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基因重组降钙素或降钙素类似物的制备工艺

基本信息

  • 申请号 CN00111438.7 
  • 公开号 CN1303868A 
  • 申请日 2000/01/13 
  • 公开日 2001/07/18 
  • 申请人 中国人民解放军第二军医大学  
  • 优先权日期  
  • 发明人 毛积芳 窦鸿  
  • 主分类号  
  • 申请人地址 200433上海市翔殷路800号 
  • 分类号  
  • 专利代理机构 中国人民解放军第二军医大学专利事务所 
  • 当前专利状态 发明专利申请公布 
  • 代理人 丁振英 
  • 有效性 发明公开 
  • 法律状态
  •  

摘要

本发明涉及基因重组降钙素或降钙素类似物的制备工艺。
先化学法合成降钙素或降钙素类似物前体基因片段,再拼接成全长基因,其C末端是丙氨酸或亮氨酸或其它可以被羧基肽酶-Y水解的氨基酸密码,以便用羧基肽酶-Y对其表达产物进行C末端修饰,修饰时加入邻硝基苯甘氨酰胺为取代亲核试剂,使降钙素或降钙素类似物前体的第33位被邻硝基苯甘氨酰胺取代,成为光敏感的产物,经光解得线形降钙素或降钙素类似物,再通过复性,获得具有与天然降钙素活性相当的产物。
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权利要求书

1.一种基因重组降钙素或降钙素类似物的制备工艺,包括:
1.1.构建降钙素或降钙素类似物前体基因及其含克隆载体 pGEM-降钙素或降钙素类似物前体基因的工程菌;
1.2.构建含降钙素或降钙素类似物前体基因融合表达载体 pGEX-降钙素或降钙素类似物前体基因的工程菌;
1.3.降钙素或降钙素类似物工程菌的发酵;
1.4.分离、纯化降钙素或降钙素类似物前体;
1.5.降钙素或降钙素类似物前体的酰胺化及复性成为成熟 降钙素或降钙素类似物;
1.6.降钙素或降钙素类似物活性的测定; 其特征在于构建降钙素或降钙素类似物前体基因时,首先 按降钙素或降钙素类似物前体的氨基酸序列,用大肠杆菌的偏 爱密码编码成若干基因片段,并化学合成基因片段,再拼接成 降钙素或降钙素类似物前体的全长基因,所拼接成的全长基因 C末端为丙氨酸(Ala)或亮氨酸(Leu)或其它可以被羧基肽 酶-Y水解的氨基酸的密码子,以便使由大肠杆菌表达出的产 物,可用羧基肽酶-Y进行C末端酰胺化。
2.根据权利要求1所述的基因重组降钙素或降钙素类似物 的制备工艺,其特征在于降钙素或降钙素类似物的前体采用羧 基肽酶-Y进行酰胺化时,同时加入邻硝基苯甘氨酰胺(O- PNGA),使得降钙素或降钙素类似物前体的第33位被O-PNGA 取代,得到光敏感的降钙素-O-PNGA或降钙素类似物-O- PNGA,该产物经光解得线形降钙素或降钙素类似物,并可通 过空气氧化折叠,重建二硫键,得到具有生物活性降钙素或降 钙素类似物。
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说明书

本发明涉及医药技术领域,是一种基因重组降钙素或降钙素类似 物的制备工艺。
降钙素是一种内源性的含32个氨基酸残基的钙调节激素。
主要 作用于骨。
现已从多种动物分离得到降钙素(人、鼠、牛、猪、鸡、 鲑鱼、鳗鱼、蛙),并化学合成其中5种或降钙素类似物。
临床使用 的为鲑鱼降钙素、人降钙素、猪降钙素及鳗鱼降钙素的类似物。
现 降钙素临床适应症主要包括:高钙血症、佩吉特病、骨质疏松症、 维生素D中毒症、骨痛症、急性胰腺炎。
由于降钙素的实用价值,全世界许多公司和厂家正在研究生产 降钙素的新方法或新工艺。
目前,市场上的商品均为化学合成,由 于其工艺复杂,对硬件设备、合成试剂、生产环境要求苛刻,使得 产品成本昂贵、规模化生产的固定投入巨大,且易污染环境。
本世 纪80年代生物技术特别是基因工程技术的发展,为生物合成多肽、 蛋白质奠定了坚实的基础。
M.Yabuta(Appl Microbiol Biotechnol 42:703-708)和Martha V.L.Ray(Bio/Technology,1993,11:64-70)等通 过基因工程生产降钙素都是先由大肠杆菌表达得到羧基端(C末端) 为甘氨酸(Gly)的降钙素前体,再经α-酰胺化酶(α-AE)的作用, 加工为成熟重组降钙素。
这是由于大肠杆菌原核的表达系统不具备 翻译后酰胺化修饰作用,因此所得的C末端为Gly的由33个氨基 酸组成的降钙素前体,必须用α-AE才能修饰C末端产生成熟降钙 素,但问题是α-AF尚未商品化,通过生物提取或基因工程得到α-AE 工艺复杂,不仅造成降钙素生产周期延长,又提高了成本。
也有研 究通过使用具有乙酰化功能的细胞来实现C末端酰胺化的,例如 Silvia Merli等(Protein Expression and Purification,1996,7:347-354) 将人降钙素基因克隆在真核表达载体pRC/RSV上,转染具有酰胺化 作用的鼠垂体细胞(AtT-20),经G-418抗性筛选,得到分泌成熟重 组人降钙素的细胞株。
但是由于产率极低,故至今该酰胺化线路只 能停留于实验室阶段。
因此,基因工程制备降钙素的关键是C末端 酰胺化。
本发明的目的是改革上述基因工程的制备工艺,提供一种工艺简 单、成本低廉、不造成环境污染的生产降钙素或降钙素类似物的新 工艺。
本发明利用基因工程制备降钙素或降钙素类似物主要在C末端 酰胺化方面作了至关重要的改进: 1.使大肠杆菌基因表达的降钙素或降钙素类似物前体C末端为 亮氨酸(Leu)或丙氨酸(Ala)或其它可被羧基肽酶-Y水解的氨基 酸,以便使用已经商品化且价格低廉的羧基肽酶-Y进行C末端酰 胺化。
2.采用羧基肽酶-Y修饰降钙素或降钙素类似物前体时,加入邻 硝基苯甘氨酰胺(O-PNGA),使降钙素或降钙素类似物前体的第33 位氨基酸被O-PNGA取代,成为光敏感中间体,再通过光解作用, 就得到C末端为NH2的线形肽。
此举提高了酰胺化效率,降低了酰 胺化的成本。
本发明利用基因工程生产重组降钙素或降钙素类似物,主要步骤 如图1所示,包括: 1.合成降钙素或降钙素类似物前体基因片段 为提高降钙素或降钙素类似物在大肠杆菌中的表达量,按照降 钙素或降钙素类似物前体的氨基酸序列,用大肠杆菌的偏爱密码, 编码成若干基因片段,使位于全长基因C末端为丙氨酸(Ala)或亮 氨酸(Leu)或其它可以被羧基肽酶-Y水解的氨基酸的密码子,以 便使由大肠杆菌表达出的产物,可用羧基肽酶-Y进行C末端酰胺化。
基因片段采用亚磷酸二酯法由ABI 391 DNA合成仪合成。
2.构建含降钙素或降钙素类似物前体基因的克隆载体的工程菌 将合成的基因片段按常规用《BASIC METHODS IN MOLECULAR BIOLOGY》方法拼接起来。
首先将片段磷酸化,再加热至96℃后, 退火到室温,拼接成全长降钙素或降钙素类似物前体基因,然后通 过连接酶的作用与经BamH1、Xho1双酶切的pGEM-7z克隆载体 相连接,成为pGEM-降钙素或降钙素类似物前体克隆载体,转化大 肠杆菌,根据α互补作用筛选含pGEM-降钙素或降钙素类似物前体 基因的阳性克隆工程菌。
3.构建含降钙素或降钙素类似物前体基因的融合表达载体的工程 菌 将含有pGEM7z-降钙素或降钙素类似物前体基因的单菌落和含 有pGEX-4T-3质粒的单菌落分别于LB培养基中扩增,纯化质粒, 用BamH1、Xho1双酶切,再通过琼脂糖凝胶电泳回收降钙素或降 钙素类似物前体基因和双酶切完全的pGEX-4T-3载体片段,按降钙 素或降钙素类似物前体基因:双酶切完全的pGEX-4T-3载体片段为 1∶3的摩尔量比进行连接,形成pGEX-4T-降钙素或降钙素类似物 前体基因,转化大肠杆菌,获得工程菌。
将其质粒DNA经双酶切和 DNA测序鉴定插入序列后,进行融合蛋白诱导表达的鉴定。
4.降钙素或降钙素类似物工程菌的高密度发酵 将工程菌接种于LB培养基,37℃培养过夜,作为一级种子,次 日将一级种子接种于含2%甘油的2-YT培养基中,37℃振摇培养, 用作二级种子(详见Lee SY,TIBTECH,1996,14:98-105),然后 将二级种子接种于发酵培养基的发酵罐中进行补料分批培养。
整个 发酵过程pH控制在7.0左右,溶解氧在35%左右,搅拌速度逐渐 增大,最高转速每分钟800转(详见M.Yabuta,Y.Suzuki,K.Ohsuye. Appl Microbiol Biotechnol.1995,42:703-708)。
5.分离纯化降钙素或降钙素类似物前体 按常规采用亲和层析从高密度发酵获得的菌体中纯化得到谷胱 甘肽巯基转移酶-降钙素或降钙素类似物前体的融合蛋白,经酶或化 学裂解,再经离子交换层析、反相凝胶脱盐,获得高纯度的降钙素 或降钙素类似物的前体。
6.降钙素或降钙素类似物前体经体外酰胺化,复性成为成熟降 钙素或降钙素类似物 将含1mM EDTA、200mM O-PNGA的溶液用5N NaOH调pH值到6.0, 加入降钙素或降钙素类似物前体、羧基肽酶-Y,于35℃保温,反应 完成后用RP-C18脱盐和纯化,冷冻干燥,得到光敏感的中间体降钙 素-0-PNGA或降钙素类似物-0-PNGA。
将产物溶解于60mM NaHSO3甲 醇-水溶液中,充入氩气5分钟,开始光解可得到线形降钙素或降钙 素类似物,反应完成后用RP-C18脱盐,再用高效液相(HPLC)纯化。
纯化得到的线形肽,经空气氧化折叠,重建二硫键[以二甲基亚砜, 半胱氨酸,K3(FeCN6)或谷胱甘肽为介质的系统],得到具有生物 活性的降钙素或降钙素类似物。
6.测定活性 按《中国药典》方法。
将体重为40-50g同一来源、同一品系、 同一性别的健康大白鼠,随机分成5组(对照组、生产样品高浓度 组、生产样品低浓度组、标准品高浓度组、标准品低浓度组),每组 10只,编号后,分别按顺序,尾静脉注射0.4ml相应浓度的降钙素 标准品、生产样品及空白稀释液。
给药后准确1小时,分别取血样, 用邻甲酚酞络合剂比色法测定血钙。
实验结果按《中国药典》附录 检定统计法中量反应平行线计算,随机设计法计算效价以及实验误 差。
并进行统计学可靠性检验。
附图说明: 图1本发明操作流程图 图2人降钙素类似物前体基因的拼接片段序列F1-F6 图3人降钙素类似物前体基因全长序列 图4高密度发酵不同时间蛋白表达量的电泳图谱 图5谷胱甘肽巯基转移酶-人降钙素类似物前体亲和纯化的电泳 图谱 图6人降钙素类似物前体电喷雾-质谱鉴定图谱 图7人降钙素类似物电喷雾-质谱鉴定图谱 图8鲑鱼降钙素前体基因全长序列 图9鲑鱼降钙素前体的基因片段序列F'1-F'8图10鲑鱼降钙素前体电喷雾-质谱鉴定图谱 图11鲑鱼降钙素电喷雾-质谱鉴定图谱 现结合实施例和附图进一步阐述本发明的制备工艺。
实施例1 基因重组人降钙素类似物的制备 一.材料与方法 1.限制性内切酶BamH1、Xho1购自Biolab,T4连接酶、T4激酶 购自Promaga。
凝血酶、羧基肽酶-Y购白Sigma。
2.菌种与质粒pGEM-7z(+)购自Promaga,pGEX-4T-3购自 Pharmacia Biotechs。
DH5α、TG1购自Promaga。
  3.放射性同位素α-32P-dATP北京亚辉生物医学公司。
4.琼脂糖、生物琼脂购自Sigma,酵母粉、蛋白胨购自Oxid。
5.质粒抽提、凝胶回收试剂盒购自上海华舜生物工程公司, T7sequencingTMKit购自Pharmacia Biotechs. 6.Glutathione Sepharose4B、SP-Sepharose Fast Flow resin、 G-25购自Pharmacia Biotech,RP-C18购自Merk。
7.质粒DNA的制备及片段的回收按华舜生物工程公司试剂盒操作 手册。
人降钙素类似物基因测序按T7sequencingTMKit操作手册。
其它常规操作按Molecular Cloning[1982]。
8.高密度发酵参照[M.Yabuta,Y.Suzuki,K.Ohsuye.Appl Microbiol Biotechnol.1995,42:703-708]。
9.发酵产物的鉴定用SDS-PAGE法。
染色胶用BioRad DENSITOMETER 扫描。
10.融合蛋白的纯化按Glutathione Sepharose4B操作手册进 行。
11.降钙素或降钙素类似物的复性参照David Andreu,Fernando Alvericio,Nuria A.Sole Mark C.Munson,Mare Fer rer;and George Barany.(1994)in Methods in Molecular Biology.Vol.35: Peptide synthesis protocols(Pennington M.W.and Dunn B.M., Eds.),pp91-169, Humana Press Inc.,Totowa,NJ。
12.活性鉴定按《中国药典》降钙素的生物测定法测定注射降钙 素后大鼠血清钙下降程度。
二.具体操作 1.构建重组人降钙素类似物前体基因 1.1.重组人降钙素类似物前体基因片段的化学合成 将重组人降钙素类似物前体基因分为6个片段F1-F6(详见图 2),采用亚磷酸二酯法由ABI 391 DNA合成仪合成,经45℃过夜 氨解,产物用12%聚丙烯酰胺凝胶电泳纯化,再用G-25脱盐后备 用。
其中片段F3、F6退火后形成人降钙素类似物前体C端的编码 序列,含有Leu的密码子CTG。
1.2.拼接重组人降钙素类似物前体的全长基因及构建含克隆载体 的工程菌 在连接反应管中加入上述6个基因片段各20pmol,10倍浓度的 连接酶缓冲液3微升,T4激酶10单位,再加水19微升,使Tris- 盐酸、MgCl2、二硫苏糖醇的终浓度分别为50mM、10mM、10mM,置 37℃30分钟,再96℃2分钟灭活T4激酶,经30分钟退火至20℃ 左右。
取10微升退火片段溶液,加入6微升BamH1、Xho1双酶切 的pGEM-7z载体溶液、连接酶5单位,再加连接酶缓冲液2微升, 使Tris-盐酸、MgCl2、二硫苏糖醇的终浓度分别为50mM、10mM、10 mM,在14℃连接过夜。
吸取该连接载体溶液10微升,加200微升 TG1大肠杆菌溶液(约含106-107个感受态细胞),冰浴30分钟后, 42℃90秒钟,加入800微升LB培养基,37℃振摇培养45分钟后 涂板。
使用α-互补筛选阳性克隆,其插入序列的大小由双酶切和DNA 测序鉴定。
拼接成的人降钙素类似物全长基因为120bp,如图3所 示,其中包括5’BamH1位点(Ⅰ),3’Xho1位点(Ⅱ),两个终止密 码(Ⅲ),在GST与hCTa编码序列之间加入GAA构成V8裂解位点(Ⅳ), 是为了以后进-步通过酶加工得到与天然人降钙素完全一致的氨基 酸序列。
为便于体外酰胺化修饰,在人降钙素类似物C末端加Leu 密码子CTG(V)。
1.3.构建含重组人降钙素类似物基因表达载体的工程菌 分别挑取含pGEM7z-人降钙素类似物前体基因的单菌落和 pGEX-4T-3质粒的单菌落各于5毫升LB培养基中扩增后,利用质 粒抽提试剂盒纯化质粒,各取10微升质粒,经4单位BamH1、4 单位Xho1在37℃双酶切2小时后,用1.2%琼脂糖凝胶电泳回收人 降钙素类似物前体基因和双酶切完全的pGEX-4T-3载体片段。
分别 取人降钙素类似物前体基因溶液和经BamH1、Xho1双酶切的 pGEX-4T-3载体溶液按摩尔量比为1∶3混匀,加4单位T4连接酶, 再加连接酶缓冲液和水,使Tris-盐酸、MgCl2、二硫苏糖醇的终浓度 分别为50mM、10mM、10mM,在4℃过夜连接形成pGEX-4T-人降钙 素类似物前体基因,此产物为重组人降钙素类似物基因表达载体。
吸取该载体溶液10微升,加200微升TG1大肠杆菌(约含106-107个感受态细胞),冰浴30分钟后,于42℃水浴90秒钟,加入800 微升LB培养基,于37℃振摇培养45分钟后涂板。
阳性工程菌质粒 DNA经双酶切和DNA测序鉴定插入序列后,按常规进行融合蛋白诱 导表达的鉴定。
2.高密度发酵 3微升OD600=0.7的工程菌接种于3毫升LB培养基37℃培养过夜 作为一级种子,次日将3毫升一级种子接种于200毫升含2%甘油的 2-YT培养基中振摇培养至OD600=0.7用作二级种子,然后按常规将 二级种子接种于含3升发酵培养基的发酵罐中进行补料分批培养。
整个发酵过程pH控制在7.0左右并不断搅拌,为维持溶解氧在35 %左右,需要不断增加搅拌速度,转数从起始每分钟50转,逐渐加 大,在7小时左右达到最高速每分钟800转,然后供应纯氧,以维 持大肠杆菌的需氧量。
分批培养5小时后菌体密度达到5.3OD600, 随后进入10小时的补料培养阶段,菌体生长近10倍。
37℃培养12小 时,加入0.3mM的异丙基硫代半乳糖苷(IPTG)诱导目的蛋白表达, 随着目的蛋白表达量增加到一定程度,菌体的比生长速率明显减小, 生长趋势开始减缓故终止发酵。
发酵菌体终浓度53OD600、重量150 克/升,经SDS-PAGE鉴定,最终融合蛋白表达量占可溶菌体蛋白 25-30%。
诱导后融合蛋白表达量的变化,通过SDS-凝胶电泳图谱(图 4)可以明显地看出,加入IPTG后目的蛋白的表达量随诱导时间的 增加而增加。
图中泳道1为IPTG诱导0.5小时菌体蛋白,2为IPTG 诱导1小时菌体蛋白,3为IPTG诱导1.5小时菌体蛋白,4为IPTG 诱导2小时菌体蛋白,5为IPTG诱导2.5小时菌体蛋白,6为IPTG 诱导3小时菌体蛋白。
分子量30kDa的条带为目的蛋白,即谷胱甘 肽巯基转移酶-人降钙素类似物前体融合蛋白。
3.纯化人降钙素类似物前体 将100g大肠杆菌菌体置于1000毫升pH7.2的磷酸缓冲液中, 冰浴中超声破碎,加入20%Triton-X100至终浓度1%,静置30分 钟,15,000g离心25分钟,取上清液与40毫升Glutathione Sepharose4B混合,温和振摇30分钟,500g离心5分钟,将沉淀 装柱,磷酸缓冲液洗脱至OD280<0.02,再用3倍于柱体积缓的冲 液(10mM glutathione,50mMTris-HCl,pH8.0)洗脱,洗脱样品 用SDS-凝胶电泳分析结果见图5,可溶性的菌体总蛋白经过亲和树 脂纯化,获得的目的融合蛋白(谷胱甘肽巯基转移酶-人降钙素类似 物前体)纯度大于90%。
泳道1为标准蛋白,2为纯化后的目的融 合蛋白。
3为纯化前可溶性的菌体总蛋白。
分子量约30kDa处为目 的融合蛋白。
用Bradford方法测定洗脱液中的蛋白含量,按100ug 融合蛋白加入1单位凝血酶,于25℃酶切20小时。
加1M二硫苏糖 醇至终浓度10mM,用浓盐酸调至pH2.0,过SP-Sepharose Fast Flow 柱。
用1号液(2M Urea,10mMHCl)洗脱至OD280<0.02,换2 号液(2M Urea,10mMHCl,100mM NaCl)洗脱,用分光光度计220nm 下检测,收集吸收峰的洗脱液。
过RP-C18脱盐柱,先用3号液 (5%CNCH3∶95%H2O∶0.1%TFA)洗脱至OD220<0.02后,再用 4号液(50%CNCH3∶50%H2O∶0.1%TFA)洗脱,收集样品,冰冻 干燥。
用高效液相(HPLC)分析产物,条件是甲流动相为 0.5%CNCH3∶0.1%TFA,乙流动相为90%CNCH3∶0.1%TFA,流 速为每分钟1毫升,线性梯度为30分钟内乙流动相由0到60%。
分析结果表明产物纯度大于90%。
用电喷雾质谱鉴定人降钙素类似 物前体见图6,图谱说明人降钙素类似物前体的分子量为3805,与 理论计算值完全一致。
4.体外酰胺化 将含1mM EDTA、200mM O-PNGA的溶液用5N NaOH调pH值到6.0, 加入人降钙素类似物前体至终浓度1mM,再加羧基肽酶-Y30微克, 置35℃水浴90分钟后用RP-C18脱盐,冷冻干燥得到光敏感中间体 人降钙素类似物-O-PNGA。
将其溶解于60mM NaHSO3甲醇-水(甲醇∶ 水=1∶1)溶液中,充入氩气后进行光解,可得到线形人降钙素类似 物,反应完成后,RP-C18脱盐,冷冻干燥,用HPLC纯化产物,条件 是甲流动相为0.5%CNCH3∶0.1%TFA,乙流动相为90%CNCH3∶ 0.1%TFA,流速每分钟1毫升,线性梯度为30分钟内乙流动相由0 到60%,得到的线形人降钙素类似物的纯度大于95%。
5.复性 将1mg线形人降钙素类似物溶于1ml乙酸-水溶液(乙酸∶水=1∶ 19)中,加(NH4)2CO3调至pH6.0,于37℃保温4小时,复性完成 后,用HPLC进行纯化,条件同上,所得人降钙素类似物的纯度大于 98%。
用电喷雾质谱鉴定人降钙素类似物,结果见图7,图谱说明人 降钙素类似物分子量为3691,与理论计算值完全一致。
6.测定活性 按《中国药典》方法。
将体重40-50g同一来源、同一品系、同 一性别的健康大白鼠,随机分成5组(对照组、人降钙素类似物样 品高浓度组、人降钙素类似物样品低浓度组、标准品高浓度组、标 准品低浓度组),每组10只,编号后,分别按顺序,尾静脉注射1×10-2单位/毫升和5×10-2单位/毫升两种浓度的降钙素标准品和人降钙素 类似物样品0.4ml/只,对照组注射空白稀释液0.4ml/只。
给药后准 确1小时,分别取血样,用邻甲酚酞络合剂比色法测定血钙。
实验 结果按《中国药典》附录检定统计法中量反应平行线计算,随机设 计法计算效价以及实验误差。
并进行统计学可靠性检验。
结果见表1。
表1.人降钙素类似物活性测定结果   人降钙素类似物样品
        标准品
0.01单位
0.05单位
 0.01单位
  0.05单位
7.31
6.99
6.24
7.04
7.15
7.38
8.51
7.16
6.63
7.26
5.85
5.84
6.59
6.20
5.85
5.61
6.30
5.89
5.81
5.46
 7.52
 7.58
 7.55
 6.81
 7.16
 7.37
 7.58
 6.62
 6.87
 7.37
  6.59
  5.53
  6.03
  5.28
  5.58
  5.99
  6.15
  5.66
  5.59
  6.12
统计结果:平均可信限(FL%)=23.890,效价:180国际单位/毫 克。
表1及统计结果表明人降钙素类似物具有显著的降血钙活性, 效价与天然人降钙素单位比活一致。
实施例2 基因工程生产鲑鱼降钙素 1.构建重组鲑鱼降钙素前体基因 1.1化学合成重组鲑鱼降钙素前体基因片段 将鲑鱼降钙素前体基因分为F1′-F8′,8个片段合成,详见图8, 操作过程同实施例1中1.1。
其中片段F1′-F8′退火后形成鲑鱼降钙 素前体C端的编码序列,含有Ala的密码子GCT。
1.2.拼接重组鲑鱼降钙素前体的全长基因及构建含克隆载体的工 程菌 操作同实施例1中1.2。
拼接的重组鲑鱼降钙素前体基因全长序 列见图9,全长基因120bp,包括5’BamH1位点(Ⅰ),3’Xho1位点(Ⅱ)、 两个终止密码(Ⅲ)、谷胱甘肽巯基转移酶与鲑鱼降钙素前体之间加 入溴化氰裂解位点蛋氨酸密码子ATG(Ⅵ)和为便于以后的化学修饰 位于鲑鱼降钙素C末端的丙氨酸密码子GCT(Ⅶ)。
1.3.构建含重组鲑鱼降钙素前体基因表达载体的工程菌 操作同实施例1中1.3。
2.高密度发酵 操作同实施例1中2。
3.纯化鲑鱼降钙素前体 3.1.谷胱甘肽巯基转移酶-鲑鱼降钙素前体融合蛋白的纯化 纯化过程同实施例1中4。
3.2.S-磺酸化及溴化氰裂解 用55%饱和(NH4)2SO4沉淀谷胱甘肽巯基转移酶-鲑鱼降钙素前 体融合蛋白,15,000g离心15分钟,加水调整蛋白浓度至10毫克 /毫升。
加入1/10体积1M Tris-盐酸调至pH8.0,按每毫升融合蛋 白加入52毫克Na2SO3和25毫克Na2S4O4的比例分别加入Na2SO3和 Na2S4O4,避光反应12小时。
经G-25柱(6×60cm)脱盐(预先用10mMTris- 盐酸,pH8.0平衡)。
收集洗脱液的流穿峰,加尿素至终浓度8M, 加浓盐酸至终浓度50mM,加入溴化氰避光反应4小时,得重组鲑鱼 降钙素前体等裂解产物。
3.3.裂解产物纯化 将上述裂解反应液加4倍体积水,经SP-Sepharose Fast Flow 层析柱,用1号液(2M尿素,10mM盐酸)洗脱至OD280<0.02,换 2号液(2M尿素,10mM盐酸,100mM NaCl),用分光光度计,以220nm 检测,收集该吸收峰的洗脱液。
收集液经RP-C18柱,先用3号液(5% 乙腈∶95%水∶0.1%三氟乙酸)洗脱至OD220<0.02,再用38%-49%乙 腈梯度洗脱,收集样品,冰冻干燥得到重组鲑鱼降钙素前体。
HPLC 分析产物,条件是流动相丙为水∶0.1%三氟乙酸,流动相丁为乙腈∶ 0.1%三氟乙酸,流速为每分钟1毫升,线性梯度为40分钟丁流动相 由0到80%,所得重组鲑鱼降钙素前体产物纯度大于95%。
用电喷雾 质谱鉴定鲑鱼降钙素前体,见图10,图谱表明鲑鱼降钙素前体的分 子量为3666,与理论计算完全一致。
4.体外酰胺化 将含1mM EDTA、200mM O-PNGA的溶液用5N NaOH调pH值到6.0, 加入鲑鱼降钙素前体至终浓度1mM,再加羧基肽酶-Y150微克,置35 ℃水浴中120分钟后用RP-C18脱盐,冷冻干燥,得到光敏感中间体 鲑鱼降钙素-O-PNGA。
将其溶解于60mM NaHSO3甲醇-水(甲醇∶水=1∶ 1)溶液中,充入氩气后进行光解,可得到线形鲑鱼降钙素,反应完 成后,RP-C18脱盐,冷冻干燥,用HPLC进行纯化,条件同上。
得到 的线形鲑鱼降钙素纯度大于95%。
5.复性 将鲑鱼降钙素1毫克溶于1毫升pH为8.0含0.1M Tris-盐酸和 5mM半胱氨酸的溶液中,置37℃5分钟。
HPLC纯化产物,条件同上。
得到的鲑鱼降钙素纯度大于99%。
用电喷雾质谱鉴定鲑鱼降钙素见 图11,图谱表明鲑鱼降钙素分子量为3432,与理论计算值完全一致。
6.活性测定 操作同实施例1中6。
结果见表2。
表2.测定鲑鱼降钙素的活性      鲑鱼降钙素样品
           标准品
0.01单位
  0.05单位
    0.01单位
   0.05单位
7.29
6.71
6.23
7.07
7.15
7.39
8.41
8.00
7.45
7.30
  5.84
  5.84
  6.57
  6.23
  5.84
  5.63
  6.29
  5.89
  5.81
  6.00
    7.55
    7.61
    7.56
    6.81
    7.15
    7.39
    7.60
    6.70
    6.70
    7.40
    6.58
    5.55
    6.10
    5.26
    5.59
    5.60
    5.89
    5.80
    5.65
    6.00
统计结果:平均可信限(FL%)=25.790,效价:4100国际单位/ 毫克。
表2及统计结果说明基因工程表达的重组鲑鱼降钙素具有显 著的降血钙活性,效价与天然鲑鱼降钙素单位比活一致。
优点和积极效果 本发明同以往的基因工程制备降钙素或降钙素类似物工艺相比 优点在于工艺简单、成本低廉、生产周期短。
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