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北京核酸检测结果,新冠病毒核酸检测技术及专利分析

来源:科技创新 编辑:八月瓜 发布时间:2021-01-20 10:54

北京核酸检测结果,新冠病毒核酸检测技术及专利分析


目前常用新冠病毒的检测方法主要为免疫检测、核酸检测。

其中,免疫检测又可细分为酶联免疫吸附测定法(ELISA)、间接ELISA法、细胞免疫组化法、免疫层析法等方法,这些免疫检测的方法学亦可作为早期诊断冠状病毒感染的方法。

而较成熟的核酸诊断技术主要有:

1.实时荧光定量PCR(RT-PCR)

2.逆转录环介导等温扩增(RT-LAMP)

3.依赖核酸序列扩增(NASBA)

4.重组酶聚合酶扩增技术(RPA)

5.基因芯片

6.其他

北京核酸检测结果,新冠病毒核酸检测技术及专利分析

根据最新版的诊疗指南,新型冠状病毒确诊的金标准是:荧光RT-PCR核酸检测呈阳性。

这种检测的基本原理是:

依照病毒的核酸序列设计特异性的引物,用于扩增对应的核酸片段;同时高度特异性的TaqMan探针可与对应的核酸片段进行结合,并在Taq酶外切酶活性作用下发生水解,产生荧光信号。根据荧光信号与扩增循环数之间的关系可得到实时扩增曲线。


采集的呼吸道样本,包括咽拭子、鼻拭子、鼻咽抽取物、深咳痰液、呼吸道抽取物、支气管灌洗液、肺泡灌洗液等。轻症病例优先采集咽拭子和痰液,重症病例优先采集肺泡灌洗液。


目前各大商业公司试剂盒中以2019-nCoV的RdRP基因(位于ORF1ab读码框)、E基因和N基因为检测对象,从而实现对2019-nCoV核酸的检测。


全球冠状病毒(除新型冠状病毒以外,还包括其他亚型的冠状病毒)检测诊断技术的主要研发力量来自国际化跨国公司和研究机构。

强生旗下的克鲁塞尔荷兰公司是最主要的专利申请机构,其次是法国巴斯德研究院和新加坡科技研究局。

从前十专利申请机构的性质看,有3家属于企业,2家属于高校,4家属于科研机构,1家为国家公益机构。从国别来看,有4家机构来自中国,2家机构来自美国,荷兰、法国、新加坡和韩国机构各1家。


对中国专利分析作进一步分析可见,冠状病毒诊断技术相关专利申请机构当中,企业申请的专利最多(占比为35% ),其次是科研单位(占比为33%)和大专院校(占比为16% )。

在前十专利申请机构中,公益性科研机构是中国研发的领军力量,企业的专利申请非常分散。


从各省市向国家知识产权局提交的冠状病毒检测与诊断相关专利申请量来看,北京提交的相关专利申请达58项,占全国总量24%,居全国首位。其次为上海、广东。


北京在冠状病毒检测与诊断方面具有较好的研究基础。中国检验检疫科学研究院、清华大学、中国医学科学院病原生物学研究所等机构,以及博奥生物、科兴生物、金迪克生物等多家企业,就冠状病毒检测提出过相关专利申请。


PCR的技术方向

PCR仪器是用于执行PCR反应的仪器,是一种可调的时序温控装置。

在核酸检测的过程中要重复进行多次温度循环,所以又被称为“热循环仪”。

PCR仪器的先进性和可靠性,对检测过程的可重复性、操作的复杂度,和核酸检测效率都有很大影响。

常规PCR仪器由主机、加热模块、PCR管样品基座、热盖等组成,包括由模板、引物、DNA聚合酶和缓冲液组成的PCR反应体系。


在PCR仪器领域中,近十年间,国外来华的申请人当中,美国(US)申请人的专利申请数量最多(约38.7%),日本(JP)次之(约28.7%),二者共占比超2/3。


仔细研究有关PCR仪器专利技术的内容,以下几个技术方向值得关注。


基于毛细管和油塞的核酸提取技术

在进行PCR之前,需要对样品中的核酸进行提纯,以排除样品中杂质的干扰。

为简化核酸检测流程、避免引入新的杂质、缩小仪器体积,越来越多的技术创新聚焦于如何将核酸提取纯化装置和PCR装置集成起来,以便加入样品即可经过一系列自动化操作而得出检测结果。


基于毛细管和油塞的提纯装置可以很好实现上述目标。

这种装置设计有弹性容器和毛细管。弹性容器中盛有样品裂解液和磁珠。毛细管内依次分布有第一油塞、第一清洗液,第二油塞、第二清洗液,第三油塞、溶出液和第四油塞,其侧部设有磁体。

样品加到弹性容器中后,被裂解液裂解并释放出核酸,核酸则被吸附在磁珠上。带有核酸的磁珠在磁体的磁场引导下,依次通过第一清洗液、第二清洗液进行清洗纯化,然后再进入溶出液中。最后核酸被释放到溶出液中。在完全封闭的情况下实现了核酸的提取纯化。通过挤压弹性容器,即可将含有核酸的溶出液传送至核酸扩增反应体系中。


日本精工爱普生和岛津、美国伊库姆、新加坡生物芯片创新有限公司等在国内对此类装置提出专利申请。


基于液滴的二段加热式核酸扩增技术

常规PCR的工作循环中通常有三个加热阶段:

1)在94℃左右的解链,又称变性;

2)根据引物Tm值选择的退火温度;

3)在72℃左右的延伸。出于简化工作流程的需要,可将第二和第三阶段合并起来,形成二段加热式核酸扩增装置。


在这样的装置中,用于PCR扩增反应的试管盛有油相物质。

试管内放入蜡封的干燥试剂,里面包含扩增用的酶、引物和缓冲试剂。

核酸溶出液从提纯装置排出并进入试管后,形成液滴。由于水的密度比油大,液滴沉降至试管底部。在加热条件下,里面的扩增用的酶、引物因为蜡封溶解而被释放出,然后溶入液滴中形成PCR反应体系。

试管的上部设有高温加热器,下部设有低温加热器。

试管中,高温区温度在90℃~100℃之间,用于使核酸解链。低温区温度控制在50℃~75℃之间,用于退火和延伸反应。

工作时,高、低温加热器和试管以相对固定的位置绕轴旋转,使液滴在重力与离心力的作用下,在试管内的两个温区之间反复运动,从而通过二段加热即可实现核酸的循环扩增。


通过技术(1)与(2)的集成,可使PCR仪器实现封闭式的核酸提纯与扩增,最大程度避免外界的干扰。

而且,仪器内全自动的操作节省了人力、提高了效率和生物安全性,使整个检测过程更加适合病毒诊断等领域。

热均匀度控制技术

热不均匀性(TNU),即PCR样品基座上最热和最冷位置的差或平均差。

TNU是自PCR仪器诞生以来就存在的问题,它的大小一定程度上决定了PCR仪器的可靠性和一致性。

PCR仪器的发展的方向之一就是尽量减小TNU效应。


生命技术公司(Life Technology)涉及加热单元分支的8件专利申请中,有4件涉及TNU消减,而涉及温控方法的专利也主要是用于改善热不均匀性。


数字PCR技术

数字PCR是第三代PCR技术。

传统PCR技术的制约因素在于依赖标准曲线。数字PCR可以进行单分子层面的计数,因此可以摆脱对标准品的依赖,从而实现对病毒核酸的精准绝对定量。

利用数字PCR进行核酸的病毒载量测定,具有更出色的灵敏度、特异性和精确性的特点,尤其适合用于早期诊断和低拷贝病毒的监控。数字PCR主要应用的样品为血液和唾液。

数字dPCR的作用原理:

将含有核酸分子的反应体系进行稀释。通过控制阀门或微滴生成器,生成体积可小至10-6数量级的反应单元。每个反应单元作为一个独立的PCR反应器,其中可能含有或者不含待检的DNA或RNA分子。在PCR扩增结束之后,采集每个反应单元信号,并以终点信号的有无作为判断标准:有荧光信号的液滴判读为“1”,无荧光信号的微滴判读为“0”。最后根据泊松分布原理计算待检靶标分子的浓度或拷贝数。


目前,市场上使用的dPCR仪器根据样品分散方式可分为两大类:


1)基于微流控芯片dPCR平台。

此类平台又分为两种:

封闭式(美国Fluidigm公司的BioMark系列,和Formulatrix公司Constellation系统),以及开放式(美国Thermo Fisher公司的Quant Studio)。

封闭式平台是在硅片或石英玻璃上光刻多个微管或微腔室,通过不同的阀门控制溶液的流动,实现样品制备、反应、分离和检测。开放式平台则是以超高密度亲疏水微孔芯片作为反应载体。芯片表面被处理成具有疏水性,而微孔内部具有亲水性。这种亲疏水结合的方式,使样品及反应体系容易进入微孔,而不会停留在表面。这样做法不仅可形成密集的独立微反应室,而且避免了各反应之间的交叉污染。


2)基于油包水技术的微滴dPCR平台。

属于此类平台的产品有:

美国Bio-Rad公司的QX100、QX200和RainDrop系列,中国锐讯生物公司DropX-2000、小海龟BioDigital等。

该技术平台有两个突出的问题:

一是样品分散过程中的破裂容易造成假阳性,二是分散通道的堵塞问题。但是,基于此技术平台的产品价格更为便宜。

病毒检测是dPCR的主要应用领域。临床上,不仅可用于冠状病毒检测,还可以用于HIV、HBV、HPV等检测,还可用于肿瘤的精准医疗,而且还可以用于动物防疫、食品安全检测上。


POCT

目前,已经有不少公司申请基于荧光RT-PCR反应体系的POCT产品。但这些产品主要应用于动物检疫领域。

赛沛公司的GeneXpert产品是全自动一体化的核酸检测系统,整合样品制备、扩增及检测等3个步骤于一个独立的试剂盒中,并将其自动化。标本处理可在2min内完成。受过基础培训的人员均可在30min完成整个测试。


需要注意的是,POCT的核酸检测目前并未得到临床专家的普遍认可。但POCT-PCR将会是非常有前途的方向。


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