号 CN201811377374.X 
  • 公开号 CN109381575A 
  • 申请日 2018/11/19 
  • 公开日 2019/02/26 
  • 申请人 厦门妙九科技开发有限公司  
  • 优先权日期  
  • 发明人 卢喜  
  • 主分类号 A61K36/88 
  • 申请人地址 361000 福建省厦门市思明区会展南五路42号 
  • 分类号 A61K36/88;A61P35/00;A61P37/04 
  • 专利代理机构 北京联瑞联丰知识产权代理事务所(普通合伙) 11411 
  • 当前专利状态 发明专利申请公布 
  • 代理人 陈剑聪 
  • 有效性 审查中-实审 
  • 法律状态 审查中-实审
  •  

摘要

本发明公开了一种能够显著降低PD‑L1表达水平的中药,由女贞子、党参、黄芪、灵芝、蒲公英、川芎、藏红花、半支莲、仙鹤草、茯苓、葛根、柴胡等多味中药配伍而成,按中医理论组方,严格筛选,经浸泡、提取、醇沉、浓缩、配制等过程制备成所需要的剂型。
本发明由纯天然草药制成,具有对非小细胞肺癌肿瘤微环境免疫力的调节作用,对人体毒副作用小。
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权利要求书


1.一种能够显著降低PD-L1表达水平的中药,其特征在于,其是由如下重量份的原料药制成的药剂:
2.根据权利要求1所述的能够显著降低PD-L1表达水平的中药,其特征在于,其是由如下重量份的原料药制成的药剂:
3.根据权利要求1所述的能够显著降低PD-L1表达水平的中药,其特征在于,其是由如下重量份的原料药制成的药剂:
4.根据权利要求1所述的能够显著降低PD-L1表达水平的中药,其特征在于,所述药剂是任何一种药剂学上可用的剂型。
5.根据权利要求1所述的能够显著降低PD-L1表达水平的中药,其特征在于,所述药剂是颗粒剂、口服液或片剂。
6.一种权利要求1-5任一所述的能够显著降低PD-L1表达水平的中药的制备方法,其特征在于,包括如下步骤:1)按配方中的12种原料药,经漂洗后混合,在中药提取生产线中用纯化水提取,提取方法如下:a)第一次提取,加六倍量纯化水,80~85℃提取4小时,100目筛网过滤,得滤液;b)第二次提取,加四倍量纯化水,75~80℃提取2小时,100目筛网过滤,得滤液;c)第三次提取,加二倍量纯化水,70~75℃提取1小时,100目筛网过滤,得滤液;2)合并1)中三次提取的滤液,浓缩成稠膏,加入等倍量95%~100%的食用酒精,搅匀,醇沉,静置12小时以上,分层,取上层液体,精滤,得滤液,3)将2)中滤液减压浓缩去除乙醇,浓缩成稠膏,冷藏保存待用。
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说明书

技术领域
本发明涉及医药领域,具体涉及一种能够显著降低PD-L1表达水平的中药。
背景技术
随着我国社会经济的发展以及人口老龄化,恶性肿瘤的发病率逐渐上升,癌症已成为人类健康的第一杀手。
2016年世界肿瘤顶级期刊(Cancer J Clin)发表了我国国家癌症中心Chen等的文章,数据显示我国仅2015年就有429.2万新发肿瘤病例和281.4万癌症死亡病例。
其中肺癌的发病率最高,并且死亡率也是排在各种肿瘤之首。
肺癌是所有癌症死亡的首要因素,占所有癌症的17%,肺癌死亡率较高,究其原因是大多数肺癌癌细胞很快对化疗药物出现耐药,甚至对治疗出现抵制作用,尽管近20年来随着显微外科、放疗、免疫治疗、化疗及分子靶向药物治疗的显著提高,肺癌的治疗技术有着突飞猛进的发展,即便如此发达国家肺癌5年生存率也仅仅维持在11%-16%的水平。
Hanahan等在2000年基于肿瘤细胞内信号变化,提出生长信号、凋亡信号、复制潜能、侵袭转移等恶性肿瘤六大特征,强调肿瘤细胞在肿瘤发生发展过程中处于核心地位。
10年后,Hanahan等又在Cell杂志发表文章,提出肿瘤的发生发展不仅仅取决于肿瘤细胞本身,而且及其以来肿瘤细胞生存的土壤也就是肿瘤微环境,肿瘤微环境也是肿瘤的一个显著特征。
肿瘤微环境一旦形成,诸多免疫细胞及分子大量聚集共同促进肿瘤免疫逃逸、肿瘤生长及转移。
最近研究表明,肿瘤微环境内的免疫耐受是导致这种情况发生的最关键原因。
肿瘤微环境作为肿瘤免疫效应阶段的执行场所,其内存在许多因素参与肿瘤组织与免疫系统的相互作用,包括局部效应细胞功能障碍、抑制性免疫调节细胞Treg、细胞因子的免疫负调节作用、抑制性配体受体反应以及肿瘤微环境中T细胞代谢活性的负调节等。
在肿瘤微环境免疫抑制网络中TGF-β处于关键地位,肿瘤细胞、肌成纤维细胞、髓系来源抑制细胞、肿瘤相关巨噬细胞以及调节性T胞等均可分泌高水平的TGF-β,而TGF-β可促进微环境中成纤维细胞的趋化和活化,激活免疫细胞与基质上皮细胞的对话,促进上皮-间质转型,并能诱导多种细胞因子的表达比如VEGF、金属蛋白酶MMP-2/-9,促进血管形成,最终导致肿瘤微环境改变,使其有利于肿瘤的浸润转移,血浆中增高的TGF-β水平常与肿瘤转移及不良预后相关。
CD4+、CD8+、CD25+T细胞(Treg)是一类免疫调节细胞,由胸腺产生,表达IL-10等免疫抑制因子,细胞表面表达CD25,本身不产生IL-2。
Treg细胞主要是通过细胞-细胞接触依赖方式发挥免疫抑制作用,在调控自身免疫性疾病的发生、炎症反应和T细胞稳态中发挥重要作用。
研究结果显示Treg细胞广泛存在于多种肿瘤组织中,并且起到免疫抑制作用,而在肿瘤组织微环境中消除该类细胞,则在一定程度上可抑制肿瘤的发展。
研究发现,肿瘤微环境对肿瘤的发生和发展具有重要的调控作用,其中免疫细胞对肿瘤细胞的监视和杀伤作用,是机体自身抑制肿瘤进展的重要作用方式。
肿瘤组织中CD4+、CD8+、CD25+T细胞的比例决定T细胞杀伤肿瘤细胞的功能。
研究证实免疫检查点PD-L1(Programmed death—l ligand l,又命名为B7--H1)在包括肺癌的多种人肿瘤细胞系和实体肿瘤组织呈高表达并与肿瘤免疫逃逸相关。
因此,本发明旨在从中药层面上研究出,对肺癌微环境中免疫功能的作用及PD-L1表达水平的影响。
发明内容
因此,本发明的目的在于提出一种能够显著降低PD-L1表达水平的中药。
所采用的技术方案为:一种能够显著降低PD-L1表达水平的中药,其是由如下重量份的原料药制成的药剂: 进一步地,一种能够显著降低PD-L1表达水平的中药,其是由如下重量份的原料药制成的药剂: 进一步地,一种能够显著降低PD-L1表达水平的中药,其是由如下重量份的原料药制成的药剂: 进一步地,所述药剂是任何一种药剂学上可用的剂型。
进一步地,所述药剂是颗粒剂、口服液或片剂。
上述能够显著降低PD-L1表达水平的中药的制备方法,包括如下步骤:1)按配方中的12种原料药,经漂洗后混合,在中药提取生产线中用纯化水提取,提取方法如下:a)第一次提取,加六倍量纯化水,80~85℃提取4小时,100目筛网过滤,得滤液;b)第二次提取,加四倍量纯化水,75~80℃提取2小时,100目筛网过滤,得滤液;c)第三次提取,加二倍量纯化水,70~75℃提取1小时,100目筛网过滤,得滤液;2)合并1)中三次提取的滤液,浓缩成稠膏,加入等倍量95%~100%的食用酒精,搅匀,醇沉,静置12小时以上,分层,取上层液体,精滤,得滤液,3)将2)中滤液减压浓缩去除乙醇,浓缩成稠膏,冷藏保存待用。
本发明的中药可以根据需要利用常规制剂生产方法,通过在制得的稠膏中加入制备不同剂型时所需要的常规辅料,可以制成任何所需要的剂型。
本发明中药的机理:本发明具有对非小细胞肺癌肿瘤微环境免疫力的调节作用。
本发明是由女贞子、党参、黄芪、灵芝、蒲公英、川芎、藏红花、半支莲、仙鹤草、茯苓、葛根、柴胡等多味中药配伍而成,依肿瘤病理学组成寒、凉、平、温、热等5种药性,通过引经药柴胡而导向十二经络,从而达到具有对非小细胞肺癌肿瘤微环境免疫力的调节作用。
这种调节作用可表现为:能够降低荷瘤鼠血清中TGF-β的水平,提高CD4+、CD25+T细胞比例,能够抑制非小细胞肺癌细胞中TGF-β水平,从而抑制上皮间质转化来调控肺癌转移。
并且,本发明能够抑制PD-L1,显著降低PD-L1表达水平。
综上,本发明具有干预微环境、改善肺癌免疫抑制状态的作用。
有望为提高肺癌综合治疗的水平,为中西医结合治疗肺癌提供新的思路。
具体实施方式
为了更好地理解本发明,下面结合实施例和实验对本发明的技术方案做进一步说明。
实施例1一种能够显著降低PD-L1表达水平的中药,其是由如下重量份的原料药制成的药剂:女贞子12份;党参23份;黄芪18份;灵芝18份;蒲公英12份;川芎16份;藏红花12份;半支莲25份;仙鹤草25份;茯苓13份;葛根13份;柴胡23份。
该中药的制备方法,包括如下步骤:1)按配方中的12种原料药,经漂洗后混合,在中药提取生产线中用纯化水提取,提取方法如下:a)第一次提取,加六倍量纯化水,85℃提取4小时,100目筛网过滤,得滤液;b)第二次提取,加四倍量纯化水,80℃提取2小时,100目筛网过滤,得滤液;c)第三次提取,加二倍量纯化水,75℃提取1小时,100目筛网过滤,得滤液;2)合并1)中三次提取的滤液,浓缩成稠膏,加入等倍量100%的食用酒精,搅匀,醇沉,静置12小时以上,分层,取上层液体,精滤,得滤液,3)将2)中滤液减压浓缩去除乙醇,浓缩成稠膏,冷藏保存待用。
4)按常规方法将上述稠膏配制成所需浓度的稠液,用喷雾干燥法制成颗粒剂型,颗粒剂采用辐射灭菌法灭菌,分装成4g/袋,每袋含有稠膏0.8g。
实施例2一种能够显著降低PD-L1表达水平的中药,其是由如下重量份的原料药制成的药剂:女贞子10份;党参20份;黄芪15份;灵芝16份;蒲公英8份;川芎15份;藏红花7份;半支莲22份;仙鹤草20份;茯苓12份;葛根9份;柴胡20份。
该中药的制备方法,包括如下步骤:1)按配方中的12种原料药,经漂洗后混合,在中药提取生产线中用纯化水提取,提取方法如下:a)第一次提取,加六倍量纯化水,80℃提取4小时,100目筛网过滤,得滤液;b)第二次提取,加四倍量纯化水,75℃提取2小时,100目筛网过滤,得滤液;c)第三次提取,加二倍量纯化水,70℃提取1小时,100目筛网过滤,得滤液;2)合并1)中三次提取的滤液,浓缩成稠膏,加入等倍量95%的食用酒精,搅匀,醇沉,静置12小时以上,分层,取上层液体,精滤,得滤液,3)将2)中滤液减压浓缩去除乙醇,浓缩成稠膏,冷藏保存待用。
4)用常规方法将上述稠膏配制成所需浓度的稠液,过滤、均化、用热压灭菌法115℃,20分钟灭菌、灌封成30ml一瓶的口服液体制剂,每瓶含有稠膏5g。
实施例3一种能够显著降低PD-L1表达水平的中药,其是由如下重量份的原料药制成的药剂:女贞子15份;党参25份;黄芪20份;灵芝24份;蒲公英14份;川芎20份;藏红花14份;半支莲28份;仙鹤草28份;茯苓18份;葛根15份;柴胡25份。
该中药的制备方法,包括如下步骤:1)按配方中的12种原料药,经漂洗后混合,在中药提取生产线中用纯化水提取,提取方法如下:a)第一次提取,加六倍量纯化水,82℃提取4小时,100目筛网过滤,得滤液;b)第二次提取,加四倍量纯化水,78℃提取2小时,100目筛网过滤,得滤液;c)第三次提取,加二倍量纯化水,74℃提取1小时,100目筛网过滤,得滤液;2)合并1)中三次提取的滤液,浓缩成稠膏,加入等倍量98%的食用酒精,搅匀,醇沉,静置12小时以上,分层,取上层液体,精滤,得滤液,3)将2)中滤液减压浓缩去除乙醇,浓缩成稠膏,冷藏保存待用。
4)按常规方法将上述稠膏配制成所需浓度的稠液,将混合物压片为4g/片的片剂型,颗粒剂采用辐射灭菌法灭菌,每片颗粒含有稠膏0.8g。
可以利用中药领域的常规制备方法,将本发明的原料药制得的稠膏根据需要制成所需要的任何剂型。
不以上述实施例为限。
实验对象与方法1.1研究对象:培养非小细胞肺癌细胞株NCI-H2228,通过在12只去胸腺裸鼠皮下注射10*8/只,3周后非小细胞荷瘤鼠模型构建成功。
1.2治疗方法:治疗组(6只)治疗方案是通过灌胃,每3天给予20mg/kg实施例1的中药,连续给药10次。
对照组(6只)通过灌胃,每3天给予安慰剂20mg/kg,连续给予10次。
1.3主要仪器与试剂:Bio-Rad550分光光度计(美国Bio-Rad公司);FACSCalibur流式细胞仪(Becton Dickinson公司);淋巴细胞分离液(上海精诚化学试剂有限公司);IFN-γ)、白细胞介素2(IL-2)、转化生长因子β(TGF-β)的ELISA检测试剂盒(南京凯基生物技术公司);CD4、CD8、Foxp3、PD-L1一抗(美国Cell signaling technology公司)。
1.4血液标本预处理:通过眼眶采集裸鼠空腹状态下的外周血约0.2ml,每份0.1ml。
一份离心后取血清保存于-20℃冰箱,用于检测IFN-γ、IL-2和TGF-β;另外一份用肝素抗凝,采用淋巴计数分离液分离外周血单个核细胞,通过流式细胞术检测CD4、CD8及Treg细胞比例1.5组织标本预处理:将裸鼠皮下肿瘤组织剥离后,用福尔马林固定,包埋成组织蜡块进行切片,用于免疫组化检测。
1.6流式细胞术检测CD4、CD8及Treg细胞比例:取0.1ml外周血单个核淋巴细胞加入EP管中,分别用10μl FITC标记的CD4、PE标记的CD8和APC标记的Foxp3抗体,避光孵育30分钟后加PBS洗涤2次,离心2000rpm5分钟,弃上清,加入500μl PBS重悬细胞后用流式细胞仪检测。
1.7ELISA试剂盒检测血清中的IFN-γ、IL-2和TGF-β:分别取荷瘤鼠血清0.1ml加入待测孔,反应板充分混匀后37℃静置2小时,反复洗涤反应板4-6次后每孔加一抗工作液,37℃静置1小时,洗板后每孔加入酶标抗体工作液,37℃静置1小时,洗板后每孔加入酶标抗体工作液,洗板后每孔加入底物工作液,37℃避光10分钟,每孔加终止液混匀后检测450nm吸收峰的吸光度值。
根据标准曲线计算血清中IFN-γ、IL-2和TGF-β的含量。
1.8统计学方法:采用SPSS20.0统计软件进行数据分析,计量资料以平均值±标准差(mean±sd)表示,组间比较采用t检验(p<0.05为差异具有统计学意义)。
2结果2.1实施例1的中药对荷瘤鼠外周血中CD4+、CD8+、Foxp3T细胞比例的影响:治疗结束后,与对照组相比,治疗组外周血中CD4+T细胞比例为(48.00±14.67)%,对照组外周血中CD4+T细胞比例为(28.36±15.93)%,组间差异具有统计学意义(p<0.05)。
治疗组外周血中CD8+T细胞比例为(12.58±3.14)%,对照组外周血中CD8+T细胞比例为(37.03±16.20)%,组间差异具有统计学意义(p<0.05)。
治疗组外周血中Treg细胞比例为(38.95±6.82)%,对照组外周血中Treg细胞比例为(28.19±4.73)%,组间差异具有统计学意义(p<0.05)。
2.2实施例1的中药对荷瘤鼠外周血中IFN-γ、IL-2和TGF-β表达水平的影响:治疗结束后,与对照组相比,治疗组外周血中IFN-γ、IL-2和TGF-β表达水平分别为(33.93±1.89)pg/ml、(31.03±0.62)pg/ml和(47.03±10.80)pg/ml;对照组中IFN-γ、IL-2和TGF-β表达水平分别为(23.03±10.87)pg/ml、(18.00±0.42)pg/ml和(68.09±9.83)pg/ml。
2组中3个指标均具有显著差异(p<0.05)。
2.3实施例1的中药对荷瘤鼠实体瘤中CD4+、CD8+、Foxp3T细胞比例的影响:治疗结束后,与对照组相比,治疗组肿瘤组织中CD4+T细胞比例为(56.76±13.83)%,对照组肿瘤组织中CD4+T细胞比例为(23.07±6.54)%,组间差异具有统计学意义(p<0.05)。
治疗组肿瘤组织中CD8+T细胞比例为(13.07±6.21)%,对照组肿瘤组织中CD8+T细胞比例为(57.58±4.31)%,组间差异具有统计学意义(p<0.05)。
治疗组肿瘤组织中Treg细胞比例为(30.17±8.27)%,对照组肿瘤组织中Treg细胞比例为(19.35±2.18)%,组间差异具有统计学意义(p<0.05)。
2.4实施例1的中药对荷瘤鼠实体瘤中PD-L1表达水平的影响:治疗结束后,与对照组相比,治疗组肿瘤组织中PD-L1表达水平显著降低。
2.5实验表明,实施例1的中药能够降低荷瘤鼠血清中TGF-β的水平,提高CD4+、25+T细胞比例,从而抑制上皮间质转化来调控肺癌转移。
实验结果表明实施例1的中药具有干预微环境、改善肺癌免疫抑制状态的作用。
本发明有望为提高肺癌综合治疗的水平,为中西医结合治疗肺癌提供新的思路。
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