八月瓜首页 > 专利查询 > >正文

新型口蹄疫疫苗及其制备方法

基本信息

  • 申请号 CN00111491.3 
  • 公开号 CN1307000A 
  • 申请日 2000/01/24 
  • 公开日 2001/08/08 
  • 申请人 中国科学院上海植物生理研究所  
  • 优先权日期  
  • 发明人 许政 张庆琪 朱慧慧 吴立刚  
  • 主分类号  
  • 申请人地址 200032上海市枫林路300号 
  • 分类号  
  • 专利代理机构 上海专利商标事务所 
  • 当前专利状态 发明专利申请公布 
  • 代理人 徐迅 
  • 有效性 失效 
  • 法律状态 失效
  •  

摘要

本发明提供了一种新的含口蹄疫病毒抗原小肽的融合蛋白及其编码序列,以及这些融合蛋白在口蹄疫的诊断和预防上的用途。
本发明还提供了含这些新型融合蛋白的口蹄疫疫苗及其制备方法。
展开

权利要求书

1.一种烟草花叶病毒外壳蛋白的融合蛋白,其特征在于,在外壳蛋白的第155-156 位氨基酸之间插入有长度为10-20个氨基酸的口蹄疫病毒特异性表位。
2.如权利要求1所述的融合蛋白,其特征在于,该外壳蛋白的序列为SEQ ID NO: 1。
3.如权利要求1所述的融合蛋白,其特征在于,该口蹄疫病毒特异性表位的长度为 11-14个氨基酸。
4.如权利要求1所述的融合蛋白,其特征在于,该口蹄疫病毒特异性表位选自下 组:SEQ ID NO:2、3和4。
5.一种分离的DNA分子,其特征在于,它含有编码权利要求1所述的融合蛋白的核 苷酸序列。
6.如权利要求5所述的DNA序列,其特征在于,该DNA编码的融合蛋白在外壳蛋白 的第155-156位氨基酸之间插入有选自下组的口蹄疫病毒特异性表位:SEQ ID NO:2、3 和4。
7.一种表达质粒,其特征在于,它含有权利要求5的DNA。
8.一种宿主细胞,其特征在于,它含有权利要求7所述的表达质粒。
9.一种产生烟草花叶病毒外壳蛋白的融合蛋白方法,其特征在于,它包括: 权利要求7所述的表达质粒经体外转录和包装,形成重组的烟草花叶病毒,该重 组的烟草花叶病毒含有编码该融合蛋白的编码序列,其中在外壳蛋白的第155-156位氨 基酸之间插入有长度为10-20个氨基酸的口蹄疫病毒特异性表位; 用该重组的烟草花叶病毒感染烟草; 在感染2周后,从烟草叶中分离出该融合蛋白。
10.一种口蹄疫疫苗制剂,其特征在于,它含有权利要求1所述的融合蛋白。
展开

说明书

本发明涉及病毒学领域。
更具体地,本发明涉及一种新的含口蹄疫病毒抗原小肽 的融合蛋白及其编码序列,以及这些融合蛋白在口蹄疫的诊断和预防上的用途。
本发明 还提供了含这些新型融合蛋白的口蹄疫疫苗及其制备方法。
口蹄疫病毒(Foot-and-Mouth Disease Virus,简称为“FMDV”)是一种在世界范 围内严重影响产肉、奶家畜生产的病毒。
目前除灭活病毒疫苗外,还没有有效的基因工 程疫苗。
而灭活病毒疫苗虽然免疫效果较好,但有时也会由于灭活不完全反而导致疫情 的爆发,所以欧共体目前已限制灭活疫苗的使用,只在疫情发生后才在局部地区使用灭 活疫苗。
亚洲包括中国是口蹄疫的多发地区,每年对畜牧业生产造成巨大损失,因此开 发具有高效、安全、廉价的基因工程疫苗具有重大的经济价值。
随着对FMDV研究的深入,它的外壳蛋白(VP1-VP4)的三维结构已被阐明。
其主要 抗原决定簇为VP1第141-160氨基酸残基,其中Arg-Gly-Asp(RGD)是病毒颗粒的细胞 结合位点。
另外VP1羧端第198-211氨基酸残基对免疫反应也有增强作用(Fred Brown.(1992)New approachs to vaccination against FMD,Vaccine 10,1022-1026)。
近几年来,利用植物病毒为载体表达外源小肽的系统逐步建立发展起来。
这是一 个非常有前途的研究方向,特别是用于生产各种用于预防和治疗的多肽药物。
研究表明 许多病原的抗原决定簇都是一些不长的小肽序列,但仅用人工合成的小肽并不足以引起 动物的免疫反应,还需要同一定的载体蛋白连接后才能有效地刺激T细胞产生抗体。
而 一些植物病毒如TMV的外壳蛋白(CP)已被证明能对引起T细胞的免疫反应起促进作用 (Loor,F.(1967)Comparative immunogenicities of tobacco mosaic virus,protein subunits and reaggregated protein subunits.Virology 33,215)。
而且外壳蛋白可以耐受一定程度的 修饰而不影响其对病毒基因组的包装。
将较短的外源小肽插入CP基因的末端,可以在 不影响病毒复制的前提下,达到高效表达外源基因的目的,如表达病原的抗原决定小 肽。
此外,CP具有可自动组装成非常稳定的棒状结构的特性,表达的外源小肽将以极 高的密度呈现在棒状病毒颗粒的表面,这对刺激免疫系统产生免疫反应非常有利。
另一 方面,从实际应用角度来说,与传统的微生物发酵反应系统相比,植物病毒表达系统不 需要昂贵的设备和严格的无菌操作,也省却了处理发酵废物的麻烦,而且具有表达量 高,纯化容易,生产成本较低的优点,具有很高的实际应用价值。
目前国外已有多个实验室对植物病毒表达载体进行探索性研究。
Hiroshi Hamamoto(1993)首次将TMV 126kd和183kd蛋白之间的通读序列插入CP与外源小肽之 间,利用通读现象表达了ACEI小肽(12肽)(1Hiroshi Hamamoto,Yoshinori Sugjyama, Noriake Nakagawa,Eiji Hashida,Yuji Matsunaga,Shizume Takemoto,Yuichiro Watanabe and yoshimi okada(1993)A New Tobacco Mosaic Virus Vector and its Use for the Systemic Production of Angiotensin-I-converting Enzyme Inhibitor in Transgenic Tobacco and Tomato.Bio/technology.11.930-932.)。
1995年Thomas H.Turpen用同样方法成 功表达了疟疾抗原小肽(12肽),并进行了较大规模的生产试验,但用该表达方法,融 合外源小肽的CP仅占CP总表达量的二十分之一(Thomas H.turpen,Stephen J,Reinl, Yupin Charoenvit,Stephen L.Hoffman,Victoria Fallarme,and Laurence K.Grill(1995) Malarial Epitopes Expressed on the surface of Recombinant Tobacco Mosaic Virus. Bio/technology 13,53-57.)。
CPMV(Cowpea mosaic virus)是第一个以完全CP融合的形式表达外源小肽获得成 功的植物病毒,Porta C.(1994)把人鼻病毒HRV-14和爱滋病HIV-1的抗原决定簇插入 到CPMV小分子包装蛋白基因的末端,获得大量带抗原决定簇的病毒粒子,且在动物试 验中显示出良好的免疫抗原性。
但他们在试图表达FMDV抗原决定簇时遇到了困难,携 带FMDV细胞黏附序列(RDG)的重组病毒无法在宿主内形成系统感染(Porta,C.,Spall, V.E.,Loveland,J.,Johmson,J.E.,Barker,P.J.and Lomonosoff,G.P.(1994)Development of Cowpea Mosaic Virus as a High-Yielding System for the Presentation of Foreigh Peptides. Virology 202,949-955.)。
烟草花叶病毒(TMV)是另一个用该方法表达小肽获得成功的例子。
TMV是一种宿主 范围广泛的正链杆状植物病毒,它可以在宿主体内高效复制和表达,又能在体外稳定存 在。
其中外壳蛋白(CP)的表达量可以达到宿主总蛋白的百分之七。
Mich B.Hein等人 (1995)首次以全CP融合蛋白的形式利用TMV在烟草内表达鼠ZP3小肽(13肽)获得了成 功,表达量接近野生型TMV。
动物试验结果也表明用TMV CP融合小肽的形式表达的抗 原决定小肽具有良好的免疫原性(John Fitchen,Roger N.Beachy and Mich B.Hein(1995) Plant virus expressing hybrid coat protein with added murine epitope elicits autoantobody response.Vaccine 13,1051-1057)。
其他实验室也用类似方法表达外源小肽获得了成功 (Yoshinori Sugiyama, Hiroshi Harnamoto, Shizume Takemoto, Yuichiro Watanabe, Yoshimi Okada.(1995) Systemic production of foreigh peptides on the particle surface of tobacco mosaic virus. FEBS Letter 359,247-250;Thomas H.turpen,Stephen J,Reinl,Yupin Charoenvit,Stephen L.Hoffman,Victoria Fallarme,and Laurence K.Grill (1995) Malarial Epitopes Expressed on the surface of Recombinant Tobacco Mosaic Virus. Bio/technology 13,53-57.)。
因此,本领域迫切需要开发出具有高效、安全、廉价的针对口蹄疫病毒的疫苗以 及安全高效的具有口蹄疫病毒免疫原性的蛋白。
本发明的一个目的就是提供一种新的具有口蹄疫病毒免疫原性的蛋白。
本发明的另一目的是提供编码该具有口蹄疫病毒免疫原性的蛋白的DNA序列。
本发明的另一目的是提供一种表达质粒,该质粒含有编码具有口蹄疫病毒免疫原 性蛋白的DNA序列。
本发明的另一目的是提供一种高效、安全、廉价的针对口蹄疫病毒的疫苗制剂及 其制备方法。
在本发明第一方面,提供了一种烟草花叶病毒外壳蛋白的融合蛋白,该融合蛋白 在外壳蛋白的第155-156位氨基酸之间插入有长度为10-20个氨基酸的口蹄疫病毒特异 性表位。
较佳地,该口蹄疫病毒特异性表位的长度为11-14个氨基酸。
更佳地,该口蹄 疫病毒特异性表位选自下组:SEQ ID NO:2、3和4。
在本发明的第二方面,提供了一种分离的DNA分子,它含有编码权利要求1所述的 融合蛋白的核苷酸序列。
较佳地,该DNA编码的融合蛋白在外壳蛋白的第155-156位氨 基酸之间插入有选自下组的口蹄疫病毒特异性表位:SEQ ID NO:2、3和4。
在本发明的第三方面,提供了含有上述DNA分子的表达质粒。
在本发明的第四方面,提供了含有上述表达质粒的宿主细胞。
在本发明的第五方面,提供了一种产生烟草花叶病毒外壳蛋白的融合蛋白方法, 它包括:(a)将权利要求7所述的表达质粒经体外转录和包装,形成重组的烟草花叶病 毒,该重组的烟草花叶病毒含有编码该融合蛋白的编码序列,其中在外壳蛋白的第 155-156位氨基酸之间插入有长度为10-20个氨基酸的口蹄疫病毒特异性表位;(b)用该 重组的烟草花叶病毒感染烟草;(c)在感染2-4周后,从烟草叶中分离出该融合蛋白。
在本发明的第六方面,提供了一种口蹄疫疫苗制剂,它含有上述的烟草花叶病毒 外壳蛋白的融合蛋白。
在附图中, 图1是对重组TMV基因组,经反转录PCR后,用5%PAGE进行检测的电泳图,其中 泳道1:1Kb DNA分子标准;泳道2:未感染病毒的烟草;泳道3、4、5、6:分 别为感染了病毒TMV、TMV-F11、TMV-F14、TMV-F20后烟草的RT-PCR扩增产物。
图2是病毒感染烟草两周到三周后,提取感染叶片总蛋白,进行变性蛋白电泳 (SDS-PAGE),经考马斯亮蓝染色后的电泳图。
其中,泳道1:蛋白分子量标准(由下至 上分别为TMV CP 17500、Carbonic Anhydrase 30000、Actin 43000、Albumin 67000、 Phosphorylase b94000);泳道2:未感染病毒的健康烟草叶片的总蛋白;泳道3、4、 5、6:分别为野生TMV、TMV-F11、TMV-F14、TMV-F20感染烟草叶片的总蛋白。
图3是以抗TMV CP的兔血清为一抗,碱性磷酸酯酶偶联的羊抗兔IgG为二抗,进 行蛋白免疫杂交(Western blot)的电泳图。
其中泳道1、2、3、4:分别为感染了野 生型TMV、TMV-F11、TMV-F14、TMV-F20的烟草总蛋白;泳道5:未感染病毒的烟草 总蛋白。
图4是经纯化的重组病毒颗粒进行SDS-PAGE电泳,经考马斯亮蓝染色后的电泳 图。
其中,泳道1:蛋白分子量标准(由下至上分别为TMV CP 17500、Carbonic Anhydrase 30000、Actin 43000、Albumin 67000、Phosphorylase b 94000);泳道2、3、4: 分别为纯化的野生TMV、TMV-F11、TMV-F14的外壳蛋白。
图5是重组TMV病毒pTMV-F11,pTMV-F14,pTMV-F20的结构示意图,其中,“表 位”表示插入了口蹄疫病毒抗原决定小肽的位置。
图6是制备和检测口蹄疫病毒抗原决定小肽的流程图。
在本发明中,“口蹄疫病毒特异性表位”、“口蹄疫病毒特异性抗原决定蔟”和 “口蹄疫病毒抗原(决定)小肽”可互换使用,指衍生自口蹄疫病毒天然蛋白、重组蛋白 或变异蛋白的具有免疫原性的肽片段,当将该肽片段施用于哺乳动物时,会产生针对口 蹄疫病毒的特异性的免疫应答反应。
口蹄疫病毒抗原决定小肽的长度通常为至少8个氨基酸,较佳地至少10个氨基 酸,更佳地至少11个氨基酸,并且通常不超过30个氨基酸,较佳地不超过25个氨基 酸,更佳地不超过20个氨基酸,更佳地不超过16个氨基酸,最佳地不超过14个氨基 酸。
一些口蹄疫病毒抗原决定小肽例子包括(但并不限于):口蹄疫病毒的外壳蛋白VP1 第142-152位氨基酸所构成的肽(SEQ ID NO:2)、VP1羧基端第198-211位氨基酸所构 成的肽(SEQ ID NO:3)、VP1第141-160位氨基酸所构成的肽(SEQ ID NO:4)、VP1 第141-152位氨基酸所构成的肽、VP1第149-160位氨基酸所构成的肽等。
在本发明中,“口蹄疫病毒外壳蛋白”指口蹄疫病毒的天然外壳蛋白、重组外壳 蛋白、或变异外壳蛋白。
一种口蹄疫病毒外壳蛋白VP1的例子是具有SEQ ID NO:17所 示氨基酸序列的蛋白。
此外,该术语包括含有或不含有起始甲硫氨酸的外壳蛋白。
该术 语还包括单体形式或聚集形式的外壳蛋白,例如聚集成口蹄疫病毒外壳形式的外壳蛋 白。
本发明的多核苷酸可以是DNA形式或RNA形式。
DNA形式包括cDNA、基因组DNA 或人工合成的DNA。
DNA可以是单链的或是双链的。
DNA可以是编码链或非编码链。
口蹄疫病毒抗原决定小肽在TMV外壳蛋白中的插入位点通常在外壳蛋白的C末 端,较佳地为第155与156氨基酸(S/G)之间。
在实施本发明时,可用本领域的常规技术(如PCR法、限制性酶切、DNA连接反 应等),将口蹄疫病毒抗原决定小肽的编码序列插入到表达载体中TMV外壳蛋白的编码 序列中,形成融合蛋白的编码序列。
尤其是插入到外壳蛋白靠近C末端,因为这样形 成融合蛋白仍然可以聚集形成病毒颗粒,而且口蹄疫抗原小肽将暴露在外侧,从而增强 了融合蛋白的免疫原性。
在获得了融合蛋白的编码序列后,可将其插入了本领域现有的各种载体中,以便 进行扩增、分析,以及用于随后的体外转录和病毒包装。
可用于本发明的载体包括本领域已知的各种克隆及转录载体,如市售的克隆载体 pUC119等。
此外,为了便于克隆和分析,可以对现有的载体进行适当的改造以便克隆, 例如在克隆载体pUC119中引入新的酶切位点,构建成新的克隆载体p210-bnx。
在本发明中,术语“宿主细胞”指原核细胞。
常用的原核宿主细胞的例子包括大 肠杆菌、枯草杆菌等。
一种特殊的优选表达载体是烟草花叶病毒。
由于,TMV感染烟草后可快速地增 殖,因此,可以在较短时间内和低成本地获得大量的本发明的融合蛋白。
在获得了含融合蛋白编码序列的表达质粒体后,可将其转入合适的宿主细胞,如 DH5、JM109、RR1等大肠杆菌菌株,形成重组TMV克隆,以便于进行扩增和分析。
大量提取表达质粒,再按本领域常规的方法进行体外转录和包装,可用于直接感染烟 草,例如按Willian O.Dawsom,David L.Beck David A.Knorr,and George L.Grantham. (1986)cDNA cloning of the complete genome of tobacco mosaic virus and production of infectious transcripts.PNAS 83,1832-1836所述的方法。
在用重组TMV感染烟草后约2-4周之后,可收集烟草叶子并用本领域常规的各种 分离纯化方法,分离出本发明的融合蛋白。
这些分离纯化方法的例子包括但并不限于: 蛋白沉淀剂处理(盐析、PEG沉淀方法)、离心、超离心、常规的复性处理、分子筛层析(凝 胶过滤)、吸附层析、亲和层析、离子交换层析、高效液相层析(HPLC)和其它各种液相层 析技术及这些方法的结合。
较佳地的分离方法是差速离心结合PEG沉淀方法。
本发明的融合蛋白可用于免疫动物,如猪、牛、羊、豚鼠、家兔、小鼠、大鼠等, 以刺激免疫应答并产生抗体。
有多种佐剂可用于增强免疫反应,其中包括但不限于弗氏 佐剂等。
本发明的融合蛋白还可与口蹄疫病毒的其他疫苗(例如灭活的口蹄疫病毒疫苗) 一起使用, 本发明还提供了一种疫苗制剂(药物组合物),它含有安全有效量的本发明融合蛋白 或其聚合形式作为活性成分以及药学上可接受的载体或赋形剂。
这类载体包括(但并不限 于):生理盐水、缓冲液、水、甘油、羊毛脂、白油、硬脂酸铝及其组合。
药物制剂应与 给药方式相匹配。
本发明的药物组合物可以被制成针剂形式,例如用生理盐水和其他辅 剂的水溶液通过常规方法进行制备。
诸如片剂和胶囊之类的疫苗制剂,可通过常规方法 进行制备。
疫苗制剂如针剂和胶囊宜在无菌条件下制造。
本发明的药物组合物和或疫苗 可以通过常规途径进行给药,其中包括(但并不限于):口服、肌内、腹膜内、静脉内、 皮下、皮内、或局部给药。
使用疫苗制剂时,是将免疫有效量的本发明融合蛋白或其聚合形式施用于哺乳动 物,如果将包含本发明口蹄疫病毒(FMDV)抗原决定小肽的融合蛋白的疫苗组合物给予被 疑或可能感染有口蹄疫病毒(FMDV)的宿主时,能加强宿主自身的免疫应答能力,那么这 样的用量被称为“免疫有效量”。
免疫有效量通常至少约10微克/千克体重,而且在大 多数情况下不超过约8毫克/千克体重,较佳地该剂量是约10微克/千克体重-约1毫克/ 千克体重。
当然,具体剂量还应考虑给药途径、病人健康状况等因素,这些都是熟练医 师技能范围之内的。
本发明还提供了对一种对口蹄疫病毒具有特异性的多克隆抗体和单克隆抗体,尤其 是单克隆抗体。
这里,“特异性”是指抗体能结合于口蹄疫病毒。
本发明不仅包括完整 的单克隆或多克隆抗体,而且还包括具有免疫活性的抗体片段,如Fab′或(Fab)2片段;抗 体重链;抗体轻链;遗传工程改造的单链Fv分子(Ladner等人,美国专利No.4,946,778); 或嵌合抗体,如具有鼠抗体结合特异性但仍保留来自人的抗体部分的抗体。
本发明还提供了一种对口蹄疫病毒具有特异性的多克隆抗体和单克隆抗体的制备 方法。
这里,“特异性”是指抗体能结合于口蹄疫病毒。
本发明的抗体可以通过本领域 内技术人员已知的各种技术进行制备。
例如,将纯化的具有口蹄疫表位小肽的融合蛋白, 施用于动物以诱导多克隆抗体的产生。
本发明还提供了一种检测样品中是否存在抗口蹄疫病毒的抗体的方法,将样品与 本发明的融合蛋白接触,从而与口蹄疫病毒抗体形成复合物;检测是否形成了免疫复合 物,如果形成免疫复合物就表示存在抗口蹄疫病毒的抗体。
本发明人将一系列FMDV抗原决定小肽11肽(142-152)、14肽(198-211)、20肽 (141-160)肽序列插入TMV CP序列的3′端,使之在CP的羧端与外壳蛋白形成融合蛋白, 并对表达的小肽进行了免疫性测定。
结果显示TMV CP融合小肽具有良好的免疫原性。
此外,本发明的这套植物病毒表达系统略加改变就可以用来表达其它各种抗原小肽。
传统的大肠杆菌发酵表达系统相比,本发明的植物病毒表达系统提供了一种新的更为廉 价的疫苗来源。
下面结合具体实施例,进一步阐述本发明。
应理解,这些实施例仅用于说明本发 明而不用于限制本发明的范围。
下列实施例中未注明具体条件的实验方法,通常按照常 规条件如Sambrook等人,分子克隆:实验室手册(New York:Cold Spring Harbor Laboratory Press,1989)中所述的条件,或按照制造厂商所建议的条件。
实施例1 表达载体(TMV cDNA全长克隆)pTMV20的构建 TMV cDNA全长克隆pTMV20是由TMV普通株U1经RT-PCR扩增后克隆入载体 p210-bnx获得。
TMV cDNA 5′端第一个碱基前紧连在T7 RNA聚合酶的启动子序列下 游,并在T7启动子上游引入KpnⅠ位点;为了便于质粒线性化进行体外转录,又在TMV cDNA 3′端引入了唯一限制性酶切位点PstⅠ。
该克隆经体外转录后感染烟草,表现出 TMV的典型感染症状。
(1)克隆载体p210-bnx的构建: 人工合成双链寡核苷酸GCTCGGTACCCGTAGGATCCTGACCTGCAGGCTA (SEQ ID NO:6),它带有KpnⅠ/BamHⅠ/PstⅠ三个酶切位点(黑色斜体字母表示),经Kpn Ⅰ/PstⅠ酶切作为插入片段;市售克隆载体质粒pUC119经KpnⅠ/PstⅠ酶切作为载体,经 连接构建成质粒p210-bnx(3.2kb)。
(2)TMV cDNA全长克隆构建过程: 1)TMV扩增及收获:将TMV普通株U1接种于“革新”烟草进行扩增。
接种一 个月后收获烟草叶片,用常规差速离心的方法提取TMV。
2)将TMV悬浮液加入SDS至百分之一,50度温育15分钟,经酚抽提和NaAC 沉淀获得TMV RNA。
以引物PST:5′-ACGTCTGCAGACTGGGCCCCTACCGG GGGTAA-3′(SEQ ID NO:7)经SuperscriptⅡ反转录,获得单链TMV cDNA。
3)以引物T7TMV 5′-GCTCGGTACC CATTAATACG ACTCACTATA GTATTTTTAC AACAATTACCA-3′(SEQ ID NO:8)和BAM:5′-TATCCATAAT CACCAAACTA AACTAGGAAT-3′(SEQ ID NO:9)对单链TMV cDNA进行PCR扩增, PCR产物经KpnⅠ/BamHⅠ酶切,克隆入载体p210-bnx(经KpnⅠ/BamHⅠ酶切),获得质 粒pTMV5′(含TMV cDNA 5′端片段的克隆)。
4)以引物SQ3:5′-GGTCGGCGGAGCCGCCGTGA-3′(SEQ ID NO:10)和PST(同 上,SEQ ID NO:7)对单链TMV cDNA进行PCR扩增,PCR产物经BamHⅠ/PstⅠ酶切, 克隆入载体pTMV5′(经BamHⅠ/PstⅠ酶切),获得质粒pTMV20(含TMV全长cDNA的 克隆)。
                   表1 TMV cDNA全长克隆中所用的引物 引物
序列
PST
5′-ACGTCTGCAGTGGGCCCCTACCGGGGGTAA-3′(SEQ ID NO:7)
T7TMV

5′-GCTCGGTACCCATTAATACGACTCACTATAGTATTTTTACAAC
AATTACCA-3′(SEQ ID NO:8)
BAM
5′-TATCCATAATCACCAAACTAAACTAGGAAT-3′(SEQ ID NO:9)
SQ3
5′-GGTCGGCGGAGCCGCCGTGA-3′(SEQ ID NO:10)
注:斜体字母为酶切位点,下划线序列为T7启动子。
实施例2 表达质粒pTMV-F11的构建: 利用两次PCR的方法,将FMDV抗原小肽序列引入TMV cDNA克隆pTMV20的 CP基因。
重组TMV克隆经体外转录和包装,得到重组烟草花叶病毒TMV-F11,用于 直接感染烟草。
11肽克隆的构建过程: 第一轮PCR:以pTMV20为模板,引物为SQ3/F11(-),退火温度为52℃,25个循环。
产物应为771bp;另以pTMV20为模板,引物为F11(+)/PST,退火温度为58℃,25个循 环。
产物应为258bp。
第二轮PCR:上述两个PCR产物经PAGE分离,回收纯化后,作为模板以SQ3/PST 为引物,进行第二轮PCR,退火温度在50-52℃之间,35个循环。
产物应为1009bp的片段, 两端分别带有NcoⅠ和PstⅠ酶切位点。
PCR产物用NcoⅠ/PstⅠ酶切,约960bp。
经电泳分离、回收后,作为连接片段。
质粒 pTMV20(9.5kb)用NcoⅠ/PstⅠ酶切,经电泳分离、回收8.6kb片段作为连接载体。
经T4 DNA 连接酶连接,转入大肠杆菌RR1菌株。
经酶切鉴定,获得含有FMDV 11肽序列的表达质粒 pTMV-F11。
大肠杆菌RR1/pTMV-F11于1999年12月21日保藏于中国典型培养物保藏中心 (CCTCC,中国,武汉市),保藏号为CCTCC NO:M99014。
插入TMV CP的FMDV 11小肽序列如下: 11肽F11(FMDV VP1 142-152AA):PNLRGDLQVLA(SEQ ID NO:2) 按Willian O.Dawsom,David L.Beck David A.Knorr,and George L.Granthan.(1986) cDNA cloning of the complete genome of tobacco mosaic virus and production of infectious transcripts.PNAS 83,1832-1836所述的方法,将表达质粒pTMV-F11经体外转录和包 装,得到重组烟草花叶病毒TMV-F11,直接感染烟草。
       表2重组TMV病毒pTMV-F11,pTMV-F14,pTMV-F20的构建中所用的引物 引物
序列
F11(+)

5′-GTGCGTGGTGACCTGCAGGTACTTGCTGGTCCTGCAACT
TGAGGT-3′(SEQ ID NO:11)
F11(-)

5′-ACCTGCAGGTCACCACGCACGTTTGGAGAGGTCCAAACCAA
ACCAG-3′(SEQ ID NO:12)
F14(+)

5′-CAAAAGATCGTTGCTCCAGTTAAACAGACTCTTGGTCCTGCA
ACTTGAGGT-3′(SEQ ID NO:13)
F14(-)

5′-TTCTGGAGCAACGATCTTTTGCTTATGTCTAGAGGTCCAAAC
CAAACCAG-3′(SEQ ID NO:14)
F20(+)

5′-CTGAGCCAAA ACTTGTAAAT CTCCTCTTAA ATTTGGAACA
GAGGTCCAAA GGAAAGGAG-3′(SEQ ID NO:15)
F20(-)

5′-ATTTACAAGT TTTGGCTCAG AAAGTTGCTA GAACTTTACC
AGGTCCTGCA ACTTG-3′(SEQ ID NO:16)
SQ3
5′-GAGAGAAGATTACAAACTGAG-3′(SEQ ID NO:10)
PST
5′-ACGTCTGCAGTGGGCCCCTACCGGGGGTAA-3′(SEQ ID NO:7)
实施例3 表达质粒pTMV-F14的构建 重复实施例2的过程,制备TMV病毒pTMV-F14,不同点在于:用F14(+)和F14(-) 代替F11(+)和F11(-),插入的是14肽F14(FMDVV P1 198-211AA): PGRHKEEIVAPVKQ(SEQ ID NO:3)而不是实施例2中的11肽(SEQ ID NO:2)。
从而获得含 有FMDV 14肽序列的重组TMV cDNA克隆pTMV-F14。
表达质粒pTMV-F14经体外转录和包装,得到重组烟草花叶病毒TMV-F14,用于 直接感染烟草。
实施例4 表达质粒pTMV-F20的构建 重复实施例2的过程,制备TMV病毒pTMV-F20,不同点在于:F20(+)和F20(-) 代替F11(+)和F11(-),插入的是用20肽F20(FMDV VP1 141-160AA): VPNLRGDLQVLAQKVARTLP(SEQ ID NO:4)而不是实施例2中的11肽(SEQ ID NO: 2)。
从而获得含有FMDV 20肽序列的重组TMV cDNA克隆pTMV-F20。
表达质粒pTMV-F20经体外转录和包装,得到重组烟草花叶病毒TMV-F20,用于 直接感染烟草。
实施例5 反转录PCR(RT-PCR)检测重组TMV基因组 试验流程可参见图6。
重组病毒感染烟草两周后,提取新生叶片总RNA,再经反 转录和PCR扩增,检测该重组病毒在烟草内的复制表达情况。
5%PAGE电泳结果如图1 所示。
其中泳道1:1Kb DNA分子标准;泳道2:未感染病毒烟草;泳道3、4、5、 6:分别为感染病毒TMV、TMV-F11、TMV-F14、TMV-F20烟草的RT-PCR扩增产物(重 组TMV病毒pTMV-F11,pTMV-F14,pTMV-F20的结构示意图可参见图5)。
结果表明,重组TMV基因组已经携带了FMDV的11、14、20肽外源片段,并可 以在烟草细胞内有效地复制表达,系统感染整株烟草。
实施例6 重组病毒感染烟草的总蛋白SDS-PAGE电泳 病毒感染烟草两周到三周后,提取感染叶片总蛋白,进行变性蛋白电泳(SDS- PAGE),经考马斯亮蓝染色后检测。
结果如图2所示,其中,泳道1:蛋白分子量标准(由 下至上分别为TMV CP 17500、Carbonic Anhydrase 30000、Actin 43000、Albumin 67000、Phosphorylase b 94000);泳道2:未感染病毒的健康烟草叶片的总蛋白;泳 道3、4、5、6:分别为野生TMV、TMV-F11、TMV-F14、TMV-F20感染烟草叶片的 总蛋白。
结果表明,感染了重组TMV病毒TMV-F11、TMV-F14、TMV-F20的烟草总蛋白中 有一主要的蛋白条带迁移率明显较野生型TMV外壳蛋白慢。
总蛋白电泳结果显示重组病 毒TMV-F11、TMV-F14 CP的表达量接近野生型TMV CP。
实施例7 蛋白免疫杂交(Western-blot) 以抗TMV CP的兔血清为一抗,碱性磷酸酯酶偶联的羊抗兔IgG为二抗,进行蛋白 免疫杂交(Western blot)。
结果如图3所示,其中泳道1、2、3、4:分别为感染了 野生型TMV、TMV-F11、TMV-F14、TMV-F20的烟草总蛋白;泳道5:未感染病毒的烟 草总蛋白。
结果显示,主条带是融合有外源小肽的TMV CP,其中TMV-F11、TMV-F14的表达 量接近野生TMV外壳蛋白的表达量。
用抗FMDV14肽或20肽的抗血清为一抗分别进行 Western印迹杂交,也可以专一性地识别TMV-F14或TMV-F20外壳蛋白上的特定FMDV 肽段。
实施例8 重组病毒稳定性的检测 重组病毒感染烟草两到三周后,取少量新生叶片研磨,将液汁感染四周龄的烟草 幼苗进行传代。
经连续三次传代后,取烟草新生叶片进行RT-PCR和Western印迹检测, 结果都只检测到单一的条带,表明重组TMV病毒基因组的结构稳定,能保持持续稳定地 表达口蹄疫病毒小肽。
实施例9 重组病毒颗粒的大量提取和纯化及SDS-PAGE电泳 重组TMV感染烟草四周后,收获叶片后在低温研磨,低速离心去除杂质,以PEG 沉淀,沉淀溶解后再经低速离心去除沉淀杂质,上清再重复进行PEG沉淀,既可获得 高纯度的重组TMV颗粒(参照D.Noordam(1973)Identification of plant virus.的方法 进行操作)。
结果如图4所示,其中,泳道1:蛋白分子量标准(由下至上分别为TMV CP 17500、Carbonic Anhydrase 30000、Actin 43000、Albumin 67000、Phosphorylase b 94000);泳道2、3、4:分别为纯化的野生TMV、TMV-F11、TMV-F14的外壳蛋白。
每一百克烟草鲜叶可获得1-2克高纯度的融合有11肽或0.5-1.0克14肽的重组 TMV病毒。
而且纯化后的重组TMV结构稳定,可以在4℃长期保存。
融合有20肽的 重组TMV病毒虽也可以系统感染烟草,但表达量明显较TMV CP为低,在纯化过程中 发现病毒颗粒结构不够稳定。
实施例10 疫苗的制备  使用前将7倍体积的10号白油和3倍体积的3%硬脂酸铝混合均匀作为免疫辅剂, 加入适量的待测TMV,TMV-F11,TMV-F14蛋白样品,以漩涡振荡器混合均匀,即 制得疫苗。
可取适量用于免疫试验动物,如豚鼠。
实施例11 融合蛋白在实验动物中的免疫效力测定 以豚鼠为试验对象(试验表明豚鼠与猪对FMDV的免疫力基本一致),进行了CP融 合小肽免疫效力的测定。
对11肽(TMV-F11)和14肽(TMV-F14)的进行了如下测定。
1.豚鼠的免疫程序: 试验共设四组,疫苗的制备方法如实施例10所述,每组各免疫四到五只豚鼠(肌 注)。
豚鼠经一次或两次免疫后由心脏取血,并制备抗血清进行乳鼠保护实验。
取血后 豚鼠恢复4-5天,再进行攻毒实验。
阴性对照组

以0.6mg野生型TMV CP免疫豚鼠。
初次免疫后14天为以同样
剂量进行第二次免疫。
二次免疫后第28天取血
阳性对照组
兰州疫苗浓缩苗。
按照使用说明书剂量一次免疫后42天取血。

一次免疫组

以0.2mg TMVCP11、0.4mg TMVCP14免疫豚鼠,免疫后第42
天取血。

两次免疫组

以0.2mg TMVCP11、0.4mg TMVCP14免疫豚鼠。
初次免疫后14
天以同样剂量进行第二次加强免疫。
二次免疫后第28天取血。

2.豚鼠保护实验: 取血后豚鼠恢复4-5天,全部以50倍豚鼠ID50(豚鼠半致病剂量)的FMDV攻毒, 在7-10天内观察其发病情况(脚爪出现红肿及水泡)。
试验结果如下: 实验豚鼠数(只)
发病豚鼠数(只)
    保护率(%)
阴性对照组
    4
    4
    0
阳性对照组
    4
    1
    75
一次免疫组
    4
    0
    100
两次免疫组
    5
    1
    80
3.乳鼠保护实验: 豚鼠免疫后由心脏取血,制备的豚鼠血清0.1ml皮下注射2-3日龄乳鼠的背部,次 日以不同剂量的FMDV攻击乳鼠,观察七天,记录存活数。
                 两次免疫组乳鼠保护试验结果     病毒稀释度
试验乳鼠数(只)
存活乳鼠数(只)
    10-4
    4
    0
    10-5
    4
    4
                 阴性对照组乳鼠保护试验结果     病毒稀释度
试验乳鼠数(只)
    存活乳鼠数(只)
    10-6
    4
    0
    10-7
    4
    4
故乳鼠保护指数为2.0。
这些试验结果显示TMV CP融合小肽具有良好的免疫原性,能在豚鼠体内激发产 生高水平的中和抗体。
讨论 如上所述,据现有的报道显示,采用CPMV作为载体表达FDMV疫苗小肽并不十分 成功,带有“FMDV LOOP”的重组CPMV病毒可感染宿主细胞并复制表达,但它不能系 统感染整株植株,并且此病毒粒子也难以从植株组织分离提纯出来。
细胞定位研究证明 了重组CPMV病毒粒子与细胞膜紧密结合,其中FMDV的特异序列“Arg-Gly-Asp”(“RGD”) 已被其它实验证实具对细胞膜亲和性。
本发明人在利用TMV为载体表达不同的FMDV抗原决簇的实验中,没有发现病毒粒 子与细胞膜黏着的现象。
带有“RDG”序列的重组病毒TMV-F11有着与野生型TMV病毒 几乎一样快的感染扩散效率。
由此可推测,单独的“RGD”序列并不足以引起病毒颗粒 对细胞膜的附着作用,还需要适当的旁侧序列或蛋白质高级结构的参与。
TMV-F20表达 的肽段(20肽)中包含有TMV-F11的片段(11肽),但TMV-F20感染植株后的花叶症状延 迟出现。
此现象可能是由于重组病毒在植株内扩散速度较低而使得感染症状推迟。
为了 确定其原因,采用RT-PCR和Western对感染植株的新生叶片进行连续检测。
结果在新 生叶片中可以检测到大量的TMV-F11和微量的TMV-F20,而在较老的叶片中TMV-F20 的表达量有明显的增加,可见TMV-F20扩散到新生叶片中速度比TMV-F11或野生TMV 病毒慢得多。
TMV-F11和TMV-F20同样带有“RGD”序列却有着不同的感染扩散速度, 可能是较长的小肽阻碍了外壳蛋白亚基之间正常的相互作用及外壳蛋白与病毒RNA之 间的作用,从而影响了病毒粒子的稳定性。
外壳蛋白不仅有效地保护病毒的基因组 RNA,而且对病毒的长距离运输也起着重要作用,实验表明将CP基因被破坏的TMV突 变体比野生型TMV的感染效率低很多。
所以若插入的外源小肽片段影响了外壳蛋白的正 确折叠或有效地包装病毒粒子,会使病毒难于进行长距离运输;这也可以被用来解释为 何在新生叶片中仅有微量的TMV-F20而在老叶片中表达量明显上升。
当从感染后烟草中 提取纯化TMV-F20病毒时,病毒颗粒很容易发生解聚也可印证这一推断。
在豚鼠免疫试验中,以TMV CP融合蛋白形式表达的外源小肽显示出良好的免疫 原性。
本发明的这套系统略加改变就可以用来表达其它各种抗原小肽。
同传统的大肠杆 菌发酵表达系统相比,本发明的植物病毒表达系统提供了一种新的更为廉价的疫苗来 源。
在本发明提及的所有文献都在本申请中引用作为参考,就如同每一篇文献被单独 引用作为参考那样。
此外应理解,在阅读了本发明的上述讲授内容之后,本领域技术人 员可以对本发明作各种改动或修改,这些等价形式同样落于本申请所附权利要求书所限 定的范围。
                序列表 (1)一般信息: (ⅱ)发明名称:新型口蹄疫疫苗及其制备方法 (ⅲ)序列数目:17 (2)SEQ ID NO:1的信息: (ⅰ)序列特征:     (A)长度:159氨基酸     (B)类型:氨基酸     (C)链型:未知     (D)拓扑结构:未知 (ⅹⅰ)序列描述:SEQ ID NO:1: MSYSITTPSQ  FVFLSSAWAD  PIELINLCTN  ALGNQFQTQQ  ARTVVQRQFS  EVWKPSPQVT     60 VRFPDSDFKV  YRYNAVLDPL  VTALLGAFDT  RNRIIEVENQ  ANPTTAETLD  ATRRVDDATV    120 AIRSAINNLI  VELIRGTGSY  NRSSFESSSG  LVWTSGPAT                             159 (2)SEQ ID NO:2的信息: (ⅰ)序列特征:     (A)长度:11氨基酸     (B)类型:氨基酸     (C)链型:未知     (D)拓扑结构:未知 (ⅹⅰ)序列描述:SEQ ID NO:2: PNLRGDLQVL A                                                               11 (2)SEQ ID NO:3的信息: (ⅰ)序列特征:     (A)长度:14氨基酸     (B)类型:氨基酸     (C)链型:未知     (D)拓扑结构:未知 (ⅹⅰ)序列描述:SEQ ID NO:3: PGRHKEEIVA PVKQ                                                            14 (2)SEQ ID NO:4的信息: (ⅰ)序列特征:     (A)长度:20bp     (B)类型:核酸     (C)链型:单链     (D)拓扑结构:线性 (ⅹⅰ)序列描述:SEQ ID NO:4: VPNLRGDLQV LAQKVARTLP                                                      20 (2)SEQ ID NO:5的信息: (ⅰ)序列特征:     (A)长度:480bp     (B)类型:核酸     (C)链型:单链     (D)拓扑结构:线性 (ⅹⅰ)序列描述:SEQ ID NO:5: ATGTCTTACA GTATCACTAC TCCATCTCAG TTCGTGTTCT TGTCATCAGC GTGGGCCGAC          60 CCAATAGAGT TAATTAATTT ATGTACTAAT GCCTTAGGAA ATCAGTTTCA AACACAACAA         120 GCTCGAACTG TCGTTCAAAG ACAATTCAGT GAGGTGTGGA AACCTTCACC ACAAGTAACT         180 GTTAGGTTCC CTGACAGTGA CTTTAAGGTG TACAGGTACA ATGCGGTATT AGACCCGCTA         240 GTCACAGCAC TGTTAGGTGC ATTCGACACT AGAAATAGAA TAATAGAAGT TGAAAATCAG         300 GCGAACCCCA CGACTGCCGA AACGTTAGAT GCTACTCGTA GAGTAGACGA CGCAACGGTG         360 GCCATAAGGA GCGCGATAAA TAATTTAATA GTAGAATTGA TCAGAGGAAC CGGATCTTAT         420 AATCGGAGCT CTTTCGAGAG CTCTTCTGGT TTGGTTTGGA CCTCTGGTCC TGCAACTTGA         480 (2)SEQ ID NO:6的信息: (ⅰ)序列特征:     (A)长度:34bp     (B)类型:核酸     (C)链型:单链 (D)拓扑结构:线性 (ⅹⅰ)序列描述:SEQ ID NO:6: GCTCGGTACC CGTAGGATCC TGACCTGCAG GCTA                                      34 (2)SEQ ID NO:7的信息: (ⅰ)序列特征:     (A)长度:30bp     (B)类型:核酸     (C)链型:单链     (D)拓扑结构:线性 (ⅹⅰ)序列描述:SEQ ID NO:7: ACGTCTGCAG TGGGCCCCTA CCGGGGGTAA                                           30 (2)SEQ ID NO:8的信息: (ⅰ)序列特征:     (A)长度:51bp     (B)类型:核酸     (C)链型:单链     (D)拓扑结构:线性 (ⅹⅰ)序列描述:SEQ ID NO:8: GCTCGGTACC CATTAATACG ACTCACTATA GTATTTTTAC AACAATTACC A                   51 (2)SEQ ID NO:9的信息: (ⅰ)序列特征:     (A)长度:30bp     (B)类型:核酸     (C)链型:单链     (D)拓扑结构:线性 (ⅹⅰ)序列描述:SEQ ID NO:9: TATCCATAAT CACCAAACTA AACTAGGAAT                                           30 (2)SEQ ID NO:10的信息: (ⅰ)序列特征:     (A)长度:20bp     (B)类型:核酸     (C)链型:单链     (D)拓扑结构:线性 (ⅹⅰ)序列描述:SEQ ID NO:10: GGTCGGCGGA GCCGCCGTGA                                                      20 (2)SEQ ID NO:11的信息: (ⅰ)序列特征:     (A)长度:45bp     (B)类型:核酸     (C)链型:单链     (D)拓扑结构:线性 (ⅹⅰ)序列描述:SEQ ID NO:11: GTGCGTGGTG ACCTGCAGGT ACTTGCTGGT CCTGCAACTT GAGGT                          45 (2)SEQ ID NO:12的信息: (ⅰ)序列特征:     (A)长度:46bp     (B)类型:核酸     (C)链型:单链     (D)拓扑结构:线性 (ⅹⅰ)序列描述:SEQ ID NO:12: ACCTGCAGGT CACCACGCAC GTTTGGAGAG GTCCAAACCA AACCAG                         46 (2)SEQ ID NO:13的信息: (ⅰ)序列特征:     (A)长度:51bp     (B)类型:核酸     (C)链型:单链     (D)拓扑结构:线性 (ⅹⅰ)序列描述:SEQ ID NO:13: CAAAAGATCG TTGCTCCAGT TAAACAGACT CTTGGTCCTG CAACTTGAGG T                   51 (2)SEQ ID NO:14的信息: (ⅰ)序列特征:     (A)长度:50bp     (B)类型:核酸     (C)链型:单链     (D)拓扑结构:线性 (ⅹⅰ)序列描述:SEQ ID NO:14: TTCTGGAGCA ACGATCTTTT GCTTATGTCT AGAGGTCCAA ACCAAACCAG                     50 (2)SEQ ID NO:15的信息: (ⅰ)序列特征:     (A)长度:59bp     (B)类型:核酸     (C)链型:单链     (D)拓扑结构:线性 (ⅹⅰ)序列描述:SEQ ID NO:15: CTGAGCCAAA ACTTGTAAAT CTCCTCTTAA ATTTGGAACA GAGGTCCAAA GGAAAGGAG           59 (2)SEQ ID NO:16的信息: (ⅰ)序列特征:     (A)长度:55bp     (B)类型:核酸     (C)链型:单链     (D)拓扑结构:线性 (ⅹⅰ)序列描述:SEQ ID NO:16: ATTTACAAGT TTTGGCTCAG AAAGTTGCTA GAACTTTACC AGGTCCTGCA ACTTG               55 (2)SEQ ID NO:17的信息: (ⅰ)序列特征:     (A)长度:213氨基酸     (B)类型:氨基酸     (C)链型:未知     (D)拓扑结构:未知 (ⅹⅰ)序列描述:SEQ ID NO:17: TTSAGESADP VTTTVENYGG ETQIQRRQHT DVSFIMDRFV KVTPQNQINI LDLMQIPSHT          60 LVGALLRAST YYFSDLEIAV KHEGDLTWVP NGAPEKALDN TTNPTAYHKA PLTRLALPYT         120 APHRVLATVY NGECRYNRNA VPNLRGDLQV LAQKVARTLP TSFNYGAIKA TRVTELLYRM         180 KRAETYCPRP LLAIHPTEAR HKQKIVAPVK QTL                                      213 展开

查看更多专利详情信息请先登录或注册会员

相关专利类别推荐

获取手机验证码,即可注册成为会员

专利详情咨询

咨询内容

姓名

手机

验证码

用户登录

手机号

手机验证码

提示

不能再减了!!!

提交成功

八月瓜客服中心已经收到您的信息,正在为您派遣知识产权顾问。知识产权顾问会携带贴心的服务以闪电搬的速度与您联系。

扫一扫关注八月瓜微信 创业一手掌握