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核酸靶分子修饰及扩增的方法

基本信息

  • 申请号 CN00111339.9 
  • 公开号 CN1287176A 
  • 申请日 2000/09/12 
  • 公开日 2001/03/14 
  • 申请人 吴昌 吴明  
  • 优先权日期  
  • 发明人 吴昌 吴明  
  • 主分类号  
  • 申请人地址 266003山东省青岛市红岛路45号3单元202户 
  • 分类号  
  • 专利代理机构  
  • 当前专利状态 发明专利申请公布 
  • 代理人  
  • 有效性 发明公开 
  • 法律状态
  •  

摘要

一种核酸靶分子修饰及扩增的方法,其特征是互补靶分子有特异性的3’端部分与非特异的5’端部分,3’端特异部分与所需扩增的靶分子具有专一的互补关系,在设定的反应条件下与靶分子杂交,互补靶分子的5’端部分为共有序列做为模板被靶分子的3’末端复制,用非特异性的引子经PCR进行扩增。
本发明能简化分子检测过程,节省人力物力,降低成本。
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权利要求书

1.一种核酸靶分子修饰及扩增的方法,包括对核酸分子进行片段化处 理,使片段化了的分子链的5'末端与已知的核酸分子链偶连,偶连后的核酸 靶分子在互补靶分子及聚合酶的作用下,以其3'末端为引子复制互补靶分子 的5'端部分,最后靶分子在与两端新序列相对应的引子的作用下经聚合酶链 反应而得以扩增,其特征是互补靶分子有特异性的3'端部分与非特异的5'端 部分,3'端特异部分与所需扩增的靶分子具有专一的互补关系,在设定的反 应条件下与靶分子杂交,互补靶分子的5'端部分为共有序列做为模板被靶分 子的3'末端复制,靶分子在经与互补靶分子杂交前后的二次修饰后,用非特 异性的引子经PCR进行扩增。
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说明书

本发明涉及一种核酸靶分子的修饰及扩增的方法。
对核酸包括脱氧核糖核酸(DNA)及核糖核酸(RNA)进行分子检测时, 需把核酸样品中的靶分子进行有选择的扩增(复制出多个同一分子)。
靶分子 是须检测的核酸片段,其结构特征可以代表所属生物体的遗传特征。
靶分子 可以是DNA、RNA或是在体外由RNA经逆转录成的DNA。
扩增得到大量 的靶分子后,用分子生物学技术可以测定靶分子的结构特征,从而得知所提 供的核酸样品的生物体(病人)的遗传特征。
目前,对核酸中的靶分子进行 扩增多采用聚合酶链反应(PCR)。
对一个双链DNA靶分子进行聚合酶链反 应时,要有二个对靶分子具专一性的、方向相反的单链核酸小分子,即引子。
引子是由化学方法合成的单链的DNA分子,能与靶分子进行分子杂交,其长 度一般为10-50碱基。
分子杂交是单链核酸分子之间通过碱基配对原理进行 结合形成双链核酸分子的过程,能进行分子杂交的二个单链分子在结构(序 列)上的关系是互补关系。
互补靶分子是指能与靶分子杂交的核酸分子。
一 个引子与靶分子中的一条分子链进行杂交,并在聚合酶的作用下有选择性地 复制靶分子,反复此过程可得到大量的靶分子。
现已经知道,造成一种遗传 病的基因位点变化可以不止一个,也就是说,要检测一种或多种遗传病时, 所需扩增的靶分子种数可达数百以上。
所述的基因位点是指核酸结构中特定 的碱基位置。
基因是核酸功能性的划分或具一定功能的核酸片段,具一定的 结构特征。
进行分子检测时如用常规的PCR方法,需要合成大量的引子,并 用大量的反应分别对靶分子进行筛选和扩增。
这种做法所需要的人力和物力、 费用都很大。
如把多个引子组合在一个PCR反应中时,这些引子之间的相互 作用会产生副产物,因而影响靶分子的扩增。
本发明的目的是提供一种对多个不同的核酸靶分子进行选择性的修饰然 后加以扩增的方法,它能克服现有技术的上述不足。
一种核酸靶分子修饰及扩增的方法,包括对核酸分子进行片段化处理, 使片段化了的分子链的5'末端与已知的核酸分子链偶连,偶连后的核酸靶分 子在互补靶分子及聚合酶的作用下,以其3'末端为引子复制互补靶分子的5' 端部分,最后靶分子在与两端新序列相对应的引子的作用下经聚合酶链反应 而得以扩增,其特征是互补靶分子有特异性的3'端部分与非特异的5'端部分, 3'端特异部分与所需扩增的靶分子具有专一的互补关系,在设定的反应条件 下与靶分子杂交,互补靶分子的5'端部分为共有序列做为模板被靶分子的3' 末端复制,靶分子在经与互补靶分子杂交前后的二次修饰后,用非特异性的 引子经PCR进行扩增。
本发明的优点是能同时对大量的靶分子进行选择性修饰,然后用少量几 种通用引子对大量种类的靶分子进行扩增,能简化分子检测过程,节省人力 物力,降低利用核酸进行分子检测的成本。
用本方法对靶分子进行扩增后, 靶分子的结构特征可以通过杂交,序列测定,分子质量,分子大小,电荷量 与分子量比值等进行测定,特别适用于生物芯片使用过程中的样品制备。
本 方法可用于测定动物,植物,微生物及病毒的基因型或其核酸量的多少。
应 用本方法可以制造有商业价值的试剂盒,或从事分子诊断服务。
下面通过实施例说明本发明。
对一可疑犯进行基因型鉴定,并与现场采集的血样的基因型进行比较。
从这二个样品中分别提取核酸,用限制性内切酶对每一样品中的0.1微克的 核酸进行片段化处理得到小分子,用已知的方法使之与一双链核酸进行偶连 反应,从而得到在5'末端加长的单链分子片段,即靶分子片段,这是第一次 修饰。
然后加入一百余种互补靶分子,使其与靶分子杂交,同时用已知的化 学方法使互补靶分子3'端保持长度不变。
靶分子与性别、肤色、发色、面型 等相关。
互补靶分子的前半部(5'端方向)有一公共序列约20碱基长,其后 半部(3'端方向)具有专一性的与特定的靶分子相互补的序列(约20碱基)。
杂交后的靶分子的3'端可在聚合酶的外切酶活性的作用下除去单链的3'末端 部分,然后复制互补靶分子的5'端序列。
这是第二次修饰。
经过如上过程, 只有靶分子具备了二个经修饰而得的公用序列。
最后把一百余种的靶分子同 时用二个公用引子进行PCR扩增。
扩增后的靶分子被标记,然后在基因芯片 上与分子探针进行杂交,最后测得信号的位置与强弱。
通过测得的信号可知 被检者的基因型,因而得知其形态特征。
如现场血样的基因与可疑犯的基因 型一致,则可断定可疑犯必在现场;如果基因型不一致,可以通过基因型而 推断出的形态去寻找相关人物。
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