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日本对虾肌动蛋白基因启动子

基本信息

  • 申请号 CN00111337.2 
  • 公开号 CN1340626A 
  • 申请日 2000/09/01 
  • 公开日 2002/03/20 
  • 申请人 国家海洋局第三海洋研究所  
  • 优先权日期  
  • 发明人 杨丰 林雄晖  
  • 主分类号  
  • 申请人地址 361005福建省厦门市大学路178号 
  • 分类号  
  • 专利代理机构 厦门原创专利事务所 
  • 当前专利状态 发明专利申请公布 
  • 代理人 张松亭 
  • 有效性 发明公开 
  • 法律状态
  •  

摘要

从日本对虾基因组中克隆到4种肌动蛋白基因启动子和3种终止子,它们可以用于构建转基因高效转录载体,进行对虾转基因抗病毒基因工程研究。
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权利要求书


1.一种能引起在日本对虾体内表达外源蛋白或反义RNA的DNA转录载体系统, 该转录体按操作顺序包含:(a)4种来自日本对虾的肌动蛋白基因启动子; (b)能引起RNA序列生成的结构DNA序列;(c)3种来自日本对虾的肌动蛋 白基因的终止子,它在日本对虾组织细胞中的功能是使转录终止并在RNA序 列的3’端加入多聚腺苷酸;
2.权利要求1的载体系统,其中结构DNA序列处于反义方向。

3.权利要求1的载体系统,其中结构DNA编码日本对虾白斑杆状病毒的DNA聚 合酶基因部分序列。

4.一种日本对虾细胞,其包含重组的双链DNA分子,该分子依次包含:   (a)选自日本对虾自身的启动子;   (b)能引起RNA序列生成的结构DNA序列;   (c)3’非翻译区,它在动物细胞中的功能是使转录终止并在RNA序列的3’端     加入多聚腺甘酸。

5.权利要求4中的日本对虾细胞,其中结构DNA序列处于反义方向。

6.权利要求4中的日本对虾细胞,其中结构DNA编码日本对虾白斑杆状病毒的 DNA聚合酶基因的部分序列。

7.一种日本对虾,其包含权利要求4的细胞。
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说明书

本发明涉及一种从日本对虾基因组中克隆到4种肌动蛋白基因启动子和3 种终止子。
对虾是现代水产养殖业的一种很重要的经济动物,然而自1993年以来,对 虾病害连年爆发,经研究证明,其主要病源是一种新的杆状病毒-对虾白 斑杆状病毒WSBV(White Spot Baculovirus)。
病毒病的爆发,对我国养 虾业造成严重危害,累计经济损失已达上百亿元。
对虾属于无脊椎动物,免 疫系统极不完善,利用药物或疫苗来防治对虾杆状病毒病似乎比较困难,最有希 望控制对虾杆状病毒病的手段就是运用现代生物工程技术,即结合反义技术与转 基因技术,培育抗病毒对虾苗种。
国内外已运用这些新技术进行抗病毒动植物的 培育研究,特别在植物方面已得到应用。
如已培育了抗白血病病毒反义RNA转基 因小鼠,转基因鼠无感染发病,而对照组感染发病达31%。
另外还报道了用腺病 毒反义RNA基因构建转基因兔,抗小鼠肝炎病毒反义RNA的转基因鼠。
在植物领 域已成功地培育出抗烟草花叶病毒,抗黄瓜花叶病毒,及抗马铃薯病毒的植株新 品系等。
然而海洋生物方面的基础研究相对薄弱,基因工程抗病毒的研究基本上 处于空白。
在转基因动物抗病毒研究中,转基因表达载体的构建又起了至关重要的作 用,其构建的好坏都将影响动物转基因的效果。
转基因动物表达载体系统包括基 因的改造和载体的构建:删除目的基因的天然启动子,将强启动子序列,终止子 序列同目的基因拼接成融合基因。
为了使对虾白斑杆状病毒早期关键基因的反义 序列能在对虾组织中很好的表达,这就需要得到对虾组织自身的强启动子序列。
肌动蛋白(actin)基因属于多基因家族。
在脊椎动物中已发现了六种肌动蛋白, 肌肉细胞中发现四种:α-骨骼肌类型肌动蛋白,α-心肌类型肌动蛋白,α-平 滑肌类型肌动蛋白,γ-平滑肌类型肌动蛋白;非肌肉细胞中发现两种:β-细胞 骨架类型肌动蛋白和γ-细胞骨架类型肌动蛋白。
在无脊椎动物中,水螅体内发 现了三种肌动蛋白,卤虫(Artemia)体内现已发现了四种肌动蛋白基因,对虾 中现已发现了两种肌动蛋白基因。
这些肌动蛋白不仅在氨基酸序列上有很高的同 源性,蛋白全长375个氨基酸中最多有25个氨基酸不同,并且在基因的碱基序 列上也有相当高的同源性。
但这些基因的同源性仅限于蛋白基因的编码区,而在 非编码区部分,如基因的启动子的同源性相当低。
国际上已普遍利用鱼的肌动蛋 白基因的启动子构建转基因表达载体用于转基因动鱼研究,例如应用鲤鱼的肌动 蛋白的启动子构建鱼表达载体用于转基因斑马鱼的研究 (P.D.Gibbs&M.C.Schmale,2000)。
国际现已发表的肌动蛋白基因序列涉及到酵 母、水螅、按蚊、卤虫、鲤鱼、鲍鱼、鸡、人等许多生物,然而对虾的肌动蛋白 全基因全序列包括其启动子尚无人发表,仅有报导是对虾的两种肌动蛋白的 cDNA序列。
本发明的目的在于首次克隆到四种肌动蛋白基因的启动子和三种终止子,这 些元件将能应用于对虾转基因载体的构建,用于转基因抗病毒工程对虾的研究。
本发明包括:一种能引起在日本对虾体内表达外源蛋白或反义RNA的DNA转 录载体系统,该转录体按操作顺序包含:(a)4种来自日本对虾的肌动蛋白基因 启动子;(b)能引起RNA序列生成的结构DNA序列;(c)3种来自日本对虾的肌 动蛋白基因的终止子,它在日本对虾组织细胞中的功能是使转录终止并在RNA 序列的3’端加入多聚腺苷酸。
本发明的载体系统,其中结构DNA序列处于反义方向。
本发明的载体系统,其中结构DNA编码日本对虾白斑杆状病毒的DNA聚合酶 基因部分序列。
本发明转基因抗病毒载体系统另一创新点在于载体系统选用的靶基因为对 虾白斑杆状病毒DNA聚合酶基因,该基因是在完成测定对虾白斑杆状病毒基因组 全序列的基础上,通过计算机生物软件分析后确定的。
DNA聚合酶基因是病毒复 制的关键基因,因此转基因虾如果大量表达该基因的反义RNA链便能在RNA水平 上抑制其功能,从而有效地阻断病毒复制传代,进而产生明显的抗病毒活性的。
本发明所述的一种日本对虾细胞,其包含重组的双链DNA分子,该分子依 次包含: (d)选自日本对虾自身的启动子; (e)能引起RNA序列生成的结构DNA序列; (f)3’非翻译区,它在动物细胞中的功能是使转录终止并在RNA序列的3’端 加入多聚腺甘酸。
根据上述的日本对虾细胞,其中结构DNA序列处于反义方向。
根据上述的日本对虾细胞,其中结构DNA编码日本对虾白斑杆状病毒的DNA 聚合酶基因的部分序列。
一种日本对虾,其包含上述特征的细胞。
以下对启动子与终止子的克隆的具体思路及方法做详细描述: (1)提取日本对虾染色体: 1.称取日本对虾的仔虾0.1克; 2.加200ul盐酸胍裂解液,用手动匀浆器匀浆; 3.加200ul氯仿和异戊醇的混合液(24∶1),混匀; 4.高速离心(15,000RPM)2分钟; 5.取上清,转入到另一离心管; 6.逐渐加入200ul的异丙醇; 7.挑取白色絮状沉淀到另一离心管中; 8.用70%的乙醇漂洗两遍; 9.加200ul的TE溶解,并加10ulRNA酶,4℃静置过夜。
10.加2ul的1M MgCl2,并缓慢加入50-100ul异丙醇,轻摇离心管直至出现大 片白色絮状沉淀; 11.挑取絮状沉淀到另一离心管中,70%乙醇漂洗两次; 12.溶解于200ulTE中; 13.电泳检测,染色体片段大小应大于50Kb,且无小片段。
(2)日本对虾染色体分别用六种平端酶完全酶切: 1.分别取2.5ug日本对虾染色体于6个0.5毫升容量的离心管中; 2.分别加六种平端酶(DraI,EcoRV,PvuII,ScaI,SspI,SmaI)的酶切 Bufferl0ul; 3.分别加上述六种平端酶30U,然后各管加双蒸水至100ul; 4.  37℃水浴过夜。
5.酶切后的染色体DNA片段用酚/氯仿/异戊醇(25∶24∶1,体积比)抽提一次;用 氯仿抽提一次; 6.加1/10体积的3M NaOAc,20ug糖元,然后加2体积的无水乙醇,混匀; 7.立即离心10分钟(15,000RPM); 8.用80%乙醇漂洗,同上离心5分钟; 9.吸干,溶于20ul双蒸水。
(3)接头制备: 1.合成两条DNA寡核苷酸链,序列如下:   Adaptorl:5’-TGAACCTCTGTAGGATCCTGAATTCGCGGCCGCCCGGGCAGGT-3’;   Adaptor2:5’-ACCTGCCCGG-3’ 其中寡核苷酸链Adaptor2的5’端磷酸化,3’端氨基化。
2.取等摩尔的上述两条寡核苷酸链于一1.5毫升容量的离心管中,加水至   100ul,沸水浴10分钟,然后68℃水浴退火过夜。
(4)日本对虾染色体酶切片段与接头连接: 1.取10ul染色体酶切片段于1.5毫升容量的离心管中,加入1ug接头; 2.加4ul的5X连接Buffer,加5U的T4连接酶,加双蒸水至20ul; 3.14℃水浴连接过夜; 4.然后70℃水浴10分钟,使酶失活; 5.加180ul的双蒸水,-20℃储存备用。
(5)PCR扩增: 1.引物设计: a.接头区两条引物:   A1 5’TGAACCTCTGTAGGATC 3’   A2 5’TGTAGGATCCTGAATTC 3’ b.肌动蛋白编码区四条引物: 因为肌动蛋白基因存在极高的保守性,通过比较分析已知的四条卤虫肌动蛋 白基因和两条对虾肌动蛋白基因的编码序列,从而设计出用于PCR克隆日本对虾 肌动蛋白的C端的四条位于肌动蛋白基因编码区引物,其中两条用于克隆启动 子,两条用于克隆终止子:   PR01:5’TC(T/C)TT(G/A)GT(G/A)ATC CAC AT 3’   PR02:5’ATC TGA GTC ATC TTC TCA C 3’   TERN1:5’TC(T/C)TT(G/A)GT(G/A)ATC CAC AT 3’   TERN2:5’ACC ACC ATG TAC CCT GG 3 2.PCR条件:   94℃    30秒   55℃    30秒   68℃    5分钟(30圈) 3.扩增启动子:   a.取1ul酶切产物为模板,PRO1和A1为引物做第一轮PCR。
  b.PCR产物稀释100倍后,取1ul做为模板,PRO2和A2为引物做第二轮    PCR。
  c.电泳纯化扩增片段后,克隆到pBluescript测序载体进行测序。
4.扩增终止子:   a.取1ul酶切产物为模板,TERN1和A1为引物做第一轮PCR。
  b.PCR产物稀释100倍后,取1ul做为模板,TERN2和A2为引物做第二轮    PCR。
  c.电泳纯化扩增片段后,克隆到pBluescript测序载体进行测序。
(6)启动子序列: 1.LOCUS   PACT0    831bp    DNA            25-MAY-2000   BASE COUNT       199A   190C   199G   243T   ORIGIN   1 ATCCTCTTAC CAGGTATAAA AAGAGTACTC GACGAAGATT ATGCTCAGTC ACGTTTCGAC  61 TCATTGTGGG TAGGTTATAT CTCCCCACTA CAGTGTATTG TGCGAGTGAT ACGAGTTCGT 121 TTACTGTGGC GATGGAGTGA ATTCAGTCTG TGAAAATGAA AGCGTGTGCG TGTGTGTGTA 181 TAAGAGAGAG ATTGTGTAAG AGGAAATGCC CAATTCTGTG TTTCTTTTCG ATTTTATAAT 241 ATTTTGTAAA TGTGTCTTTT ATGAGTGAGT GACTGTATAT TTGTATGTTT CCTAAAGTAC 301 ATATATGTGC TTGTACTTGT AATGTACATT TGCGTGAGTG TGTGTAAATG TGTATATATG 361 TTTGTGTTTG TGTTAAGATG AATATGTGCT TTTATTAACA AGCATGCCTG TCGTAGATTT 421 CAACAGAACT CTCACTCTTC TCATACTTTC AGATTTAGCT GCATCCATAA ACAACCACCA 481 CCATGTGTGA CGACGAAGAC GCGACCGCCC TCGTGGTTGA CAATGGCTCC GGCATGGTCA 541 ACGGCTTCGC CGGAGACGAC GCCCCTCGTG CCGTGTTCCC CTCCATCGTC GGCCGCGCCC 601 GTCACCAGGG TGTGATGGTC GGTATGGGTC AGAAGGACGC CTACGTCGGT GATGAAGCCC 661 AGAGCAAGCG TGGTATCCTC ACCCTCAAGT ACCCCATCGA GTACGGTATC ATCACCAACT 721 GGGACGACAT GGAGAAGATC TGGTACCACA CCTTCTACAA TGAGCTCCGT GTTGCCCCTG 781 AGGAGTGCCC CACTCTTCTT ACTGAAGCTC CCCTCAACCC CAAGGCCAAC C 2. LOCUS        PACTI      928bp  DNA                   07-JUN-2000    BASE COUNT       275A   201C   189G   263T    ORIGIN    1 ATCAAATTTA CCGATATATT TTATTTGTAA CTAAGGAACT TGAGGTTAAC TTAGTATGAA   61 GACTGTGTTC TAAAGTGTTG CTTATTTTTA GTATAAAAAG TCGAATTTCT TTTTATGAGG   121 GTGCTTATTT CGTAACTTAC TTAAATCTAT TAAATGTATG GTAATAAAAT GATAGTGCTG  181 ACTGACGGCG ACAAAAAAAA GTGTTACTAA AGAACAGATC TAGTCTTCAT TAAGACCATA  241 TAAATAAATT TATTTACAGC GAACATCTGC ACCTCAGTAT AAAACGGGGA AAATGGTTTA  301 CAAAGCAAAG CGAGAGTAGG GAAAACGCGA TCATACGAAG GCCTTTTCGG ATTATTGCTT  361 CTTCAGAGTC CTGAACAAGT ATAAAACGAA AAGGCTTGCG ACATAATCAC GTGGTTTCCT  421 GTTTTCTTCC TTATTTAGTT TACAATTTCA AATTAAAACA TTATAGGAAG GTTTAATCAT  481 TTAATCACTT AATAAATAGG CTCAAATTAT ATATTGATGT TAATACTTTT CATCAAATTT  541 CAGGCAAACT TTTGACACCG TATCTACACA TTCACCATGT GTGACGACGA GGATCAGTGC  601 GCGCTCGTGT GCGACAATGG CTCCGGCATG GTCAAGGCCG GTTTCGCCGG AGACGACGCC    661 CCTCGCGCCG TGTTCCCCTC CATCGTCGGC CGTGCTCGTC ACCAGGGTGT GATGGTCGGT  721 ATGGGTCAGA AGGACGCCTA CGTCGGTGAT GAGGCCCAGA GCAAGCGTAG TATCCTCACC  781 CTCAAGTACC CCATTGAGCA CGGTATCATC ACCAACTGGG ACGACATGGA GAAGATCTGG  841 TACCACACTT TCTACAATGA GCTCCGTATT GCCCCTGAGG AGTCCCCCAC ACTTCTCACT  901 GAGGCTCCCC TCAACCCCAA AGCCAACC 3. LOCUS      PACT5      1261bp  DNA                   13-JUN-2000    BASE COUNT      422A   257C   277G   305T    ORIGIN    1 ACTAACTAAA GCAAAAAGTG ATACTGTAAG AATGCGCCTA AAATAGTAGG AACAAATCTA   61 TGACATCAAG GACAAACTTT GACACAGCGA GAACAAAATA GTGACAGAAC AAAAAATGAC  121 GCAAGAATAT TTAGTGACAT GGTAAGAACA AAAAGGTGAA GCAACAAGAT CAAAACGTAA  181 AGCGATGCAA ACAAAAAGAG ATACTGAAAT CAAAATAGAA CAAAAAAGTT AACGCATATA  241 ATCAGAAAAT GTAAAAGAAT AAACAAAAGG TTTAACAATA AGAAAAAAAG TGACACAGCA  301 AGAACAAAAA AGAACAAATA CTAAAAACTT ACACATTAAG AACAAAAACA AAAGGGTACA  361 AAAAGATTGG GAATAATTGT TAAGAAGGCG AAACCAAGTG CCAGATATTC TGACCACTCG  421 CCAGATATCC TCTTACCAGG TACAAAAAGA GTACTCGACG AAGATTATGC TCAGTCACGT  481 TTCGACTCAT TGTGGGTAGG TTATATCTCC CCACTACAGT GTATTGTGCG AGTGATACGA  541 GTTCGTTTAC TGTGGCGATA GAGTGAGTTC AGTCTGTGCA AATGAAAGCG TGTGCGTGTG  601 TGTGTATAAG AGAGAGATTG TGTAAGAGGA AATGCCCAAT TCTGTGTTTC TTTTCGATTT  661 TATAGTATTT ATGTAAATGT GTCTTTTATG AGTGAGTGAC TGTATATTTG TATGTTTCCT  721 AAAGTACATA TATGTGCTTG TACTTGTAAT GTACATTTGC GTGAGTGTGT GTAAATGTGT  781 ATATATGTTT GTGTTTGTGT TAAGATGAAT ATGTGCTTTT ATTAACAAGC ATGCCTGTCG  841 TAGATTTCAA CAGAACCCTC ACTCTTCTCA TACTTTCAGA TTTAGCTGCA TCCATAAACA  901 ACCAACACCA TGTGTGACGA CGAAGACGCG ACCGCCCTCG TGGTTGACAA TGGCTCCGGC  961 ATGGTCAAGG CCGGCTTCGC CGGAGACGAC GCCCCTCGTG CCGTGTTCCC CTCCATCGTC 1021 GGCCGCGCCC GTCACCAGGG TGTGATGGTC GGCATGGGTC AGAAGGACGC CTATGTCGGC 1081 GATGAGGCCC AGAGCAAGAG AGGTATCCTG ACTCTCAAGC ACCCCATCGA GCACGGTATC 1141 ATCACCAACT GGGACGACAT GGAGAAGATC TGGCATCACA CCTTCTACAA CGAACTCCGT 1201 GTTGCTCCTG AGGAATCCCC CGTCCTCCTG ACTGAGGCTC CCCTCAACCC CAAGGCCAAC 1261 C 4. LOCUS       PACT7      1028bp  DNA                   12-JUN-2000    BASE COUNT       304A   219C   198G   307T    ORIGIN    1 ATCCGTATGT TTTTGCCCCG GGTCAATTTT GAAAATATGT AAAGCAATTT TATTGAGCAG   61 ACTTTTCTAG AGTCAAGTCC TGTTATTACA AATTTGTTCA TGATAATTGT AGGTTGTATC  121 AACAAAATGT GATAACTATG GTAAACAGAG TAACTAATCA CTAATGGAAT TATAACTGAT  181 TCATAGTTCT TACTATGAAC CTAAGCAAAC AATCTTGAGT TGCCTGTTGT ATTCATCGTT  241 GTCTAAAGGT TATTGAACAA GACTTTACAT ACACGTACAT GCACGTCTTT ATGTATACTC  301 ATCTATTTAC TTAGTTATTG TGTGGTATAT GATGAATGCA GATTATGATA GTATCAGAAT  361 GAAGAAATTT ATATCATTAT CCTTGAGAAA TTAGTCGTTG TATGATGATA ATTGAGACTG  421 TCGTGCAGAA AACAGTCGAA ATTATCCACT CAGAATTCAA ATCATGCTTT CACTATATTG  481 ATATTTTTGT AATCATAATT GCAAGACAAT GTAAGTGATC ATATGATATT TATAGACCAA  541 TTTTCATCAT TCAGATCTGA CGTTAAGAAC CATAAAGTTA GTGGTCGAGA AATGTTATAA  601 AATTTTGTAA ATCCAACATT TACATTAACC GAGTATAATT CGTCAATCAT ATCTCTTCAG  661 ATATACGTAA CAAGCAAACA TGTGTGACGA CGACACTTGT GCCCTCGTGT GCGACAATGG  721 CTCCGGCCTC TGCAAGGCTG GCTTCGCCGG AGACGACGCC CCTCGTGCCG TCTTCCCCTC  781 CATCGTCGGC CGTCCCCGTC ACCAGGGTGT GATGGTCGGC ATGGGTCAGA AGGACGCCTA  841 CGTCGGTGAT GAGGCCCAGA GCAAGAGAGG TATCCTCACC CTCAAATACC CCATCGAGCA  901 CGGTATCATC ACTAACTGGG ACGACATGGA GAAGATCTGG CATCACACTT TCTACAACGA  961 ACTCCGTGTT GCTCCTGAGG AATCCCCCGT CCTCCTGACT GAGGCTCCCC TCAACCCCAA 1021 GGCCAACC (7)终止子序列: 1.LOCUS       T2         667bp  DNA                  20-JUN-2000   BASE COUNT      233A   154C   111G   169T   ORIGIN   1 ACCACCATGT ACCCTGGCAT CGCCGACAGG ATGCAGAAGG AAATCACTGC CCTCGCTCCC  61 TCAACCATGA AGATCAAGAT CATTGCCCCA CCTGAGCGCA AGTACTCCGT CTGGATCGGT 121 GGCTCCATCC TGGCCTCCCT CTCCACCTTC CAGCAGATGT GGATCAGCAA GCAGGAGTAT 181 GACGAGTCAG GCCCTTCAAT CGTTCACAGG AAGTGCTTCT AAGTCGGACC CCCAATACAG 241 CTTTAATGTG TAGATATATA CATGTATAGT GTACACGCTC AGAACAAGAT TTTTTTCTAT 301 AAATGAACGC AACACGTAAT TGTAAGGATG CTTATTTAAT TAAATTAATG ATTTTTTAAA 361 TGTATATTTT TCAACCTTAA ATTATAACCC AAACGATTTA TATCTACAAT AAGATATGCA 421 CGACCTAAAA AGAAAAAACA ACAACAAAGG AAAAAAAAGG TAGAACTCGA TATTAAGAAT 481 ATTAAATTAG CCAGAACCTG AACACGGTTA AGAACTAAAA GTGAAAGTTC ACACTTCAAA 541 ATCCAGACAC ACATCGATTA AAAAGTAGCA CTGTGACTCA CTGGTACACC TACAATGCTA 601 CTTTCTCCTG TGATCTCAAC AATGCTGCAT TCTTGTCTGT CATAAACAGG AAAAATAACC 661 ATATCAG 2. LOCUS       T13       978bp   DNA                  20-JUN-2000    BASE COUNT      309A   192C   174G   303T    ORIGIN   1 ACCACCATGT ACCCTGGTAT TGCTGACCGC ATGCAGAAGG AGATCACTTC TCTTGCTCCT  61 TCCACCATCA AGATCAAAAT CATTGCTCCT CCCGAGCGTA AGTACTCCGT CTGGATCGGT 121 GGCTCCATCC TTGCTTCTCT GTCCACCTTC CAGGCCATGT GGATCACCAA GGATGAATAC 181 GATGAGTCAG GCCCCGCCAT CGTTCACCGC AAGTGCTTCT AAGTGATGGT TAGAATGGGA 241 GTGGGAATGT ACATTGGGAT GTACTTATAC AAATAATAAA TAATTATAAA TCAACATGCT 301 TTATTGGTAA TACCACGAGA GAAAATACAT TTAAAATGGT GACCCAGTTC ACAATCTGAA 361 GAGAACAAAC GTACATCGTC CCCATACAAA AACACAAACA CACACAGATA CTCAAACTTG 421 CATAAGTATT TTTACGTATC ACTGTCTATT GTATGTTTAT GAATCTACTT ATCTTAATAT 481 ATGAATAAAT ACATATTTCT ATCTCTATAC GCACACATTC AAGAGAGAGA AATTTAAGTG 541 GCATTTGCAC CCAAATTCCG TCCTGCCCTG AAATCGCGTA ATGAGTATGG CGATACTTTC 601 CTTTATAGAC CACGGTCGAT GTGTAAAGGT TCAATCAACC TGATTTGAAA TAAGGATTTA 661 TAAGGTGTCA CTATCTGAAT AGTGATCATT TATTGTAAGT AATTCAATGC CAATTTACTT 721 TTAAAGGTAA TATTGTTAGC GGAGATATAT AAAAAGTGTT GTAATATTGT GGGAACGGCA 781 CCTTAGTGAA TGCTTTGCAA CTGTTGTGTT CGTTTGTGCA AGCTATACAC TGCATCTTTT 841 AATCTAGTAT TTATGATTAC ATATGAATAG AAAAATATTA TTCAGCCATA TTCGAGGACA 901 TTTGATTCTG CAACAGTATT GTATTTCATT CATGAACATC ATGGAAGAAT CAATAATGAT 961 ACAATGCTTC GTTCTCAG 3. LOCUS       T32        578bp   DNA                 21-JUN-2000    BASE COUNT       148A   151C   129G   150T    ORIGIN   1 CCACCATGTA CCCTGGTATT GCTGACCGCA TGCAGAAGGA GATCACTGCC CTTGCTCCTT  61 CCACCATCAA GATCAAGATC ATTGCTCCTC CCGAGCGTAA GTACTCCGTC TGGATCGGTG 121 GTTCCATCCT GTCTTCTCTG TCCACCTTCC AGTCCATGTG GATCACCAAG GATGAGTACG 181 ATGAGTCTGG CCCCGGCATC GTTCACCGCA AGTGCTTCTA AATGACTTCG TCTATATTTT 241 GATATCAATA AATGGACAAT AACAAATAAT CTTTATATGG TTTCCCTTCA AAACGAGAAT 301 TAATCAATAG TCGAGCCAAG TGAACAAAGA TGAAGCTTAC ACCTGCCCGG GCGGCCGCGA 361 ATTCAGGATC CTACAATCAA GCTTATCGAT ACCGTCGACC TCGAGGGGGG GCCCGGTACC 421 CAGCTTTTGT TCCCTTTAGT GAGGGTTAAT TGCGCGCTTG GCGTAATCAT GGTCATAGCT 481 GTTTCCTGTG TGAAAATGGT ATCCGCTCAC AATTCCACAC AACATACGAG CCGGAAGCAT 541 AAGTGGAAAA GCCTGGGGTG CCTAATGAGT GACTAACT (7)该载体选用的靶基因为对虾白斑杆状病毒的DNA聚合酶基因,该序列为: LOCUS       DNAPOL      8520bp   DNA                   30-APR-1999 BASE COUNT      2703A  1591C   1861G  2364T ORIGIN   1 ATAGTACCCG TTCATAATTT TCGGTATTTT CCCCAGACAA ACAAATACCA TTTTTTACTT  61 TTAATTGTTT AAAGTCTTCC ATTTTTATAC CGTGTAACCC TAACAATGGT GTGCCAGTAT 121 AATAAATCTA CGGACCATGC TCTTGATCTG GGAAGTGTAC TCGTGATTTC TGTAGAAATT 181 GCTATTTCCT ATTCATTATT TCCATTACAG GAAAGATGA TAAAATGAAG ACGTGCGATG 241 AGATATGTGT TTTTTCAATA TCGTATATCA AATTTGGGCA AATTACATAT TTTTTAGCGT 301 CAACACTCAT CTTCATGCAA GACTTTTTGG AGTGAAATTA CTAAAAAAGG CTATATTTCA 361 TGTACAACAT AAAACACATG TGCAGACATT AAATTGGTTT GCTTCACCCC CCCAACATCG 421 TTTTCATCAA CTCTTTCCTC ACCTCTATAT AAAACCAGCC TGCACCCCCT CGGAACCCAC 481 AGTCGACTTG TACCCTCCGT CGAGATGACA TCTCCAGCTC CATCACCCTC TTCCACCCCC 541 AAATCCAGTT GTACCACTAT TGTAAACCGA TGTGGTTTCC TCCTTGACAA CAACAAGGAA 601 GTGGTCATCT ACGACACCAA TTCCAAATTC AAGTGTGAAC CCAAAAATCT GGAACTAATT 661 GGTGTACTTT CTGGAGTCTC TGATAATGTT GTTACCCAGA TATCCCCCGA CCAGATATTT 721 GTGGGAACAT ATATGGTCAA ATATAACTGG TCTAAATCTG GTCATGAACG CTTCAGTGAC 781 ATGAGTAACA ACTGTCTGGA CAATATTACA CGCCCTTCAG AAGTGATTGA AAGTGTGATA 841 AAGAAAACGT CCAGCGACTT TAAAATGAAG TACACACGTT CCTTGATGGA CCACACCGAG 901 AAATACTATT TTTCTGGTGA CCAAAAATTG AGCAAAATTA GTAGTTGGTG TACACCCCTA 961 TACGACAGTG GGTATGCAAC TCCGTCTAGA AAACTTTGTC AAGGAAGAAC ATGAAACTGT    1021 CGTGGTGCAC AACCCTTCTG GAATGACTGG ATTCAACATA TTTAATAGTT CCCCCGTGTA    1081 TTTTGAAGTG CACAATGAGA TGGACGCCCT AATTTTTATG GCGGCTTTCT TGAAGCACAA    1141 TAGTTTATGG GGAGAAATTA ACGCCAATAT GGACTTGTAC ACGTTTGATT ATGCGGGTGC    1201 TTTTCTGGAC GAAAGATGGT GCCACCACGA GAAGAGTTTT TCTGTCGTCC GAGCACAACT    1261 TATCAACTCG TATTACAAGT GCAGGAGAAA AATCATGCAA GCCCTGGACA ATAACTACAA    1321 CAACAAGAAT AAGAAGAGGA AGAATGTTGG TGGAGCACCT GCGTTCACAT TTATGAGCGG    1381 GGACGGAGAG GGAGGAAAGG AAGCCCTAGA AGCTAGTTTC GATGTGATTG GGGGAACAAG    1441 AGGAGGAAGA TTTGGTGTTG ATTCAACACC ATGCCCCCAT TCTTCAGCCA TGCAACTAAA    1501 ACTGGACAAT GAAGGAAACT ATGGATGTAT TGCCTGCTTC GCATCAATGT TCTTTGTATT    1561 GGAGAACCCA GGTGATGAAT CTTCCTTCAT ATCAACGGAT GCCTCTAAAA TTGGACAAGC 1621 GCAAGCATGG ATAGATGAAC GACTACGAAA CAATGAAAAT GGAGGAGAAG AAAATAATGT 1681 CTTTAAAAAG ACCTTCCATA TGCTGGCTGA TATTACCCAA AAGGCTCATG AAACTGCCTA 1741 TTCCAATACC ATCCCACTTG GACCCAATGG CAGGCAGTGG AATTGGCCTA CTCACACTGT 1801 GGAACCTATT GCCCATGAAT TTGTTACCCA TTCTCTAGTA AACACATTGA AAAATCTAGG 1861 GGATAGAAAA CTTCCCCGAT TCAATTTTGA TATCTTGTAC AACTTGCTTA ATCCATTTGG 1921 AAAAATGTTG CTAGTGTTTA TTCAAAATTG TCACATTTTA ACTGGACATA AAAACAATGA 1981 AAATGTGGTG CCTCGAGGTT CTGCTTCTGG GAAGTGGTGG ACTATTAATT TTGTGGGTGT 2041 GAACATGTGG ACTTTTCAAG TAACAAAATG TAAAGTTGAA AAGGATAGAA AAATATCCGA 2101 TTTGGCCTGT ATGGAAACTC TCCCTCGTCT ACCTAATCCA GGAAGCACTA CCGTCGATGA 2161 CAGAATAGTT TTTAAGGGAT TCTGTAGAGG GGAAAATCTA GGGAGTGTAG GTGAAGTCGT 2221 ATCCGACATT ACACAGAGTG TCAAGAATTT TTGTCTCATG GTTGAAAATA GGAAATTTAG 2281 TGTGGATAAA GAAACTGGTT TCATCTCTTC AGAATCGATA GTGTCTGATC CCTTCTTTTC 2341 ACTAGAAGTG ACTGGCTGTA GATCTAATCG TGCCCAAGAT ACTATTAATA ATGGCCGAGT 2401 TAGTGCTCGT GTAATGAGGA TCCTAAAGTC ACGTGAAGGT GCTCGTGTAT GGTTGGCCAA 2461 GGATGAAAAT GCCATCATCT TTGAAAACGT TAACCACGAT ACGGCCATCT CTACGGACGC 2521 TATGGAGCGA GCTATAGGGC AGCACAAGAT ACTGTACTAT GATATTGAAA CAACAGATAA 2581 AGATTTCACC GACAAAAAAT CAGTCATCAC ATCTATTGGG TTCTGTTTGT GTACGGGAGG 2641 CGATATGACA CATGGAGGAG AGAGAGGAGT ATTTGGACTG GTTGCACCTG GATCCGACGT 2701 GGAAAAGGTG AAAGAGACTA TAATAAATTC GTACGATCCT GAAGAAAAGG AAGACATTAT 2761 GAAACAGTGC CCTCAAGTGA TTGAAATTTT CACCAACGAG TTTGAAATGT TGCTTGGTTT 2821 TGGAAAGTAT ATAGATAAAG TGAAGCCTCA CGTGATTAGT GGGTGGAACA ATGTAGCTTT 2881 TGACGACCCC TTTGTCTTTA CTCGTATCGT CAAACATTTG AGTGATCACA CCAAAGACAT 2941 GTCTTATTGT GTAGCAGATG CATCTACAGC AGAATCTGTC CTTCCTAGAG CAACAGAAGG 3001 AGGAGGAGGA GAAACTCCAT ATAGATTGAG CACCCCTCAA GAAAGAATAC AACTAGCAAG 3061 CACTGGTATT TTCAATAAAT TGGGAAAATT TGTAGACAAG AAAACTGGCA TGTTGAAACC 3121 TGAAATGACT GCAGATTTAT TGGCCGGGGC AGAAAGTCAG GCCAATACCA AGTTTAAGGA 3181 ACGCAACAAG TTATCCTCCA GTAATAAAGG ATCAGCAGGA TGGTTCCAGA AAATTATTGG 3241 CGGTATGTGC AGTGCTATTC GGTTGGATCT CATGAAAGTG TGCGAAAAGG CCTATAAAGA 3301 ATCCCTCTCT GAATTTAATT TGAACGCCGT GCTCGCCAAA GTGAGTAGTG TCGGCGACAA 3361 GGTTAAAAAT GTAAAAGATG AAGTAGACCT ACACTTTCAT CTATTGGGAT TCTTGAAGCT 3421 GAAGAAGGCC CAGGATCAGG CAAAAGTACA CGTCTATTGT TGCAAGGATG CCTACTTGAC 3481 TGGTATAGTT TCTACCTCCA TCAACAAGGA AGGGGAGATT TTTAGGCTGT GTATGGACTC 3541 TGCTTTAACC GAGGCGGTCG TGACAGCCAA CCTGGCCACT CCTCTATGTA TAGGAGAAGG 3601 AGCAATCTGT AGAAATATGG GAGAAGAAAG GGCAGATAGA AGAGGTGTGG GAGTAAGAAG 3661 ACACTCTATT GCCACAGACA CAAAGGGAGG TATGGTGAGT CAACCTATCG TCAATCATGT 3721 TCCCTATCAA ACGATTGACA TGACAAGTTT GTACCCGATG ACCATGTGTC AGAATAATCT 3781 GTGCACCACT ACCTTTGTGA CCCATCGACA AATTATGCAA CTGAGGGATA GATTGGTACT 3841 TGAAAAAATG AAAAACAAAA CCACCGACTC TTTATTGTTG TTGGACGTTA TTGACGAGTG 3901 CAATCAGATT GTGTTGTCCG AGTACAGACC CATTGATATT GCAGTCGCAT CATGGAAGAA 3961 TAGCAACTCT AATAGACAAA CTCCAATTAC TCGCATAGAG GAAAGTTTGG GTCTAAGATT 4021 CATAGAAAAT TTGGATGCCG AGAAGACAAA TAATAAAACG TGGTGCACCA ATACATCTCC 4081 CAATATGAAT GTCACTGCCG CAGGTATGGA TTACTTCCCC GAGATTGTGT GTGACATTAA 4141 TATGCAGTTT GCGGCCAAGG TGAATGATGA TATGCATATA GCCCCAGCAA GTTTAGAGTA 4201 TATGCTTCAA GTATTGCCCA TAATGTTAAT CGACAGACCG TACATTGGCG CACACATAAC 4261 AGCTGGAAAA TGTCGTACAT TGGAGGATAT TCTCTCAGAA CTCGAAAAGG ACTTTTCTGT 4321 TGAAAAAGAT GAGGAAATTA TAAGAACCCA TTGGACATTT AAGGGTCAAA AACAATACGA 4381 TTTCTGTCAT AGTCCTGTGA CCCAAATGGC TCGTCACATT ATTGAATCTA CGGGAAGAAA 4441 TATCCGTGAT TATGAAGGCA ATGAAAAATT CGAGAGGTTG GTTAGCTTAT CAGACAGAAT 4501 TTATCGCCGC GTTGGCGCAT TTGATTCGGC CAATGATCCA GCTGTTAGAC TGTGGTCTTC 4561 TCGTCTAATC AATGTTGGAA TGTTGGTTAG GACATGGAAC GTAAAAACTG ACATTCTTAA 4621 GGGAATCATC CCTCAAATGC AAGCCACTTA CAGAGCCGAT CGAGTTGTGA TGCAGAACAA 4681 GGCCAAGGAG TTTGCCAAGA TGGGAGACAT GAAAAGAGCT GGTCTAAACA AAGTTGGACA 4741 AAATATTATG AAGCTCGGTA TGAATTCCAT GTATGGTCAT TTGGCCCTAA GAGCACGTTC 4801 GAGCCGTAAA GAGTTTGCGT CTGGATCTGC CAATACTGCC TCAAGTATTT CCAACATGTC 4861 AGCCACCGGA GGAATTGGAG GAGGCACAAG GCACTCGGTG ACGGCCAATC AGATTACAGA 4921 AAATGCTCGA TGTGTATTTG GCAATATTGG TTGTGGATTA CAGATGGCTC TTCCTGGTAC 4981 TAAGCAGACG TACGGGGATA CAGATTCTGT ATTCTGCGTG CATAATATTG TAGGTGATGG 5041 AGGAATGATA CCAGAATATG ATGAACAAAC TGGCAAATAT TATTATGTGA TGGATATTGC 5101 TCTAAAAAAT AAAATGGCTG CAATTATTCC CATCCTAGTC AACTCGTTAA CAAAGGGCAT 5161 CCAGTTTGTA GAGCGCCGAG ACGCTGGTGT GGGCATGATG AATATCGCCC ATGAACGTCT 5221 AGCTGTCGCT GGTCTTTTGT TTGCCAAGAA AACATACCAT ATGCTTCACT TTAATGAAAA 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6961 TGAAGAAAAA CCATTAATGG GTGTGCCTTT TGAAGTTGCA CTCAATTCTC TAATAGGAAA 7021 ACACAAGTGC ACAGATACAT GCGACATGGC TTGTTGTCAA TCATTGTATT TTGTCCTCTT 7081 GTACACGCTA GCTTTAAAAT TTGAGAACGA AAGATTGGCC CGGCAAATTG GCCTAGATGA 7141 CTCTGTAGAT TTGATGGCTG AGATGTTGTT CGGAGGGGAT AAACTATTGG CCCAGGAAGT 7201 GTTAAAAAGG GTAAAAGATG CTCAAGATAG AAAGTTGGTG AAATCTTTAT TGCCTTTAAA 7261 TTATAACCAT GACACAAATA CAATTATATT TTTGTTTGAG TCTTTAAGGT TTGCTCAGAA 7321 ACCTGTAGCT GGTATGAGTG TTAGTGAAAT AAAAGACGCT GTTAGAGGTC TGGCCTTTTC 7381 TACCACTACA GGTACTGTGT GGAATTATAC TGATGAAAGA TTTTTTGGAC CATTGTATAA 7441 CATGGATGAA CTTTGTAACG AACGTGTCAA TGGAAATTGT AAATTGTCCT TTATAACTGG 7501 TATTTATCAT ACGGCAGCAG TAGAATTGGC TGCTGCATGT CTATCTTGTG TTTTGTAAGA 7561 AATGATAATA AAAAACATGT ATAATTTCAT TCTGGTTTTT ATTTTATATC CTCAAGAGTT 7621 GTAGTAGTAG CAGCAGCAGC AGCAGCAATA GCAGCATTAT TTTCAGCGAC AGCTTCTTCA 7681 TTTCTATTGA TTGATATCTG GTCATTTTCT ACAGCCCATG GTCGTTTAAG GAATATTCTT 7741 TGAAGCAGAA ACACATACCC AGCAATGATT GCAATGATCA ATATTAATAG TAGCGAATTA 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