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栉孔扇贝三倍体苗种生产方法

基本信息

  • 申请号 CN00111305.4 
  • 公开号 CN1136765C 
  • 申请日 2000/08/25 
  • 公开日 2004/02/04 
  • 申请人 中国水产科学研究院黄海水产研究所  
  • 优先权日期  
  • 发明人 王清印 杨爱国 张岩 刘志鸿  
  • 主分类号  
  • 申请人地址 266071山东省青岛市市南区南京路106号 
  • 分类号  
  • 专利代理机构 青岛联智专利商标事务所有限公司 
  • 当前专利状态 发明专利权部分无效宣告的公告 
  • 代理人 袁和善 
  • 有效性 有效专利 
  • 法律状态
  •  

权利要求书


1.一种栉孔扇贝三倍体苗种的生产方法,其特征是在苗种培育过程 中,其亲贝的培育,积卵、受精和用药技术是:亲贝暂养的有效积温达 200℃以上,雌雄亲贝应严格分开暂养;采用二级积卵处理方法,产出的 卵子先收集在0.3m3大水槽内,密度达到2000个/ml时,加入精液受精, 精卵比例100∶1,受精时要求卵子产出后不超过2小时,精子不超过1 小时;受精后将卵子浓缩入16.6L的小水槽内,卵子密度在3000万粒/L, 后进行药物处理,处理结束后直接移入水池中孵化;三倍体诱导技术参数: 药物起始处理时间是在光学显微镜下观察到第一极体出现35-45%时;加 入浓度为10-70mg/L的6-DMAP进行药物处理;药物持续处理时间为15-20 分钟。
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说明书

技术领域: 本发明属于细胞生物技术中的细胞染色体操作技术,是在生产规模下 对栉孔扇贝受精卵进行诱导,生产三倍体苗种的一种技术方法。
背景技术: 本发明做出之前,贝类多倍体育种在美、日、英等国都有研究,目前 贝类多倍体生产性育种只在牡蛎中获得了成功,而在海湾扇贝、华贵栉孔 扇贝、大扇贝等经济扇贝种类中,三倍体诱导虽已获得成功,但均局限于 试验规模,没有实现产业化。
由于栉孔扇贝为中国独有养殖种类,因此国 外没有这一种类三倍体诱导技术的研究。
国内对栉孔扇贝三倍体诱导技术已有研究,如大连水产学院的王子臣 等(1990)采用温度休克法进行了栉孔扇贝的三倍体诱导,青岛海洋大学 的吕隋芬等(1992)采用细胞松驰素B进行了栉孔扇贝三倍体的诱导,但 上述研究也是仅限于试验规模,至今未见用于生产的大规模的栉孔扇贝三 倍体育苗技术的研究内容。
人工诱导多倍体的方法,不外乎物理、化学和生物方法,应用较多的 主要有温度休克法、静水压处理法和细胞松驰素B(以下简称CB)、咖啡 因、6-二甲氨基嘌呤(简称6-DMAP)等化学药物诱导法。
上述的三倍 体诱导技术虽然获得成功,也可达到较高的三倍体率,但由于试验目的是 进行科学研究,试验规模小,对生产性问题没有加以考虑,故技术内容难 以在生产中推广使用。
发明内容: 本发明的目的是提出一种新的、利用6-DMAP作为诱导剂,可以应用 于大规模生产中的栉孔扇贝三倍体育苗技术,培育出具有生长快、个体大、 出柱率高、抗逆能力强等优良品质的栉孔扇贝三倍体苗种。
本发明是按以下操作技术完成的:在栉孔扇贝三倍体一定规模苗种生 产过程中,解决亲贝培育,积卵、受精和用药(6-DMAP)技术,掌握适 宜诱导技术参数,主要包括药物起始处理时间、药物浓度,药物持续处理 时间。
亲贝培育、积卵、受精和用药技术是:亲贝暂养的有效积温应达200 ℃以上,雌雄亲贝应严格分开暂养;采用二级积卵处理方法,产出的卵子 先收集在0.3m3大水槽内,密度达到2000个/ml时,加入精液受精,精卵 比例100∶1,受精时要求卵子产出后不超过2小时,精子不超过1小时; 受精后将卵子浓缩入16.6L的小水槽内,卵子密度在3000万粒/L,后进 行药物处理,处理结束后直接移入水池中孵化。
三倍体诱导技术参数: 药物起始处理时间:在光学显微镜下观察到第一极体出现35-45%时 加入药物6-DMAP。
药物处理浓度:6-DMAP的浓度为10-70mg/L。
药物持续处理时间:15-20分钟。
具体实施方式: 下面通过实施例详细叙述本发明的大规模苗种生产技术: 最佳实施例具体操作工艺过程:生产中诱导栉孔扇贝三倍体时,一般 采用二级积卵处理方法,即先将卵子收集在一个较大的容器内,常用0.3 立方米水槽,卵子密度达到2000个/ml左右开始受精,精子的用量要比 正常二倍体生产多,保证精子与卵子的比例不少于100∶1,受精后再浓 缩冲洗入标有16.6L刻度的较小的水槽内,观察第一极体出现35-45%时, 加入溶解好的1克6-DMAP(60mg/L的浓度)进行处理,处理卵子的密度 在3000万粒/L左右,为保证受精及药物作用均匀,必须不断搅动,处理 15分钟后直接入池孵化。
完成上述操作过程,首先要解决亲贝培育,积卵、受精技术及生产栉 孔扇贝三倍体苗种的诱导技术参数,包括起始处理时间、药物浓度、持续 处理时间。
亲贝培育,积卵、受精技术:使用6-DMAP诱导栉孔扇贝三倍体,要 获得较高的三倍体诱导率,关键问题是保证被处理的受精卵具有较高的同 步发育性。
受精卵发育的同步性与精卵的质量有关,对栉孔扇贝而言,尽 量延长亲贝暂养时间,亲贝暂养的有效积温应在200℃以上。
应尽量避免 人为刺激提早产卵,是目前研究条件下获得充分成熟卵子的有效方法。
一 般不采取人工刺激的方法进行催产。
另外,在整个生产过程应注意,精卵 产出后应尽快受精,卵子产出后不超过2小时,精子不超过1小时,否则, 精卵质量下降,将会影响受精率。
受精过程中还要注意,如受精过程是否同步、避免精子污染等。
在实 际生产中,由于亲贝的产卵和排精均有一定的时间段,不可能在同一时间 同时进行,因而自然受精的受精卵发育的同步性较差,为了解决这一问题, 亲贝在暂养期间,雌雄要严格分开,分别产卵排精后进行人工授精。
授精 时的精子用量要比正常二倍体生产多,应保证精子与卵子的比例不少于 100∶1,授精后必须不断搅动,这样才能达到较高的受精率,同时使受精 卵有较好的同步发育性。
6-DMAP诱导贝类三倍体对温度没有依赖性,在较低温度下并不影响 减数分裂恢复的能力。
正常情况下,水温主要影响到受精卵减数分裂的进 程,在较高温度下受精卵发育的同步性较高,可获得较高的三倍体率。
因 此在诱导贝类三倍体时应采用较高的水温。
合理用药技术,由于6-DMAP价格较高,为了确保一定的药物处理浓 度,同时又尽可能的降低生产成本,采取二级积卵处理的方法以保持卵子 的活力。
先将卵子收集在一个较大的容器内,常用0.3立方米水槽,卵子 密度达到2000个/ml左右开始授精。
授精后的卵子浓缩入16.6L的小水 槽内,卵子的密度在3000万粒/L左右,等待药物处理。
诱导技术参数: 1)药物起始处理时间:适宜的诱导参数,是保证较高三倍体率和成 活率的关键。
在水温20℃条件下,受精后第20分钟、25分钟、30分钟, 受精卵分别用60mg/L的6-DMAP处理15分钟,其三倍体率和成活率见表 1、表2: 表1.不同起始时间处理的三倍体率和孵化率 起始时间(min)         三倍体率(%)           孵化率(%) 20                       71                    68 30                       66                    60 表2.不同起始处理时间对三倍体率和D型幼虫成活率的影响 起始处理时间(min)        20              25              30 三倍体率(%)             78.5            82.5            67.2 D型幼虫成活率(%)        57.3            75.8            59.5 试验结果表明,处理时机的选择对三倍体率和D型幼虫成活率有显著 影响,卵子受精后第25分钟开始处理,可获得较高的三倍体率和D型幼 虫成活率,但是,在实验条件相同的情况下,采用相同的起始处理时间, 在不同批次的诱导中也会得到不同的三倍体率和成活率,这主要是不同批 次卵子的发育进程有所差异造成,因此起始处理不应孤立的确定,而应以 受精卵发育的生物学时间,即第一极体出现的百分率计算较为准确,经实 验最适起始处理时间,以观察到第一极体出现35-45%为好,在规模化生 产中,还需要参照大概的发育时间过程,留有充分的准备时间。
2)处理持续时间:卵子受精后25分钟(水温20℃),第一极体占40% 时,用60mg/L的6-DMAP处理10-20分钟,结果见表3: 表3.不同持续处理时间对D型幼虫成活率和三倍体率的影响     处理时间min           D型幼虫成活率        三倍体率     10                        80.5               66.6     15                        75.0               83.0     20                        50.2               85.0 在试验条件下处理10-20分钟,延长6-DMAP处理时间三倍体率有所 增加,但胚胎死亡率也明显上升。
持续处理时间15分钟,可获得较高的 诱导率和成活率,能够满足规模化生产的要求。
3)药物处理浓度:适宜的药物处理浓度,是获得较高三倍体率的前 提下,提高成活率的关键。
卵子受精后25分钟(水温20℃),第一极体 占40%时,用10-70mg/L的6-DMAP处理15分钟,结果见表4: 表4.不同药物浓度对三倍体率和D型幼虫成活率的影响 药物浓度(mg/L)    10      20      30      40      50      60      70 三倍体率          25.8    30.2    41.8    53.8    68.2    83.0    84.8 D型幼虫成活率     95.0    90.4    91.0    85.5    80.2    75.0    43.2 从表中可以看出,10-70mg/L的6-DMAP都可以诱导栉孔扇贝三倍体, 随着药物浓度的增加三倍体率上升,但D型幼虫成活率下降,60mg/L的6 -DMAP浓度可达到较高的三倍体率和成活率。
本发明技术,规模生产的三倍体诱导率可稳定在80%以上,成体的三 倍体率达70%左右。
1999年和2000年两年在中国水产科学研究院长岛增 殖站进行了生产性试验,1999年,育苗水体100方,共诱导卵子20亿, 2000年,育苗水体700方,共处理卵子150亿,两年的D-型幼体三倍体 率均达80%以上,稚贝三倍体率达70%以上。
经14个月养殖试验表明,三倍体比二倍体壳高平均增加12.6%,闭 壳肌明显大于二倍体,鲜肉柱得率提高66.3%,扇贝养殖产量在现有条件 下提高20-30%。
本发明与已有技术(以诱导剂细胞松驰素B(CB)为例)对比,具有以 下特点: 在目前人工诱导贝类三倍体的主要方法中,物理方法,无论是温度刺 激还是压力处理,一般认为只能达到70%的倍化率,而化学药物诱导法, 即CB及6-DMAP的最大倍化率,在实验室小规模情况下,可达到或接近 100%。
采用本发明技术,可以在大生产的条件下,使D-型幼体三倍体率 达80%以上,稚贝三倍体率达70%以上。
在栉孔扇贝中,6-DMAP可以取得和CB同样的诱导效果,而孵化率 大为提高,可达到70%以上,是三倍体栉孔扇贝规模化生产的首选诱导剂。
与CB相比,6-DMAP毒性小,对操作者的潜在危害小。
6-DMAP为水 溶性,配制药物容易,处理结束时不需要洗卵可直接入池孵化,CB则需 用二甲基亚砜溶解及在处理结束后需润洗去除残留的药物,因此,6-DMAP 的使用比CB简便,更适合应用于大规模生产。
三倍体动物具有不育性,在生长过程中只有少量能量用于性腺发育, 更多的能量用于生长,因此扇贝三倍体具有生长快、个体大、品质优、抗 逆能力强等特点,可明显增加产量、提高品质并降低死亡率,这已在多种 养殖扇贝的三倍体研究中得到证实。
栉孔扇贝三倍体技术的开发和应用, 将使扇贝养殖产量在现有条件下提高20-30%,鲜出柱率提高60%左右,并 有效地遏制目前存在的品质下降、出柱率低的问题。
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